лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения
Классы МПК: | A61K39/40 бактериальные A61K39/106 вибрионы; Campylobacter |
Автор(ы): | Жебрун А.Б., Сафонова Н.В., Геннадьева Т.Я., Довгаль С.Г., Денисова И.И., Гончарова Л.Б. |
Патентообладатель(и): | Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера |
Приоритеты: |
подача заявки:
2000-12-07 публикация патента:
27.03.2003 |
Изобретение относится к области медицины, микробиологии и иммунологии. Лактосыворотка содержит антитела против Н.pylori, в том числе против его факторов патогенности - токсина и уреазы. Коров в стельном периоде иммунизируют смесью термоинактивированной культуры Н.pylori и антигенного экстракта из биомассы Н.pylori. Активную фракцию выделяют из молока в раннем периоде лактации путем обезжиривания, удаления казеина, осветления, диафильтрации и концентрирования. Лактосыворотка содержит в качестве активного начала антитела к суммарному антигену Н.pylori в титре не более 1:12800, к токсину - не ниже 1:6400 и к уреазе - не ниже 1:6400 при следующем соотношении компонентов (от общего содержания белка): иммуноглобулин G 25,95
1,15, иммуноглобулин А - 11,85
0,75, иммуноглобулин М - 16,95
0,05, иммуноглобулины других классов 0,75
0,3, альфа-лактоглобулин 10,65
0,55, бета-лактоглобулин - 18,35
0,25, сывороточный альбумин - 5,65
0,65, остаточные белки - остальное. Повышена специфическая активность препарата. 2 с. и 1 з.п.ф-лы, 1 табл.
Рисунок 1
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
Формула изобретения
1. Способ получения иммунной специфической лактосыворотки, включающий иммунизацию коров в период стельности, получение молока в ранние сроки лактации, обезжиривание молока, удаление казеина, осветление, диафильтрацию и концентрирование, отличающийся тем, что иммунизацию коров осуществляют смесью термоинактивированной культуры Н. pylori и антигенного экстракта из биомассы Н. pylori. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для получения термоинактивированной культуры и антигенного экстракта используют токсигенные уреазопозитивные штаммы Н. pylori, прошедшие предварительно не более 1 пассажа на искусственных питательных средах после выделения от больных гастродуоденальными заболеваниями. 3. Иммунная специфическая лактосыворотка, полученная по способу п. 1 или 2, отличающаяся тем, что содержит антитела к суммарному антигену Н. pylori в титре не ниже 1: 12800, к токсину - не ниже 1: 6400 и к уреазе - не ниже 1: 6400 при следующем соотношении компонентов, % от общего содержания белка:Иммуноглобулин G - 25,95
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
Иммуноглобулин А - 11,85
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
Иммуноглобулин М - 16,95
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
Иммуноглобулины других классов - 0,75
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
Альфа-лактоглобулин - 10,65
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
Бета-лактоглобулин - 18,35
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
Сывороточный альбумин - 5,65
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
Остаточные белки - Остальное
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к области медицины, микробиологии и иммунологии и может быть использовано в разработке средств лечения и профилактики заболеваний, ассоциированных с инфекцией Helicobacter pylori. Helicobacter (H.) pylori - патогенный микроорганизм - поражает слизистые желудка и двенадцатиперстной кишки, является ведущим этипатогенетическим фактором массовых заболеваний гастродуоденальной сферы - гастритов, дуоденитов, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, злокачественной лимфомы желудка [1]. Известны специфические иммунные препараты - лактосыворотки, выделяемые из молозива или молока иммунизированных коров и направленные против патогенных микроорганизмов, поражающих желудочно-кишечный тракт: шигелл, сальмонелл, энтеровирусов, а также способы получения таких лактосывороток [2, 3, 4]. Известна специфическая иммунная лактосыворотка против патогенных бактерий рода Shigеlla и способ ее получения [3]. Указанная лактосыворотка представляет собой фракцию молока стельных коров, иммунизированных внутримышечно и диателически (введением антигена в молочные ходы вымени) взвесью инактивированных шигелл, лактосыворотка содержит следующие белки: иммуноглобулины - (56,27![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
Получение суммарного антигена Helicobacter pylori. Готовят питательную среду для культивирования Helicobacter pylori (H. pylori): к расплавленному колумбийскому агару (Columbio Agar Base) стерильно добавляют лошадиную нормальную сыворотку до конечной ее концентрации 7% и раствор Iso Vitalex (Becton Dickinson Microbiology Systems) до конечной концентрации 1%. Агар разливают в чашку Петри и дают ему застыть. Посев культуры 6 свежевыделенных штаммов H. pylori на поверхность агара производят бактериальной петлей (1 чашка с посевом на каждый штамм H.pylori) и распределяют нанесенный материал по поверхности агара стерильным шпателем. Чашки с посевом помещают в анаэростат системы GasPak 100 с газогенерирующим пакетом типа GasPak и выдерживают в термостате при 37oС 6 суток. Выросшие H. pylori проверяют микроскопическим методом на чистоту культуры, снимают биомассу культуры стерильным стеклянным шпанделем и эмульсируют в 50 мл стерильного 0,15 М раствора NaCl, содержащего 0,01 М фосфатно-буферного раствора рН 7,2
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
1) на содержание белка биуретовым методом;
2) содержание белковых фракций методом электрофореза в полиакриламидном геле;
3) содержание иммуноглобулинов класса G, класса А и класса М в реакции радиальной иммунодиффузии в геле агарозы;
4) концентрацию лактозы (методом иодометрии, по разнице между качеством, взятого и непрореагировавшего иода титрованием Na2S2О2);
5) активность специфических антител против а) суммарного антигена Н. pylori; б) против токсина; в) против уреазы - в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА). ИФА выполняют известными способами, в качестве антигена, сорбируемого на твердой фазе (в лунках полистирольного планшета для иммунологических реакций), используют: а) нейтрализованный антигенный экстракт из микробной массы Н. pylori, полученный, как описано выше, в концентрации 5 мкг/мл; б) ассоциированный с вакуолизирующим токсином рекомбинантный Cag A-ипотеин в концентрации 2 мкг/мл; в) рекомбинантную уреазу Н.pylori в концентрации 2 мкг/мл. В качестве детектора иммуноглобулинов используют меченные пероксидазой аффинно-очищенные антитела к иммуноглобулинам крупного рогатого скота в рабочем разведении (фирма Sigma). Лактосыворотку иммунную специфическую, полученную, как указано выше, исследуют в ИФА параллельно с исследованием лактосыворотки из пула молока от 20 неиммунизированных коров ("нормальная лактосыворотка"). Иммунную и "нормальную" лактосыворотки предварительно разводят 1:800 ЗФР и исследуют в ИФА в последовательных разведениях: 1: 1600, 1:3200, 1:6400, 1:12800, 1: 25600. За титр антител в иммунной лактосыворотке принимают то ее наибольшее разведение, при исследовании которого показатель ИФА (оптическая плотность продукта реакции при длине волны 492 нм) в 2 раза и более превышает величину показателя ИФА "нормальной" лактосыворотки в том же разведении. Например: показатели ИФА иммунной лактосыворотки равны: в разведении 1:600 - 2,48; в разведении 1:3200 - 2,01; в разведении 1:6400 - 1,43; в разведении 1:12800 - 0,742; в разведении 1:25600 - 0,503. Показатели ИФА "нормальной" лактосыворотки: 1: 1600 - 0,485; 1:3200 - 0,438; 1:6400 - 0,386; 1:12800 0,308; 1: 25600 - 0,296. Наибольшее разведение, при котором соблюдается условие 2-кратного превышения показателя ИФА иммунной лактосыворотки над "нормальной" лактосывороткой - 1:12800. Это и есть титр антител иммунной лактосыворотки. В результате контроля приготовленной по примеру 1 лактосывротки получают следующие данные, представленные в таблице. Процентное содержание белковых фракций иммунной лактосыворотки близко к таковому у известных аналогов и прототипа. Иммунная лактосыворотка содержит специфические антитела к антигенам Н.pylori в высоких титрах, сравнимых с титрами высокоактивных сывороток крови людей, инфицированных Н.pylori [5]. По содержанию лактозы препарат находится на уровне ареактогенных молочных смесей [2]. Пример 2
Молоко от иммунизированных коров (см. пример 1) собирают на 4-й день лактации и объединяют в пул (от 5 животных). 10 л пулированного молока используют для получения иммунной лактосыворотки в соответствии с условиями примера 1. Получают следующие результаты, предствавленные в таблице, которые принципиально близки к результатам контроля иммунной лактосыворотки из непулированного молока. Пример подтверждает возможность получения высокоактивного специфического препарата при выделении лактосыворотки из пула молока. Пример 3
Индивидуальные образцы молока от иммунизированных коров, взятые на 2-, 6-, 8-, 10-е сутки лактации, фракционируют и получают из них лактосыворотку, как описано в примере 1. Получают 20 образцов лактосыворотки, в которых определяют концентрацию белка и процентное соотношение белковых фракций, титры антител и концентрацию глюкозы. Максимальные уровни титров антител наблюдают на 2-е сутки лактации: к суммарному антигену Н. pylori 1:25600, к токсину 1:25600, к уреазе 1: 12800. Минимальные значения титров отмечают в лактосыворотках на 10-й день: 1:3200, 1:1600, 1:800 соответственно, что существенно ниже титров лактосыворотки от 8-го дня лактации: 1:12800, 1:6400, 1:6400 соответственно. Существенное падение титров после 8-го дня (в 4 и более раз) указывает на то обстоятельство, что использование молока после 8-го дня лактации для получения активного препарата нецелесообразно. Исследование белкового состава иммунные лактосывороток, выделенных в период 2 - 8-й дни лактации, выявляет следующие колебания показателей: содержание общего белка (35
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
![лактосыворотка иммунная специфическая против helicobacter pylori и способ ее получения, патент № 2201256](/images/patents/269/2201021/177.gif)
Выполняют в соответствии с условиями примера 1 с тем отличием, что иммунизацию осуществляют термоинактивированной взвесью Н.pylori, без добавления антигенного экстракта. Получают препараты лактосывороток с низким содержанием антител к токсину и уреазе. Максимальные титры антител к этим антигенам отмечают в лактосыворотках от 2-го дня лактации: 1:1600 и 1:1600 соответственно, что существенно ниже, чем в предлагаемом изобретении. Таким образом, представленные примеры реализации изобретения свидетельствуют о возможности получения нового препарата - лактосыворотки иммунной специфической против Helicobacter pylori, в отличие от прототипа и аналогов, обладающей биологической активностью и высокими титрами антител, против суммарного антигена Н.pylori, а также против токсина и уреазы данного микроба. Активность против двух последних антигенов имеет существенное значение в связи с тем, что они считаются основными факторами патогенности Н.pylori [6,7]. Предложенный способ получения иммунной лактосыворотки обеспечивает получение препарата с заявленными параметрами. При этом состав антигена для иммунизации коров имеет существенное значение для получения лактосыворотки с высокой специфической активностью антител. Предлагаемая для иммунизации смесь термоинактивированной культуры Н. pylori и антигенного экстракта из биомассы данного микроба обеспечивают высокие титры антител к токсину и уреазе, так же как и к суммарному антигену Н.pylori. Источники информации:
1. Helicobacter pylori, Basio Mechanisnis to Clinical Cure. Edit. Hunt R.H., Tytgat G.N.J. Kluwer Acad, Publischers. Dordrecht/Boston/London, 1994. 2. Геннадьева Т. Я. , Колесникова Е.Н., Стрелкова М.Р. и др. Уровень сенсибилизации к белкам коровьего молока у детей при пероральном введении иммунных лактосывороток. В сб.: "Острые кишечные инфекции", Л. - 1986, труды НИИЭМ им. Пастера, вып.10, с. 154-160. 3. Николаева Т. А., Геннадьева Т.Я., Капелюш Е.В. и др. Электрофоретическая характеристика противошигеллезных лактосывороток и влияние процесса ультрафильтрации на белковый состав препарата. В сб.: "Острые кишечные инфекции", Л., 1987, Труды НИИЭМ им. Пастера, вып.11, с.67-70. 4. Brussow Y. e.a. J. Clin. Microbiol., 1987, v.25, 6, p.982-986. 5. Goodwin C.S. e.a. J. Infect. Dis., 1987, 3, 155: 488-494. 6. Figura N. and Crabtree J.E. In: "Helicobacter pylori, Basic Mechanisnis to Clinical Cure". Kluwer Acad. Publaschcra Dordrecht/Boston/London, 1994, p.222-231. 7. Mobley H.T.L. and Foxall. Там же, стр.41-58.
Класс A61K39/106 вибрионы; Campylobacter