нуклеотидная последовательность вируса классической свиной лихорадки (csfv) (варианты), полипептид csfv, пестивирусная вакцина против csfv, диагностический набор и способ

Формула изобретения

1. Нуклеотидная последовательность, соответствующая геному вируса классической свиной лихорадки (CSFV), отличающаяся тем, что включает кодирующую часть нуклеотидной последовательности С-штамма CSFV, показанную в SEQ ID NO: 1, или комплементарную последовательность, или РНК-эквивалент такой нуклеотидной последовательности.

2. Нуклеотидная последовательность, соответствующая геному вируса классической свиной лихорадки (CSFV), включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность аминокислот 268-494 аминокислотной последовательности, показанной в последовательности SEQ ID NO: 1, или комплементарную последовательность, или РНК-эквивалент такой нуклеотидной последовательности, и/или нуклеотидную последовательность, несущую мутацию в нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислоты 690-877, аминокислотной последовательности, показанной в последовательности SEQ ID NO: 1, или комплементарную последовательность, или РНК-эквивалент такой нуклеотидной последовательности, причем упомянутую мутацию выбирают из делеций или замещений 1-188 аминокислот в последовательности 690-877, замещений одной или более аминокислот, кодируемых нуклеотидной последовательностью, на аминокислоты, кодируемые соответствующей частью генома другого штамма пестивируса, инсерций гетерологичной нуклеотидной последовательности.

3. Нуклеотидная последовательность по п. 2, отличающаяся тем, что содержит инсерцию гетерологичной последовательности между аминокислотами 690 и 691 или 691 и 692 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

4. Нуклеотидная последовательность, соответствующая геному вируса классической свиной лихорадки (CSFV), включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую, по крайней мере, аминокислотную последовательность 690-1063 SEQ ID NO: 1, или комплементарную последовательность или РНК-эквивалент такой нуклеотидной последовательности, и дополнительно содержащая мутацию в последовательности, кодирующей последовательность аминокислот 268-494 SEQ ID NO: 1, причем упомянутую мутацию выбирают из делеций или замещений одной или более аминокислот, изменяющих, по крайней мере, один эпитоп в последовательности 268-494, замещений одной или более аминокислот, кодируемых этой нуклеотидной последовательностью, на аминокислоты, кодируемые соответствующей частью генома другого пестивирусного штамма, инсерций гетерологичной нуклеотидной последовательности.

5. Нуклеотидная последовательность по п. 4, отличающаяся тем, что содержит инсерцию гетерологичной последовательности между аминокислотами 690 и 691 или 691 и 692 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

6. Нуклеотидная последовательность, кодирующая пестивирусный полипептид, соответствующий последовательности аминокислот 690-1063 SEQ ID NO: 1, отличающаяся тем, что содержит мутацию в одном из эпитопов в последовательности аминокислот 691-750 или 785-870, причем эта мутация изменяет упомянутый эпитоп.

7. Нуклеотидная последовательность по п. 6, отличающаяся тем, что содержит инсерцию гетерологичной последовательности между аминокислотами 690 и 691 или 691 и 692 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

8. Полипептид вируса классической свиной лихорадки, кодируемый нуклеотидной последовательностью по любому из пп. 1, 2, 4 или 6.

9. Нуклеотидная последовательность штамма вируса классической свиной лихорадки, пригодная в качестве вакцины, которая представляет собой полноразмерную ДНК-копию или ее инфекционный транскрипт, нуклеотидной последовательности по любому из пп. 1, 2, 4 или 6.

10. Пестивирусная вакцина против вируса классической свиной лихорадки, содержащая полинуклеотид, имеющий последовательность по любому из пп. 1-7, или полипептид по п. 8, или нуклеотидную последовательность вакцинного штамма по п. 9, в количестве, достаточном для защиты от вируса классической свиной лихорадки.

11. Диагностический набор для диагностики пестивирусов, содержащий, по крайней мере, нуклеотидную последовательность, кодирующую антигенный пестивирусный полипептид, антигенный пестивирусный полипептид и/или антитело, индуцированное против антигенного пестивирусного полипептида, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность имеет последовательность по любому из пп. 1-7, полипептид представляет собой полипептид по п. 8, или антитело, индуцированное против полипептида по п. 8.

12. Диагностический способ, позволяющий отличить животных, инфицированных пестивирусом от вакцинированных животных, причем указанные вакцинированные животные были вакцинированы пестивирусным полипептидом или штаммом пестивируса, содержащим мутацию в последовательности аминокислот 268-494 или 690-1063 в SEQ ID NO: 1, который включает контактирование тестируемого образца с пестивирусным антигеном, соответствующим последовательности аминокислот 268-494 или 690-1063 либо их части, и с антителом, направленным против эпитопа указанного пестивирусного антигена, причем эпитоп не функционален в мутированном полипептиде или пестивирусном штамме, используемом для вакцинации, и измерение степени конкуренции между антителом в упомянутом образце и антителом, направленным против эпитопа пестивирусного антигена.

13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что пестивирусный антиген является димеризованным или мультимеризованным полипептидом и часть указанного антитела иммобилизована, а другая часть антитела мечена.

14. Способ по п. 12 или 13, отличающийся тем, что пестивирусный полипептид и антиген соответствуют последовательности аминокислот 690-1063, а указанный эпитоп находится между аминокислотами 785 и 870.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Предметом настоящего изобретения является способ создания полноразмерной ДНК-копии генома С-штамма, вакцинный штамм классической свиной лихорадки и транскрипция его РНК, которая после трансфекции в клетки вызывает синтез инфекционного вируса С-штамма. Это изобретение включает также (противопестивирусные) вакцины, полученные из С-штамма, а также субъединичные вакцины против пестивируса, средства и методы диагностики пестивирусных инфекций. Настоящее изобретение далее включает способ обнаружения иммуноактивного вещества в образце с помощью конкурентного анализа.

Известный уровень техники

Классическая свиная лихорадка является очень заразным заболеванием, часто вызывает гибель свиней от сильной лихорадки и кровотечения и может протекать в острой или хронической форме (Van Dirschot, 1986, Hog cholera, стр. 289-300. В книге Diseases of Swine", Jowa State University Press, Ames ). Вспышки этой болезни периодически возникают в разных странах Европы и других регионах и могут быть причиной больших экономических убытков.

Вакцинация поросят вакцинным штаммом живого ослабленного вируса классической свиной лихорадки, так называемым "китайским" штаммом (С-штамм), защищает свиней от заражения классической свиной лихорадкой (Terpstra and Wensvoort, 1988, Vet. Microbiol, 16: 123-128). Основным недостатком вакцинации поросят обычными вакцинами, одной из которых является С-штамм, является то, что вакцинированных поросят невозможно отличить с помощью серологических методов от поросят, инфицированных диким штаммом вируса классической свиной лихорадки. Однако С-штамм считается одним из наиболее эффективных и безопасных живых вакцин. Включение (сывороточного) маркера в С-штамм дает большие преимущества и значительно улучшает эту вакцину.

Вирус классической свиной лихорадки (СSFV относится к роду Pestivirus вида Flaviviridae (Francki, R.I.B и др., 1991, Flaviviridae, стр. 223-233 в пятом отчете Международного комитета по таксономии вирусов, Archiv. Virol. Suppl. 2, Springer Verlag, Вена). Двумя другими членами рода Pestivirus, которые в структурном, антигенном и генетическом отношении близко связаны с вирусом классической свиной лихорадки, являются вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV ) и вирус болезни Бордера (BDV), поражающий в основном овец (Moennig and Plagemann, 1992, Adv., Uirus Res., 41:53-98; Mооrтаnn и др. , 1990, Virology 177: 184-198; Becher и др., 1994, Virology 198: 542-551).

Геномы пестивирусов содержат молекулу РНК с положительной цепью длиной 12,5 тысяч пар нуклеотидов (Renard и др., 1985, DNА 4:429-438; Moormann and Hulst 1988, Virus. Res. , 11: 281-291; Becher и др., 1994, Virology, 198: 542-551). Однако геномы РНК с положительной цепью нескольких нецитопатогенных штаммов вируса вирусной диареи крупного рогатого скота могут быть гораздо больше ( Meyers и др., 1991, Virology, 180: 602-616; Меуеrs и др., 1992, Virology, 191: 368-386; Qi и др., 1992, Virology, 189: 285-292).

Отличительной особенностью вирусов с геномом РНК с положительной цепью является то, что их геномная РНК является инфекционной, то есть после трансфекции этой РНК в клетки, обеспечивающие репликацию вирусов, образуется инфекционный вирус. Как предполагалось, геномная (вирусная) РНК пестивирусов также является инфекционной (Moenning and Plagemann) 1992, Adv. Virus Res., 41: 53-98).

В настоящее время технология рекомбинантных ДНК делает возможной in vitro транскрипцию клонированной ДНК. Это позволило синтезировать инфекционную РНК in vitro из ДНК-копии генома вируса РНК с положительной цепью. В области молекулярной инженерии хорошо известно, что ДНК в отличие от РНК легко поддается сайт-направленному мутагенезу. Поэтому технология получения синтетической инфекционной РНК в значительной степени расширила исследования в области репликации, вирулентности, патогенеза, рекомбинации РНК, формирования векторов и антивирусной стратегии вирусов РНК с положительной цепью. Однако применение этой технологии может вызывать серьезные проблемы. Они были описаны в недавно опубликованном обзоре Бойера и Наунни, 1994 ( Virology, 198: 415-426). Действительно, нельзя прогнозировать с полной уверенностью успех или неудачу при создании полноразмерной ДНК-копии генома вируса, содержащего РНК с положительной цепью, и при получении синтетической инфекционной РНК из такой полноразмерной ДНК-копии.

Краткое изложение существа изобретения

Настоящим изобретением предусматриваются нуклеотидные последовательности, соответствующие геному вируса классической свиной лихорадки, которые содержат, по крайней мере, часть нуклеотидной последовательности С-штамма вируса классической свиной лихорадки, представленной в виде последовательности с идентификационным 1, комплемент или эксивалент РНК такой нуклеотидной последовательности либо их мутанты. Кроме того, предусматриваются дегенеративные нуклетидные последовательности, которые имеют разные нуклеотиды, но кодируют одинаковые аминокислоты. В объем настоящего изобретения входят также полипептиды, закодированные этими нуклеотидными последовательностями, и вакцинные штаммы, геном которых содержит такую нуклеотидную последовательность, в частности штамм рекомбинантного вируса на основе транскриптов полноразмерной ДНК-копии генома С-штамма вируса классической свиной лихорадки.

Как указывалось выше, полезными также являются частичные нуклеотидные последовательности, в частности такие, которые содержат мутацию в структурной области вирусного генома, то есть в нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислоты 1-1063 последовательности с идентификационным 1. Мутация может состоять в замещении соответствующей частью генома другого пестивирусного штамма, замещении одной или нескольких аминокислот или их делеции. Мутация может также представлять собой вставленную или замещенную гетерологичную нуклеотидную последовательность, изменяющую стратегию трансляции нуклеотидной последовательности вируса классической свиной лихорадки или процессинг полипептида, закодированного нуклеотидной последовательностью вируса классической свиной лихорадки. Кроме того, мутация может представлять собой вставленную или замещенную гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, которая вызывает иммунитет против другого патогена; в этом случае последовательность вируса классической свиной лихорадки используется в качестве вектора для гетероиммуногенов.

Настоящее изобретение включает в себя как нуклеотидные последовательности пестивирусного генома в целом, так и их части или мутанты, последовательности которых содержат мутацию в субобласти белка E1, то есть в нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислоты, соответствующие аминокислотам (691-750 или 785-870 последовательности с идентификационным 1, a также полипептиды, закодированные этими нуклеотидными последовательностями. Эти полипептиды являются особенно полезными для защиты животных от пестивирусной инфекции благодаря тому, что их можно использовать в диагностических целях для отличия животных, зараженных дикими штаммами пестивируса, от вакцинированных животных.

Кроме того, в объем этого изобретения входят вакцины, содержащие нуклеотидную последовательность, полипептид или вакцинный штамм, а также диагностические композиции, содержащие нуклеотидную последовательность или полипептид, рассмотренные выше, или антитело, индуцированное против такого полипептида.

Настоящее изобретениие включает в себя также методы и средства диагностики пестивирусных инфекций, в частности такие средства и методы, которые позволяют отличить инфицированных животных от вакцинированных.

Этим изобретением предусматривается также метод определения тестируемых веществ, таких как антитело или антиген, в процессе выполнения иммуноанализа, который разработан на основе теста специфического связывания с использованием иммобилизованного эталонного вещества для специфического связывания и аналогичного меченого эталонного вещества.

Детальное описание изобретения

Настоящим изобретением предусматривается полная последовательность кДНК генома РНК "китайского" штамма (С-штамм; заявка на европейский патент 351901) вируса классической свиной лихорадки. Это позволяет создать полноразмерную ДНК-копию этой последовательности, на основании которой можно транскрибировать синтетическую РНК, которая после трансфекции соответствующих клеток, в частности клеток SК6-М ( Kasза Z. и др., 1972, Res., Vet., Sci., 13: 46-51; заявка на европейский патент 351901), вызывает синтез инфекционного вируса С-штамма. Ниже приводится описание этого открытия с целью получения вакцин на основе модифицированного С-штамма, например вакцин, содержащих (серологический) маркер. Хотя это изобретение иллюстрируется в отношении одного штамма вируса классической свиной лихорадки, оно также полезно и применимо для пестивирусных штаммов в результате обмена специфических геномных сегментов, описываемых ниже, между другим пестивирусом и С-штаммом вируса классической свиной лихорадки или путем создания "инфекционной" ДНК-копии другого пестивируса.

Нуклеотидная последовательность ДНК-копии геномной РНК С-штамма представлена в виде последовательности с идентификационным 1. Все цифры, указанные в тексте, относятся к этой последовательности и могут незначительно отличаться от последовательностей других пестивирусов. Эта нуклеотидная последовательность содержит 12311 нуклеотидов и одну большую открытую рамку считывания, состоящую из 11694 нуклеотидов, кодирующих полипротеин из 3898 аминокислот. Размер открытой рамки считывания аналогичен размеру геномов штаммов Brescia ( Moormann и др., 1990, Virology, 177: 184-198) и Alfort (Meyers и др., 1989, Virology, 171: 555-567) вируса классической свиной лихорадки.

Открытая рамка считывания начинается с ATG в положениях нуклеотидов 374-376 и заканчивается TGA-кодоном в положениях нуклеотидов 12068-12070. Длина 5"-концевой некодирующей области, предшествующей открытой рамке считывания, составляет 373 нуклеотида. Эта последовательность представляет собой весьма консервативную область в штаммах Brescia, Alfort и С (фиг. 2), а прогнозируемая вторичная структура этой области сходна с аналогичной структурой 5"-концевой некодирующей области вируса гепатита С ( Brown и др. 1992, Nucleic Acids Res., 20: 5041-5045), который является еще одним членом семейства Flaviviridae. Было установлено, что 5"-концевая некодирующая область вируса гепатита С содержит аминоацильный сайт внутренней рибосомы ( Tsukiyama-Kohara и др., 1992, J. Virol., 66:1467-1483). Такие сайты имеют важные регуляторные функции (Agоl. , 1991. Adv. Virus, Res., 40: 103-180). Аналогия с вирусом гепатита С показывает, что 5"-концевая некодирующая область вируса классической свиной лихорадки также содержит аминоацильный сайт внутренней рибосомы, который расположен между нуклеотидами 124 и 374 последовательности с идентификационным 1 и представляет собой важный регуляторный элемент. Аминоацильный сайт внутренней рибосомы можно использовать в качестве сайта для мутации с целью ослабления вируса, а также для изменения стратегии трансляции открытой рамки считывания.

Второй важной областью, регулирующей репликацию пестивирусов, является 3"-концевая некодирующая область. При сравнительном анализе последовательности С-штамма с последовательностями штаммов Bresciа и Alfort в этой области была обнаружена последовательность из 13 нуклеотидов, характерная только для С-штамма (фиг. 2В). Эта уникальная последовательность TТТТСТТТТТТТТ занимает положения нуклеотидов 12128-12140 в последовательности с идентификационным 1. Это единственная вставка из более чем двух нуклеотидов в ряду, обнаруженная в последовательности С-штамма, по сравнению с последовательностями штаммов Brescia и Alfort. В остальном последовательности в 3"-концевых некодирующих областях трех штаммов вируса классической свиной лихорадки являются достаточно гомологичными. Общая гомология последовательностей в этой области оказывается ниже при сравнении штаммов вируса классической свиной лихорадки и вируса вирусной диареи крупного рогатого скота. Тем не менее вполне очевидно, что последовательность ТТТТСТТТТТТТТ С-штамма также отсутствует в последовательностях 3"-концевых некодирующих областей штаммов вируса вирусной диареи крупного рогатого скота. Поэтому последовательность TTTTCTTTTTTTT является характерной для генома С-штамма и может служить великолепным маркером для специфической последовательности С-штамма. Эту последовательность можно использовать в качестве основы для нуклеотидных зондов и для определения последовательностей с целью идентификации специфических пестивирусов С-штамма. Поэтому можно сделать вывод о том, что все пестивирусные штаммы, имеющие эту последовательность в 3"-концевой некодирующей области (необязательно в таком же положении, как в С-штамме), относятся к С-штамму и входят в объем настоящего изобретения.

Важным параметром инфекционности транскриптов ДНК-копии генома пестивируса является аминокислотная последовательность. В этой связи необходимо рассмотреть два аспекта, касающиеся клонирования и секвенирования РНК-содержащих вирусов вообще и пестивирусов в частности. Во-первых, частота мутации генома вирусов, содержащих РНК с положительной цепью, является достаточно высокой (около 110⁴ нуклеотидов во время репликации), поэтому ни один из вирусных препаратов или препаратов вирусной РНК не является клональным в отношении вирусной РНК, которую он содержит. Среди этих молекул РНК могут быть также молекулы, не являющиеся инфекционными. Если появление таких молекул было вызвано незрелыми стоп-кодонами в большой открытой рамке считывания, то их можно легко распознать. Кроме того, можно распознать мутации в активных сайтах вирусных ферментов или известных структурах белков. Однако, если взаимосвязь между аминокислoтной последовательностью, функцией или структурой белка неизвестна, что характерно для большинства пестивирусных белков, невозможно предсказать, какая аминокислота является правильной, а какая нет. Во-вторых, мутации могут возникнуть во время синтеза кДНК. Поэтому геном С-штамма клонировали и секвенировали дважды независимо друг от друга. Области с несходными последовательностями клонировали и секвенировали не менее трех раз (ср. фиг. 1). Последовательность, которая дважды встречалась в определенном положении, считалась правильной. Необходимость такого подхода для синтеза инфекционных транскриптов ДНК-копии генома С-штамма подтверждается следующим открытием.Полноразмерная ДНК-копия pPRKr1c-113, полученная после второй серии клонирования и секвенирования (фиг. 3), оказалась неинфекционной. После клонирования и секвенирования областей с несходными последовательностями кДНК-клонов, полученными во время первой и второй серии, было обнаружено пять аминокислот, которые отличались в полноразмерной копии второй серии клонов, поэтому последовательность С-штамма была признана правильной. После коррекции этих пяти кислот в pPRKf1c-113 был получен клон pPRKf1c-133, который синтезировал инфекционные транскрипты (фиг. 4). Пять различий находятся в положениях аминокислот 1411 (Vаl --> А1а); 2718 (G1у --> Аsp); 2877 (Val --> Met ); 3228 (Leu --> Met ); 3278 (Туr --> Glu). Аминокислоты, закодированные в этих положениях последовательностью кДНК, которая является неинфекционной, указаны до стрелки, а аминокислоты, находящиеся в тех же положениях инфекционной копии, приведены после стрелки (последовательность с идентификационным 1). Станет.ли изменение каждой аминокислоты в отдельности причиной отсутствия инфекционности ДНК-копии С-штамма, необходимо определить путем анализа инфекционности транскриптов с отдельными мутациями каждой из этих пяти аминокислот. Однако полученный результат показывает, что даже небольшие различия в аминокислотной последовательности могут иметь важное значение для инфекционности транскриптов ДНК-копии генома С-штамма. Он также свидетельствует о том, что создание инфекционных транскриптов копии последовательности пестивируса может оказаться на практике невозможным из-за небольших различий в последовательностях (даже на уровне одной аминокислоты), которые могут оказаться незамещенными.

Мутанты, полученные на основе С-штамма, которые пригодны для получения вакцины (маркера), входят в объем настоящего изобретения. Они могут включать в нуклеотидной последовательности с идентификационным 1 такие мутации, как делеции, инсерции, (несколько) мутаций нуклеотидов и вставленные и/или замененные геномные фрагменты, взятые из других пестивирусных штаммов.

Последовательность С-штаммов может быть поделена на четыре области, пригодные для мутации и/или обмена. Первой областью является 5"-концевая некодирующая последовательность, охвтывающая нуклеотиды с 1 по 373. Вторая область кодирует структурные белки N^pro-C-E2-E3-Е1 и включает в себя нуклеотиды с 374 по 3563. Третья область кодирует неструктурные белки и охватывает нуклеотиды с 3564 по 12068. Четвертая область представляет собой 3"-концевую некодирующую последовательность, которая охватывает нуклеотиды с 12069 по 12311.

Одна область, которая является особенно пригодной для получения вакцин-маркеров С-штамма, представляет собой геномную область, кодирующую структурные белки N^pro-С-Е2-Е3-Е1. Эта область расположена между аминокислотами 1 и 1063 в последовательности с идентификационным 1. Предпочтительные субобласти этой части генома определяются следующими аминокислотными последовательностями 1-168 (N^pro), 169-267 (С), 286-494 (Е2), 495-689 (Е3) и 690-1063 (E1) или их частями. Например, N-концевую антигенную часть области, кодирующей белок Е1 С-штамма и охватывающей аминокислоты 690-877, заменяли соответствующей областью белка Е1 штамма Brеsсiа. (фиг. 4, pPRHf1c-h6). Синтезированное производное С-штамма является инфекционным, и его можно отличить от штамма дикого типа и от штамма Brеsсiа посредством реакции со специфическими моноклональными антителами С-штамма и штамма Brеsсiа, воздействующими на белки Е1 и Е2; например, полученный С-штамм подвергали взаимодействию с моноклональными антителами, специфичными для белка Е1 штамма Brеsсiа (таблица 1). Антигенные свойства нового мутанта изменились по сравнению с родительским вирусом, и это свидетельствует о том, что замена N-концевой половины белка Е1 С-штамма аналогичной областью другого штамма вируса классической свиной лихорадки является одним из возможных способов создания вакцины-маркера С-штамма. Однако это изобретение не ограничивается заменой N-концевых половин белка Е1 в С-штамме и других штаммах вируса классической свиной лихорадки. N-концевые половины белка Е1 из любого другого пестивирусного штамма можно заменить соответствующими частями белка Е1 С-штамма. В этом отношении особенно полезными являются последовательности белка Е1 пестивирусных штаммов, которые выделены у поросят, но относятся к антигенной группе, в которую не входит С-штамм. Примерами таких штаммов, которые выбирают на основе перекрестной нейтрализации, являются штаммы "van ЕЕ, " Stam ", "SFUK 87", " Wisman" и "5250" (Wensvoort и др., 1989, Vet, Microbiol., 20: 291-306; Wensvoort 1992. В отчете о заседании национальных лабораторий по исследованию свиней в Европейском Совете. 16-17 июня 1992 г. V1/4059/92-EN(PV ET/EN/1479), 1992, стр. 59-62).

Было установлено, что N-концевая половина белка Е1 содержит три четко выраженных антигенных домена А, В и С, которые расположены в разных частях белка Е1, причем каждый из них взаимодействует с сильно нейтрализующими моноклональными антителами (Wensvoort, 1989, J. Gen. Virol., 70: 2865-2876; Van Rign и др., 1992, Vet. Microbiol., 33: 221-230; Van Rign и др., 1993. J. Gen. Virol. , 74: 2053-2060). Эпитопы, сохраняемые в 94 протестированных штаммах вируса классической свиной лихорадки, картированы в домене А, в то время как эпитопы доменов В и С не сохраняются (Wensvoort 1989, J. Gen. Virol. , 70: 2865-2876). Картирование эпитопов гибридами генов Е1 штаммов Brescia и C (Van Rign и др., 1992, Vet. Microbiol., 33:221-230) и делеционными мутантами белка Е1 штамма Brescia, позволяет предположить, что домены А и В + С образуют два различных антигенных комплекса в N-концевой половине белка El (Van Rijn и др., 1993, J. Gen. Virol., 74: 2053-2060). Это предположение было далее подтверждено открытием того, что шесть цистеинов, находящихся в положениях 693, 737, 792, 818, 828 и 856 N-концевой половины Е1, имеют важное значение для правильной укладки белка Е1. Однако, по крайней мере, Cys 792 не оказывает существенного влияния на инфекционность штамма Brescia, поскольку мутант этого вируса, устойчивый к воздействию моноклонального антитела, был выделен в случае мутации Суs --> Arg в этом положении (Van Rijn и др., 1993, выступление на 9-м Международном конгрессе по вирусологии 8-13 августа, Глазго, Шотландия).

Если небольшие изменения аминокислотной последовательности могут встать причиной утраты инфекционности РНК С-штамма (см. пример 2), то замена цистеина в положении 792 свидетельствует о том, что замена аминокислоты в положении, которое в гораздо меньшей степени подходит для модификации без утраты функции, может привести к получению жизнеспособного вирусного мутанта. Таким образом, влияние замены определенной аминокислоты на свойства вируса необходимо определять эмпирическим путем для каждой аминокислоты в последовательности штамма С. Это еще раз показывает, что на основе ранее опубликованных данных невозможно определить последовательности-мишени для модификации С-штамма, например для создания вакцины-маркера.

Важное значение для создания вакцин-маркеров С-штамма имеет возможность дифференцировать серологическими методами вакцинированных свиней и свиней, инфицированных диким штаммом вируса классической свиной лихорадки. Ранее было показано, что вектор живого ослабленного вируса псевдобешенства, экспрессирующий белок Е1, или иммуноаффинный очищенный белок Е1, экспрессированный в клетках насекомых с помощью бакуловирусного вектора, вызывает защитную иммунную реакцию у свиней против холеры (WO 91/00352; Van Rijn и др., 1991, J. Virol. , 65: 2761-2765; Hulst и др., 1993, J.Virol., 67:5435-5442). Было установлено, что мутанты белка Е1 с удаленным доменом А или удаленными доменами В + С (фиг. 5) также вызывают защитную иммунную реакцию у свиней против холеры (таблица 2). Это свидетельствует о том, что защитный иммунитет, вызванный вакцинным штаммом, не зависит от нейтрализирующих антител против доменов А и В + С. Поэтому мутанты пестивирусного штамма, у которых заменен или мутирован только домен А или только домены В + С либо их части с помощью соответствующей области другого пестивируса, предпочтительно, но необязательно пестивируса, выделенного у свиней, который относится а другой антигенной группе по сравнению с С-штаммом (примеры приведены выше), также входят в объем настоящего изобретения. Область белка Е1, включающая домен А и пригодная для обмена или мутации, расположена между аминокислотами 785 и 870. Кроме того, могут быть заменены или мутированы части этой области, например субобласти, расположенные между аминокислотами 785 и 830, а также между аминокислотами 829 и 870. Область белка Е1, включающая домены В + С и пригодные замены или мутации, расположены между аминокислотами 691 и 750. Могут быть также заменены или мутированы части этой области, например субобласти, расположенные между аминокислотами 691 и 719, а также между аминокислотами 717 и 750.

У животных, зараженных пестивирусами, вырабатываются антитела против белка Е2 (Kwang и др., 1992, Vet. Microbiol., 32: 281-292; Wensvoort, неопубликованные наблюдения). Поэтому второй областью, пригодной для создания вакцины (маркера) путем мутации (делеций, инсерций, точковых мутаций) или замены соответствующего генетического материала пестивирусом с другими антигенами или пестивирусом, относящимся к другой антигенной группе, является область, кодирующая белок Е2.

С-штамм можно также использовать в качестве вектора для инсерций или экспрессии гетерологичного генетического материала (последовательностей). В случае синтеза вектора гетерологичный генетический материал, введенный в С-штамм, служит для изменения стратегии трансляции большой открытой рамки считывания и процессинга полипротеина, закодированного этой открытой рамкой считывания. Примером последовательности, пригодной для изменения стратегии трансляции большой открытой рамки считывания является последовательность, определяющая аминоацильный сайт внутренней рибосомы (Duke и др., 1992, J.Virol. , 66: 1602-1609, и приведенные здесь противопоставленные материалы). Примером последовательности, пригодной для изменения процессинга полипротеина, является сигнальная последовательность, определяющая транслокацию белков, экспортированных из клетки или введенных в мембраны через мембрану эндоплазматического ретикулума ( Blobel, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 77: 1496-1500; Kreil, 1981, Annu. Rev. Biochem., 50: 317- 348). Сигнальные последовательности расщепляются с помощью клеточных сигнальных пептидаз. Однако последовательности, кодирующие сайты расщепления вирусных протеаз, можно также использовать для изменения процессинга полипротеина.

Последовательности, которые были введены и экспрессированы вектором С-штамма, можно использовать в качестве маркера для идентификации вакцинированных свиней или для их защиты от патогена, из которого была взята гетерологичная инсерцированная последовательность. Последовательности-маркеры предпочтительно являются антигенными и относятся к микроорганизмам, не реплицирующимся в организме свиней. Они могут кодировать известные полные генные продукты (например, белки капсида или оболочки) или их антигенные части (например, эпитопы). Последовательности-маркеры предпочтительно получают из вирусов, относящихся к следующим семействам: Adenoviridae, Arenaviridae, Arteriviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Circoviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Hepadnaviridae, Herpesviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Papovaviridae, Rhabdoviridae, Parvoviridae, Poxviridae, Picornaviridae, Reoviridae, Retroviridae и Togaviddae.

Однако последовательности-маркеры могут также кодировать искусственные антигены, не встречающиеся в природе, или гистохимические маркеры, подобные -галактозидазе Escherichia coli, дегидрогеназе спирта Drosophila, щелочной фосфатазе плаценты человека, люциферазе светляков и хлорамфеникол-ацетилтрансферазе.

Гетерологичный генетический материал, кодирующий один или несколько белков, создающих защитный иммунитет против болезни, вызываемой патогеном, соответствующим гетерологичному генетическому материалу, можно получить из других пестивирусных штаммов, в том числе последовательностей указанных выше штаммов, парвовируса свиней, респираторного коронавируса свиней, вируса инфекционного гастроэнтерита, вируса респираторного синдрома свиней (вирус Лелистада, европейский патент 92200781.0), вируса болезни Ауески (вирус ложного бешенства), вируса эндемической диареи свиней и таких бактерий, как Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Actinobacillus pleuropneumoniae, Streptococcus suis, Treponema hyodysenteria, Escherichia coli, Leptospira, и микроплазматы, такая как M. hyopneumoniae и М. lyorhinis.

Сайты, пригодные для инсерции гетерологичных последовательностей в С-штамме, но не являющиеся единственно возможными, расположены между аминокислотными остатками 170 и 171, между остатками 690 и 691 и между остатками 691 и 692 и указаны в последовательности с идентификационным 1.

Настоящее изобретение включает в себя также диагностические тесты, которые можно использовать для отличия свиней, вакцинированных вакциной-маркером или субъединичной вакциной, содержащей (мутированный) белок Е1 и/или (мутированный) белок Е2, от свиней, зараженных диким штаммом пестивируса. Приемлемые формы таких диагностических тестов описываются в примерах 4 и 5. Обычный неизбирательный твердофазный иммуноферментный анализ (ELISА) вируса классической свиной лихорадки выполняли с использованием белка Е1 в качестве антигена при выполнении комплексной треппинг-блокировки в соответствии с описанием, приведенным Венсвортом и др., 1988 (Vet. Microbiol., 17: 129-140). В прототипном твердофазном иммуноферментном анализе с комплексной трэппинг-блокировкой (CTB-ELISA), который известен также как твердофазный иммуноферментный анализ с блокировкой в жидкой фазе или твердофазный иммуноферментный анализ с двухслойным иммуносэндвичем, используют два моноклональных антитела, выработанных против белка Е1 штамма Brescia вируса классической свиной лихорадки. Эпитоп для моноклонального антитела b3, который расположен в домене А, сохраняется в штаммах вируса классической свиной лихорадки, в то время как эпитоп моноклонального антитела b8, находящегося в домене С, не сохраняется (Wensvoort, 1989, J. Gen. Virol., 70: 2865-2876). Твердофазный иммуноферментный анализ с комплексной трэппинг-блокировкой является чувствительным, надежным методом и позволяет детектировать специфические антитела вируса классической свиной лихорадки, инфицированных пестивирусом. Таким образом, с помощью этого анализа можно отличить свиней, зараженных штаммом вируса классической свиной лихорадки, от свиней, инфицированных, например, штаммом вируса вирусной диареи крупного рогатого скота. Однако с помощью этого теста нельзя отличить свиней, инфицированных диким штаммом вируса классической свиной лихорадки, от свиней, вакцинированных С-штаммом. Кроме того, этот анализ не пригоден для использования с субъединичной вакциной Е1 независимо от того, является ли она живой или инактивированной.

Один тест в соответствии с настоящим изобретением представляет собой модифицированный твердофазный иммуноферментный анализ с комплексной трэппинг-блокировкой на основе одного моноклонального антитела, например b3. Такой твердофазный иммуноферментный анализ с комплексной трэппинг-блокировкой на основе одного моноклонального антитела, которое используется для связывания антигена с поверхностью планшета для выполнения твердофазного иммуноферментного анализа, а также для конкуренции с дикой сывороткой, до сих пор не описывался в научной литературе и является неотъемлемой частью настоящего изобретения. Теперь, когда известен основной принцип этого теста, его можно успешно применять для создания диагностических наборов для детектирования других антител, в том числе антител против других вирусов или других болезней, либо антител, которые являются индикаторами других состояний организма человека или животного. Поэтому это открытие является полезным для всех твердофазных иммуноферментных анализов или подобных анализов с применением комплексной трэппинг-блокировки, которые разрабатываются на основе одного моноклонального антитела и димеризованного или мультимеризованного антигена. Представленный в заявке метод тестирования применим также для определения других членов пар молекул связывающихся партнеров, таких как активаторы/рецепторы, ферменты/ингибиторы и другие, в которых один из партнеров имеет, по крайней мере, два одинаковых сайта связывания.

Таким образом, этим изобретением предусматривается также метод определения наличия тестируемого вещества (например, антитела), способного избирательно связываться с сайтом связывания партнера (например, антиген), на основе конкуренции тестируемого вещества с измеряемым количеством эталонного вещества (антитела), способного избирательно связываться с сайтом связывания партнера, который включает в себя

1) контактирование образца с

(a) эталонным веществом (антителом), связанным с твердым носителем,

(b) связывающим партнером (антигеном) эталонного вещества, молекулой такого партнера, содержащей, по крайней мере, два одинаковых сайта связывания для эталонного вещества, и

(c) эталонным меченым веществом (антителом);

2) измерение степени отделения меченого вещества от носителя.

Например, связывающим партнером (антигеном) для эталонного вещества (антитела), содержащим, по крайней мере, два одинаковых сайта связывания, является димер связывающего партнера (антигена) с эталонным веществом.

На основе такого же принципа создан метод определения наличия тестируемого вещества (антитела), имеющего, по крайней мере, два одинаковых сайта связывания в одной молекуле, которые предназначены для связывания со связывающим партнером (антителом), который включает в себя:

1) контактирование образца с (а) связывающим партнером (антителом), связанным с твердым носителем, и (b) связывающим меченым партнером (антителом);

2) измерение степени связывания меченого вещества с носителем.

В этих методах антитела и антигены приводятся только в качестве примера; они могут быть заменены молекулами связывающихся партнеров.

Настоящим изобретением далее предусматривется диагностический набор, содержащий:

a) эталонное моноклональное антитело, связанное с твердым носителем,

b) эталонное моноклональное меченое антитело и вариантно

с) комплекс антигена с эталонным антителом, содержащий по крайней мере, два одинаковых сайта связывания для эталонного антитела, или комплекс компонентов (а) и/или (b) и (с), а также другие компоненты, необходимые для выполнения конкурентного иммунологического анализа.

Этот метод пригоден для дифференциального диагностического тестирования с использованием субъединичной вакцины Е1, в которой удален один или несколько эпитопов белка Е1, например домен А. Этот тест можно применять с субъединичным белком Е1, в котором домен А был подвергнут мутации, в результате которой антитела, выработанные против такого мутированного домена А, не конкурируют с моноклональным антителом b₃ в отношении эпитопа этого антитела. Кроме того, этот тест можно применять с модифицированным С-штаммом или другими вакцинными штаммами вируса классической свиной лихорадки, в которых домен А был заменен доменом пестивируса, относящимся к другой антигенной группе так же, как и вирус классической свиной лихорадки (см. выше), или был подвергнут мутации, в результате которой антитела, воздействующие на этот домен, не конкурируют с моноклональным антителом b₃ в отношении эпитопа этого антитела. Хотя этот тест описывается и рассматривается в примерах для домена А белка Е1, аналогичный тест на оcнове одного моноклонального антитела b₈ можно использовать вместе с вакциной, у которой удалены домены В + С или домен С либо домены В + С или домен С заменены аналогичными доменами пестивируса, относящегося к другой антигенной группе, как и вирус классической свиной лихорадки (см. выше), либо домены В + С или домен С были мутированы так, что антитела, выработанные против этих доменов, не конкурируют с моноклональным антителом b₈ в отношении эпитопа этого антитела. Этот тест иллюстрируется на основе моноклонального антитела b₃ или моноклонального антитела b₈ штамма Brescia. Однако этот тест можно успешно применять с другими моноклональными антителами, направленными против домена А или доменов В + С белка Е1 штамма Brescia или против домена В или доменов В + С любого другого штамма вируса классической свиной лихорадки, а также с моноклональными антителами, выработанными против аналогичных доменов в белке Е1 любого другого пестивируса. Этот тест можно также выполнять на основе эпитопов белка Е2 (см. пример 5). Антигены, используемые в (модифицированных) твердофазных иммуноферментных анализах с комплексной трэппинг-блокировкой по настоящему изобретению, предпочтительно являются димерами или мультимерами белка Е1 (плюс или минус 3"-концевая трансмембранная область) или белка Е2 (см. пример 5) штаммов вируса классической свиной лихорадки, взаимодействующих с моноклональным антителом b₃ или b₈ или с аналогичными моноклональными антителами, направленными против эпитопов белка Е2. В случае вакцины с мутированным доменом А димеры или мультимеры антигена, используемого для диагностического теста, можно синтезировать путем удаления конструкции В + С (см. пример 5), а в случае вакцины с мутированными доменами В + С, димеры или мультимеры антигена, используемого для диагностического теста, можно синтезировать путем удаления конструкции А (ср. фиг. 5 в отношении конструкций; ср. примеры 4 и 5). Димеризованная (или мультимеризованная) форма антигена белка Е1 строится на основе дисульфидных мостиков, образуемых цистеиновыми остатками в С-концевой части белка Е1. Это позволяет выполнять очень чувствительный иммуноанализ, поскольку молекула димеризованного антигена содержит две копии эпитопа одного моноклонального антитела. Таким образом, одно моноклональное антитело можно использовать для иммобилизации димеризованного антигена через один эпитоп и для мечения димеризованного антигена через другой эпитоп. Конкуренция, создаваемая антителами сыворотки, образовавшимися в результате инфицирования диким штаммом, ингибирует связывание меченого антитела с антигеном, поэтому это явление можно использовать в качестве чувствительного теста на присутствие таких антител. Настоящее изобретение относится также к диагностическим наборам на основе этого метода, которые включают антигены для белка Е1 или Е2, меченые (ферментом) и иммобилизованные моноклональные антитела аналогичного типа, воздействующие на эпитоп белка Е1 и Е2, а также другие известные компоненты (планшеты, разбавители, ферментный субстрат, красители и т.д.), предназначенные для выполнения иммуноанализа конкурентного типа.

Вакцина по настоящему изобретению содержит нуклеотидную последовательность как таковую или в виде вакцинного штамма, в векторе или организме-хозяине, или полипептид, как описывалось выше, в количестве, достаточном для защиты от пестивирусной инфекции. Эта вакцина может быть многоцелевой и включать другие иммуногены или нуклеотиды. Помимо этого такие вакцины могут содержать известные носители, адъюванты, растворители, эмульгаторы, консерванты и т.д. Вакцины по настоящему изобретению можно получить известными методами.

Способ по настоящему изобретению, который предназначен для получения инфекционных транскриптов полноразмерной ДНК-копии генома штамма вируса классической свиной лихорадки, в частности С-штамма, можно использовать для получения любого другого С-штамма или пестивирусного штамма. Метод, описанный здесь для живого ослабленного вакцинного штамма вируса классической свиной лихорадки, можно использовать также для in vitro ослабления (модификации) С-штамма или любого другого штамма вируса классической свиной лихорадки или пестивирусного штамма с целью получения вакцины.

Вакцина на основе С-штамма по настоящему изобретению позволяет с помощью серологических методов отличать вакцинированных свиней от свиней, зараженных диким штаммом вируса классической свиной лихорадки. Вакцины-маркеры на основе любого другого штамма вируса классической свиной лихорадки или пестивирусного штамма можно с той же степенью надежности получить с помощью методов по настоящему изобретению. Такие вакцины-маркеры можно создать путем мутации (делеции, сайт-направленной мутации, инсерции) области, кодирующей белок Е1, N-концевой части белка Е1, доменов А или В + С белка Е1, области, кодирующей белок Е2 С-штамма, аналогичных областей в геномах С-штамма или других пестивирусных штаммах, либо путем замены этих областей соответствующими областями пестивирусов, включающими другие антигены, или пестивирусов, относящихся к другой антигенной группе.

Альтернативным способом создания вакцины-маркера на основе С-штамма является включение в его геном гетерологичного генетического материала, экспрессирующего антигенный белок или эпитоп(ы) микроорганизма, который не реплицируется в организме свиней, или имеющего искусственное происхождение и не встречающегося обычно в организме свиней.

Кроме того, такой гетерологичный генетический материал может кодировать антигены, сообщающие защитный иммунитет против болезни, вызываемой патогенным для свиней микроорганизмом. Поэтому в объем настоящего изобретения входит применение С-штамма или штаммов, полученных на его основе, либо другого пестивирусного штамма в качестве вектора, предназначенного для эксперессии гетерологичных антигенов, защищающих от определенной болезни в организме-хозяине, причем организмом-хозяином является млекопитающее. Структура рекомбинантных вирусов С-штамма, экспрессирующих гетерологичные последовательности, и сайты, пригодные для вставки этих гетерологичных последовательностей, были описаны выше. Аналогичные рекомбинантные вирусы можно создать для вирусов, полученных из С-штамма, или для любого другого пестируса. Поэтому эти вирусы также входят в объем настоящего изобретения.

Неотъемлемая часть настоящего изобретения относится к иммуногенному потенциалу субъединичного белка Е1 с делециями в домене А или доменах В + С. Как показано в таблице 2, оба мутантных белка Е1 способны вызывать защитный иммунитет у свиней против контрольного заражения смертельной дозой вирулентного штамма Brescia. В объем настоящего изобретения входит также использование мутантов белка Е1 с делециями или другими мутациями в доменах А и В + С в качестве инактивированной субъединичной вакцины или живой субъединичной вакцины, экспрессированной векторной системой в организме животного, вакцинированного против классической свиной лихорадки. Кроме того, мутированный белок Е1 вместе с другими антигенными белками вируса классической свиной лихорадки, например белок Е2 или его мутированную форму, можно использовать в качестве инактивированной или живой субъединичной вакцины (см. выше).

Настоящее изобретение включает в себя также диагностические тесты, предназначенные для отличия свиней, вакцинированных вакциной-маркером вируса классической чумы или субъединичной вакциной, содержащей (мутированный) белок Е1 и/или (мутированный ) белок Е2, от свиней, зараженных диким штаммом пестивируса. Диагностическое тестирование может быть основано на серологических методах, детектировании антигенов или нуклеиновых кислот. Выбор метода тестирования, пригодного для данного случая, наряду с другими факторами зависит от специфичности используемого маркера. Одной приемлемой формой серологического диагностического тестирования является модифицированный твердофазный иммуноферментный анализ с комплексной трэппинг-блокировкой, описываемый в примере 4. В соответствии с настоящим изобретением этот метод с использованием одного антитела не ограничивается детектированием вируса классической свиной лихорадки или других пестивирусов и может служить для определения других

антител в других диагностических целях у людей или животных, а также для идентификации других веществ со специфическим связыванием.

Примером приемлемого тестирования на обнаружение антигена с использованием вакцины-маркера на основе С-штамма является тест, позволяющий обнаружить белок Е1 дикого штамма вируса классической свиной лихорадки, а не белок Е1 вакцинного штамма в крови свиней. Если домен А С-штамма был заменен доменом пестивирусного штамма, относящегося к другой антигенной группе по сравнению с вирусом классической свиной лихорадки, то такое тестирование можно проводить на основе моноклональных антител, распознающих консервативные эпитопы домена А вируса классической свиной лихорадки.

Однако, если область белка Е2 С-штамма модифицирована с целью получения вакцины-маркера, то распознавание вакцинированных и инфицированных животных производится путем серологического или антигенного диагностического тестирования модифицированной области белка Е2 вслед за введением такой вакцины. Такое диагностическое тестирование позволяет использовать в качестве антигена специфические последовательности белка Е2. Специфические последовательности белка Е2 можно получить из родительского С-штамма (см. пример 5), из штаммов вируса классической свиной лихорадки, которые отличаются антигенами от С-штамма, или из пестивирусов, относящихся к другой антигенной группе по сравнению с вирусом классической свиной лихорадки. Однако эти специфические последовательности белка Е2 можно также получить путем мутации (делеции, инсерции или точковой мутации) нативного белка Е2 любого пестивируса, при этом они могут содержать (мутированные) части белка Е2 любого пестивируса. В качестве антигена в диагностическом тестировании можно использовать димерный и мультимерный белок Е2 (см. пример 5). Кроме того, белок Е2 вместе с одним моноклональным антителом (ср. примеры 4 и 5) можно использовать при выполнении твердофазного иммуноферментного анализа с комплексной трэппинг-блокировкой, основные особенности которого были описаны выше. Диагностическое тестирование на основе белка Е2 описывается в примере 5. Если набор для детектирования антитела предназначен для выявления белка Е2 пестивируса и основан на использовании одного моноклонального антитела, такой тест-набор предпочтительно включает антитело, распознающее консервативный эпитоп в белке Е2. Такие тесты также входят в объем настоящего изобретения.

И, наконец, диагностическое тестирование можно выполнять на основе специфического детектирования модифицированной в С-штамме области диких штаммов вируса классической свиной лихорадки. Приемлемыми методами такого тестирования являются гибридизация нуклеиновой кислоты специфическими зондами и/или амплификация путем полимеразной реакции синтеза цепи. Последовательности С-штамма можно отличить от последовательностей дикого штамма вируса классической свиной лихорадки путем амплификации на основе полимеразной реакции синтеза цепи (части) 3"-концевой некодирующей области, включающей последовательность ТТТТСТТТТТТТТ, характерную для генома С-штамма.

Если С-штамм модифицирован путем инсерции гетерологичной последовательности-маркера, в объем настоящего изобретения входит любая форма диагностического тестирования на основе этой последовательности, например путем использования антигена, эпитопа (эпитопов) или гистохимического продукта, закодированного этой последовательностью, или путем детектирования гетерологичной генетической информации с помощью методов гибридизации нуклеиновых кислот, например с помощью специфических зондов и/или амплификации, в частности полимеразной реакции синтеза цепи.

Пример 1.

Молекулярное клонирование и секвенирование генома С-штамма.

Клетки и вирус. Клетки почки свиньи ( SK6-М, заявка на европейский патент 351901) культивировали в основной питательной среде Игла, содержащей 5% сыворотки плода коровы и антибиотики. Сыворотку плода коровы анализировали на присутствие вируса вирусной диареи крупного рогатого скота или его антител, как описано (Moormann и др., 1990, Virology 177: 184-198). Использовали только сыворотку, не содержащую вирус вирусной диареи крупного рогатого скота и его антитела. "Китайский" вакцинный штамм (С-штамм) вируса классической свиной лихорадки адаптировали к клеткам SK6-М так, как это описывается в заявке на европейский патент 351901. Штамм под названием "Cedipest" не обладал цитопатическими свойствами и биологически клонировался путем трехкратного титрования в конечной точке. После трех этапов амплификации был получен клонированный вирус с титром, равным 3,510⁶ 50%-ной тканевой цитопатогенной дозе/мл.

Выделение цитоплазматической РНК из клеток SK-6, инфицированных С-штаммом.

Внутриклеточную РНК из клеток, инфицированных С-штаммом, выделяли так, как описано ( Moormann и др., 1990, Virology, 177: 184-198). Для этого монослои клеток SК6-М в колбах объемом 162 см³ (Costar) инфицировали штаммом "Cedipest" путем нескольких заражений (множественность заражения) пятью 50%-ми тканевыми цитопатогенными дозами на клетку. После этого клетки инкубировали в течение 1,5 часов при температуре 37^oС и добавляли свежую среду до конечного объема, равного 40 мл. Через 7 часов добавляли актиномицин D до достижения конечной концентрации, равной 1 мкг/мл. Через 24 часа клетки дважды промывали холодным забуференным фосфатом физиологическим раствором и лизировали охлажденным льдом буфером для лизиса (50 ммолей трис-HCl, рН 8,2, 0,14 моля NaCl, 2 ммоля MgCl₂, 5 ммолей дитиотреитола, 0,5% (в объемном отношении) NP-40, 0,5% (в отношении веса к объему) дезоксихолата натрия и 10 ммолей ванадат-рибонуклеозидных комплексов (New England Biolabs). Лизаты центрифугировали (4^oС, 5 минут, 4000 g ) и в течение 30 минут при температуре - 37^oС надосадочную жидкость обрабатывали протеиназой К (250 мкг/мл, конечная концентрация), дважды экстрагировали фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом (49: 49:2) и один раз экстрагировали хлороформом и изоамиловым спиртом (24:1). РНК хранили в этаноле.

Синтез и амплификация кДНК

1-2 мкг цитоплазматической РНК из клеток, инфицированных С-штаммом, и 20 пмолей (-)смыслового праймера инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре с 1 мкл 10 ммолей гидроксида метилртути. Денатурированную РНК затем инкубировали с 1 мкл 286 ммолей -меркаптометанола в течение 5 минут при комнатной температуре. РНК транскрибировали в течение 45 минут при температуре 42^oС с помощью 200-400 единиц обратной транскриптазы M-MLV, не содержащей РНКазу Н (Promega), в 1 объеме буфера обратной транскриптазы M-MLV (50 ммолей трис-HCl, рН 8,3, 75 ммолей КСl, 3 ммоля МgСl₂ и 10 ммолей дитиотреитола), содержащем 40 единиц рРНКазина (Promega) и 80 мкл дАТФ, дГТФ, дКТФ и дТТФ. Конечный объем реакционной смеси составлял 25 мкл. Образцы покрывали 30 мкл минерального масла (Sigma).

После обратной транскрипции образцы денатурировали в течение 10 минут при температуре 94^oС. Порции из каждой реакции обратной транскрипции объемом 2,5 мкл амплифицировали посредством полимеразной цепной реакции на протяжении 39 циклов (цикл: 94^oС, 60 секунд; 55^oС, 60 секунд и 72^oC, 1-2 минуты) в 100 мкл Taq -полимеразного буфера (предоставлен изготовителем Таq-полимеразы), содержащего 1 мкмоль (+) и (-) смысловых праймеров, 200 мкмолей каждого из четырех нуклеозид-5"-трифосфатов и 2,5 единицы Таq-полимеразы ДНК (Boehringer Mannheim). Образцы покрывали 75 мкл минерального масла (Sigma).

Клонирование кДНК, охватывающей первичный геном С-штамма

Геном С-штамма клонировали в результате выполнения двух независимых циклов. Во время первого цикла клонирования (фиг. 1А) праймеры для синтеза одноцепочечной кДНК и полимеразную цепную реакцию выбирали на основе гомологии между последовательностями штаммов Вresсia Moormann и др., 1990, Virology, 177: 184-198) и Alfort (Meyers и др., 1989, Virology, 171: 555-567) вируса классической свиной лихорадки и штаммов Osloss ( Renard и др., европейский патент 0208672) вируса вирусной диареи крупного рогатого скота и NADL (Collett и др., 1988, Virorlogy, 165: 191-199). Для достижения оптимальной амплификации размеры фрагментов кДНК выбирали равными 0,5-2,5 тысячам пар нуклеотидов. Продукты амплификации, очищенные гелем, обрабатывали ДНК-полимеразой Т4 и ДНК-полимеразой 1 Кленова, а затем фосфорилировали полинуклеотидкиназой Т4. После этого фрагменты кДНК лигировали с помощью лигазы Т4 в сайт Smаl. pGEM4 Z-синего.

Во втором цикле клонирования (фиг. 1В) праймеры выбирали из последовательности кДНК-клонов, полученной после первого цикла клонирования. Праймеры по возможности содержали сайты рестрикции, пригодные для клонирования амплифицированных фрагментов кДНК. После обратной транскрипции и амплификации посредством полимеразной цепной реакции (см. выше) фрагменты кДНК или рассекали двумя разными рестрикционными ферментами, или дефосфолировали и фосфорилировали (как описывалось выше) у одного конца и гидролизовали приемлемым рестрикционным ферментом у другого конца. Если было невозможно использовать в праймерах сайты рестрикции, введенные посредством полимеразной цепной реакции, для клонирования выбирали сайт в амплифицированном фрагменте кДНК. После очистки гелем продукты полимеразной цепной реакции лигировали в очищенный на теле hGЕМ4-Z-синий (Promega) или pGEM5Zf (+) (Promega), гидролизованный рестрикционными ферментами, образующими концы, сопоставимые с концами продуктов полимеразной цепной реакции.

Чтобы получить кДНК-клоны, содержащие последние 5"-и 3"-концы генома С-штамма, мы использовали метод лигирования по 3"-5"- концам (Mandl и др., 1991, Journal of Virology 65: 4070-4077). Цитоплазматическую РНК выделяли из клеток, инфицированных С-штаммом, как описывалось выше, и очищали через слой 5,7 СsСl (Moormann and Hulst, 1988, Virus Res., 11: 281-291). На основании результатов, позволяющих предположить, что у 5"-конца генома вируса вирусной диареи крупного рогатого скота отсутствует 5"-кэп (Brock и др., 1992, J.Virol. Meth., 38: 39-46), геномную РНК С-штамма лигировали без предварительной обработки пирофосфатазой. 8 мкг РНК лигировали в реакционной смеси, содержащей 50 ммолей трис-HCl, рН 8,0, 10 ммолей МgCl₂, 10 ммолей дитиотреитола, 20 единиц рРНКазина (Promega), 10 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (без РНКазы) и 1 ммоль АТФ, с использованием 10 единиц лигазы РНК Т4 (New England Biolabs). Эту смесь инкубировали в течение 4 часов при температуре 37^oС. РНК экстрагировали смесью фенола и хлороформа, осаждали этанолом, собирали осадок и вновь суспендировали в воде, не содержащей РНКазы. Порции РНК (2 мкг) были обратно-транскрибированы и амплифицированы так, как описывалось выше. Порции каждой полимеразной цепной реакции объемом 2 мкл повторно амплифицировали с использованием набора праймеров. Для обратной транскрипции использовали (-)смысловой праймер, который гибридизировали в 5"-концевой некодирующей области. Для двух стадий амплификации в соответствии с полимеразной цепной реакцией мы использовали (+) смысловые праймеры, гибридизируемые в 3"-концевой некодирующей области, и (-) смысловые праймеры, гибридизируемые в 5"-концевой некодирующей области. После экстракции смесью фенола и хлороформа и осаждения этанолом продукты, полученные в результате полимеразной цепной реакции, гидролизовали Ncol (включенным в (+)смысловой праймер, использованный в полимеразной цепной реакции) и Еаg 1 (нуклеотид 81 в последовательности с идентификационным 1) и лигировали в сайты Ncol-Eaql области рUС21 (Vieira and Messing, 1991, Gene, 199: 189-194).

Все процедуры модификации и клонирования, использованные в примере 1, выполняли, как описано (Sam-brook и др., 1989, Molecular, cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Коулд-Спринг-Харбор, шт. Нью-Йорк). Рестрикционные ферменты и модифицирующие ДНК ферменты покупали и использовали в соответствии с указаниями изготовителей. Плазмиды трансформировали и поддерживали в штамме DН5а Escherichia coli (Hanahan., 1985, DNA cloning 1: 109-135).

Секвенирование кДНК-клонов

Плазмидную ДНК, используемую для секвенирования, экстрагировали и очищали посредством щелочного лизиса и осаждения хлористым литием или центрифугирования в хлористом цезии (Sambrook и др., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory, Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Коулд-Спринг-Харбор, шт. Нью-Йорк). Набор для секвенирования на основе полимеразы Т7 (Pharmacia) использовали для прямого двухцепочечного секвенировали плазмидной ДНК. Помимо SР6, Т7 и универсальных прямых и обратных праймеров pUC/M13 использовали олигонуклеотидные затравки на основе последовательности штамма Brescia вируса классической свиной лихорадки (Moormann и др., 1990, Virology, 177: 184-198). Праймеры синтезировали с помощью синтезатора ДНК "Cyclone" (New Brunswick Scientific) или синтезатора ДНК/РНК 392 (Applied Biosystems). Продукты реакции секвенирования анализировали на 6% акриламидном геле, содержащем 8 молей мочевины. Данные секвенирования анализировали на компьютере Compaq 386 с помощью аппаратных средств "Speedreader" и программного обеспечения Intelligenetics Inc, Applied Imageing Corp., Женева, Швейцария) и на компьютере Apple Macintosh с программным обеспечением MacMollytetra.

Учитывая возможность ошибок секвенирования или расхождений, вызыванных Таq-полимеразой или гетерогенностью РНК С-штамма, всю геномную последовательность кДНК-клонов С-штамма определяли путем секвенирования как минимум двух кДНК-клонов, полученных после независимых полимеразных реакций синтеза цепи. В случае выявления расхождений между нуклеотидными последовательностями двух клонов определенной области, определяли обобщающую нуклеотидную последовательность этой области путем секвенирования третьего кДНК-клона, полученного после выполнения еще одной независимой полимеразной реакции синтеза цепи (фиг. 1А).

Пример 2.

Синтез инфекционных транскриптов первичной ДНК-копии генома С-штамма.

Конструкция кДНК-клона pPRKf1c-113. Первичную ДНК-копию геномной РНК С-штамма создавали по схеме, изображенной на фиг. 3. Сначала создавали два субклона, один из которых (pPRc64) содержал последовательность кДНК 5"-концевой половины генома (нуклеотиды 1-5560), а второй (pPRc111) - последовательность кДНК 3"-концевой половины генома (нуклеотиды 5463-12311). Первоначально созданную конструкцию первичного кДНК-клона анализировали в pGEM4z -синем. Однако этот подход оказался неудачным из-за нестабильности первичной вставки в этот вектор. Для увеличения стабильности клонов вставки 5"- и 3"-концевых половин клонов вторично клонировали в производном вектора рОК12 с малым числом копий (Vieira and Messing, 1991. Gene, 100: 189-194), в результате чего были получены клоны рРRс108 и pPRcl23. На этом этапе вектор рОК12 модифицировали путем удаления большинства сайтов рестрикции, сайта множественного клонирования и последовательности промотора Т7. Полученный вектор, pPRK, который использовали для дальнейшего первичного клонирования, содержал уникальные сайты Spel, Notl, Eagl, BamH1, EcoRV, EcoRl и Xbal в сайте множественного клонирования.

Первичный клон рРRКf1c-113 имеет следующую конструкцию (фиг. 3). Вставки плазмид pPRc45 и pPRc46 соединялись в сайте Hpal, находящемся в положении нуклеотида 1249 в последовательности С-штамма (последовательность с идентификационным 1), образуя плазмиду pPRc49. Вставка pPRc49 далее присоединялась к вставке рРRс44 в сайте Nsil, находящемся в положении нуклеотида 3241 (последовательность с идентификационным 1), образуя pPRc63. 5"-Концевую половину клона pPRc64 (нуклеотиды 1-5560, последовательность с идентификационным 1) создавали путем соединения вставки pPRc63 с амплифицированным (полимеразная цепная реакция) фрагментом кДНК последней 5"-концевой области геномной РНК С-штамма. Получали 5"-концевой (+)смысловой праймер, содержащий сайты EcoRl и Satl, за которым шла последовательность полимеразного промотора РНК Т7 и первые 23 нуклеотида геномной РНК С-штамма. Этот промотор и (-)смысловой праймер второго цикла клонирования использовали для амплификации фрагмента кДНК, который гидролизовали посредством EcoRl и Хhоl и клонировали с образованием pPRc63 в результате гидролиза EcoRl-Xhol (нуклеотид 216 в последовательности с идентификационным 1). И, наконец, вставку pPRc64 еще раз клонировали с образованием pPRK в результате гидролиза EcoRl-Xhal, что позволило получить pPRc108.

3"-Концевую половину клона pPRc111 (нуклеотиды 5463-12311, последовательность с идентификационным 1) создавали путем соединения четырех клонов, полученных во втором цикле (pPRc67, 53, 58 и 55), и одного клона, полученного в первом цикле (рРRс14). Вставки рРRс67 и pPRc53 соединяли в сайте Nhе1, находящемся в положении нуклеотида 7778, с образованием pPRc71. Вставки pPRc55 и pPRc58 соединяли в сайте Apal, находящемся в положении нуклеотида 10387, с образованием pPRc65. Вставки рРRс65 и рРRс14 затем соединяли в сайте Аff11, находящемся в положении нуклеотида 11717, с образованием pPRc73. Вставку pPRc73 соединяли со вставкой pPRc71 в сайте Pstl, находящемся в положении нуклеотида 8675, с образованием pPRc79. После этого вставку pPRc79, содержащую полную 3"-концевую последовательность кДНК С-штамма, модифицировали так, чтобы можно было ввести сайт Srfl, который после гидролиза образовывал точный 3"-конец последовательности кДНК С-штамма (точная транскрипция 3"-конца). С этой целью синтезировали 3"-концевой (-)смысловой праймер, содержащий сайты Srfl и Xbal и 18 нуклеотидов, дополняющих 3"-концевую последовательность геномной РНК С-штамма. Этот праймер и (+)смысловой праймер, полученный в первом цикле клонирования, использовали для амплификации фрагмента кДНК. Этот фрагмент гидролизовали с помощью сайтов Sреl (положение нуклеотида 11866, последовательность с идентификационным 1) и Xbal и клонировали с образованием рРRс79, гидролизованного посредством Sbel -Xbal, в результате чего получали pPRclll.

Наконец, создавали первичный кДНК-клон pPRKf1c-113, для чего специфичный для С-штамма фрагмент Nсоl5532- Xbalmcs вектора pPRc111 вставляли в вектор pPRc108, гидролизованный посредством Nсо15532 - Xbal mcs.

Конструкция первичного клона pPRK-f1c-133

Первичный кДНК-клон pPRKf1c-113 помимо "молчащих" нуклеотидных мутаций включал пять точковых мутаций, в результате которых происходила такая же замена аминокислот, как в аминокислотной последовательности, выделенной, по крайней мере, из двух кДНК-клонов, полученных в первой серии. Эти пять точковых мутаций в клоне pPRKf1c-113 заменяли преобладающей последовательностью (2 и 3) путем замены подвергнутых воздействию фрагментов ДНК соответствующими фрагментами ДНК, содержащими преобладающую последовательность.

5"-Концевую половину кДНК-клона pPRKc108 с точковой мутацией в положении нулеотида 4516 модифицировали путем замены фрагмента Scal3413 -Ncol5532 вектора pPRc108 фрагментом вектора pPRc124. Клон рРRс124 получали путем замены фрагмента Pvull 4485 -Nhel5065 вектора pPRc44 соответствующим фрагментом вектора pPRc32 (ср. фиг. 1). Новую 5"-концевую половину кДНК-клона обозначали как pPRcl29.

В целях клонирования создавали 3"-концевую половину клона путем удаления 5"-концевой части последовательности С-штамма pPRKf1c-113 из сайта Safl этого вектора (ср. фиг. 3) до сайта Hpal в положении нуклеотида 5509 (последовательность с идентификационным 1) с образованием вектора pPRcl23. В pPRcl23 нужно было изменить мутации в положениях нуклеотидов 8526, 9002, 10055 и 10295. Мутацию в положении 8526 восстанавливали на протяжении двух стадий. Сначала фрагмент Apal 8506 -PStl 8675 в pPRc53 заменяли фрагментом из pPRc90 с образованием вектора pPRcl25. Затем фрагмент Nhel 7378 - РStl 8675 вектора pPRcl23 заменяли фрагментом вектора pPRcl25 с образованием pPRcl27.

Чтобы восстановить три мутации в положениях 9002, 10055 и 10205, сначала модифицировали рРRс58 так, чтобы удалить сайт FSpl в этом векторе. На этом этапе удаляли фрагмент EcoRl mcs -Ndel вектора рРВс58 (разрыв Ndel в рGЕМ4Z-синем), что позволило получить pPRcl26. Плазмидный вектор pPRcl26 использовали для восстановления мутаций в положениях 10055 и 10205 для замены фрагмента Sасl9975 -Apal10387 соответствующим фрагментом вектора pPRc96 с образованием рРRс128. Мутацию в положении 9002 восстанавливали путем замены фрагмента Aat 11-Fspl9016 (разрыв Aat11 в рСЕМ4z -синем) вектора рРВс128 фрагментом Fspl9016 вектора pPRc90 с образованием pPRcl30. И наконец, фрагмент РStl 8675 -Apal10387 вектора pPRcl27 заменяли соответствующим фрагментом вектора pPRcl30, что позволило получить плазмиду pPRcl32. Все этапы субклонирования, на протяжении которых производилась замена отдельных мутаций, проверяли посредством секвенирования.

Первичный клон pPRKflc-133 создавали путем вставки фрагмента Ncol 5532 - Хbal mcs, плазмиды pPRcl32 в вектор pPRcl29, гидролизованный Ncol 5532 - Xbal mcs.

Конструкция гибридного первичного клона pPRKf1c-h6

Жизнеспособные мутанты С-штамма, содержащие другие антигены, можно получить из клона pPRKf1c-133 путем замены части гена Е1 этой конструкции аналогичным геном штамма Brescia вируса классической свиной лихорадки. Для этого фрагмента Nhel2443 -Affll 2999 вектора рРRс129 заменяли соответствующим фрагментом рРЕh6 (Van Rijn и др., 1992), что позволило получить 5"-концевую половину гибридного клона pPRc139. Первичный гибридный клон pPRKf 1с-h6 получали путем вставки фрагмента Ncol 5532 -Xfbal mcs вектора pPRcl32 в pPRcl39. После выполнения этой операции клон содержал антигенную область Е1 штамма Вrеscia вируса классической свиной лихорадки со специфическим сайтом Bg111.

Все процедуры модификации и клонирования, представленные в примере 2, выполняли в соответствии с указаниями, приведенными в противопоставленном материале (Sambrook и др. , 1989, Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Коулд-Спринг-Харбор, шт. Нью-Йорк). Ферменты рестрикции и модификации ДНК покупали в коммерческих предприятиях и использовали в соответствии с указаниями изготовителей. Плазмиды трансформировали и поддерживали в штамме DН5 Escheria coli (Hanahan., 1985 in DNA cloning 1: 109-135).

Транскрипция РНК in vitro

Плазмидную ДНК, используемую для транскрипции РНК in vitro очищали на колонках Qiagen (Westburg) в соответствии с указаниями изготовителей. После перевода ДНК в линейную форму с помощью фрагмента Xba1 или Srfl плазмидную ДНК экстрагировали фенолом и хлороформом, осаждали этанолом, сушили в условиях вакуума и растворяли в соответствующем объеме воды, не содержащей РНКазу.

1 мкг линейной плазмидной ДНК использовали в качестве матрицы для транскрипции in vitro. РНК синтезировали в течение 1 часа при температуре 37^oС в 100 мкл реакционных смесей, содержащих 40 ммолей трис-HCl, рН 7,5, 6 ммолей MgCl₂, 2 ммоля спермидина, 10 ммолей дитиотреитола, 100 единиц рРНКазина (Promega) по 0,5 ммоля АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ и 170 единиц РНК-полимеразы Т7 (Pharmacia). Матричную ДНК удаляли путем гидролиза в течение 15 минут при температуре 37^oС с помощью ДНКазы 1, не содержащей РНКазы (Pharmacia), с последующей экстракцией фенолом и хлороформом и осаждением этанолом. РНК растворяли и 20 мкл воды, не содержащей РНКазы, и производили количественное определение путем измерения в ультрафиолетовой области спектра при длине волны 260 нм.

Трансфекция РНК

Смесь для трансфекции РНК получали путем осторожного смешивания 50 мкл раствора липофектина ( Gibco BRL) (10 мкг липофектина в воде, не содержащей РНКазы) и 50 мкл раствора РНК (1 мкг РНК в воде, не содержащей РНКазы) и инкубации этой смеси при комнатной температуре в течение 15 минут. Для трансфекции РНК использовали субклонфлюэнтные монослои SК6-клеток на 6-луночных планшетах для культивирования тканей диаметром 35 мм. Эти клетки дважды промывали средой Игла, модифицированной по способу Дульбекко. После этого к клеткам добавляли 1 мл указанной выше среды, а затем смесь для трансфекции РНК. После инкубации в течение 16 часов при температуре 37^oС эту среду заменяли 2 мл среды Игла, модифицированной по способу Дульбекко, в которую было добавлено 5% сыворотки плода коровы. Инкубацию продолжали еще в течение 3 дней при температуре 37^oС. Затем клетки подвергали иммунному окрашиванию с использованием специфических моноклональных антител вируса классической свиной лихорадки в результате применения анализа монослоя иммунопероксидазы в соответствии с описанием, приведенным Венсвортом и др. (Vet. Microbiol., 1986, 12: 101-108).

Характеристика рекомбинантных вирусов С-штамма

Надосадочные жидкости трансфецированных клеток переносили на планшеты с лунками диаметром 35 мм, содержащими конфлюэнтные монослои SК6-клеток, и инкубировали в течение 5 дней при температуре 37^oС. Клетки трансфецированных монослоев обрабатывали трипсином, разбавляли в 7,5 раз средой Игла, модифицированной по методу Дульбекко, и культивировали еще в течение 7 дней при температуре 37^oС в колбах объемом 75 см² (Costar). После этого клетки культуры вируса дважды замораживали и оттаивали, суспензии клеток осветляли центрифугированием при 5000g в течение 10 минут при температуре 4^oС и собирали надосадочные жидкости.

Вирус характеризовали путем анализа монослоя иммунопероксидазы и рестрикционного анализа жизнеспособных фрагментов, амплифицированных посредством полимеразной цепной реакции. После заражения SК6-клеток вирусами FLc-h6 и F1c-133 монослои инкубировали в течение 4 дней при температуре 37^oС. Затем монослои подвергали иммуному окрашиванию моноклональными антителами против консервативных (моноклональное антитело b3, домен А) и неконсервативных (моноклональные антитела b5 и b6, домены В+С) эпитопов белка Е1 штамма Bresciа, а также моноклональными антителами, специфичными для С-штамма и направленными против белка Е1 (моноклональное антитело с2) или Е2 (моноклональное антитело с5) (Wensvoort G.,1989, в работе Thesis, стр. 99-113, Утрехт, Нидерланды). Монослои SК6-клеток, зараженных нативным вирусом Brescia или нативным вирусом С-штамма, использовали в этом анализе в качестве контрольных образцов. Результаты приведены в таблице 1 и соответствуют прогнозируемым данным. Моноклональное антитело b3 распознает эпитоп белка Е1, консервативный в штаммах вируса классической свиной лихорадки, и поэтому распознает все штаммы, представленные в таблице 1. Моноклональные антитела b5 и b6 не распознают белок Е1 С-штамма и поэтому взаимодействуют только со штаммами Brescia и F1с-h6. В отличие от этого моноклональное антитело с2 не распознает белок Е1 штамма Brescia и поэтому взаимодействует только со штаммами С и F1c-133. И, наконец, моноклональное антитело с5 не распознает белок Е2 штамма Brescia и поэтому взаимодействует со всеми вирусами, представленными в таблице 1, за исключением штамма Brescia.

Геномная РНК вируса F1c- h6 должна содержать специфический сайт Bglll, который находится в гене Е1 (см. выше). Чтобы удостовериться в наличии этого сайта, цитоплазматическую РНК выделяли из SК6-клеток, зараженных рекомбинантным вирусом F1c-h6 или вирусом F1c-133, амплифицированным с помощью полимеразной цепной реакции, описанной выше, с использованием праймеров, описанных Van Rijn и др. (1993, J. Hen. Virol., 74: 2053-2060), и гидролизовали фрагментом Bg111 Амплифицированный фрагмент из 1091 пар оснований F1с-h6 разрывался под действием Bg111 c образованием фрагментов, состоящих из 590 и 501 пар оснований, в то время как амплифицированный фрагмент F1c-133 оставался неповрежденным.

Пример 3

Иммунизация поросят делеционными мутантами белка Е1

Конструкция и экспрессия делеционных мутантов белка Е1 штамма Brescia вируса классической свиной лихорадки.

Как известно, белок Е1 без трансмембранной области штамма Brescia вируса классической свиной лихорадки, экспрессируемый клетками насекомых, вызывает защитную иммунную реакцию у свиней против классической свиной лихорадки (Hulst и др. , 1993, J.Virol., 67: 5435-5442). Были также определены два антигенных элемента, А и В+С, в N-концевой половине белка Е1, где образуются антитела, нейтрализующие вирус классической свиной лихорадки (Wensvoort, 1989, J. Gen. Virol., 70: 2865-2876; Van Rijn и др., 1992, Vet. Microbiol., 33: 221-230; Van Rijn и др., 1993, J. Gen. Virol., 74:2053-2060). Кроме того, антитела, оказывающие нейтрализующее действие на домен А и домены В+С, синергически нейтрализуют вирус классической свиной лихорадки (Wensvoort, 1989, J. Gen. Virol., 70: 2865-2876). Чтобы оценить иммуногенность мутантных белков Е1 с делецией доменов В+С или домена А, были созданы соответствующие конструкции в бакуловирусном векторе и экспрессированные мутантные белки были испытаны на свиньях.

Бакуловирусы, экспрессирующие мутантные белки Е1, создавали путем перекрывающей рекомбинации ДНК вируса АсNРV дикого типа (вирус ядерного полиэдроза Autographa Californica ) и ДНК вектора переноса рАсМо8, включающего последовательность, кодирующую определенный мутантный белок El. Вектор переноса рАсМо8 получали из рАсАs3 (Vlak и др., 1990, Virology, 179: 312-320) путем введения фрагмента Т непосредственно в 5"-конец первого основания (G) специфического сайта BamH1 последнего вектора. Таким образом создавали стартовый кодон АТG, перекрывающий первое основание G сайта ВаmH1. Матричную РНК транскрибировали из гетерологичных последовательностей, введенных в сайт BamH1 с помощью промотора р10 AcNPV.

Последовательности, кодирующие мутантные белки Е1, получали из вставки pPRb2 белка E1 (Van Rijn и др., 1992, Vet. Microbiol., 33: 221-230) путем амплификации с помощью полимеразной реакции синтеза цепи. В этой связи были созданы два праймера, включающие сайт BamH1 в своей последовательности. 5"-Концевой (+)смысловой праймер имеет последовательность (последовательность с идентификационным 2). Подчеркнутая последовательность в этом праймере идентична нуклеотидам 2362-2381 в последовательности штамма Brescia (Moormann и др., 1990, Virology, 177: 184-198), жирным шрифтом обозначен сайт BamH1. 3"-Концевой (-)смысловой праймер включает стоп-кодон, расположенный рядом с сайтом ВаmH1. Он имеет последовательность (последовательность с идентификационным 3). Подчеркнутая последовательность в этом праймере соответствует нуклеотидам 3433-3453 в последовательности штамма Brescia (Moormann и др., 1990, Virology, 177: 184-198); жирным шрифтом показан сайт ВаmН1, а курсивом - стоп-кодон.

Амплифицированные последовательности клонировали в сайте ВаmH1 вектора рАсМо8 и проверяли в отношении правильной ориентации в векторе с помощью рестрикционного анализа. Правильный вектор переноса обозначали как pPAb11. Перекрывающую рекомбинацию между ДНК вируса АсNРV и ДНК вектора pPAb11, селекцию и очистку бакуловирусного вектора, экспрессирующего белок Е1, выполняли в соответствии с описанием, приведенным в противопоставленном материале ( Hulst и др., 1993, Virol., 67: 5435-5442). Дальнейшее исследование белка El посредством радиоиммунопреципитационных анализов и специфических моноклональных антител Е1 было также описано Халстом и др. (J.Virol., 1993, 67: 5435-5442). Полученный рекомбинантный бакуловирус экспрессирует белок Е1 штамма Brescia дикого типа без трансмембранной области (ср. второй столбец сверху на фиг. 3). Белок Е1 без трансмембранной области секретируется клетками (Hulst и др., 1993, J. Virol., 67: 5435-5442).

Делецию области, кодирующей домены В+С, из гена белка Е1 вектора pPAb11 производили путем замены фрагмента Nhel-Bglll в этой конструкции соответствующим фрагментом вектора рРЕh14 (Van Rijn и др., 1993, J. Gen. Virol., 74: 2053-2060). Полученный вектор переноса обозначали как рРАb16. Он включал делецию в гене белка Е1, охватывающую кодоны 693-746. Аналогичным образом, область, кодирующую домен А, удаляли из вектора pPAbll путем замены фрагмента Nhel-Bg111 вектора pPAbll соответствующим фрагментом вектора pPEh18 (Van Rijn и др., 1993, J. Gen. Virol., 74: 2053-2060), в результате чего был получен вектор переноса pPAbl2. Этот вектор включает делецию в гене белка Е1, охватывающую кодоны 800-864.

Рекомбинантные бакуловирусы, экспрессирующие удаленные белки Е1, создавали, отбирали и характеризовали в отношении продуктов экспрессии Е1 так, как описывалось выше.

Иммунизация и контрольное заражение поросят

Группы из четырех (или двух) поросят в возрасте 6-8 недель без признаков заражения специфическими патогенами, вакцинировали внутримышечно в нулевой (0) день 1 мл водомасляной эмульсии, содержащей 4 мкг (мутантного) белка Е1, и повторно вакцинировали на 28-й день 1 мл двойной водомасляной эмульсии, содержащей 15 мкг (мутантного) белка El (таблица 2). Конструкция мутантного белка Е1, содержащего делецию в домене А или домене В/С, и белка Е1 дикого типа описывалась выше и представлена конструкциями, изображенными на фиг. 5. Для первой вакцинации, производимой в нулевой (0) день, использовали надосадочную жидкость клеток насекомых, зараженных соответствующими рекомбинантными бакуловирусами. Количество белка Е1 в надосадочной жидкости калибровали так, как описывалось в противопоставленном материале (Hulst и др., 1993, J. Virol. , 67: 5435-5442). Для повторой вакцинации, производимой на 28-день, белок Е1 очищали посредством иммуноаффинного электрофореза из надосадочной жидкости зараженных клеток насекомых (Hulst и др., 1993, там же). Поросят из всех вакцинированных групп и невакцинированной контрольной группы, в которую входили два животных без признаков заражения специфическими патогенами, подвергали контрольному инфицированию путем введения в нос 100 доз, вызывающих гибель 50% организмов штамма Brescia 456610 вируса классической свиной лихорадки (Terpstra and Wensvoort, 1988, Vet. Microbiol., 16: 123-128). Такая доза контрольного заражения вызывает у невакцинированных поросят острую форму болезни, которая сопровождается сильным жаром и тромбоцитопенией, возникает на третий-пятый день и становится причиной гибели животных на седьмой-одиннадцатый день. Пробы гепаринизированной (этилендиаминтетрауксусная кислота) брали на 40, 42, 45, 47, 49, 51, 53 и 56 день после вакцинации и анализировали на содержание тромбоцитов и вируса классической свиной лихорадки в соответствии с описанием, приведенном в противопоставленном материале (Hulst и др., 1993, там же). Пробы сыворотки крови брали на 0, 21, 28, 42 и 56 день и анализировали посредством твердофазного иммуноферментного анализа с комплексной трэппинг-блокировкой (Wensvoort и др. , 1988, Vet. Microbiol., 17: 129-140) и нейтрализующего пероксидаза-связанного анализа (NРLA, Terpstra и др., 1984, Vet. Microbiol., 9: 113-120) с целью обнаружения (нейтрализации) антител против вируса классической свиной лихорадки. Результаты тестирования с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с комплексной трэппинг-блокировкой выражали в виде процентного значения игибирования стандартного сигнала; ингибирование <30% является отрицательным, ингибирование 30-50% неопределенным, ингибирование > 50% положительным. Титры нa основе нейтрализующего пероксидаза-связанного анализа выражены как эквивалент разведения сыворотки, который нейтрализует 100 50%-ных тканевых цитопатогенных доз штамма Brescia в 50% реплицированных культур.

Всех животных ежедневно осматривали с целью выявления симптомов болезни и измеряли у них температуру тела. Клиническими симптомами заболевания были жар, анорексия, лейкопения, тромбоцитопения и паралич.

Пример 4.

Разработка твердофазного иммуноферментного анализа с комплексной трэппинг-блокировкой (дифференциального твердофазного иммуноферментного анализа с комплексной трэппинг-блокировкой) для выявления вируса классической чумы свиней на основе одного моноклонального антитела

Описание диагностического теста.

В этом примере описывается твердофазный иммуноферментный анализ с комплексной трэппинг-блокировкой (CTB-ELISА) и его разновидность CTB-DIF (дифференциальный твердофазный иммуноферментный анализ с комплексной трэппинг-блокировкой), которые представляют собой модификацию существующего твердофазного иммуноферментного анализа с комплексной трэппинг-блокировкой (Wensvoort и др. , 1988, Vet. Microbiol., 17: 129-140) и предназначены для обнаружения специфических антител вируса классической свиной лихорадки.

Дифференцильный твердофазный иммуноферментный анализ с комплексной трэппинг-блокировкой основывается на открытии того, что клетки SF21, инфицированные рекомбинантным бакуловирусом, экспрессирующим белок Е1 с трансмембранной областью, выделяют в среду димеризованный белок Е1. Этот белок был обнаружен в результате анализа сред с клетками, инфицированными вышеуказанным бакуловирусом, на вестерн-блот после электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия в невосстанавливающих условиях. В димерах Е1 имеются две копии эпитопа (по одной для каждого мономера) для специфических монокалональных антител белка Е1. Таким образом, вместе с димеризованным антигеном можно использовать специфическое моноклональное антитело определенного белка Е1, которое является иммобилизованным антителом, нанесенным на стенки лунки титрационного микропланшета, и одновременно детектирующим антителом, связанным с пероксидазой хрена.

Дифференциальный твердофазный иммуноферментный анализ с комплексной трэппинг-блокировкой можно применять вместе с субъединичной вакциной E1, имеющей делецию в домене А (см. фиг. 5 для ознакомления с конструкцией). С помощью этого метода удалось дифференцировать специфические антитела вируса классической чумы свиней, образующиеся у поросят, вакцинированных белком Е1 с удаленным доменом А, и специфические антитела вируса классической чумы свиней, образующиеся у поросят, зараженных слабовирулентными штаммами Henken, Zoelen, Bergen, 331 и Cedipest (заявка на европейский патент 351901).

Четыре поросенка без признаков заражения специфическими патогенами, которым были присвоены номера 766, 786, 789 и 770, вакцинировали мутантным белком Е1, имеющим делецию в домене А, как это описывалось в примере 3 (см. также таблицу 2), и подвергали контрольному заражению вирулентным штаммом Brescia вируса классической чумы свиней на 44-й день после вакцинации. Производили анализы сыворотки, взятой на 28, 42 и 56-й день.

Сыворотку против слабовирулентных штаммов вируса классической свиной лихорадки получали также в группах из четырех поросят без признаков заражения специфическими патогенами. Сыворотку, взятую у поросят, зараженных штаммами Henken, Zoelen, Веrgеn и 331, анализировали на 0, 21, 28 и 42-й день после заражения. Сыворотку, взятую у поросят, вакцинированных вакциной Cedipest, анализировали на 0, 44, 72 и 170-й день после вакцинации.

Вышеуказанную сыворотку анализировали с помощью трех разных тестов. Тест 1 представляет собой нейтрализующий пероксидаза-связанный анализ, описанный Terpstra и др., 1984 (Vet. Microbiol., 9: 113-120), который предназначен для обнаружения нейтрализующих антител против вируса классической свиной лихорадки. Тест 2 представляет собой твердофазный иммуноферментный анализ с комплексной трэппинг-блокировкой (Wensvoort и др., 1988, Vet. Microbiol., 17: 129-140), предназначенный для обычного обнаружения антител против вируса классической свиной лихорадки.

В дифференциальном твердофазном иммуноферментном анализе с комплесной трэппинг-блокировкой использовали моноклональное антитело b3 (известное также как CV1-HCV -39.5) (Wensvoort 1989, J. Gen. Virol. Virol., 70: 2865-2876), способное распознавать эпитоп, находящийся в домене А1 белка Е1 вируса классической свиной лихорадки. Лунки планшета для твердофазного иммуноферментного анализа покрывали моноклональным антителом b3 (степень разбавления 1: 2000) (иммобилизованное антитело). После промывки лунок в них вводили моноклональное антитело b3, связанное с пероксидазой хрена (степень разбавления 1: 4000) (детектирующее антитело). Среду с клетками Sf21, инфицированными бакуловирусом, образующим Е1 с трансмембранной областью и содержащим димеризованный белок Е1 в концентрации до 20 мкг/мл, разбавляли в отношении 1:500 и предварительно инкубировали в тестируемой сыворотке (степень разбавления 1:2,5). Смесь сыворотки с антигеном добавляли к конъюгату в лунки планшета для твердофазного иммуноферментного анализа. После инкубации лунки промывали еще раз и добавляли раствор хромогена в субстрате. Если иммобилизованное и конъюгированное моноклональное антитело связывается с антигеном, пероксидаза хрена вызывает хромогенную реакцию, указывая на то, что тестируемая сыворотка является отрицательной для антител вируса классической свиной лихорадки. Если этот эпитоп в антигене блокируется антителами тестируемой сыворотки, конъюгат пероксидазы хрена удаляется промыванием и лунки остаются чистыми, свидетельствуя о том, что тестируемая сыворотка содержит в домене А1 антитела против вируса классической свиной лихорадки. Результаты, полученные при выполнении трех разных серологических тестов, даны в таблице 3.

На 42-й день после вакцинации сыворотка поросят, вакцинированных белком Е1 с делецией в домене А, реагировала при выполнении нейтрализующего пероксидаза-связанного анализа и твердофазного иммуноферментного анализа с комплексной трэппинг-блокировкой и не реагировала в процессе выполнения дифференциального твердофазного иммуноферментного анализа с комплексной трэппинг-блокировкой. После контрольного заражения штаммом Brescia вируса классической свиной лихорадки вирулентная сыворотка тех же поросят давала положительную реакцию во всех трех тестах на 56-й день после вакцинации (12-й день после контрольного заражения), свидетельствуя о том, что после контрольного заражения имел место бустер-эффект. Начиная с 21-го дня после заражения, сыворотка поросят, вакцинированных штаммами Henken, Zoelen, Bergen и 331, положительно реагировала при выполнении нейтрализующего пероксидаза - связанного анализа, твердофазного иммуноферментного анализа с комплексной трэппинг-блокировкой и дифференциального твердофазного иммуноферментного анализа с комплексной трэппинг-блокировкой. Начиная с 44-го дня после вакцинации то же самое было верным для поросят, вакцинированных вакцинным штаммом Сеdipest.

Таким образом, дифференциальный твердофазный иммуноферментный анализ с комплексной трэппинг-блокировкой позволяет получить необходимые результаты и может использоваться вместе с вакциной-маркером с мутированным доменом А белка Е1 вируса классической свиной лихорадки, поскольку антитела против этого мутированного домена не конкурируют с моноклональным антителом b3 в отношении воздействия на эпитоп этого моноклонального антитела.

Антиген, используемый в дифференциальном

твердофазном иммуноферментном анализе с комплексной трэппинг-блокировкой, представляет собой димеризованный белок Е1 без трансмембранной области штамма Brescia дикого типа, изображенный на фиг. 5. Однако димеризованный белок Е1, синтезированный из конструкции с "делецией доменов В+С", показанной на фиг. 5, можно также использовать в качестве антигена при выполнении этого теста.

Пример 5

Сравнение твердофазных иммуноферментных анализов с комплексной трэппинг-блокировкой в отношении выявления вируса классической свиной лихорадки на основе белков Е1 и Е2

Описание диагностических тестов.

В этом примере описывается модификация дифференциального твердофазного иммуноферментного анализа с комплексной трэппинг-блокировкой по примеру 4 и твердофазный иммуноферментный анализ с комплексной трэппинг-блокировкой на основе белка Е2 вируса классической свиной лихорадки и сравнивается чувствительность этих методов с тремя другими твердофазными иммуноферментными анализами с комплексной трэппинг-блокировкой, предназначенными для детектирования антител против белка Е1, и с нейтрализующим пероксидаза-связанным (NPLA) (Terpstra и др., 1984, Vet. Microbiol., 9: 113-120).

В дифференциальном твердофазном иммуноферментном анализе с комплексной трэппинг-блокировкой по примеру 4, именуемом El-Bac-DIF в таблицах 4-8, используется белок Е1 без трансмембранной области, синтезированный в качестве антигена в клетках насекомых (клетки SF21). В модифицированном методе Е1-Вас-DIF, именуемом El-Bac-dBC-DIF, используется белок Е1 без трансмембранной области, синтезированный в качестве антигена в клетках насекомых (клетки SF21) с делецией доменов В+С (ср. фиг. 5). В соответствии с вестерн-блоттингом белок Е1 без трансмембранной области с удаленными доменами В+С выделяется из клетки в виде димера (результаты не приведены). Тестирование по методу El-bac-dBC- DIF выполняли следующим образом. Лунки планшета для твердофазного иммуноферментного анализа покрывали моноклональным антителом b3 (степень разбавления 1:4000) (иммобилизованное антитело), инкубировали в течение 16 часов при температуре 37^oС и промывали. Среду, содержащую димеризованный антиген El-dBC с концентрацией 20 мкг/мл, разбавляли в отношении 1: 50 и предварительно инкубировали с тестируемой сывороткой (степень разбавления 1: 2,5) (0,5 часа при температуре 37^oС). На покрытые планшеты для твердофазного иммуноферментного анализа наносили смесь сыворотки с антигеном. После инкубации в течение 1 часа при температуре 37^oС лунки промывали и добавляли моноклональное антитело b3, конъюгированное с пероксидазой хрена (степень разбавления 1:1000) (детектирующее антитело). После инкубации в течение 1 часа при температуре 37^oС лунки промывали еще раз и добавляли раствор хромогена в субстрате. Хромогенную реакцию выполняли в течение 10 минут при комнатной температуре. Результаты хромогенной реакции интерпретировали так же, как описывалось в примере 4.

Другими методами твердофазного иммуноферментного анализа с комплексной трэппинг-блокировкой, предназначенными для детектирования антител против белка Е1 вируса классической свиной лихорадки, представленными в таблицах 4-8, являются твердофазный иммуноферментный анализ белка Е1 вируса классической чумы свиней (Е1-СSFV ELISА) с использованием в качестве антигена нативного белка Е1 из клеток, зараженных вирусом классической свиной лихорадки (Wenvoort и др., 1988, Vet. Microbiol., 17: 129-140); дифференциальные твердофазные иммуноферментные анализы El-Вас и El-Bac-DIF с использованием белка Е1 без трансмембранной области, синтезированного в виде антигена в клетках насекомых. В твердофазных иммуноферментных анализах El-CSFV и Е1-Вас используются моноклональные антитела b3 и b8 вируса классической свиной лихорадки (Wensvoort, 1989, J. Gen. Virol., 70: 2865-2876) в виде иммобилизованного и детектирующего антитела, в то время как в твердофазном иммуноферментном анализе El-Bac-DIF используется только моноклональное антитело b3 в качестве как иммобилизованного, так и детектирующего антитела. Твердофазный иммуноферментный анализ El-CSFV выполняли точно в соответствии с описанием, приведенным Венсвортом и др., 1988 (Vet. Microbiol., 17: 129-140). Твердофазные иммуноферментные анализы El-Bac и El-Bac-DIF выполняли так, как описывалось выше для твердофазного иммуноферментного анализа El-Bac-dBC-DIF при внесении следующих изменений. В твердофазном иммуноферментном анализе El-Bac используемый антиген представлял собой раствор с соотношением 1:400 димеризованного белка Е1 в среде клеток SF21, инфицированных белком Е1 бакуловируса (ср. фиг. 5) при концентрации 20 мкг/мл. Моноклональное антитело b8, конъюгированное с пероксидазой хрена, представляет собой детектирующее антитело в этой модификации твердофазного иммуноферментного анализа и используется в виде раствора со степенью разбавления 1:1000. В дифференциальном твердофазном иммуноферментном анализе El-Bac-DIF используется такой же антиген, что и в твердофазном иммуноферментном анализе El-Bac, но при степени разбавления 1: 200. Моноклональное антитело b3, конъюгированное с пероксидазой хрена, использовали в этом твердофазном иммуноферментном анализе в качестве детектирующего антитела со степенью разбавления 1:1000.

В твердофазном иммуноферментном анализе Е2-Вас использовали антиген Е2 вируса классической свиной лихорадки, синтезированный в клетках SF21, инфицированных бакуловирусом СЕ2 (Hulst и др., 1994, Virology, 200: 558-565). Поскольку из инфицированных клеток насекомых не выделяется белок Е2, использовали лизат этих клеток. Подобно белку Е1 большая часть белка Е2 встречается в виде димеризованных молекул, если анализировать лизаты инфицированных клеток в неденатурирующих условиях на гелях для электрофореза в полиакриламидном геле с доцецилсульфатом натрия (результаты не приведены). Твердофазный иммуноферментный анализ с комплексной трэппинг-блокировкой на основе этого антигена Е2 позволяет получить оптимальные результаты при использовании с моноклональными антителами С5 и С12 (Wensvoort G., 1989, In Thesis, стр. 99-113, Утрехт). Однако можно также использовать белок Е2 только с моноклональным антителом С5 или С12. В конкурентном анализе моноклональные антитела С5 и С12 ингибируют активность друг друга в отношении связывания с белком Е2. Это свидетельствует о том, что эти моноклональные антитела распознают одинаковые или перекрывающиеся эпитопы в белке Е2 (результаты не показаны). Твердофазный иммуноферментный анализ Е2-Вас выполняли следующим образом. Моноклональное антитело С12 разбавляли в отношении 1:1000 и наносили на лунки планшета для твердофазного иммуноферментного анализа (16 часов при температуре 37^oС. После этого лунки промывали. Лизаты клеток SF21, инфицированных бакуловирусом СЕ2, разбавленные в отношении 1:1250, предварительно инкубировали с тестируемой сывороткой (1:1) в течение 0,5 часа при температуре 37^oС. В лунки сенсибилизированных планшетов вводили смесь сыворотки с антигеном и инкубировали в течение 1 часа при температуре 37^oС. После этого планшеты промывали и инкубировали с моноклональным антителом С5, конъюгированным с пероксидазой хрена (со степенью разбавления 1:2000). После инкубации в течение 1 часа при температуре 37^oС планшеты еще раз промывали и добавляли раствор хромогена в субстрате. Хромогенную реакцию выполняли в течение 10 минут при комнатной температуре. Результаты хромогенной реакции интерпретировали так же, как в примере 4. Все описанные выше разбавления производили в буфере для нейтрализующего пероксидаза-связанного анализа + 4% фотосистемы (Terpstra и др., Vet. Microbiol., 9: 113-120).

В таблице 4 приведены результаты анализа сыворотки трех поросят без признаков заражения специфическими патогенами, которых вакцинировали вакциной Cedipest с помощью описанных выше твердофазных иммуноферментных анализов с комплексной трэппинг-блокировкой и нейтрализующего пероксидаза-связанного анализа. Сыворотку анализировали на 0, 16, 23, 30, 37, 44, 50, 72, 113, 141 и 170-й день после вакцинации. В таблицах 5-8 приведены результаты анализа сыворотки группы из пяти поросят без специфических патогенов, зараженных слабовирулентными штаммами 331, Bergen, Henken и Zoelen вируса классической чумы свиней, который выполняли с помощью описанных выше методов твердофазного иммуноферментного анализа с комплексной трэппинг-блокировкой и анализа на основе нейтрализующей пероксидазы. Сыворотку анализировали на 0, 10, 14, 17, 24, 28, 35 и 42-й день после инфицирования. Начиная с 16-го дня после вакцинации, сыворотки поросят, вакцинированных штаммом Cedipest, реагировали в каждом из пяти методов твердофазного иммуноферментного анализа, а также в нейтрализующем пероксидаза-связанном анализе. В этот период времени чувствительность твердофазных иммуноферментных анализов Е2-Вас и El-Bac-dBC-DIF была такой же высокой, а, может быть, и выше, чем у трех других твердофазных иммуноферментных анализов с комплексной трэппинг-блокировкой. С 37-го по 170-й день после вакцинации вся сыворотка одинаково положительно реагировала во всех пяти твердофазных иммуноферментных анализах, а также в нейтрализующем пероксидаза-связанном анализе. Сыворотка поросят, зараженных слабовирулентными штаммами вируса классической свиной лихордки, реагировала также во всех пяти твердофазных иммуноферментных анализах с комплексной трэппинг-блокировкой и нейтрализующем пероксидаза-связанном анализе. За исключением нескольких случаев сопоставимость результатов реакции сыворотки в пяти твердофазных иммуноферментных анализах с комплексной трэппинг-блокировкой и в нейтрализующем пероксидаза-связанном анализе имела место с 21-го до 42-го дня после инфицирования. Приходилось анализировать большие количества сыворотки животных, зараженных слабовирулентными штаммами, чтобы сделать вывод о том, имеются ли существенные различия между чувствительностью, достигаемой в пяти твердофазных иммуноферментных анализах с комплексной трэппинг-блокировкой на ранней стадии заражения (до 17-го дня).

Можно сделать вывод о том, что твердофазные иммуноферментные анализы Е2-Вас и El-Bac-CTB- DIF характеризуются достаточно высокой степенью эффективности. Поэтому твердофазный иммуноферментный анализ Е2-Вас можно использовать вместе с вакциной-маркером вируса классической свиной лихорадки (например, мутированный или немутированный субъединичный белок Е1, вакцина-маркер С-штамма, модифицированная в области белка Е2), которая не вызывает образования антител, конкурирующих с моноклональными антителами в этом твердофазном иммуноферментном анализе. Твердофазный иммуноферментный анализ El-Bac-dBC-DIF в той же степени, что и твердофазный иммуноферментный анализ Е1-Вас-DIF (дифференциальный твердофазный иммуноферментный анализ с комплексной трэппинг-блокировкой по примеру 4) пригоден для использования с вакциной - маркером вируса классической свиной лихорадки с мутированным доменом А белка Е1, поскольку антитела против этого мутированного домена А не конкурируют с моноклональным антителом b3 за эпитоп для этого антитела.

Описание чертежей

На фиг. 1 дано схематическое изображение кДНК-клонов, используемых для определения нуклеотидной последовательности С-штамма. На фиг. 1А показана первая серия кДНК-клонов (см. текст). кДНК-клоны с номерами 32, 90 и 96 использовали для замены pPRKf1c-113 на pPRKf1c-133 (см. пример 2). Клон 14 был единственным кДНК-клоном первой серии, который использовали для конструкции pPRKf1c-113 (см. фиг. 3). На фиг. 1В представлена вторая серия кДНК-клонов (см. текст). Пронумерованные кДНК-клоны второй серии использовали для создания pPRKf1c-113 (см. последовательность с идентификационным 1). Положения кДНК по отношению к нуклеотидной последовательности генома С-штамма указаны масштабной линейкой (тысячи пар нуклеотидов) в нижней части чертежа. Схематическое изображение идентифицированных в настоящее время генов вируса классической свиной лихорадки и их структуры в геноме этого вируса дано в верхней части чертежа.

Специалисты в области номенклатуры пестивирусных белков до сих пор не пришли к определенному согласию. Описываемый здесь белок Е2 именуется также gр42 (Tamura и др., 1993, Virology, 193: 1-10), gр. 44/48(Thiel и др. 1991, J. Virol., 65: 4705-4712) или EO (Rumenapf и др., 1993, J. Virol. 67: 3288-3294). Белок Е2 именуется также gр25 (Tamura, и др., 1993, Virology, 193: 1-10), gp 33 (Thiel и др., 1991, J.Virol., 65: 4705-4712) или El (Rumenapf и др. , 1991, J. Virol. , 67: 3288-3294). Белок Е1 по настоящему изобретению именуется также gp53 (Tamura и др., 1993, Virology, 193: 1-10), gp 55 (Thiel и др. , 1991, J. Virol., 65: 4705-4712), gр 51-54 (Moormann и др., 1990,. Virology, 177:184-198) и Е3 (Rumenapf и др., 1993, J.Virol., 67:3288-3294). N-концевая аутопротеаза N^pro вируса классической свиной лихорадки (р20 вируса вирусной диареи крупного рогатого скота, Wiskerchen и др. 1991, J.Virol. , 64: 4508-4514), именуемая также р23, была идентифицирована Тиеном и др. , 1991 (J. Virol., 65: 4705-4712). Расщепление распознающей последовательности этой протеазы, сохраняющейся в пестивирусах, приводит к образованию N-конца С-штамма (Stаrк и др., 1993, J.Virol., 67: 7088-7095).

На фиг. 2 приведен сравнительный анализ первичной структуры нуклеотидных последовательностей 5"-конца (А) и 3"-конца (В) некодирующих областей штаммов Вrеsсia, Alfort и С вируса классической свиной лихорадки. За исключением первых 12 нуклеотидов 5"-концевая некодирующая последовательность штамма Brescia была описана Мурманном и др., 1990, J. Virology, 177: 184-198. Первые 12 нуклеотидов 5"-концевой некодирующей области штамма Brescia ранее не были рассмотрены в научной литературе. Подобно последним 5"- и 3"-концевым последовательностям генома С-штамма они были определены по методу лигирования 3"- 5"-концевой РНК, описанному в примере 1 настоящей заявки на патент. За исключением первых 9 нуклеотидов 5"-концевая некодирующая последовательность штамма Alfort была описана Мейером и др., 1989, Virology, 171: 555-567. Первые девять нуклеотидов генома штамма Alfort были представлены Мейером в диссертации, озаглавленной "Virus der Klassischen Schweinepest: Genomanalyse und Vergleich mit dem Virus der Bovinen Viralen Diarrhoe", 1990, Тюбинген, Германия. Последовательности 3"-концевых некодирующих областей штаммов Brescia и Alfort были описаны Мурманном и др., 1990, Virology, 177: 184-198, и Мейером и др., 1989, Virology, 171: 555-567. Стартовый кодон ATG и стоп-кодон TGA большой открытой рамки считывания (ср. последовательность с идентификационным 1) подчеркнуты.

На фиг. 3 дана схема конструкции первичного кДНК-клона pPBKflc-113. Номера клонов приведены в условных обозначениях на фиг. 1. Сайты слияния вставок клонов показаны вертикальными линиями. Сайты, соответствующие этим линиям, указаны в нижней части рисунка. Подчеркнутые номера клонов обозначают кДНК-клоны с векторными последовательностями рОК12 (Vieira and Messing, 1991, Gene, 100: 189-194) (см. фиг. 4). 5"- и 3"-концы pPRKflc-113 были получены наращиванием с помощью амплификации фрагментов кДНК посредством полимеразной цепной реакции (см. пример 2). Амплифицированные фрагменты обозначены аббревиатурой PCR. Масштабная линейка в нижней части чертежа и схематическое изображение структуры генома вируса классической свиной лихорадки описывались в условных обозначениях на фиг. 1.

На фиг. 4 дано схематическое изображение векторных последовательностей и первичных кДНК-вставок в клонах рРRКflc-113, pPRKflc-133 и рРRКf1с-h6. Структура вектора pPRK, производного рОК12 (Vieira and Messing, 1991, Gene, 100: 189-194) описывались в примере 2. Кап^R, ген устойчивости к канамицину; ORI, сайт инициации репликации; i, ген, кодирующей репрессор гена -галактозидазы; РО, область промотора/оператора гена -галактозидазы; lac Z, часть гена -галактозидазы, кодирующего субъединицу -галактозидазы. Указано несколько сайтов рестрикции вектора и последовательности, фланкирующие первичные вставки в вектор. Соответствующие сайты были рассмотрены в примере 2. Указатели и номера в pPRKflc-113 соответствуют нуклеотидам пяти кодонов, которые были заменены в этой конструкции, в результате чего был получен клон pPRKflc-133. Последняя конструкция включает последовательность, указанную в последовательности с идентификационным 1.

Черным квадратиком в pPRKf1с-h6 отмечена область белка Е1 клона рРRКflc-133, которая была заменена соответствующей областью штамма Brescia Являются ли транскрипты, выведенные из определенной первичной конструкции, инфекционными (+) или нет (-), указано справа от этой конструкции. Т7, последовательность промотора Т7. Вставки первичных конструкций указаны на масштабной линейке (тысячи пар нуклеотидов), представляя нуклеотидную последовательность С-штамма, указанную в последовательности с идентификационным 1.

На фиг. 5 дано схематическое изображение мутантных белков Е1, экспрессированных в клетках насекомых вектором бакуловируса. Все белки Е1 закодированы нуклеотидной последовательностью штамма Brescia (Moormann и др., 1990, Virology, 177: 184-198) и начинаются у N-конца фрагментом LyS в положении кодона 668 в большой открытой рамке считывания этой последовательности. С-конец нативного белка Е1 представляет собой фрагмент Lеu в положении кодона 1063 в большой открытой рамке считывания, в то время как С-концы трех других белков Е1 находятся в положении аминокислоты 1031. Точечными рамками отмечены N-концевая сигнальная последовательность, охватывающая аминокислотные остатки 668-689, внутренняя гидрофобная последовательность, охватывающая аминокислотные остатки 806-826, и С-концевая трансмембранная область, расположенная в области, охватывающей аминокислотные остатки 1032-1063 белка Е1. Удаленные аминокислотные последовательности в мутантных белках Е1 с делецией доменов В+С или А обозначены разрывами в полосках, представляющих эти белки. Расположение этих делеций по отношению к аминокислотной последовательности белка Е1 можно определить по масштабной линейке в нижней части чертежа. На масштабной линейке показано расположение белка Е1 в аминокислотной последовательности, закодированной большой открытой рамкой считывания штамма Brescia.