новые пестицидные протеины и штаммы
Классы МПК: | C12N15/32 кристаллические белки бацилл C12N15/62 ДНК последовательности, кодирующие белки при слиянии C12N15/82 для клеток растений C07K14/325 кристаллический пептид Bacillus thuringiensis (бета-эндотоксин) A01N63/00 Биоциды, репелленты или аттрактанты или регуляторы роста растений, содержащие микроорганизмы, вирусы, плесневые грибы, ферменты, сбраживающие материалы или вещества, полученные или экстрагированные из микроорганизмов или животных материалов |
Автор(ы): | УОРРЕН Грегори Уэйн (US), КОЗИЛ Майкл Джин (US), МАЛЛИНС Марта Элис (US), НАЙ Гордон Джеймс (US), КАРР Брайан (US), ДИЗАЙ Налини Мэной (US), КОСТИЧКА Кристи (US), ДАК Николас Брендан (US), ЭСТРУЧ Хуан Хосе (US) |
Патентообладатель(и): | НОВАРТИС АГ (CH) |
Приоритеты: |
подача заявки:
1995-09-27 публикация патента:
20.01.2003 |
Изобретение может быть использовано в селекции растений. Трансгенное растение получают введением в его геном молекулы ДНК, кодирующей инсектицидный протеин, который секретируется на вегетативной стадии роста Bacillus spp. Трансформация может также включать использование последовательностей ДНК, кодирующих вспомогательные и/или слитые протеины. Секреция инсектицидных протеинов во время вегетативной стадии роста штаммов Bacillus обеспечивает защиту растения от повреждения насекомыми-вредителями. 3 с. и 43 з.п. ф-лы, 33 табл.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48, Рисунок 49, Рисунок 50, Рисунок 51, Рисунок 52, Рисунок 53, Рисунок 54, Рисунок 55, Рисунок 56, Рисунок 57, Рисунок 58, Рисунок 59, Рисунок 60, Рисунок 61, Рисунок 62, Рисунок 63, Рисунок 64, Рисунок 65, Рисунок 66, Рисунок 67, Рисунок 68, Рисунок 69, Рисунок 70, Рисунок 71, Рисунок 72, Рисунок 73, Рисунок 74, Рисунок 75, Рисунок 76, Рисунок 77, Рисунок 78, Рисунок 79, Рисунок 80, Рисунок 81, Рисунок 82, Рисунок 83, Рисунок 84, Рисунок 85, Рисунок 86, Рисунок 87, Рисунок 88, Рисунок 89, Рисунок 90, Рисунок 91, Рисунок 92, Рисунок 93, Рисунок 94, Рисунок 95, Рисунок 96, Рисунок 97, Рисунок 98, Рисунок 99, Рисунок 100, Рисунок 101, Рисунок 102, Рисунок 103, Рисунок 104, Рисунок 105, Рисунок 106, Рисунок 107, Рисунок 108, Рисунок 109, Рисунок 110, Рисунок 111, Рисунок 112, Рисунок 113, Рисунок 114, Рисунок 115, Рисунок 116, Рисунок 117, Рисунок 118, Рисунок 119, Рисунок 120, Рисунок 121, Рисунок 122, Рисунок 123, Рисунок 124, Рисунок 125, Рисунок 126, Рисунок 127, Рисунок 128, Рисунок 129, Рисунок 130, Рисунок 131, Рисунок 132, Рисунок 133, Рисунок 134, Рисунок 135, Рисунок 136, Рисунок 137, Рисунок 138, Рисунок 139, Рисунок 140, Рисунок 141, Рисунок 142, Рисунок 143, Рисунок 144, Рисунок 145, Рисунок 146, Рисунок 147, Рисунок 148, Рисунок 149, Рисунок 150, Рисунок 151
Формула изобретения
1. Способ получения трансгенного растения, содержащего стабильно включенную в геном растения молекулу ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую вегетативный инсектицидный протеин, который секретируется на вегетативной стадии роста Bacillus spp. , включающий трансформацию указанного растения кассетой экспрессии, где указанная нуклеотидная последовательность функционально связана с экспрессируемыми в растении последовательностями, включающими регуляторные сигналы трансляции и транскрипции, необходимые для экспрессии объединенных кодирующих ДНК в организме-хозяине, и необязательно необходимые дополнительные регуляторные последовательности. 2. Способ по п. 1, где Bacillus выбирают из Bacillus thuringiensis и B. cereus. 3. Способ по любому из п. 1 или 2, где специфический в отношении насекомых протеин токсичен для Coleoptera или Lepidoptera. 4. Способ по п. 3, где спектр инсектицидной активности включает активность в отношении видов Agrotis и/или Spodoptera и прежде всего активность в отношении совки ипсилон [Agrotis ipsilon; CИ] и/или совки травяной [Spodoptera frugiperda] и/или совки малой [Spodoptera exigua] и/или табачной листовертки и/или совки хлопковой [Helicoverpa zea] . 5. Способ по п. 2, где Bacillus представляет собой Bacillus cereus, имеющий регистрационный номер NRRL B-21058. 6. Способ по п. 2, где Bacillus представляет собой Bacillus thuringiensis, имеющий регистрационный номер NRRL D-21060. 7. Способ по п. 2, где Bacillus представляет собой Bacillus, выбранный из штаммов, имеющих регистрационные номера NRRL B-21224, NRRL B-21225, NRRL B-21226, NRRL B-21227, NRRL B-21228, NRRL B-21229, NRRL B-21230 и NRRL B-21439. 8. Способ по любому из пп. 1-7, где указанный специфичный в отношении насекомых протеин имеет молекулярную массу приблизительно 30 кДа или более, предпочтительно от приблизительно 60 до приблизительно 100 кДа и наиболее предпочтительно приблизительно 80 кДа. 9. Способ по п. 8, где протеин содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 20, включая их гомологи. 10. Способ по п. 8, где протеин содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 21, включая их гомологи. 11. Способ по п. 8, где протеин содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 52, включая их гомологи. 12. Способ по любому из пп. 8-11, где последовательности, представляющие собой сигнал секреции, удалены или инактивированы. 13. Способ по п. 10, где указанный специфичный в отношении насекомых протеин сопровождается вспомогательным протеином, который усиливает специфичную в отношении насекомых активность указанного специфичного в отношении насекомых протеина. 14. Способ по п. 13, где вспомогательный протеин имеет молекулярную массу приблизительно 50 кДа. 15. Способ по п. 13, где вспомогательный протеин имеет происхождение из Bacillus cereus. 16. Способ по п. 15, где вспомогательный протеин и специфичный в отношении насекомых протеин имеют происхождение из штамма АВ78. 17. Способ по любому из пп. 13-16, где последовательности, представляющие собой сигнал секреции, удалены или инактивированы. 18. Способ по п. 1, где указанный специфичный в отношении насекомых протеин является многомерным пестицидным протеином, который содержит более одной полипептидной цепи и в котором, по крайней мере, одна из полипептидных цепей представляет собой специфичный в отношении насекомых протеин и/или вспомогательный протеин, который описан в предыдущих пунктах. 19. Способ по п. 18, где указанный многомерный протеин имеет молекулярную массу от приблизительно 50 до приблизительно 200 кДа. 20. Способ по п. 1, где указанный специфичный в отношении насекомых протеин представляет собой слитый протеин, содержащий несколько протеиновых доменов, включающий, по меньшей мере, специфичный в отношении насекомых протеин и/или вспомогательный протеин, который описан в предыдущих пунктах и образуемый посредством слияний генов в открытой рамке считывания, которые при трансляции с помощью рибосом продуцируют слитый протеин, который, по меньшей мере, сочетает в себе свойства специфичного в отношении насекомых протеина и/или вспомогательного протеина и необязательно других компонентов, применяемых при слиянии. 21. Способ по п. 20, где указанный слитый протеин включает рибонуклеазный S-протеин. 22. Способ по п. 20, где указанный слитый белок содержит специфичный в отношении насекомых протеин, представленный в SEQ ID NO: 5, и вспомогательный протеин, представленный в SEQ ID NO: 2, что приводит к протеину, представленному в SEQ ID NO: 23, включая его гомологи. 23. Способ по п. 20, где слитый протеин, представленный в SEQ ID NO: 50, включая его гомологи, содержит специфичный в отношении насекомых протеин, представленный в SEQ ID NO: 35, и вспомогательный протеин, представленный в SEQ ID NO: 27. 24. Способ по любому из пп. 20-23, где указанный слитый протеин содержит специфичный в отношении насекомых протеин и/или вспомогательный протеин, который описан в предыдущих пунктах, слитый с сигнальной последовательностью, которая является гетерологичной по происхождению по отношению к протеину-реципиенту. 25. Способ по п. 24, где указанная сигнальная последовательность представляет собой сигнал секреции или ориентирующую последовательность, которая направляет трансгенный продукт к определенной органелле или компартменту клетки. 26. Способ по п. 25, где этот протеин имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 43 или в SEQ ID NO: 46, включая их гомологи. 27. Способ по п. 25, где указанная последовательность представлена в открытой рамке считывания 2 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6, включая их гомологи. 28. Способ по п. 27, где указанная нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 19 или открытой рамке считывания 1 SEQ ID NO: 1, включая их гомологи. 29. Способ по п. 27, где указанная нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 28 или в SEQ ID NO: 31, включая ее гомологи. 30. Способ по любому из пп. 27-29, где указанная нуклеотидная последовательность полностью или частично оптимизирована для экспрессии в микроорганизме. 31. Способ по любому из пп. 27-29, где указанная нуклеотидная последовательность полностью или частично оптимизирована для экспрессии в растении. 32. Способ по п. 30, где указанная нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 35, включая их гомологи. 33. Способ по п. 32, где указанная нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 42 или SEQ ID NO: 45, включая их гомологи. 34. Способ по п. 31, где указанная нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 30 или SEQ ID NO: 51, включая их гомологи. 35. Способ по п. 25, где указанная нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 22, включая ее гомологи. 36. Способ по п. 35, где, по крайней мере, один компонент последовательности указанной молекулы ДНК включает нуклеотидную последовательность, оптимизированную для экспрессии в растении. 37. Способ по п. 36, где указанная нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 49, включая ее гомологи. 38. Способ по п. 1, где молекула ДНК выделена с помощью способа, включающего: (а) получение молекулы ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую специфичный в отношении насекомых протеин; и (б) гибридизацию этой молекулы ДНК с олигонуклеотидным зондом, полученным из молекулы ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 или SEQ ID NO: 51, и (в) выделение гибридизующейся ДНК. 39. Способ по любому из пп. 1-38, где трансгенное растение дополнительно экспрессирует второй особый, пригодный для борьбы с насекомыми, ингредиент. 40. Способ по п. 31, где второй, пригодный для борьбы с насекомыми, ингредиент представляет собой![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196032/948.gif)
28.09.1994 по пп. 1-6, 7 (кроме NRRL B - 21439), 8-10, 12-22, 24, 25, 27, 28, 30, 31, 32 (в отношении Seq ID Nos. 17 и 18), 33 ( в отношении Seq ID No: 24), 35, 36, 38 (в отношении Seq ID Nos. 1, 4 и 6), 39-46, (в отношении Seq ID Nos. 1, 4 и 6);
05.06.1995 по пп. 7 (в отношении NRRL B - 21439), 11 (в отношении Seq ID Nos. 29 и 32), 26, 29, 32 (в отношении Seq ID Nos. 26 и 35), 33 (в отношении Seq ID Nos. 27, 39, 42 и 45), 34 (в отношении Seq ID No: 30), 37, 38 (в отношении Seq ID Nos. 28, 30 и 31), 46 (в отношении Seq ID Nos. 28, 30 и 31);
27.09.1995 по пп. 11 (в отношении Seq ID No: 52), 23, 34 (в отношении Seq ID No: 51), 38 (в отношении Seq ID No: 51), 46 (в отношении Seq ID No: 51).
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к способам и композициям для борьбы с вредителями растений и другими вредителями. В частности оно относится к новым протеинам с пестицидной активностью, которые могут быть выделены из Bacillus на стадии вегетативного роста. Изобретение относится также к штаммам Bacillus, протеинам и генам, кодирующим протеины. Способы и композиции, также предлагаемые согласно настоящему изобретению, могут быть использованы в различных системах для борьбы с вредителями растений и другими вредителями. Насекомые-вредители являются основным фактором потери урожая экономически важных сельскохозяйственных культур во всем мире. Для борьбы или полного уничтожения важных с сельскохозяйственной точки зрения вредителей используют широкий спектр химических пестицидов. Тем не менее существенный интерес представляет разработка эффективных альтернативных пестицидов. Микробиологические пестициды играют важную роль в качестве альтернативы химическому методу борьбы с вредителями. Наиболее широко применяемый микробиологический продукт основан на использовании бактерии Bacillus thuringiensis (Bt). Bt представляет собой грамположительную спорообразующую бактерию рода Bacillus, которая во время споруляции продуцирует инсектицидный кристаллический протеин (ИКП). Известны многочисленные разновидности Bt, которые продуцируют более 25 различных, но родственных ИКП. Большинство ИКП, продуцируемых Bt, токсичны для личинок определенных видов насекомых из отрядов Lepidoptera (Чешуекрылых), Diptera (Двукрылых) и Coleoptera (Жесткокрылых). Обычно при поедании ИКП чувствительным к нему насекомым кристалл растворяется и превращается с помощью протеаз кишечника насекомого в токсичное производное. Ни один из ИКП, активных в отношении личинок жуков, таких как колорадский жук (Leptinotarsa decemlineata) или большой мучной хрущак (Tenebrio molitor), не проявил существенной эффективности в отношении представителей рода Diabrotica, в частности Diabrotica virgifera virgifera - блошки длинноусой западной (БДЗ) - или Diabrotica longicornis barberi - блошки длинноусой северной. Bacillus cereus (Bc) во многом схож с Bt. Основным характерным отличием является отсутствие у Вс параспорального кристалла. Вс является широко распространенной бактерией, обычно присутствующей в почве и выделяемой из различных пищевых и лекарственных продуктов. Этот организм принимает участие в порче пищи. Хотя Bt очень полезна для борьбы с насекомыми-вредителями, необходимо расширять количество потенциальных агентов, предназначенных для биологической борьбы. Настоящее изобретение относится, таким образом, к композициям и способам борьбы с вредителями растений. В частности оно относится к новым пестицидным протеинам, которые продуцируются штаммами Bacillus на стадии вегетативного роста. Эти протеины могут найти применение в качестве пестицидных агентов. Настоящее изобретение относится прежде всего к практически очищенному штамму Bacillus, который продуцирует протеин с пестицидной активностью на стадии вегетативного роста, причем этот штамм Bacillus не является В. sphaericus SSII-1. Предпочтительным является штамм Bacillus cereus, имеющий регистрационный номер NRRL В-21058 и Bacillus thuringiensis, имеющий регистрационный номер NRRL В-21060. Также предпочтительным является штамм, выбранный из группы штаммов, имеющих регистрационные номера NRRL В-21224, NRRL В-21225, NRRL В-21226, NRRL В-21227, NRRL В-21228, NRRL В-21229, NRRL В-21230 и NRRL B-21439. Кроме того, изобретение относится к специфичному в отношении насекомых протеину, который может быть выделен в фазе вегетативного роста из Bacillus spp. и предпочтительно из штамма Bacillus thuringiensis и В. cereus, и к его компонентам, причем этот протеин не является токсичным для комаров из В. sphaericus SSII-1. Специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению предпочтительно является токсичным для насекомых из отрядов Coleoptera или Lepidoptera и имеет молекулярную массу приблизительно 30 кДа или более, предпочтительно от приблизительно 60 до приблизительно 100 кДа и более предпочтительно приблизительно 80 кДа. В частности специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению обладает таким спектром инсектицидной активности, который включает активность в отношении видов Agrotis и/или Spodoptera и предпочтительно активность в отношении совки ипсилон [Agrotis ipsilon; СИ], и/или совки травяной [Spodoptera frugiperda], и/или совки малой [Spodoptera exigua], и/или табачной листовертки, и/или совки хлопковой [Helicoverpa zea]. Специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению предпочтительно может быть выделен, например, из штамма Bacillus cereus, имеющего регистрационный номер NRRL В-21058, или из Bacillus thuringiensis, имеющего регистрационный номер NRRL B-21060. Специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению предпочтительно может быть выделен из штамма Bacillus spp., выбранного из группы штаммов, имеющих регистрационные номера NRRL В-21224, NRRL В-21225, NRRL B-21226, NRRL B-21227, NRRL B-21228, NRRL B-21229, NRRL В-21230 и NRRL B-21439. В частности в объем настоящего изобретения включен специфичный в отношении насекомых протеин, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 7, включая любые протеины, которые структурно и/или функционально являются его гомологами. Кроме того, предпочтительным является специфичный в отношении насекомых протеин, когда этот протеин имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 2, включая любые протеины, которые структурно и/или функционально являются его гомологами. Особенно предпочтительным является специфичный в отношении насекомых протеин, когда этот протеин имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 32, включая любые протеины, которые структурно и/или функционально являются его гомологами. Кроме того, предпочтительный вариант осуществления изобретения включает специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению, в котором последовательности, представляющие собой сигнал секреции, были удалены или инактивированы. В объем настоящего изобретения, кроме того, включены вспомогательные протеины, которые усиливают специфичную в отношении насекомых активность протеина, специфичного в отношении насекомых. Эти вспомогательные протеины предпочтительно имеют молекулярную массу приблизительно 50 кДа и могут быть выделены, например, из штамма Bacillus cereus во время фазы вегетативного роста и особенно предпочтительно из штамма Bacillus cereus AB78. В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к вспомогательному протеину, в котором последовательности, представляющие собой сигнал секреции, были удалены или инактивированы. Кроме того, настоящее изобретение относится к обладающим пестицидной активностью многомерным протеинам, которые содержат более одной полипептидной цепи и в которых по крайней мере одна из полипептидных цепей представляет собой специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению, а по крайней мере одна из полипептидных цепей представляет собой вспомогательный протеин по изобретению, который активирует или усиливает пестицидную активность специфичного в отношении насекомых протеина. Многомерные протеины по изобретению, обладающие пестицидной активностью, предпочтительно имеют молекулярную массу от приблизительно 50 кДа до приблизительно 200 кДа. В объем изобретения включен, в частности, обладающий пестицидной активностью многомерный протеин, который содержит специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению и вспомогательный протеин по изобретению, который активирует или усиливает пестицидную активность специфичного в отношении насекомых протеина. Кроме того, настоящее изобретение относится к слитым протеинам, содержащим несколько протеиновых доменов, включающих по крайней мере специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению и/или вспомогательный протеин по изобретению, образующихся посредством генетических слияний, которые при трансляции рибосомами продуцируют слитый протеин, сочетающий в себе по крайней мере свойства специфичного в отношении насекомых протеина по изобретению и/или вспомогательного протеина по изобретению и необязательно других компонентов, применяемых при слиянии. Один из вариантов осуществления изобретения относится к слитому протеину, содержащему рибонуклеазный S-протеин, специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению и вспомогательный протеин по изобретению. Кроме того, еще один вариант осуществления изобретения относится к слитому протеину, содержащему специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению и вспомогательный протеин по изобретению, причем либо специфичный в отношении насекомых протеин, либо вспомогательный протеин находятся на N-конце слитого протеина. Предпочтительным является слитый протеин, который содержит специфичный в отношении насекомых протеин, представленный в SEQ ID NO: 5, и вспомогательный протеин, представленный в SEQ ID NO: 2, что приводит к образованию протеина, представленному в SEQ ID NO: 23, включая любые протеины, которые структурно и/или функционально являются его гомологами. Также предпочтительным является слитый протеин, содержащий специфичный в отношении насекомых протеин, представленный в SEQ ID NO:35, и вспомогательный протеин, представленный в SEQ ID NO: 27, что приводит к образованию протеина, представленного в SEQ ID NO: 50, включая любые протеины, которые структурно и/или функционально являются его гомологами. Кроме того, изобретение относится к слитому протеину, содержащему специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению и/или вспомогательный протеин по изобретению, слитый с сигнальной последовательностью, предпочтительно с секретирующей сигнальной последовательностью или с последовательностью, обеспечивающей целенаправленную доставку, которая направляет трансгенный продукт к определенной органелле или компартменту клетки, причем сигнальная последовательность является гетерологичной по происхождению по отношению к протеину-реципиенту. Особенно предпочтительным по изобретению является слитый протеин, когда этот протеин имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 43 или в SEQ ID NO: 46, включая любые протеины, которые структурно и/или функционально являются его гомологами. В контексте настоящего изобретения такое понятие, как "практически гомологичная последовательность", обозначает близкое структурное сходство между последовательностями аминокислот. Например, практически гомологичные протеины могут быть гомологичными на 40%, предпочтительно на 50% и наиболее предпочтительно гомологичными на 60% или 80% или более. Гомология также включает сходство, когда отсутствуют одна или несколько субпоследовательностей аминокислот или когда включены субпоследовательности с дополнительными аминокислотами. Еще один предмет изобретения относится к молекуле ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует специфичный в отношении насекомых протеин, который может быть выделен в фазе вегетативного роста из Bacillus spp., и его компоненты, причем этот протеин не является токсичным для комаров из В. sphaericus SSII-1. В частности настоящее изобретение относится к молекуле ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует специфичный в отношении насекомых протеин, причем спектр его инсектицидной активности включает активность в отношении видов Agrotis и/или Spodoptera и предпочтительно активность в отношении совки ипсилон [Agrotis ipsilon; СИ], и/или совки травяной ISpodoptera frugiperda], и/или совки малой [Spodoptera exigua], и/или табачной листовертки, и/или совки хлопковой [Helicoverpa zea] . Предпочтительной является молекула ДНК, когда эта молекула содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6, включая любые молекулы ДНК, которые являются ее структурными и/или функциональными гомологами. Также предпочтительной является молекула ДНК, когда эта молекула содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31 или SEQ ID NO: 1, включая любые молекулы ДНК, которые являются ее структурными и/или функциональными гомологами. Кроме того, изобретение относится к молекуле ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует вспомогательный протеин по изобретению, усиливающий специфичную в отношении насекомых активность протеина, специфичного в отношении насекомых. Предпочтительной является молекула ДНК, когда эта молекула содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19, включая любые молекулы ДНК, которые являются ее структурными и/или функциональными гомологами. Еще один вариант осуществления изобретения относится к молекуле ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую специфичный в отношении насекомых протеин, который может быть выделен в фазе вегетативного роста из Bacillus spp. , и его компоненты, когда этот протеин не является токсичным для комаров из В. sphaericus SSII-1, причем эта нуклеотидная последовательность оптимизирована для экспрессии в микроорганизме или в растении. Предпочтительной является молекула ДНК, когда эта молекула содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18, включая любые молекулы ДНК, которые являются ее структурными и/или функциональными гомологами. Также предпочтительной является молекула ДНК, когда эта молекула содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 или SEQ ID NO: 30, включая любые молекулы ДНК, которые являются ее структурными и/или функциональными гомологами. Кроме того, изобретение относится к молекуле ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую обладающий пестицидной активностью многомерный протеин, который содержит более одной полипептидной цепи и в котором по крайней мере одна из полипептидных цепей представляет собой специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению, а по крайней мере одна из полипептидных цепей представляет собой вспомогательный протеин по изобретению, который активирует или усиливает пестицидную активность специфичного в отношении насекомых протеина. Предпочтительной является молекула ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению и вспомогательный протеин по изобретению, который активирует или усиливает пестицидную активность специфичного в отношении насекомых протеина. Особенно предпочтительной является молекула ДНК, когда эта молекула содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 19, включая любые нуклеотидные последовательности, которые являются ее структурными и/или функциональными гомологами. Еще один вариант осуществления изобретения относится к молекуле ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый протеин, который содержит несколько протеиновых доменов, включающих по крайней мере специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению и/или вспомогательный протеин по изобретению, образуемый посредством генетических слияний, и которая при трансляции на рибосомах продуцирует слитый протеин, который по крайней мере сочетает в себе свойства специфичного в отношении насекомых протеина по изобретению и/или вспомогательного протеина по изобретению и необязательно других компонентов, применяемых при слиянии. Предпочтительной по изобретению является молекула ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый протеин, содержащий специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению и вспомогательный протеин по изобретению, причем либо специфичный в отношении насекомых протеин, либо вспомогательный протеин находятся на N-конце слитого протеина. Особенно предпочтительной является молекула ДНК, когда эта молекула содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, включая любые молекулы ДНК, которые являются ее структурными и/или функциональными гомологами. Кроме того, изобретение относится к молекуле ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый протеин, содержащий специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению и/или вспомогательный протеин по изобретению, слитый с сигнальной последовательностью, предпочтительно с секретирующей сигнальной последовательностью или с последовательностью, обеспечивающей целенаправленную доставку, которая направляет трансгенный продукт к конкретной органелле или компартменту клетки, причем сигнальная последовательность является гетерологичной по происхождению по отношению к ДНК-реципиенту. В объем настоящего изобретения, кроме того, включена молекула ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый протеин или многомерный протеин по изобретению, и которая оптимизирована для экспрессии в микроорганизме или в растении. Предпочтительной является оптимизированная молекула ДНК, причем эта молекула содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 45 или SEQ ID NO:49, включая любые молекулы ДНК, которые являются ее структурными и/или функциональными гомологами. Кроме того, изобретение относится к оптимизированной молекуле ДНК, в которой последовательности, кодирующие сигнал секреции, удалены с ее 5"- конца, и прежде всего к оптимизированной молекуле ДНК, когда эта молекула содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 39, включая любые молекулы ДНК, которые являются ее структурными и/или функциональными гомологами. В контексте настоящего изобретения такое понятие, как "практически гомологичная последовательность", обозначает близкое структурное сходство между последовательностями нуклеотидов. Например, практически гомологичные молекулы ДНК могут быть гомологичными на 60%, предпочтительно на 80% и наиболее предпочтительно гомологичными на 90% или 95% или более. Гомология также включает сходство, когда одна или несколько субпоследовательностей нуклеотидов или аминокислот отсутствуют или когда включены субпоследовательности с дополнительными нуклеотидами или аминокислотами. Настоящее изобретение также включает молекулы ДНК, которые гибридизируются в умеренно строгих условиях с молекулой ДНК по изобретению, как она определена выше в настоящем описании, и предпочтительно с олигонуклеотидным зондом, который получают из этой молекулы и который включает смежную часть кодирующей последовательности для специфичного в отношении насекомых протеина длиной по крайней мере 10 нуклеотидов, причем эти молекулы имеют специфичную в отношении насекомых активность, и эти молекулы ДНК также кодируют специфичные в отношении насекомых протеины. Предпочтительными являются молекулы ДНК, когда гибридизация происходит при 65oС в буфере, содержащем 7%-ный ДСН (додецилсульфат натрия) и 0,5М фосфат натрия. Особенно предпочтительной является молекула ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению, и которую получают способом, включающим:(а) получение молекулы ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую специфичный в отношении насекомых протеин;
(б) гибридизацию этой молекулы ДНК с олигонуклеотидным зондом, получаемым из молекулы ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 или SEQ ID NO: 31; и
(в) выделение гибридизующейся ДНК. Изобретение, кроме того, относится к специфичному в отношении насекомых протеину, когда этот протеин кодируется молекулой ДНК по изобретению. Также в объем настоящего изобретения включена кассета экспрессии, содержащая молекулу ДНК по изобретению, функционально связанную с обеспечивающими экспрессию последовательностями, включающими регуляторные сигналы транскрипции и трансляции, необходимые для экспрессии объединенных конструкций ДНК в организме-хозяине, предпочтительно в микроорганизме или растении, и необязательно дополнительные регуляторные последовательности. Изобретение, кроме того, относится к векторной молекуле, содержащей кассету экспрессии по изобретению. Кассета экспрессии и/или веторная молекула по изобретению предпочтительно представляет собой часть генома растения. Еще один вариант осуществления изобретения относится к организму-хозяину, предпочтительно к организму-хозяину, выбранному из группы, состоящей из клеток растений и насекомых, бактерий, дрожжей, бакуловирусов, простейших, нематод и водорослей, и содержащему молекулу ДНК по изобретению, кассету экспрессии, содержащую эту молекулу ДНК, или векторную молекулу, содержащую эту кассету экспрессии, предпочтительно стабильно включенную в геном организма-хозяина. Изобретение, кроме того, относится к трансгенному растению и предпочтительно к растению кукурузы, включая его части, а также потомство и семенной материал, содержащему молекулу ДНК по изобретению, кассету экспрессии, содержащую эту молекулу ДНК, или векторную молекулу, содержащую эту кассету экспрессии, предпочтительно стабильно включенную в геном растения. Предпочтительным является трансгенное растение, включая его части, а также потомство и семенной материал, стабильно трансформированные молекулой ДНК по изобретению, кассетой экспрессии, содержащей эту молекулу ДНК, или векторной молекулой, содержащей эту кассету экспрессии. Также предпочтительным является трансгенное растение, включая его части, а также потомство и семенной материал, экспрессирующие специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению. Кроме того, изобретение относится к трансгенному растению, предпочтительно к растению кукурузы по изобретению, как оно определено выше в настоящем описании, которое дополнительно экспрессирует второй, отличный от первого, пригодный для борьбы с насекомыми ингредиент, предпочтительно
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196032/948.gif)
выращивание штамма Bacillus в культуре;
получение супернатанта из этой культуры;
кормление личинки насекомого пищей с добавлением супернатанта; и
определение смертности. Еще один предмет настоящего изобретения относится к способу выделения специфичного в отношении насекомых протеина по изобретению, включающему:
выращивание штамма Bacillus в культуре;
получение супернатанта из этой культуры; и
выделение специфичного в отношении насекомых протеина из супернатанта. В объем изобретения также включен способ выделения молекулы ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую специфичный в отношении насекомых протеин, обладающий инсектицидной активностью протеинов по изобретению, причем этот способ включает:
получение молекулы ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую специфичный в отношении насекомых протеин;
гибридизацию этой молекулы ДНК с ДНК, полученной из видов р. Bacillus; и
выделение этой гибридизующейся ДНК. Кроме того, изобретение относится к способу расширения спектра насекомых-мишеней в результате использования специфичного в отношении насекомых протеина по изобретению в сочетании по крайней мере еще с одним, вторым инсектицидным протеином, отличным от специфичного в отношении насекомых протеина по изобретению, и предпочтительно с инсектицидным протеином, выбранным из группы, состоящей из
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196032/948.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196009/945.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196032/948.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196009/945.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196032/948.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196032/948.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196032/948.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196032/948.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196009/945.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196032/948.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196032/948.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196032/948.gif)
лидерные последовательности пикорнавирусов, например, EMCV-лидер (5"-некодирующая область энцефаломиокардита) (Elroy -Stein О., Fuerst T.R. и Moss В.. (1989) PNAS USA. 86:6126-6130);
лидерные последовательности потивирусов, например, TEV-лидер (вирус гравировки табачной) (Allison и др., (1986); MDMV-лидер (вирус мозаичной карликовости кукурузы); Virology, 154:9-20);
связывающий протеин тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина (BiP) (Macejak D.G. и Sarnow P., (1991) Nature, 353:90-94);
нетранслируемую лидерную последовательность мРНК из покровного протеина вируса мозаики люцерны (AMV RNA 4) (Jobling S.A. и Gehrke L., (1987) Nature, 325: 622-625);
лидерную последовательность вируса мозаики табака (TMV) (Galliе D.R. и др., (1989), Molecular Biology of RNA, с. 237-256); и
лидерную последовательность вируса хлорозной мозаики кукурузы (MCMV) (Lommel S.A. и др., (1991) Virology, 81: 382-385; см. также у Della-Cioppa и др., (1987) Plant Physiology, 84:956-968). В кассете экспрессии может быть использован терминатор из растений. См., например, у Rosenberg и др., (1987) Gene, 56: 125, у Guerineau и др., (1991) Mol. Gen. Genet. , 226: 141-144; у Proudfoot, (1991) Cell, 64: 671-674; у Sanfacon и др., (1991) Genes Dev., 5: 141-149; у Mogen и др., (1990) Plant Cell, 2: 1261-1271; у Munroe и др., (1990) Gene, 91: 151-158; у Ballas и др. , (1989) Nucleic Acid Res., 17: 7891-7903; у Joshi и др., (1987) Nucleic Acid Res., 15: 9627-9639. Для тканеспецифичной экспрессии нуклеотидные последовательности по изобретению могут быть функционально связаны со специфичными для ткани промоторами. См. , например, европейскую заявку ЕР-А 0618976, включенную в настоящее описание в качестве ссылки. Кроме того, настоящее изобретение включает трансгенные растения, в частности трансгенные фертильные растения, трансформированные с помощью вышеописанных способов, и их бесполое и/или половое потомство, включающее и, кроме того, предпочтительно экспрессирующее пестицидный протеин по изобретению. Особенно предпочтительными являются гибридные растения. Трансгенное растение по изобретению может представлять собой двудольное или однодольное растение. Предпочтительными являются однодольные растения семейства Graminaceae (злаки), включающие растения родов Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale и Setaria. Особенно предпочтительными являются трансгенные растения кукурузы, пшеницы, ячменя, сорго, ржи, овса, дернообразующих злаков и риса. Среди двудольных растений особенно предпочтительными по изобретению являются соя, хлопчатник, табак, сахарная свекла, масличный рапс и подсолнечник. Следует отметить, что понятие "потомство" включает потомство трансгенных растений, полученное как "бесполым", так и "половым" путем. Под это понятие также подпадают все мутанты и все разновидности, которые получают с помощью известных способов, таких как, например, гибридизация клеток или селекция мутантов, и которые проявляют характерные свойства исходного трансформированного растения, наряду со всеми продуктами скрещивания и гибридизации трансформированного растительного материала. Еще один предмет изобретения относится к материалу для размножения трансгенных растений. Под материалом для размножения трансгенных растений в контексте настоящего изобретения понимают любой растительный материал, который может быть размножен половым или бесполым путем in vivo или in vitro. Особенно предпочтительными согласно настоящему изобретению являются протопласты, клетки, каллюсы, ткани, органы, семена, эмбрионы, пыльца, яйцеклетки, зиготы, а также любой другой материал для размножения, получаемый из трансгенных растений. Части растений, такие как, например, цветки, стебли, плоды, листья, корни, образующиеся у трансгенных растений или у их потомства, ранее трансформированных с помощью способа по изобретению и, следовательно, состоящие по крайней мере частично из трансгенных клеток, также являются предметом настоящего изобретения. До поступления в продажу в качестве коммерческого продукта материала для размножения растений (плодов, клубней, зерна, семян) и прежде всего семенного материала его обычно обрабатывают защитным покрытием, содержащим гербициды, инсектициды, фунгициды, бактерициды, нематоциды, моллюскициды или смеси, состоящие из нескольких этих препаратов, при необходимости вместе с другими дополнительными носителями, поверхностно-активными веществами или способствующими нанесению адьювантами, обычно применямыми в области изготовления препаративных форм для обеспечения защиты от повреждения, вызванного бактериями, грибами или насекомыми-вредителями. Для обработки семенного материала защитное покрытие может быть нанесено на семенной материал либо путем пропитки клубней или зерен жидким составом, либо путем нанесения на них покрытия из сложной влажной или сухой композиции. Кроме того, в особых случаях возможно использование других способов обработки растений, например путем направленной обработки почек или плодов. Семенной материал для растения по изобретению содержит молекулу ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую пестицидный протеин по изобретению, и может быть обработан покрытием, защищающим семенной материал и содержащим соединение, предназначенное для обработки семенного материала, такое как, например, каптан, карбоксин, тирам (TMTD
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196047/174.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196047/174.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196047/174.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196032/948.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196032/948.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196032/948.gif)
5"-GAA ATT GAT САА GAT ACN GAT-3" (SEQ ID NO: 9). где N обозначает любое основание. Кроме того, ДНК-зонд для гена VIP1 Bс AB78, представленный в настоящем описании, позволяет осуществлять отбор любого штамма Bacillus или других организмов с целью определить, присутствует ли в нем ген VIP1 (или родственный ему ген) в естественном состоянии, или трансформированный специальным образом организм включает ген VIP1. Таким образом, выше представлено общее описание изобретения, сущность которого более подробно поясняется на приведенных ниже примерах, иллюстрирующих настоящее изобретение, и их не следует рассматривать как ограничивающие его объем, если нет специального указания. Была разработана стандартная номенклатура на основе идентичности последовательностей протеинов, включенных в объем настоящего изобретения. Названия генов и протеинов, используемые в подробных примерах, и их взаимосвязь с названиями, которые использовались в первичной заявке [заявка на патент США 314594/08], представлены в табл.I. Экспериментальная часть
Примеры композиций
Действующее вещество, применяемое в приведенных ниже примерах препаративных форм, представляет собой штамм Bacillus cereus, имеющий регистрационнй номер NRRL В-21058; штаммы Bacillus thuringiensis, имеющие регистрационные номера NRRL В-21060. NRRL B-21224, NRRL B-21225, NRRL В-21226, NRRL В-21227 и NRRL B-21439; и штаммы Bacillus spp., имеющие регистрационные номера NRRL В-21228, NRRL В-21229 и NRRL B-21230. Все указанные выше штаммы представляют собой природные изоляты, содержащие специфичные в отношении насекомых протеины по изобретению. В альтернативном варианте выделенные специфичные в отношении насекомых протеины применяют в качестве действующего вещества по отдельности или в комбинации с перечисленными выше штаммами Bacillus. А1. Смачиващиеся порошки см табл. II
Споры тщательно смешивают с адъювантами и смесь тщательно размалывают в пригодной для этой цели мельнице, получая смачивающиеся порошки, которые могут быть разбавлены водой для получения суспензий требуемых концентраций. А2. Эмульсионные концентраты
Споры Bacillus thuringiensis - 10%
Полиэтиленгликолевый эфир октилфенола (4-5 моль этиленоксида) - 3%
Додецилбензолсульфонат кальция - 3%
Полиэтиленгликолевый эфир касторового масла (36 моль этиленоксида) - 4%
Циклогексанон - 30%
Смесь ксилолов - 50%
Эмульсии любой требуемой концентрации могут быть получены из этого концентрата разбавлением водой. A3. Дусты см. табл. III. Готовые к применению дусты получают смешением действующего вещества с носителями и измельчением смеси в пригодной для этой цели мельнице. А4. Экструдированный гранулят
Споры Bacillus thuringiensis - 10%
Лигносульфонат натрия - 2%
Карбоксиметилцеллюлоза - 1%
Каолин - 87%
Действующее вещество или их комбинацию смешивают и измельчают совместно с адъювантами и смесь далее увлажняют водой. Смесь экструдируют, гранулируют и сушат в потоке воздуха. А5. Гранулы с покрытием
Споры Bacillus thuringiensis - 3%
Полиэтиленгликоль (мол. масса 200) - 3%
Каолин - 94%
Действующее вещество или их комбинацию равномерно подают в смеситель к каолину, увлажненному полиэтиленгликолем. Таким путем получают беспылевые гранулы с покрытием. А6. Суспензионный концентрат
Споры Bacillus thuringiensis - 40%
Этиленгликоль - 10%
Полиэтиленгликолевый эфир нонилфенола (15 моль этиленоксида) - 6%
Лигносульфонат натрия - 10%
Карбоксиметилцеллюлоза - 1%
37%-ный водный раствор формальдегида - 0,2%
Силиконовое масло в виде 75%-ного водного раствора - 0,8%
Вода - 32%
Действующее вещество или их комбинацию смешивают до гомогенности с адъювантами, получая суспензионный концентрат, из которого путем разбавления водой могут быть получены суспензии любой требуемой концентрации. Пример 1. Выделение и характеристика АВ78
Штамм Bacillus cereus AB78 выделяли в лабораторных условиях как контаминант на чашках в среде Т3 (на литр: 3 г триптона, 2 г триптозы, 1,5 г дрожжевого экстракта, 0,05М фосфат натрия (рН 6,8) и 0,005 г MnCl2; Travers R. S. , 1983). Во время фазы логарифмического роста штамм АБ78 проявлял выраженную активность в отношении блошки длинноусой западной. Была также подтверждена антибиотическая активность в отношении грамположительных Bacillus spp. (таблица 12). Морфологические характеристики штамма АВ78 были следующими. Вегетативные палочки прямые, 3,1-5,0 мм длиной и 0,5-2,0 мм шириной. Клетки с закругленными концами, одиночные, собранные в короткие цепочки. Из каждой клетки образуется одиночная субтерминальная, цилиндрически-овальная эндоспора. Параспоральный кристалл не образуется. Колонии непрозрачные, складчато-морщинистые, долевидные и плоские. Не продуцирует пигментов. Клетки подвижные. Имеются жгутики. Характеристики роста АВ78 были следующими. Факультативный анаэроб с оптимальной температурой для роста 21-30oС. Может расти при 15, 20, 25, 30 и 37oС. Не может расти при температуре свыше 40oС. Растет в среде с 5-7%-ным NaCl. В таблице 13 представлен биохимический профиль штамма АВ78. Пример 2. Бактериальная культура
Субкультуру штамма Bc AB78 использовали для инокуляции в среду, известную как ТВ-бульон следующего состава:
Триптон - 12 г/л
Дрожжевой экстракт - 24 г/л
Глицерин - 4 мл/л
КН2РO4 - 2,1 г/л
К2НРO4 - 14,7 г/л
РН 7,4
Фосфат калия добавляли к автоклавированному бульону после охлаждения. Колбы инкубировали при 30oС на роторном вибраторе при 250 об/мин в течение 24-36 часов, что соответствует началу средней логарифмической фазы. Вышеописанную методику легко можно адаптировать для применения в ферментаторах больших размеров с использованием способов, хорошо известных в данной области техники. В процессе вегетативного роста, обычно в течение 24-36 часов после начала культивирования, что соответствует началу средней логарифмической фазы, бактерии штамма АВ78 отделяли с помощью центрифугирования от супернатанта культуры. Супернатант культуры, содержащий активный протеин, использовали для определения биологической активности. Пример 3. Определение биологической активности в отношении насекомых
Активность штамма B.cereus AB78 в отношении различных насекомых исследовали по описанной ниже методике. В отношении блошки длинноусой западной, северной и южной (Diabrotica virgifera virgifera, D.longcornis barberi и D.undecempunctata howardi соответственно): из супернатанта культуры AB78, выращенной в течение 24-36 часов, готовили растворы, смешивали с искусственной питательной жидкой средой (Marrone и др. , (1985) J. of Economic Entomology, 78: 290-293) и давали возможность отвердеть. Отвердевшую среду нарезали и помещали в чашки. Новорожденных личинок помещали на питательную среду и выдерживали при 30oС. Учет гибели проводили через 6 дней. Определение биологической активности клона E.coli: Клетки E.coli выращивали в течение ночи при 37oС в бульоне, содержащем 100 мкг/мл ампициллина. 10 мл культуры обрабатывали ультразвуком трижды по 20 с каждый раз. Добавляли 500 мкл обработанной ультразвуком культуры к жидкой питательной среде для блошки длинноусой западной. В отношении колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata): из супернатанта культуры AB78, выращенной в течение 24-36 часов, готовили растворы в Тритоне Х-100 (до получения конечной концентрации 0,1% ТХ-100). Кусочки картофельного листа размером 5 см2 погружали в эти растворы, сушили на воздухе и помещали на увлажненную фильтровальную бумагу в пластиковые чашки. Новорожденных личинок помещали на кусочки листьев и выдерживали при 30oС. Учет гибели проводили через 3-5 дней. В отношении большого мучного хрущака (Tenebrio molitor): из супернатанта культуры АВ78, выращенной в течение 24-36 часов, готовили растворы, смешивали с жидкой искусственной питательной средой (фирма Bioserv F9240) и давали возможность отвердеть. Отвердевшую среду нарезали и помещали в пластиковые чашки. Новорожденных личинок помещали на питательную среду и выдерживалии при 30oС. Учет гибели проводили через 6-8 дней. В отношении кукурузного мотылька, совки ипсилон, коробочного червя хлопчатника, табачного бражника и совки малой (Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Heliothis virescens, Manduca sexta и Spodoptera exigua соответственно): из супернатанта культуры АБ78, выращенной в течение 24-36 часов, готовили растворы в ТХ-100 (до получения конечной концентрации 0,1% ТХ-100). С помощью пипетки наносили 100 мкл на поверхность площадью 18 см2 отвердевшей искусственной питательной среды (фирма Bioserv F9240) и давали возможность высохнуть на воздухе. Затем новорожденных гусениц помещали на поверхность питательной среды и выдерживали при 30oС. Учет гибели проводили через 3-6 дней. В отношении комара обыкновенного (Culex pipiens): из супернатанта культуры АВ78, выращенной в течение 24-36 часов, готовили растворы. С помощью пипетки 100 мкл в 10 мл воды вносили в пластиковую чашку объемом 30 мл. Личинок третьего возраста помещали на воду и выдерживали при комнатной температуре. Учет гибели проводили через 24-48 часов. Спектр энтомологической активности штамма АВ78 представлен в таблице 14. Подтверждено, что спектр инсектицидной активности впервые описанного штамма B.cereus AB78 существенно отличается от такового известных активных в отношении жесткокрылых
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196032/948.gif)
Среду для культивирования, лишенную клеток и дебриса, насыщали до 70%, добавляя твердый сульфат аммония (472 г/л). Растворение осуществляли при комнатной температуре с последующим охлаждением в ледяной бане и центрифугированием при 10000
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196025/8226.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196025/8226.gif)
Компонент с молекулярной массой 80 кДа, выделенный с помощью ДСН-ПААГ, переносили на PVDF-мембрану и подвергали аминоконцевому секвенированию с использованием повторных циклов Эдмана в импульсно-жидкостном секвенаторе типа ABI 470. Перенос осуществляли в 10 мМ CAPS-буфере с метанолом (10%), рН 11,0, следующим образом. Проводили инкубацию геля после электрофореза в транспортном буфере в течение пяти минут. Слегка смачивали 100%-ным МеОН первичную PVDF-мембрану для блоттинга типа ProBlott, затем уравновешивали в транспортном буфере. Создавали сэндвич между вспененной губкой и квадратиками из фильтровальной бумаги с конфигурацией катод-гель-мембрана-анод. Перенос осуществляли в течение 1 часа при постоянном напряжении 70 вольт. После переноса мембрану промывали водой и окрашивали в течение двух минут 0,25%-ным кумассином синим (Coomassie Blue R-250) в 50%-ном МеОН. Обесцвечивание осуществляли путем нескольких промывок смесью 50% МеОН, 40% воды и 10% уксусной кислоты. После обесцвечивания мембрану сушили на воздухе перед вырезанием полос для анализа последовательности. Для получения максимальной эффективности и выхода использовали блотт-картридж и соответствующие циклы. Для идентификации и количественной оценки производных РТН-аминокислот в каждом последовательном цикле анализ данных проводили с использованием модели 610 программного обеспечения для анализа последовательности. Было установлено, что N-концевая последовательность представляет собой NH2-Lys-Arg-Glu-Ile-Asp-Glu-Asp-Thr-Asp-Thr-Asx-Gly-Asp-Ser-Ile-Pro-(SEQ ID NO: 8), где Asx обозначает Asp или Asn. Полная аминокислотная последовательность для компонента с молекулярной массой 80 кДа представлена в последовательности SEQ ID NO: 7. Последовательность ДНК, которая кодирует SEQ ID NO: 7, представлена в последовательности SEQ ID NO: 8. Пример 6. Строение ДНК-зонда
Получали олигонуклеотидный зонд для области гена, кодирующей аминокислоты 3-9 N-концевой последовательности (пример 5). Зонд синтезировали на основе наиболее часто встречающегося кодона гена 6-эндотоксина Bacillus thuringensis (Bt). Нуклеотидную последовательность 5"-GAA ATT GAT CAA GAT ACN GAT-3" (SEQ ID NO: 9) использовали в качестве зонда в Саузерн-гибридизациях. Олигонуклеотид синтезировали с использованием стандартных способов и оборудования. Пример 7. Определение изоэлектрической точки протеина, активного в отношении блошек длинноусых
Очищенный протеин после пятой стадий процесса очистки анализировали на изоэлектрическом фокусирующем геле с рI 3-9, используя систему для электрофореза типа Phastgel (фирма Pharmacia). Процесс разделения, равно как и процесс окрашивания серебром, осуществляли с использованием стандартных для этого устройства методов. Значение рI составило приблизительно 4,9. Пример 8. Данные о АВ78, полученные на основе ПЦР
Для подтверждения того, что штамм B.cereus AB78 не содержал любых генов инсектицидного кристаллического протеина B.thuringiensis или B.sphaericus, применяли ПЦР-анализ (см., например, заявку на патент США 08/008006; и Carozzi и др., (1991) Appl. Environ. Microbiol. 57 (11): 3057-3061, включенные в настоящее описание в качестве ссылок) (таблица 17). Пример 9. Космидное клонирование обшей ДНК из штамма B.cereus AB78 Ген VIP1A(a) клонировали из общей ДНК, полученной из штамма AB78, следующим образом. Выделение ДНК штамма AB78 осуществляют следующим образом. 1. Выращивают бактерии в 10 мл L-бульона в течение ночи (применяют стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл). 2. Добавляют 25 мл свежего L-бульона и ампициллин (30 мкг/мл). 3. Выращивают клетки при встряхивании в течение 2-6 часов при 30oС. 4. Вращают клетки в полипропиленовой пробирке с оранжевой крышкой объемом 50 мл в клинической центрифуге с верхним расположением пробирок типа IEC при 3/4 скорости. 5. Ресуспендуют клеточный дебрис в 10 мл TES (TES = 50 мМ Трис, рН 8,0, 100 мМ ЭДТК, 15 мМ NaCl). 6. Добавляют 30 мг лизоцима и инкубируют в течение 2 ч при 37oС. 7. Добаляют 200 мкл 20%-ного ДСП и 400 мкл маточного раствора протеиназы К (20 мг/мл). Инкубируют при 37oС. 8. Добавляют 200 мкл свежей протеиназы К. Инкубируют 1 час при 55oС. Добавляют 5 мл TES до получения 15 мл конечного объема. 9. Дважды экстрагируют фенолом (10 мл фенола, центрифугируют при комнатной температуре при 3/4 скорости в клинической центрифуге с верхним расположением пробирок типа IEC). Переносят супернатант (верхнюю фазу) в чистую пробирку, используя пипетку с широким отверстием. 10. Экстрагируют один раз смесью 1: 1 (объем/объем) фенол: хлороформ/изоамиловый спирт (соотношение 24:1). 11. Осаждают ДНК равным объемом холодного изопропанола; центрифугируют до получения в пробирке для центрифугирования осадка ДНК. 12. Ресуспендируют полученный в пробирке для центрифугирования осадок в 5 мл ТЕ. 13. Осаждают ДНК с помощью 0,5 мл 3М NaOAc, pH 5,2, и 11 мл 95%-ного этанола. Выдерживают в течение 2 часов при -20oС. 14. Извлекают ДНК из пробирки с помощью пластиковой петельки, переносят в микроцентрифужную пробирку, вращают, отбирают пипеткой избыток этанола, сушат в вакууме. 15. Ресуспендируют в 0,5 мл ТЕ. Инкубируют 90 минут при 65oС для облегчения возвращения ДНК в раствор. 16. Определяют концентрацию, используя стандартные методы. Космидное клонирование АБ78
Все процедуры, если не указано иное, выполняли в соответствии с Stratagene Protocol, Supercos 1 Instruction Manual, Cat. 251301. Обычно используют следующие стадии:
А. Частичное разложение ДНК АВ78 рестриктазой SAU ЗА. Б. Получение ДНК-вектора. В. Лигирование и упаковка ДНК. Г. Формирование космидной библиотеки. 1. Начинают разведение культуры клеток НВ101 путем посева 50 мл выдержанной в течение ночи культуры в 5 мл ТВ с 0,2%-ной мальтозой. Икубируют в течение 3,5 ч при 37oС. 2. Центрифугируют клетки и ресуспендируют в 0,5 мл 10 мМ MgSO4. 3. Объединяют вместе:
100 л клеток
100 л растворенной упаковочной смеси
100 л 10 мМ MgSO4
30 л ТВ
4. Адсорбируют при комнатной температуре в течение 30 минут без встряхивания. 5. Добавляют 1 мл ТВ и осторожно смешивают. Инкубируют в течение 30 минут при 37oС. 6. Высевают 200 л на L-amp-чашки. Инкубируют в течение ночи при 37oС. Случайным образом отбирали по крайней мере 400 космидных клонов и подвергали скринингу на активность в отношении блошки длинноусой западной, как описано в примере 3. ДНК из 5 активных клонов и 5 неактивных клонов использовали в Саузерн-гибридизациях. Результаты показали, что гибридизация с использованием вышеописанного олигонуклеотидного зонда коррелировала с активностью в отношении блошки длинноусой западной (таблица 18). Космидные клоны Р3-12 и Р5-4 были помещены в Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL) и получили регистрационные номера NRRL В-21061 и NRRL В-21059 соответственно. Пример 10. Выявление области длиной 6 т.п.н. активной в отношении блошки длинноусой западной
ДНК из космидного клона Р3-12 частично расщепляли с помощью рестриктазы Sau3A и лигировали с вектором pUC19 E.coli, а затем трансформировали в E. coli. ДНК-зонд, специфичный в отношении протеина VIP1A(a) с молекулярной массой 80 кДа, синтезировали с помощью ПЦР-амплификации части ДНК клона Р3-12. Олигонуклеотиды МК113 и МК117, которые гибридизуются с частями VIP-lA(a), синтезировали с использованием неполной аминокислотной последовательности протеина с молекулярной массой 80 кДа. Субклоны плазмиды идентифицировали с помощью гибридизации колоний с зондом, полученным в результате ПЦР, и исследовали биологическую активность в отношении блошки длинноусой западной. Один из этих клонов, а именно PL2, гибридизовался с фрагментом, образованным в результате ПЦР, и обладал активностью в отношении блошки длинноусой западной в исследовании, проведенном по описанной выше методике. Фрагмент длиной 6 т.п.н., полученный из PL2 с помощью рестриктазы ClaI, клонировали в сайте SmaI бифункционального вектора рНТ 3101 E.coli-Bacillus (Lereclus D. и др., 1989, FEMS Microbiology Letters, 60: 211-218), получая pCIB6201. Эта конструкция в любой ориентации придает активность в отношении блошки длинноусой западной как штаммам Bacillus, так и штаммам E.coli. pCIB6022 содержит тот же самый ClaI-фрагмент длиной 6 т.п.н. в pBluescript SK(+) (фирма Stratagene), образует протеин, эквивалентный VIP-1А(а) (как подтверждено методом Вестерн-блоттинга), а также обладает активностью в отношении блошки длинноусой западной. Нуклеотидную последовательность рС1Р6022 определеляли с помощью метода дидезокси-терминации Sanger и др., Ргос. Natl. Acad. ScL, USA, 74: 5463-5467 (1977), с использованием наборов PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kits и набора PRISM Sequenase
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196047/174.gif)
Для подтверждения того, что открытая рамка считывания (ОРС) гена VIP1A(a) необходима для проявления инсектицидной активности, в гене создавали трансляционнную мутацию "сдвига рамки". Рестриктаза Bg1II распознает уникальный сайт, локализованный в кодирующей области VIP1A(a) длиной 857 пар оснований. рСIВ6201 расщепляли с помощью BglII и одноцепочечные концы заполняли с помощью ДНК-полимеразы (фрагмент Кленова) и дНТФ. Плазмиду повторно дотировали и трансформировали в Е.соli. Образовавшаяся плазмида рСIВ6203 содержит четыре нуклеотидные инсерпии в области, кодирующей VIP1A(a). pCIB6203 не обладает инсектицидной активностью в отношении БДЗ, что подтверждает то, что VIP1A(a) является основным компонентом, обусловливающим активность в отношении блошки длинноусой западной. Для дальнейшего определения области, необходимой для кодирования VIP1A(a), конструировали области субклонов VIP1A(a) и VIP2A(a) (вспомогательный протеин) и определяли их способность к комплементации мутации в pCIB6203. pCIB6203 содержит фрагмент XbaI-EcoRV длиной 3,7 т.п.н. в pBluescript SK(+) (фирма Stratagene). Вестерн-блоттинг показал, что рСIВ6023 продуцирует протеин VIP1A(a) такого же размера и в таком же количестве, что и клоны PL2 и рСIВ6022. рСIВ6023 содержал полный ген, кодирующий протеин 80 кДа. рСIВ6023 депонировали в Agricultural Research Service, Patent Culture Collection, (NRRL), Nothern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, под регистрационным номером NRRL B-21223N. pCIB6206 содержал XbaI-ClaI-фрагмент длиной 4,3 т.п.н. из рСIВ6022 в pBluescript SK(+) (фирма Stratagene). pCIB6206 депонировали в Agricultural Research Service, Patent Culture Collection, (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, под регистрационным номером NRRL B-21321. pCIB6023, pCIB6206 и рСIВ6203 не проявляли выраженной активности в отношении блошки длинноусой западной, когда их исследовали по отдельности. Однако смесь клеток, содержащих pCIB6203 (VIP1A(a) -мутированный плюс VIP2A(a)), и клеток, содержащих pCIB6023 (только VIP1A(a)), проявляла высокую активность в отношении блошки длинноусой западной. Аналогично этому смесь клеток, содержащих pCIB6206, и клеток, содержащих pCIB6203, проявляла высокую активность в отношении блошки длинноусой западной. Для дальнейшего определения пределов активности VIP2A(a) конструировали рСIВ6024, которая полностью содержит VIP2A(a), но лишена большей части кодирующей области VIP1A(a). pCIB6024 конструировали путем гель-фильтрации рестрикционного ClaI- SeaI-фрагмента длиной 2,2 т.п.н. из рСIВ6022, заполняя одноцепочечные концы с помощью ДНК-полимеразы (фрагмент Кленова) и дНТФ, и лигирования этого фрагмента с вектором pBluescript SK(+) (фирма Stratagene), расщепленного ферментом EcoRV. Клетки, содержащие pCIB6024, не проявляли активности в отношении блошки длинноусой западной. Однако смесь клеток, содержащих pCIB6024, и клеток, содержащих pCIB6023, проявляла высокую активность в отношении блошки длинноусой западной (см. таблицу 19). Таким образом, pCIB6023 и pCIB6206 должны продуцировать функционально активный продукт гена VIP1A(a), в то время как pCIB6203 и pCIB6024 должны продуцировать функционирующий продукт гена VIP2A(a). Эти результаты позволяют предположить, что для получения максимальной активности в отношении блошки длинноусой западной необходим(ы) продукт(ы) гена из области VIP2A(a) в сочетании с VIP1A(a) (см. таблицу 19). Прямоугольные области обозначают протяженность VIP1A(a) и VIP2A(a). Светлый прямоугольник обозначает часть VIP1, кодирующую протеин 80 кДа, обнаруженный у Bacillus. Темный прямоугольник обозначает N-концевой пропептид VIP1A(a), предсказанный на основе анализа последовательности ДНК. Помеченный пунктиром прямоугольник обозначает кодирующую область VIP2A(a). Большая буква "X" обозначает местоположение интродуцированной в VIP1A(a) мутации "сдвига рамки считывания". Стрелки показывают конструкции, транскрибируемые промотором бета-галактозидазы. Пример 12. Образование антител против АВ78
Вызывали образование антител у двух крыс линии Lewis, давая обеим возможность двигаться, с последующим использованием этих клеток для образования линии клеток гибридомы, а также для образования достаточного количества сыворотки для ограниченного скрининга библиотеки геномной ДНК. Другим фактором было очень ограниченное количество доступного антигена, а также тот факт, что он мог быть получен только путем очистки с помощью электрофореза в ПААГ и последующего электроблоттинга на нитроцеллюлозе. Вследствие ограниченной доступности антигена на нитроцеллюлозе последнюю эмульгировали в ДМСО и инъецировали в подушечки на лапках задних ног животных с той целью, чтобы вызвать продуцирование В-клеток в вышележащих подколенных лимфатических узлах. Из первой порции крови получали сыворотку, обладающую сильной реакцией, что было подтверждено с помощью Вестерн-блоттинга. Последующие несколько инъекций и кровопусканий позволили получить достаточное количество сыворотки, чтобы осуществить весь требуемый скрининг. Затем, используя одну из крыс, создавали гибридомы. Подколенные лимфатические узлы вырезали, измельчали и полученные клетки сливали с мышиной миеломой P3
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196025/8226.gif)
После электроблоттинга на нитроцеллюлозу образцов АВ78, прошедших электрофорез в ПААГ, используют способный к реверсии штамм Ponceau S для визуализации всех перенесенных протеинов. Определяли полосу, соответствующую ранее идентифицированному и прошедшему N-концевое секвенирование токсину АВ78, и вырезали из нитроцеллюлозы. Каждая полоса имеет размер примерно 1
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196025/8226.gif)
1. Наносят покрытие из АВ78/ДМСО в ЗБФР. Инкубируют в течение ночи при 4oС. 2. Трижды промывают планшет однократным буфером для промывки ELISA. 3. Блокируют (1% БСА и 0,05%-ный Твин 20 в ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор)) в течение 30 минут при комнатной температуре. 4. Трижды промывают планшет однократным буфером для промывки ELISA. 5. Добавляют крысиную сыворотку. Инкубируют в течение 1,5 ч при 37oС. 6. Трижды промывают планшет однократным буфером для промывки ELISA. 7. Добавляют козлиное антикрысиное антитело в концентрации 2 мкг/мл в растворителе ELISA. Инкубируют 1 час при 37oС. 8. Трижды промывают планшет однократным буфером для промывки ELISA. 9. Добавляют кроличью антикозлиную щелочную фосфатазу в концентрации 2 мкг/мл в растворителе ELISA. Инкубируют 1 час при 37oС. 10. Трижды промывают планшет однократным буфером для промывки ELISA. 11. Добавляют субстрат. Инкубируют 30 минут при комнатной температур
12. Прекращают процесс с помощью 3Н NaOH через 30 минут. Получение антисыворотки против VIР2А(а)
Частично очищенный супернатант культуры штамма АВ78 разделяли с помощью непродолжительного электрофореза в ДСН-ПААГ (фирма Novex), следуя инструкциям производителя. Разделенные протеины подвергали электрофорезу на нитроцеллюлозе (S& S 21640), как описано у Towbin и др. (1979). Нитроцеллюлозу окрашивали с помощью Ponceau S и выявляли полосу соответствующую VIP2A(a). Полосу VIP2A(a) вырезали и эмульгировали в ДМСО непосредственно перед инъекцией. Первоначально кролика иммунизировали эмульгированным VIP2A(a), смешанным в соотношении приблизительно 1:1 с полным адъювантом Фрейнда, путем внутримышечной инъекции в четыре разных места. Последующие иммунизации проводили с четырехнедельными интервалами, и они были идентичны первой, за исключением того, что использовали неполный адъювант Фрейнда. Первую сыворотку собирали после иммунизации, вызывающей ответную реакцию на протеин VIP2A(a). Анализ на основе Вестрен-блоттинга супернатанта культурь АВ78 с использованием этой антисыворотки показал наличие протеина VIP2A(a), имеющего в основном полную длину. Пример 13. Усиление инсектицидной активности неактивных штаммов Bt с помощью клонов VIP AB78
Добавление рСIВ6203 вместе с супернатантом 24-часовой культуры (начало средней логарифмической фазы) из штамма Bt GC91 вызывает 100%-ную гибель Diabrotica virgifera virgifera. Ни рСIВ6203, ни GC91 по отдельности не проявляют активности в отношении Diabrotica virgifera virgifera. Полученные результаты представлены ниже. Исследуемый материал - Процент гибели Diabrotica
рСIВ6203 - 0
GC91 - 16
рСIВ6203 + GC91 - 100
Контроль - 0
Пример 14. Выделение и биологическая активность штамма B.cereus AB81 Второй штамм B.cereus, обозначенный как AB81, выделяли из образцов элеваторной зерновой пыли с помощью стандартных методик. Субкультуру AB81 выращивали и готовили к определению биологической активности, как описано в примере 2. Биологическую активность оценивали по описанной в примере 3 методике. Были получены следующие результаты. Виды исследуемых насекомых - Процент гибели
Ostrinia nubilalis - 0
Agrotis ipsilon - 0
Diabrotica virgifera virgifera - 55
Пример 15. Выделение и биологическая активность штамма B.thuringiensis АВ6
Штамм B. thuringiensis, обозначенный как АВ6, выделяли из образцов элеваторной зерновой пыли стандартными методами, известными в данной области техники. Субкультуру АВ6 выращивали и готовили к определению биологической активности, как описано в примере 2. Половину образца автоклавировали в течение 15 минут с той целью, чтобы установить присутствие
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196059/946.gif)
Ostrinia nubilalis - 0
Agrotis ipsilon - 100
Agrotis ipsilon (автоклавированный образец) - 0
Diabrotica virgifera virgifera - 0
Снижение инсектицидной активности супернатанта культуры при автоклавировании до незначительных уровней свидетельствует о том, что активный ингредиент не является
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196059/946.gif)
Штамм Bt, обозначенный как AB88, выделяли из образцов элеваторной зерновой пыли с помощью стандартных методов. Субкультуру AB88 выращивали и готовили для исследования биологической активности, как описано в примере 2. Половину образца автоклавировали в течение 15 минут с той целью, чтобы установить присутствие
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196059/946.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196059/946.gif)
Бактериальную жидкую культуру выращивали в течение ночи (12 ч) при 30oС в ТВ-среде. Клетки центрифугировали при 5000
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196025/8226.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196025/8226.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196025/8226.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196032/948.gif)
анионобменная фракция 23 (меньшая): xEPFVSAxxxQxx (SEQ ID NO: 10)
анионобменная фракция 28 (большая): xEYENVEPFVSAx (SEQ ID NO: 11)
Когда активный в отношении KM осадок в пробирке после центрифугирования с рН 4,5 далее разделяли с помощью анионнообменной хроматографии на колонке типа Poros-Q, активность была обнаружена только во фракциях с основной полосой ~60 кДа. Активный в отношении совки-ипсилон протеин также сохранился в осадке в пробирке после центрифугирования, когда рН диализата АБ88 снижали до 4,5. При препаративном ИЭФ с использованием амфотерных электролитов с рН 3-10 активность не была обнаружена в КМ-активных фракциях ИЭФ; вместо этого она оказалась наиболее высокой во фракции с рН 4,5-5,0. Ее основные компоненты имеют молекулярные массы ~35 и ~80 кДа. Осадок в пробирке после центрифугирования с рН 4,5 отделяли с помощью анионобменной ЖХВР с целью получения фракций, содержащих только продукт с молекулярной массой 35 кДа, и фракций, содержащих полосы как 35 кДа, так и 80 кДа. Пример 18. Характеристика VIP штамма АВ88
Фракции, содержащие вегетативные протеины, активные в отношении различных чешуекрылых, готовили по описанной в примере 17 методике. Фракции с инсектицидной активностью разделяли с помощью электрофореза в 8-16%-ных ДСН-полиакрилаидных гелях и переносили на PVDF-мембраны [LeGendre и др., (1989) A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing, ред. Matsudaria P.T. (Academic Press Inc., New York)]. Биологический анализ фракций показал, что различные VIP ответственны за активность в отношении разных видов чешуекрылых. Активность в отношении Agrotis ipsilon определяется протеином 80 кДа и/или 35 кДа, взятых либо по отдельности, либо в комбинации. Эти протеины не похожи на любые
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196032/948.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196032/948.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196032/948.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196032/948.gif)
Штамм В.thuringiensis, обозначенный как AB424, выделяли из образца покрытой мхом сосновой шишки стандартными методами, известными в данной области техники. Субкультуру AB424 выращивали и готовили к определению биологической активности, как описано в примере 2. Биологическую активность оценивали по описанной в примере 3 методике. Были получены следующие результаты. Исследованные виды насекомых - Процент гибели
Ostrinia nubilalis - 100
Agrotis ipsilon - 100
Diabrotica virgifera virgifera - 0
Штамм AB424 был депонирован в Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, под регистрационным номером NRRL B-21439. Пример 18Б. Клонирование генов VIР3А(а) и VIP3A(b). которые кодируют протеины, активные в отношении совки ипсилон
Общую ДНК из изолятов АВ88 и AB424 выделяли [Ausubel и др., (1988) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY)] и расщепляли рестиктазами XbaI [библиотека ДНК разделенных на фракции по размерам от 4,0 до 5,0 т. п. н. XbаI-фрагментов штамма В. thuringiensis AB88] и EcoRI [библиотека ДНК разделенных на фракции по размерам от 4,5 до 6,0 т.п.н. EcoRI-фрагментов штамма В. thuringiensis AB424] соответственно и лигировали с предварительно линеаризированным этими же ферментами и дефосфорилированным вектором pBluescript, а затем трансформировали в штамм Е.coli DH5
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196009/945.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196025/8226.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196025/8226.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196025/8226.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196047/174.gif)
С использованием Вестрен-блоттинга анализировали зависимость экспрессии инсектицидного протеина VIP3A(a) от времени. Были взяты образцы из культур В. thuringiensis AB88 в процессе их роста и споруляции. Инсектицидный протеин VIP3A (а) может быть обнаружен в супернатантах культур AB88 во время фазы логарифмического роста, а именно через 15 ч после начала культивирования. Он достигал своего максимального уровня в начале стационарной фазы и сохранялся на высоких уровнях во время и после споруляции. Аналогичные результаты получали при использовании супернатантов культур Bacillus cereus AB424. Уровни инсектицидного протеина VIP3A(a) отражали экспрессию гена VIP3A(a), как это было установлено с помощью Назерн-блоттинга. Начало споруляции определяли с помощью непосредственных микроскопических исследований и путем анализа присутствия
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196032/948.gif)
Для выявления Bacillus, содержащих гены, родственные VIP3A(a) из изолята АВ88, коллекцию изолятов Bacillus подвергали скринингу путем гибридизации. Культуры 463 штаммов Bacillus выращивали в лунках микротитровальных планшетов до споруляции. Для переноса культур на чашки диаметром 150 мм, содержащей L-агар, использовали приспособление для нанесения колоний с 96 наконечниками. Инокулированные чашки выдерживали при 30oС в течение 10 часов, а затем при 4oС в течение ночи. Колонии блоттировали на найлоновые фильтры и зондировали HindIII-фрагментом длиной 1,2 т.п.н., имеющим происхождение из VIP3A(a). Гибридизацию осуществляли в течение ночи при 62oС, используя условия гибридизации, предложенные Maniatis и др. в Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982). Фильтры промывали с помощью 2
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196025/8226.gif)
Путем гибридизации колоний по описанной в примере 18В методике было установлено, что штамм В. thuringiensis, обозначенный как M2194, содержит VIР3-подобный(ые) ген(ы). VIР3-подобный ген штамма M2194 считают критическим, поскольку его экспрессия не может быть обнаружена во время фаз бактериального роста ни с помощью метода иммунноблоттинга с использованием поликлональных антител против протеина VIP3A(a), выделенного из АВ88, ни с помощью биологического анализа, как описано в примере 3. Получали кроличью антисыворотку против очищенного инсектицидного протеина VIP3A(a). Протеин, связанный с нитроцеллюлозой (50 мкг), растворяли в ДМСО и эмульгировали с помощью полного адъюванта Фрейнда (фирма Difco). Двум кроликам каждый месяц делали подкожные инъекции в течение трех месяцев. У них брали кровь через 10 дней после второй и третьей инъекций и получали сыворотку из образца крови [Harlow и др. (1988) в Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY)]. VIР3-подобный ген штамма М2194 клонировали в pKS, следуя протоколу, описанному в примере 9, создавая таким образом pCIB7108. E.coli, содержащая рСIВ7108, которая включает ген VIP3 из штамма М2194, обладает активностью в отношении совки ипсилон, что свидетельствует о том, что ген кодирует функционально активный протеин, обладающий инсектицидной активностью. Плазмида pCIB7108 была депонирована в Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL) под регистрационным номером NRRL B-21438. Пример 18Е. Инсектицидная активность протеинов VIP3A
Спектр активности инсектицидных протеинов VIP3A оценивали качественно в биологических опытах, в которых рекомбинатный штамм E.coli, несущий гены VIP*А, включали в пищу личинок. В этих опытах клетки, несущие гены VIP3A(a) и VIP3A(b), проявили инсектицидную активность в отношении Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Heliothis virescens и Helicoverpa zea. В аналогичных экспериментальных условиях бактериальные экстракты, содержащие протеины VIP3A, не проявили активности в отношении Ostrinia nubilalis. (см. табл. VI и VII). Пример 19. Выделение и биологическая активность других Bacillus spp. Были выделены другие виды Bacillus, которые продуцируют во время вегетативного роста протеины, обладающие инсектицидной активностью. Эти штаммы выделяли из образцов, взятых из окружающей среды, с помощью стандартных методов. Изоляты готовили для определения биологической активности и оценивали, как описано в примерах 2 и 3 соответственно. Изоляты, которые продуцировали инсектицидные протеины во время вегетативного роста, обладающие активностью в отношении Agrotis ipsilon в опытах по определению биологической активности, представлены в табл. VIII. Не обнаружено корреляции между наличием кристаллов
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196032/948.gif)
Для выявления штаммов, содержащих гены, родственные тем, которые были обнаружены в области VIP1A(a)/VIP2A(a) штамма АВ78, коллекцию штаммов Bacillus подвергали скринингу путем гибридизации. Независимые культуры 463 штаммов Bacillus выращивали в лунках 96-луночных микротитровальных планшетов (всего использовали пять планшетов) до споруляпии культуры. Из всех изученных штаммов 288 были классифицированы как Bacillus thuringiensis, a 175 были классифицированы как другие виды Bacillus на основе наличия или отсутствия кристаллов
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196032/948.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196025/8226.gif)
Несколько ранее охарактеризованных штаммов Bacillus исследовали методом Саузерн-блоттинга на наличие ДНК, сходной с VIP1A(a)/VIP2A(a). ДНК из штаммов Bacillus AB78, АВ88, GC91, HD-1 и АТСС 10876 анализировали на присутствие VIP1A(a)/VIP2A(а)-подобных последовательностей. ДНК из штаммов Bt GC91 и HD-1 и штамма Вс АТСС 10876 не гибридизуются с ДНК VIP2A(a)/VIP1A(a), что свидетельствует о том, что они лишены последовательностей ДНК, аналогичных генам VIP1A(a)/VIP2A(a). Аналогично этому ДНК из инсектидного штамма АВ88 (пример 16) не гибридизовалась с VIP1A(a)/VIP2A(а)-областью ДНК, позволяя предположить, что активность VIP, продуцируемого этим штаммом, не является результатом гомологии с VIP1A(a)/VIP2A(a). В противоположность этому Bacillus thuringiensis var. tenebrionis (Btt) содержал последовательности, которые гибридизовались с VIP1A(a)/VIP2A(а)-областью. Дальнейший анализ подтвердил, что Btt содержит VIP1A(а)/VIP2A(а)-подобные последовательности. С целью охарактеризовать в штамме Btt гомологи VIP2A(a) и VIP1A(а) клонировали гены, кодирующие эти протеины. Анализ методом Саузерн-блоттинга показал, что фрагмент длиной 9,5 т.п.н., полученный с помощью обработки рестриктазой EcoRI, вероятно содержит области, кодирующие гомологи. Геномную ДНК ращепляли EcoRI и с помощью гель-фильтрации очищали фрагменты длиной приблизительно 9,5 т.п.н. Эту ДНК лигировали с вектором pBluescript SK(+), расщепленным рестриктазой EcoRI, и трансформировали в Е.coli с той целью, чтобы создать плазмидную библиотеку. Приблизительно 10000 колоний подвергали скринингу путем гибридизации колоний на наличие последовательностей, гомологичных VIP2A(а). Были выявлены 28 позитивных колоний. Все 28 колоний являются идентичными и содержат гомологи VIP1A(a)/VIP2A(a). Клон рСIВ7100 был депонирован в Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria Illinois 61604, USA, под регистрационным номером NRRL B-21322. Из рСIВ7100 конструировали несколько субклонов. XbaI-фрагмент из рСIВ7100 длиной 3,8 т.п. н. клонировали в pBluescript SK(+), получая рСIВ7101. HindIII-фрагмент длиной 1,8 т.п.н. и HindIII-фрагмент длиной 1,4 т.п.н. из рСIВ7100 клонировали в pBluescript SK(+), получая рСIВ7102 и рСIВ7103 соответственно. Субклоны рСIВ7101, рСIВ7102 и рСIВ7103 были депонированы в Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria Illinois 61604, USA, под регистрацинным номерами В-21323, В-2134 и В-2135 соответственно. Последовательность ДНК из области рСIВ7100, содержащей гомологи VIP2A(a)/VIP1A(a), определяли с помощью метода терминации дидезокси-цепи (Sanger и др. , Proc. Natl. Acad. ScL, USA, 74:5463-5467 (1977)). Реакции проводили с использованием наборов PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kits и набора PRISM Sequenase
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196047/174.gif)
Протеины VIP могут встречаться в природе в виде отдельных полипептидов или в виде двух или нескольких взаимодействующих полипептидов. Когда активный VIP состоит из двух или нескольких цепей взаимодействующих протеинов, то эти цепи протеина могут быть получены в виде отдельной полипептидной цепи из гена, образовавшегося в результате слияния двух или нескольких кодирующих областей VIP. Гены, кодирующие две цепи, сливают, соединяя кодирующие области генов с той целью, чтобы получить отдельную открытую рамку считывания, кодирующую оба полипептида VIP. Сложные полипептиды могут быть слиты для того, чтобы получить меньший по размеру полипептид в виде NH2-концевого слитого протеина, или они могут быть слиты для того, чтобы получить более крупные полипептиды в виде NН2-концевого слитого протеина. Между этими двумя полипептидными доменами необязательно может быть использована линкерная область. Такие линкеры хорошо известны в данной области техники. Такой линкер необязательно может быть сконструирован таким образом, чтобы он содержал сайты протеазного расщепления, так что, когда отдельный слитый полипептид переваривается насекомым-мишенью, он расщепляется в линкерной области, высвобождая два полипептидных компонента молекулы активного VIP. VIP1A(a) и VIP2A(a) из штамма B.cereus AB78 гибридизируют с целью создать отдельный полипептид, сливая их кодирующие области. Образовавшаяся ДНК содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, которая кодирует протеин, представленный в SEQ ID NO: 23. Аналогичным образом могут быть получены другие слитые протеины. Слияние генов, кодирующих VIP1A(a) и VIP2A(a), осуществляют с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Подлежащие делеции нуклеотиды между кодирующими областями VIP1A(a) и VIP2A(a) удаляют, используя известные методы мутагенеза, или в другом варианте кодирующие области сливают, используя методы ПЦР. Слитые полипептиды VIP могут быть экспрессированы в других организмах с использованием синтетического гена или частично синтетического гена, оптимизированного для экспрессии в альтернативном хозяине. Например, для экспрессии слитого указанного выше полипептида VIP в кукурузе создают синтетический ген, используя для каждой аминокислоты предпочтительные для кукурузы кодоны, см. , например, европейскую заявку ЕР-А 0618976, включенную в настоящее описание в качестве ссылки. Синететические последовательности ДНК, созданные этими методами, представлены в SEQ ID NO: 17 (оптимизированная для кукурузы версия кодирующей последовательности VIP1A(a) с молекулярной массой 100 кДа), в SEQ ID NO: 18 (оптимизированная для кукурузы версия кодирующей последовательности VIP1A(a) с молекулярной массой 80 кДа) и в SEQ ID NO: 24 (оптимизированная для кукурузы версия кодирующей последовательности VIP2A(a)). Синтетические гены VIP1 или VIP2, оптимизированные для экспрессии в кукурузе, могут быть слиты с использованием методов ПЦР или же могут быть созданы синтетические гены для слияния в определенном сайте рестрикции. Альтернативно этому может быть создан синтетический слитый ген с той целью, чтобы кодировать отдельный полипептид, содержащий домены как VIP1, так и VIP2. Добавление пептидного линкера между доменами VIP1 и VIP2 слитого протеина может быть осуществлено с помощью ПЦР-мутагенеза, с помощью синтетической линкерной ДНК, кодирующей линкерный полипептид, или с помощью других методов, известных в данной области техники. Слитые полипептиды VIP могут состоять из одного или нескольких связывающих доменов. Если при слиянии используют более одного связывающего домена, то, применяя такой гибрид, можно бороться со многими вредителями-мишенями. Другие связывающие домены могут быть получены с использованием всех либо части других VIP; эндотоксинов Bacillus thuringiensis либо их части; или других протеинов, способных связываться с вредителем-мишенью, либо соответствующих связывающих доменов, имеющих происхождение из таких связывающих протеинов. Одним из примеров гибридной конструкции, содержащей оптимизированную для кукурузы последовательность ДНК, кодирующую гибридную отдельную полипептидную цепь, имеющую VIP2A(a) на N-конце и VIP1A(a) на С-конце, является рСIВ5531. Последовательность ДНК, кодирующую линкер, имеющий пептидную последовательность PSTPPTPSPSTPPTPS (SEQ ID NO:47), встраивали между двумя кодирующими областями. Последовательность, кодирующая этот линкер и соответствующие сайты клонирования, представляет собой 5"-CCC GGG CCT TCT ACT CCC ССА ACT CCC TCT CCT AGC ACG ССТ CCG АСА CCT AGC GAT АТС GGA ТСС-3" (SEQ ID NO: 48). Синтезировали олигонуклеотиды, представляющие собой верхнюю и нижнюю нити, и клонировали в векторе pUC после гибридизации и фосфорилирования с использованием стандартных методов. Терминирующий кодон в VIP2A(a) удаляли с использованием ПЦР и замещали на сайт SmaI с помощью сайта рестрикции BglII. Трансляционное слияние осуществляли путем лигирования фрагмента BamHI/PstI гена VIP2A(a) из рСIВ5522 (см. пример 24), ПЦР-фрагмента, содержащего Pstl-концевой фрагмент гена VIP2A(a) (идентичный таковому, примененному при конструировании рСIВ5522), синтетического линкера, имеющего концы, которые могут быть слиты с дефосфорилированным сайтом на 5"-конце и с BamHI на 3"-конце, и модифицированного синтетического гена VIP1A(a) из описанной ниже рСIВ5526 (см. SEQ ID NO: 35). Гибрид получали с помощью лигирования четырех компонентов, что приводит к образованию плазмиды, содержащей ген VIP2A(a) без кодона терминации трансляции с линкером и кодирующую область VIP1A(a) без сигнала секреции Bacillus. Последовательность ДНК этой конструкции, представленная в SEQ ID NO: 49, кодирует слитый протеин, представленный в SEQ ID NO: 50. Отдельный полипептидный гибрид, в котором VIP1A(a) представляет собой N-конец, a VIP2A(a) представляет собой С-конец, может быть создана аналогичным образом. Кроме того, либо один, либо оба гена могут быть связаны в трансляционном гибриде, содержащем или не содержащем линкер, либо на 5"-, либо на 3"-конце с другими молекулами типа генов, кодирующих токсины, или репортерных генов. Пример 23. Обеспечение доставки VIP2 в органеллы растений
Известно, что в растениях имеются различные механизмы доставки генных продуктов, а последовательности, контролирующие функции этих механизмов, охарактеризованы в некоторых деталях. Например, обеспечение доставки генных продуктов в хлоропласт контролируется сигнальной последовательностью, обнаруженной на конце с аминогруппой различных протеинов. Этот сигнал отщепляется в процессе импорта в хлоропласт, давая зрелый протеин (см., например, у Comai и др. , J. Biol. Chem. 263: 15104-15109 (1988)). Эти сигнальные последовательности могут быть слиты с продуктами гетерологичных генов, таких как VIP2, для осуществления импорта этих продуктов в хлоропласт (van den Broeck и др. Nature 313: 358-363 (1985)). ДНК, кодирующая соответствующие сигнальные последовательности, может быть выделена из 5"-конца кДНК, кодирующих протеин RUBISCO, протеин CAB, фермент EPSP-синтазу, протеин GS2 и многие другие протеины, которые, как известно, локализованы в хлоропласте. Другие генные продукты локализованы в других органеллах, таких как митохондрия и пероксисома (см., например, у Unger и др.. Plant Molec. Biol. 13: 411-418 (1989)). кДНК, кодирующие эти продукты, могут также быть подвергнуты обработке, чтобы обеспечивать эффективные доставки продуктов гетерологичных генов, таких как VIP2, в эти органеллы. Примерами таких последовательностей являются кодируемые в ядре АТФазы и специфичные в отношении митохондрий изоформы аспартатаминотрансферазы. Аналогично этому обеспечение доставки к клеточным протеиновым тельцам описано у Rogers и др. (Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 82:6512-6516 (1985)). Путем слияния соответствующих обеспечивающих доставку последовательностей, описанных выше, с представляющими интерес кодирующими последовательностями, такими как VIP2, трансгенный продукт можно направлять к любой органелле или компартменту клетки. Для обеспечения доставки в хлоропласт, например сигнальную последовательность хлоропласта из гена RUBISCO, гена CAB, гена EPSP-синтазы или гена GS2 сливают в рамке считывания с аминоконцевым кодоном ATG трансгена. Выбранная сигнальная последовательность должна включать известный сайт расщепления, а при конструировании гибрида следует принимать во внимание любые аминокислоты, расположенные после сайта расщепления, которые необходимо отщепить. В некоторых случаях это требование может быть реализовано путем добавления небольшого количества аминокислот между сайтом расщепления и инициирующим кодоном ATG или в альтернативном варианте путем замещения некоторых аминокислот в кодирующей последовательности. Гибриды, сконструированные для импорта в хлоропласт, могут быть оценены с точки зрения эффективности поглощения хлоропластом путем трансляции in vitro транскрибируемых in vitro конструкций с последующим поглощением в хлоропласт in vitro с использованием методов, описанных у Barlett и др., под ред. Edelmann и др. , Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier. с. 1081-1091 (1982); Wasmann и др. , Mol. Gen. Genet. 205: 446-453 (1986). Эти методы конструирования хорошо известны в данной области техники и равным образом применимы как для митохондрий, так и для пероксисом. Описанные выше механизмы, обеспечивающие доставку в клетку, могут быть применены не только в сочетании с родственными им промоторами, но также и в сочетании с гетерологичными промоторами, чтобы достичь конкретной цели, а именно доставки в клетку в условиях регуляции транскрипции промотором, имеющим схему экспрессии, отличную от таковой, свойственной промотору, от которого происходит обеспечивающий доставку сигнал. Последовательность ДНК, кодирующая сигнал секреции, присутствует в нативном гене VIP2 Bacillus. Этот сигнал отсутствует в зрелом протеине, имеющем N-концевую последовательность LKITDKVEDF (аминокислотные остатки с 57 по 66 последовательности SEQ ID NO: 2). VIP2 можно сконструировать таким образом, чтобы он секретировался из растительной клетки или чтобы была обеспечена его доставка в субклеточные органеллы, такие как эндоплазматический ретикулюм, вакуоль, митохондрия или пластиды, в том числе хлоропласты. Гибридные протеины, созданные путем слияния сигнального пептида секреции с геном-маркером, успешно доставляли протеин в область секреции (см. Itimaga G. и др., The Plant Cell, 1: 381-390 (1989), Denecke и др.. The Plant Cell, 2: 51-59 (1990)). Были выявлены аминоконцевые последовательности, ответственные за обеспечение доставки в эндоплазматический ретикулюм, апопласт и за внеклеточную секрецию из алейронных клеток (Koehler & Но, Plant Cell 2:769-783 (1990)). Чтобы сохранить протеин в эндоплазматическом ретикулюме или в вакуоли, необходимо наличие дополнительных сигналов. Для сохранения протеина в эндоплазматическом ретикулюме требуется наличие пептидной последовательности KDEL/HDEL на его карбоксильном конце (см. обзор Pelham, Annual Review Cell BioL, 5: 1-23 (1989). Также были охарактеризованы сигналы для сохранения протеинов в вакуоли. Сигналы, обеспечивающие доставку в вакуоль, могут присутствовать либо на аминоконцевом участке (Holwerda и др.. The Plant Cell, 4: 307-318 (1992), Nakamura и др., Plant PhysioL, 101: 1-5 (1993)), либо на карбоксиконцевом участке, либо во внутренней последовательности протеина, подлежащего доставке (Tague и др., The Plant Cell, 4: 307-318 (1992), Saalbach и др. , The Plant Cell, 3: 695-708 (1991)). Кроме того, аминоконцевые последовательности вместе с карбоксиконцевыми последовательностями ответственны за доставку генных продуктов в вакуоль (Shinshi и др., Plant Molec. Biol. 14: 357-368 (1990)). Аналогично этому протеины могут быть доставлены в митохондрии или пластиды с использованием специфичных гибридов сигнального пептида с карбоксильным концом (Heijne и др., Eur. J. Biochem., 180: 535-545 (1989), Archer и Keegstra, Plant Molecular Biology, 23: 1105-1115 (1993)). Чтобы обеспечить доставку VIP2 либо для секреции, либо в различные субклеточные органеллы, может быть создана оптимизированная для кукурузы последовательность ДНК, кодирующая известный(ные) сигнальный(ные) пептид(ы) либо на 5"-, либо на 3"-конце гена, в зависимости от требований. Чтобы секретировать VIP2 из клетки, последовательность ДНК, кодирующая эукариотический сигнальный пептид секреции MGWSWIFLFLLSGAAGVHCL (SEQ ID NO: 25 из заявки РСТ W095/00497 или любая другая известная из литературы (например, Itirriaga и др.. The Plant Cell, 1: 381-390 (1989), Denecke и др.. The Plant Cell, 2: 51-59 (1990)), может быть добавлена на 5"-конце либо полной последовательности гена VIP2, либо укороченной последовательности с той целью, чтобы кодировать зрелый протеин или ген, укороченный до нуклеотида 286, или кодировать протеин, который должен начинаться от аминокислотного остатка 94 (метионин). Чтобы обеспечить сохранение доставленного VIP2 в эндоплазматическом ректикулюме, в дополнение к сигналу секреции на 3"-конце гена должна быть добавлена последовательность ДНК, кодирующая сигнальный пептид KDEL/HDEL эндоплазматического ретикулюма. Для обеспечения доставки в вакуоль может быть сконструирована последовательность ДНК, кодирующая сигнальный пептид SSSSFADSNPIRVTDRAAST (SEQ ID NO: 3; Holwerda и др. The Plant Cell, 4: 307-318 (1992)) и примыкающая к сигналу секреции, или последовательность, кодирующая сигнальный пептид с концевой карбоксильной группой и описанная у Dombrowski и др. The Plant Cell, 5: 587-596 (1993), или же ее функциональный вариант может быть встроен на 3"-конце гена. Аналогично этому может быть сконструирован VIP2 для обеспечения доставки либо в митохондрии, либо в пластиды, в том числе в хлоропласты, путем встраивания в последовательность VIP2 последовательностей, которые, как известно, могут кодировать необходимые сигналы, обеспечивающие доставку. Бактериальный сигнал секреции, присутствующий в VIP2, может быть сохранен или удален из окончательной конструкции. Одним из примеров конструкции, которая содержит эукариотический сигнал секреции, слитый с кодирующей последовательностью VIP, является рСIВ5528. Синтезировали олигонуклеотиды, соответствующие как верхней, так и нижней нити последовательностей, кодирующих сигнальный пептид секреции SEQ ID NO: 25, и имеющие последовательность 5"-GGАТССАСС ATG GGC ТGG AGС TGG АТС ТТС СТG ТТС СТG СТG АGС GGС GСС GСG GGС GТG САС ТGС СТGСАG-3" (SEQ ID NO: 41). После гибридизации 5"-конец сигнала секреции напоминал "липкие концы", соответствующие сайтам рестрикции BamHI и PstI. Олигонуклеотид гибридизировали, фосфорилировали и лигировали в рСIВ5527 (конструкция, описанная в примере 23А), которую расщепляли BamHI/PstI с использованием стандартных методов. Полученная оптимизированная для кукурузы кодирующая последовательность представлена в SEQ ID NO: 42, она кодирует протеин, описанный в SEQ ID NO: 43. Этот кодируемый ею протеин содержит эукариотический сигнал секреции эукариот вместо сигнала секреции, присущего Bacillus. Одним из примеров конструкции, которая содержит сигнал, обеспечивающий доставку в вакуоль и слитый с кодирующей последовательностью VIP, является рСIВ5533. Синтезировали олигонуклеотиды, соответствующие как верхней, так и нижней нити последовательностей, кодирующих пептид SEQ ID NO: 3, обеспечивающий доставку к вакуоли, и имеющих последовательность 5"-ССG СGG GСG ТОС ACT GСС ТСА GСА GСА GСА GСТ ТСG CCG АСА GСА АСС ССА ТСС GСG ТGА ССG АСС GСG ССG ССА GСА ССС ТGСАG-3" (SEQ ID NO: 44). После гибридизации 5"-конец сигнала, обеспечивающего доставку в вакуоль, напоминал "липкие концы", соответствующие сайтам рестрикции SacII и PstI. Олигонуклеотид гибридизировали, фосфорилировали и лигировали в рСIВ5528 (конструкция, описанная выше), которую расщепляли SacII/PstI с использованием стандартных методов. Полученная оптимизированная для кукурузы последовательность представлена в SEQ ID NO: 45, кодирующей протеин, описанный в SEQ ID NO: 46. Этот кодируемый протеин в дополнение к эукариотическому сигналу секреции содержит пептид, обеспечивающий доставку в вакуоль. Аналогичными способами может быть создан ген VIP1 для секреции или обеспечения доставки в субклеточные органеллы. Пример 23А. Удаление сигнала секреции, присущего Bacillus из VIP1A(a) и VIР2А(а)
VIP1A(a) и VIP2A(a) секретируются во время роста штамма АВ78. Природа пептидных последовательностей, которые действуют как сигналы секреции, описана в литературе (Simonen и Palva, Microbiological reviews, с. 109-137 (1993)). Руководствуясь информацией, приведенной в вышеуказанной публикации, выявляли предполагаемый сигнал секреции в обоих генах. В VIP1A(a) этот сигнал состоит из аминокислот 1-33 (см. SEQ ID NO: 5). Процессинг сигнала секреции, по-видимому, происходит после серина на аминокислоте 33. Было выявлено, что в VIP2A(a) сигнал секреции состоит из аминокислот 1-49 (см. SEQ ID NO: 2). Анализ N-концевого пептида секретируемого зрелого протеина VIP2A(a) выявил N-концевую последовательность LKITDKVEDFKEDK. Было установлено, что эта последовательность начинается с аминокислоты 57 в SEQ ID NO: 2. Гены, кодирующие эти протеины, модифицировали путем удаления сигналов секреции, присущих Bacillus. Конструировали кодирующую область оптимизированного для кукурузы гена VIP1A(a), которая имела последовательности, кодирующие первые 33 аминокислоты, т.е. сигнал секреции, удаленный с 5"-конца этого гена. Эту модификацию получали с помощью ПЦР, используя прямой праймер, который содержит последовательность 5"-GGA ТСС АСС ATG AAG АСС AAC CAG АТС AGC-3" (SEQ ID NO: 33) и который гибридизируется с оптимизированным для кукурузы геном (SEQ ID NO: 26) за нуклеотидом в положении 100, и добавляли сайт рестрикции BamHI и эукариотический трансляционный инициирующий консенсусный сайт, включающий стартовый кодон. Обратный праймер, содержащий последовательность 5"-AAG CTT CAG CTC CTT G-3" (SEQ ID NO: 34), гибридизируется с комплементарной нитью за нуклеотидом в положении 507. Получали продукт амплификации длиной 527 пар оснований, содержащий сайты рестрикции BamHI на 5"-конце и HindIII на 3"-конце. Продукт амплификации клонировали в Т-векторе (описанном в примере 24, см. ниже) и секвенировали для гарантии правильности последовательности ДНК. Затем с помощью расщепления рестриктазами получали BamHI/HindIII- фрагмент и применяли для замещения BamHI/HindIII-фрагмента, оптимизированного для кукурузы гена VIP1A(a), клонированного в кассете промотора, предпочтительного для корня. Полученную конструкцию обозначали как рСIВ5526. Оптимизированная для кукурузы кодирующая область VIP1A(a) с удаленным сигналом секреции Bacillus представлена в SEQ ID NO: 35, а кодируемый протеин представлен в SEQ ID NO: 36. Ген, кодирующий форму VIP2A(a), которая образуется после процессинга, т. е. кодирующую область с удаленным сигналом секреции, конструировали с использованием методики, аналогичной описанной выше для конструирования формы VIP1A(a), которая образуется после процессинга. Модификацию получали с помощью ПЦР, используя прямой праймер 5"-GGA TCC ACC ATG СТG CAG ААС СТG AAG АТС AC-3" (SEQ ID NO: 37). Этот праймер гибридизируется с оптимизированным для кукурузы геном VIP2A(a) (SEQ ID NO: 27) за нуклеотидом в положении 150. Молчащую мутацию получали в нуклеотиде в положении 15 этого праймера, получая сайт рестрикции Pstl. Обратный праймер имеет последовательность 5"-AAG СТТ ССА СТС СТТ СТС-3" (SEQ ID NO: 38). Получали продукт длиной 259 пар оснований, содержащий сайт рестрикции HindIII на 3"-конце. Продукт амплификации клонировали в Т-векторе, секвенировали и лигировали с ращепленной BamHI/HindIII, предпочтительной для корня кассетой промоторов, содержащей оптимизированный для кукурузы VIP2A(a). Полученную конструкцию обозначали как рСIВ5527. Оптимизированная для кукурузы кодирующая область VIP2A(a) с удаленным сигналом секреции, присущим Bacillus, представлена в SEQ ID NO: 39, а кодируемый протеин представлен в SEQ ID NO: 40. Пример 24. Конструирование и клонирование оптимизированных для кукурузы генов VIP1A(a) и VIР2А(а)
Конструирование: Оптимизированные для кукурузы гены конструировали путем обратной трансляции нативных последовательностей протеинов VIP1A(a) и VIP2A(a), используя кодоны, которые в основном применяют для кукурузы (Murray и др. , Nucleic Acid Research, 17: 477-498 (1989)). Для облегчения клонирования последовательность ДНК, кроме того, модифицировали, включая уникальные сайты рестрикции с интервалами через каждые 200-360 нуклеотидов. Конструировали VIP1A(a) при клонировании в виде 11 таких фрагментов, a VIP2A(a) клонировали в виде 5 фрагментов. После клонирования индивидуальных фрагментов соседние фрагменты объединяли, используя сайты рестрикции, общие для обоих фрагментов, получая полный ген. Для клонирования каждого фрагмента конструировали олигонуклеотиды (50-85 нуклеотидов), представляющие собой как верхнюю, так и нижнюю нить ДНК. Верхний олигонуклеотид из первой олигонуклеотидной пары конструировали таким образом, чтобы он имел однонитевую область длиной 15 пар оснований на 3"-конце, которая гомологична аналогичной однонитевой области нижней нити следующей олигонуклеотидной пары, с целью направлять ориентацию и последовательность различных олигонуклеотидных пар внутри данного фрагмента. Также конструировали олигонуклеотиды таким образом, чтобы, когда все олигонуклеотиды, представляющие фрагмент, гибридизируются, концы имели однонитевые области, соответствующие конкретному сайту рестрикции, который должен быть образован. Строение каждого олигомера оценивали на стабильность вторичных структур, таких как петли из двухцепочечных участков одноцепочечных молекул, используя программу OLIGO фирмы NBI Inc. При необходимости нуклеотиды изменяли, чтобы уменьшить стабильность вторичной структуры без изменения аминокислотной последовательности протеина. Растительную консенсусную последовательность сайта связывания рибосом растений TAAACAATG (Joshi и др., Nucleic Acid Res., 15: 6643-6653 (1987)) или эукариотическую консенсусную последовательность сайта связывания рибосом CCACCATG (Kozak, Nucleic Acid Research, 12: 857-872 (1984)) встраивали за трансляционным стартовым кодон гена. Клонирование: Олигонуклеотиды синтезировали по методу фирмы IDT Inc. и использовали в виде лиофилизированных порошков. Их ресуспендировали в концентрации 200 мкМ. К 30 мкл каждого олигонуклеотида добавляли формамид до конечной концентрации 25-50% и образец кипятили в течение 2 минут перед разделением на предварительно приготовленном геле из 10%-ного полиакрил-амид/мочевина, полученном от фирмы Novex. После электрофореза олигонуклеотид определяли с помощью УФ-экранирования, помещая гель на пластинку для ТСХ, содержащую флуоресцентный индикатор, и экспонируя ее УФ-лучами. Область, содержащую ДНК правильного размера, вырезали и экстрагировали от полиакриламидного геля путем инкубации в течение ночи измельченного фрагмента геля в буфере, содержащем 0,4 М LiC1, 0,1 мМ ЭДТК. ДНК отделяли от остатка геля путем центрифугирования через фильтр типа Millipore UFMC. Экстрагированную ДНК подвергали осаждению этанолом, добавляя 2 объема абсолютного спирта. После центрифугирования осадок ресуспендировали в dH2O в концентрации 2,5 мкМ. Фрагменты клонировали либо путем гибридизации олигомеров и лигирования с соответствующим вектором, либо путем амплификации гибридизованного фрагмента, используя в качестве матрицы эквимолярную смесь всех олигомеров для конкретного фрагмента и специфичные для конца ПЦР-праймеры. Клонирование путем гибридизации и лигирование: Гомологичные двунитевые олигонуклеотидные пары получали путем смешения 5 мкл верхнего и нижнего олигонуклеотида каждой олигонуклеотидной пары с буфером, содержащим однократный полинуклеотидкиназный (ПНК) буфер (70 мМ Трис-НС1 (рН 7,6), 10 мМ MgCl2, 5 мМ дитиотриитол (ДТТ)), 50 мМ КС1 и 5%-ный формамид в конечном объеме 50 мкл. Олигонуклеотиды кипятили в течение 10 минут и медленно охлаждали до 37oС или до комнатной температуры. Для анализа на 4%-ной агарозе в буферной системе ТАЕ (Metaphore
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196047/174.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196009/945.gif)
![новые пестицидные протеины и штаммы, патент № 2196824](/images/patents/274/2196047/174.gif)
Использовали метод очистки, основанный на сродстве VIP2 к субстрату NAD. Супернатант, описанный в примере 4, после обработки натрий-нитратным буфером с рН 3,5 в течение ночи подвергали диализу в 20 мМ Трис, рН 7,5. Нейтрализованный супернатант добавляли к равному объему промытой NAD агарозы и инкубировали при осторожном встряхивании при 4o С в течение ночи. Смолу и раствор протеина добавляли в 10-миллилитровую полипропиленовую колонку одноразового использования и давали протекать раствору протеина. Колонку промывали 20 мМ Трис, рН 7,5 (5 объемов колонки), затем промывали 20 мМ Трис, рН 7,5 (2-5 объемов колонки), 100 мМ NaCl, а затем 20 мМ Трис, рН 7,5 (2-5 объемов колонки). Протеины VIP элюировали 20 мМ Трис, рН 7,5, дополненным 5 мМ NAD. Элюент собирали в объеме, составляющем приблизительно 3 объема колонки, и концентрировали в Centricon-10. Выход обычно составлял 7-15 мкг протеина на 1 мл смолы. Когда очищенные протеины анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ с последующим окрашиванием серебром, проявлялись два полипептида, один с Mr приблизительно 80000, а другой с Мг приблизительно 45000. N-концевое секвенирование показало, что протеин с Мг 80000 соответствовал форме VIP1A(a), полученной в результате протеолитического расщепления, а протеин с Mw 45000 соответствовал форме VIP2A(a), полученной в результате протеолитического расщепления. Совместная очистка VIP1A(a) с VIP2A(a) свидетельствует о том, что два протеина, вероятно, образуют комплекс и имеют области связывания протеин-протеин. Очищенные таким образом протеины VIP1A(a) и VIP2A(a) обладали биологической активностью в отношении блошки динноусой западной. Пример 26. Экспрессия оптимизированных для кукурузы VIP1A(a) и VIР2А(а)
Штаммы E.coli, содержащие различные плазмиды, включающие гены VIP, анализировали в отношении экспрессии VIP. Штаммы E.coli, содержащие индивидуальные плазмиды, выращивали в течение ночи в L-бульоне и экспрессируемый протеин экстрагировали из культуры, как описано выше в примере 3. Экспрессию протеина анализировали с помощью Вестерн-блоттинга, используя антитела, полученные с помощью стандартных методов, известных в данной области техники и аналогичных таковым, описанным выше в примере 12. Кроме того, инсектицидную активность экспрессируемых протеинов оценивали в отношении блошки длинноусой западной в соответствии с методом из приведенного выше примера 3. Результаты анализа экспрессии в E.coli представлены в табл. X. ДНК из этих плазмид применяли для временной экспрессии VIP в системе экспрессии протопласта кукурузы. Протопласты выделяли из 6 суспензионных культур кукурузы линии 2717 путем разложения клеточных стенок с использованием целлюлазы Cellulase RS и мацеразы Macerase RIO в соответствующем буфере. Протопласты получали путем фильтрования и центрифугирования. Протопласты трансформировали стандартным методом прямого переноса гена, используя приблизительно 75 мкг ДНК плазмиды и ПЭГ-40. Обработанные протопласты инкубировали в течение ночи в темноте при комнатной температуре. Анализ экспрессии VIP осуществляли на эксплантатах протопластов с помощью Вестерн-блоттинга. Инсектипидную активность в отношении блошки длинноусой западной определяли аналогично методике, описанной выше для экспрессии в E.coli. Результаты анализа экспрессии в протопласте кукурузы приведены в табл. XI. Данные об экспрессии, полученные как для E.coli, так и для протопластов кукурузы, свидетельствуют о том, что оптимизированные для кукурузы гены VIP1A(a) и VIP2A(a) продуцируют такой же протеин, что и нативные гены VIP1A(a) и VIP2A(a) соответственно и что протеины, кодируемые оптимизированными для кукурузы генами, функционально эквивалентны протеинам, кодируемым нативными генами. Все публикации и заявки на патент, упомянутые в настоящем описании изобретения, характеризуют уровень техники для специалистов в данной области техники, для которых предназначено настоящее изобретение. Все публикации и заявки на патент включены в настоящее описание в качестве ссылки в той степени, в какой каждая отдельная публикация или описание патента, взятые конкретно и по отдельности, должны были бы быть включены в качестве ссылки. В Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria Illinois 61604, USA, были депонированы штаммы, представленные в табл. XII. Хотя вышеприведенное изобретение описано и проиллюстрировано достаточно подробно на примерах с целью облегчения понимания его сущности, очевидно, что на практике в рамках прилагаемой формулы изобретения могут быть внесены определенные изменения и модификации. То
Класс C12N15/32 кристаллические белки бацилл
Класс C12N15/62 ДНК последовательности, кодирующие белки при слиянии
Класс C12N15/82 для клеток растений
Класс C07K14/325 кристаллический пептид Bacillus thuringiensis (бета-эндотоксин)
Класс A01N63/00 Биоциды, репелленты или аттрактанты или регуляторы роста растений, содержащие микроорганизмы, вирусы, плесневые грибы, ферменты, сбраживающие материалы или вещества, полученные или экстрагированные из микроорганизмов или животных материалов