способ определения целлюлозолитической активности ферментов микрофлоры в толстом кишечнике у птицы

Формула изобретения

Способ определения целлюлозолитической активности ферментов микрофлоры в толстом кишечнике у птицы, включающий отбор пробы, разбавление ее буфером, содержащим дистиллированную воду, NaCl, NaHCO₃, помещение в нее источника целлюлозы, предварительно обработанного и взвешенного, инкубирование, повторное взвешивание источника целлюлозы и по его потере в весе определение целлюлозолитической активности ферментов микрофлоры, отличающийся тем, что пробу отбирают из толстого кишечника птицы в количестве 1 г, добавляют до 5 мл буфер, содержащий на 100 мл дистиллированной воды 0,9-1,0 г NaCl, 0,3-0,4 г NaHCO₃ (рН 7,8-8), помещают обработанные и взвешенные на торсионных весах источники целлюлозы в виде целлофановых полосок размером 4x1 см, инкубируемые при 41-42^oС.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к физиолого-биохимическим исследованиям пищеварения у животных, в частности к методам определения активности ферментов микрофлоры толстого кишечника у птиц.

Известно определение целлюлозолитической активности содержимого рубца (см. авторы: Мосолова Э.С., Каплан В.А., кн. "Новое в методах зоотехнических исследований". Харьков, 1964). По известной методике отбирается 200 мл рубцового содержимого. Термос заполняется дистиллированной водой, нагретой до 39-40^oС, которая выливается из него перед взятием пробы рубцового содержимого. Содержимое фильтруется через 4 слоя марли в стакан, помещенный в водяную баню с температурой 39^oС.

Предварительно в 5-6 пробирок (диаметром 2 см и длиной 20 см) помещается полоска (8017 мм) тонкого целлофана. Полоски обмываются дистиллированной водой, смесью спирта с эфиром (1:1), высушиваются при 105^oC до постоянного веса и взвешиваются на аналитических весах. Штатив с пробирками помещается в водяную баню с температурой 39^oС. В каждую пробирку с помощью цилиндра отмеривается 30 мл рубцовой жидкости. Далее содержимое пробирок заливают вазелиновым маслом и инкубируют в термостате в течение 24 ч при 39^oС. Затем целлофановые полоски опять обрабатывают и взвешивают. По разнице веса целлофановых полосок до инкубирования и после него определяют процент гидролиза целлюлозы или целлюлозолитическую активность ферментов микрофлоры рубца крупного рогатого скота.

Наиболее близким техническим решением является способ определения целлюлозолитической активности, в котором осуществляют отбор пробы из рубца 50-70 мл, затем рубцовое содержимое фильтруют через двойной слой марли и разводят 1: 1 искусственной питательной средой, состоящей из следующих компонентов: NaH₂PO₄; NаНСО₃; КCl; KI; NаСl; МgSО₄; FeSO₄7H₂O; МnSО₄; CuSO₄5Н₂О; ZnSO₄7Н₂О; СоSО₄; Na₂В₄O₇10H₂O; SrCl₂6H₂O; K₂CrO₄; NaAsO₃; глюкоза; мочевина и дистиллированная вода; рН 7,1. Пропускают углекислый газ, после в каждую пробирку с источником целлюлозы приливают инкубируемую смесь, опять насыщают углекислым газом и закрывают резиновой пробкой с дефлегматором. Все операции производят в ультратермостате при 40^oС.

В качестве источников целлюлозы используются обеззоленные гофрированные фильтры, предварительно взвешенные.

После 24-часовой инкубации извлекают фильтры, промывают, высушивают и взвешивают и по потере в весе источников целлюлозы определяют активность микрофлоры рубца (см. Н.В. Курилов, Н.А. Севастьянова, В.Н. Коршунов и др. Изучение пищеварения у жвачных. Методические указания, Боровск, 1979, с.64).

Недостатком известных технических решений является: 1) использование бумажных фильтров приводит к неточному результату, так как при промывании происходят потери бумаги; 2) сложность проведения исследований, трудоемкость как в первой, так и во второй методиках исследований; 3) использование большого количества компонентов в опытах; 4) ограниченность применения.

Задачей заявляемого предложения является расширение технологических возможностей и упрощение процесса исследования с сохранением достоверности, точности получаемых результатов.

Поставленная задача достигается тем, что в способе определения целлюлозолитической активности ферментов микрофлоры толстого кишечника у птицы, включающем отбор пробы, разбавление ее буфером, содержащим дистиллированную воду, NaCl, NaHCO₃, помещение в нее источника целлюлозы, предварительно обработанного и взвешенного, инкубирование, повторное взвешивание источника целлюлозы и по его потере в весе определение целлюлозолитической активности ферментов микрофлоры, пробу отбирают из толстого кишечника птицы в количестве 1 г, добавляют до 5 мл буфер, содержащий на 100 мл дистиллированной воды 0,9-1,0 г NaCl, 0,3-0,4 г NaHCO₃ (рН 7,8-8), помещают обработанные и взвешенные на торсионных весах источники целлюлозы в виде целлофановых полосок размером 41 см, инкубируемые при 41-42^oС.

Новизна заявляемого предложения обусловлена тем, что по сравнению с известными техническими решениями процесс определения целлюлозолитической активности ферментов упрощается за счет того, что исключается фильтрация пробы; подогрев посуды и пробы; использование искусственной среды, состоящей из большого количества компонентов. Для приготовления буфера в нашем случае необходимо: к 100 мл дистиллированной воды добавить NaCl - 0,9-1,0 г и NaHCO₃ - 0,3-0,4 г (рН 7,8-8). В пробирки центрифужные помещается по 1 г содержимого толстого кишечника птицы, доводят до 5 мл буфером, хорошо перемешивают.

Кроме того, заявляемое предложение позволяет провести исследование целлюлозолитической активности ферментов микрофлоры у птицы.

Пример конкретного осуществления способа определения целлюлозолитической активности ферментов микрофлоры толстого кишечника у птицы.

Из толстого кишечника птицы, а именно из слепых отростков берут пробу химуса в количестве 1 г и помещают в центрифужные пробирки, куда доливают до 5 мл буфера, смешивают. Для приготовления буферного раствора (рН 7,8-8) к 100 мл дистиллированной воды добавляют NaCl - 0,9-1,0 г и NaHCO₃ - 0,3-0,4 г. Затем в центрифужные пробирки с содержимым аккуратно пинцетом помещают полоски из тонкого (пищевого) целлофана. Целлофановые полоски должны быть заранее нарезаны (41 см), хорошо обмыты дистиллированной водой, протерты смесью спирта с эфиром, высушены при 105^oС до постоянного веса и взвешены на торсионных весах. После того, как опустили целлофановые полоски на дно пробирок, содержимое пробирок заливают тонким слоем (2-3 мм) вазелинового масла и закрывают ватным тампоном. Штатив с пробирками помещают в термостат при 41^oС. Через 24 ч штатив вынимают из термостата и пипеткой удаляют слой вазелинового масла. Полоски целлофана тщательно промывают горячей дистиллированной водой, протирают спиртом с эфиром и высушивают при 105^oС до постоянного веса, взвешивают. Мерой целлюлозолитической активности служит выраженное в процентах уменьшение веса целлофановых полосок в результате 24-часового инкубирования с буфером при 41^oС.

Расчет производится в процентах расщепления целлюлозы.

Пример расчета:



Вес сухой целлофановой полоски до инкубирования 17 мг, вес полоски после инкубирования 15 мг, значит

б