способ получения биологически активной кормовой добавки из растительного сырья

Формула изобретения

1. Способ получения биологически активной кормовой добавки из растительного сырья, включающий измельчение растительного сырья, отбор культур бактерий, получение посевного материала и ферментативный гидролиз, отличающийся тем, что отбор культур бактерий осуществляют из различных отделов пищеварительного тракта растительноядных животных: ротовой полости, или зоба, или преджелудка, или отделов кишечника, или экскрементов, ферментный гидролиз проводят монокультурой или ассоциацией микроорганизмов, или комплексом, состоящим из ассоциации микроорганизмов и, по крайней мере, одного дополнительного штамма микроорганизмов, и/или дополнительного микроэлемента при температуре 18-70^oС в течение 5-48 ч до получения целлюлозной активности добавки не менее 90 ед/г сухого продукта ферментации.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что отделы кишечника для отбора бактериальных культур выбирают из группы: слепая или ободочная кишки.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что, по крайней мере, один дополнительный штамм микроорганизмов выбирают из группы микроорганизмов, относящихся к родам: Bacillus, Clostridium, Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Micrococcus, Ruminococcus, Proteus, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Brevibacterium.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве микроэлемента используют селен.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что ферментативный гидролиз осуществляют твердофазным способом.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к кормопроизводству, в частности к способам приготовления кормов для млекопитающих, птиц и рыб, содержащих повышающие эффективность пищеварения и лечебно-профилактические добавки, сорбенты, основанные на переработке целлюлозосодержащего сырья или отходов.

Уровень техники

Вопросы кормопроизводства в сельском хозяйстве, птицеводстве и рыбоводстве, а также при содержании животных в домашних условиях и в зоопарках актуальны и решаются по нескольким направлениям. К ним относятся i) традиционные поиски оптимальных кормовых смесей с использованием витаминных и других минеральных добавок; ii) поиски технических решений, позволяющих получать корма из растительных отходов; iii) включение в состав традиционных кормов биопрепаратов, полученных с помощью биотехнологических методов и способствующих перевариванию грубых кормов; iv) включение в состав корма препаратов для профилактики или лечения; v) поиски новых комплексных способов, решающих одновременно несколько задач кормопроизводства и лечебной профилактики.

Известны способы предварительной обработки грубого целлюлозного растительного материала и отходов [1], переработки отходов хвойных пород [2] для их использования в кормопроизводстве.

К недостаткам способов можно отнести либо большое энергопотребление при обработке соломы паром, или большую длительность (в течение 23 дней) ферментации отходов древесины с помощью мицелия гриба.

Сокращение сроков переработки грубых кормов производится путем использования предварительно приготовленных заквасок на основе содержимого рубца жвачных животных [3] или на основе последовательного преобразования целлюлозосодержащих отходов сначала в аэробных условиях по крайней мере с одним типом микроорганизма, затем в анаэробных условиях с другими типами микроорганизмов [4]. Такие корма не относятся к классу лечебно-профилактических, так как их основная цель - способствовать наиболее полной переработке целлюлозы.

Известно изобретение, в котором увеличение прироста живой массы крупного рогатого скота достигается за счет повышения переработки грубого корма и клетчатки в пищеварительном тракте животных. С этой целью из рубца телят выделяют ассоциацию микроорганизмов, основным критерием которой является быстрое расщепление целлюлозы [5]. Полученную ассоциацию скармливают в жидком виде дополнительно к основному корму. Этот способ кормления не будет высокоэффективным при кормлении моногастричных животных, так как основная часть микроорганизмов погибнет при прохождении через желудок животных.

Известны способы приготовления кормов, в которых в качестве лечебно-профилактических препаратов, повышающих биологическую ценность корма, используют белково-витаминно-минеральные кормовые смеси [6].

Известен способ приготовления лечебно-профилактического корма для животных, в том числе для рыб [7], в соответствии с которым в состав корма вводят пробиотик на основе бактерий Bacillus.

Известна кормовая добавка для кормления цыплят, в которой в качестве лечебно-профилактического средства и с целью повышения живой массы бройлеров используют биопрепарат АНТА-1. В состав биопрепарата входит специально подобранная композиция из 6 видов микроорганизмов, выращенная на жидком кукурузном экстракте [8]. Способ получения биопрепарата связан с проведением направленной селекции штаммов, взятых с определенным титром и фазой роста для конкретного типа субстрата. Возможность использования биопрепарата для обработки целлюлозосодержащих отходов и его эффективность для выращивания других животных не известны.

Известны биопрепараты, которые вводят в качестве кормовой добавки для лечения желудочно-кишечных заболеваний животных. Основными элементами, входящими в состав биопрепаратов, являются отдельные микроорганизмы или комплексы микроорганизмов, содержащиеся, например, в экскрементах животных [9].

Известно использование целлюлолитических бактерий в кормопроизводстве [1]. Целлюлолитические бактерии выделяли из почвы, гниющих растений, а также силоса путем высева на агаризированную среду Гетчинсона, где в качестве единственного источника углерода использовали отвар соломы.

Наиболее близким к рассматриваемому изобретению является способ [1]), в соответствии с которым для получения корма используют ферментативный гидролиз измельченного растительного сырья путем внесения в него предварительного полученного препарата на основе содержимого слепой кишки обыкновенной полевки. Препарат получают путем выращивания бактериальной флоры на целлюлозосодержащем субстрате. После чего препарат вносят в предварительно измельченное растительное сырье, помещенное в капроновый мешок, и ведут ферментацию при непрерывном промывании смеси проточной водой.

Недостатками способа являются ведение процесса бактериями, выделенными только из одного источника, и, возможно, не самыми эффективными, а также осуществление ферментации в проточных условиях. Последнее требует дополнительных энергозатрат, связанных с перемешиванием, обеспечением протока воды. Процесс сопровождается существенным расходом воды. Кроме того, образуются сточные воды в качестве отхода производства.

Сущность изобретения

Техническим результатом изобретения является повышение усвояемости корма при введении в рацион сельскохозяйственных животных, птицы, рыбы, домашних животных биологически активной кормовой добавки, а также снижение себестоимости кормосмеси.

Для достижения технического результата при приготовлении биологически активной кормовой добавки на основе растительного сырья с помощью одной культуры или смеси культур микроорганизмов отбор бактериальной флоры осуществляют из различных отделов пищеварительного тракта или экскрементов растительноядных животных, при этом эффективность микроорганизмов может быть повышена за счет введения по крайней мере одного дополнительного штамма микроорганизмов и/или дополнительного введения микроэлементов.

К дополнительному аспекту изобретения относится то, что отбор бактериальной флоры осуществляют из различных отделов пищеварительного тракта животных: ротовой полости, или зоба, или преджелудка, или разных отделов кишечника, например, слепой или ободочной кишок, или экскрементов.

Эффективность препарата может быть повышена путем введения по крайней мере одного дополнительного штамма микроорганизмов, выбранного из группы микроорганизмов, относящихся к родам: Bacillus, Clostridium, Lactobacillus, Streptococcus, Micrococcus, Ruminococcus, Proteus, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Pseudonocardia, Micromonospora, Thermomonospora.

Для повышения эффективности препарата в него может быть включен микроэлемент, например селен.

Получение биологически активной добавки к кормам осуществляют следующим способом.

Из отделов пищеварительного тракта или экскрементов растительноядных животных отбирают пробы, в состав которых входят микроорганизмы. Выделение по крайней мере одной культуры или ассоциации микроорганизмов проводят путем инкубации выделенных проб в безазотистой среде, содержащей целлюлозу. В ассоциацию микроорганизмов может быть дополнительно включен по крайней мере один отдельный штамм микрооганизмов, относящийся к родам Bacillus, Clostridium, Streptococcus, Micrococcus, Ruminococcus, Proteus, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Micromonospora, Thermoactinomyces. Полученный комплекс микроорганизмов поддерживают путем его размножения в соответствующих средах. Растительное сырье или его отходы предварительно размельчают и смешивают с полученным комплексом микроорганизмов.

Биологически активный продукт получают, проводя последующую ферментацию смеси проточным или твердофазным способом в факультативно-анаэробных условиях при температуре 15-70^oС.

Для внедрения в промышленное производство представлялось необходимым подобрать ассоциацию микроорганизмов, отличающуюся высокими показателями скорости роста, целлюлолитической активности, популяционной устойчивости и конкурентной способности, а также устойчивости к различным неблагоприятным факторам.

Была поставлена задача выделения штаммов микроорганизмов-продуцентов целлюлолитических ферментов, отвечающих этим требованиям.

Ассоциацию выделеляют из одного или нескольких видов растительноядных животных. Отбор бактериальной флоры осуществляют: i) из одной части пищеварительного тракта; ii) из нескольких частей пищеварительного тракта; iii) из проб экскрементов; iv) из пищеварительного тракта и из проб экскрементов, iiv) из пищеварительного тракта и/или из проб экскрементов в сочетании с коллекционными штаммами. В тех случаях, когда микроорганизмы выделяют из разных отделов пищеварительного тракта, то в зависимости от вида растительноядных животных микроорганизмы выделяют из содержимого ротовой полости животных (включая секреты желез), и/или зоба, и/или преджелудка, и/или кишечника, например из слепой, ободочной кишок. В группу экскрементов входят фекалии и цекотрофы.

Для увеличения эффективности переработки грубых кормов с помощью выделенных микроорганизмов предпочтительно отбирать виды растительноядных животных, которые в соответствии с условиями кормления вырабатывают необходимый комплекс бактерий. С этой целью животных предварительно выдерживают на диете, в состав которой входит не менее 20% и не более 40% (по весу) грубых кормов. Для увеличения в комплексе азотфиксирующих микроорганизмов целесообразно в последней фазе откорма использовать корма с минимальным количеством белкового азота, например листья одуванчиков, яблоки и др.

Из животных предпочтительно использовать представителей моногастричных млекопитающих (кролики, зайцы, пищухи, даманы, хутии и др.) или полигастричных млекопитающих (ленивец, лось, дикие виды баранов и козлов, верблюд, альпака и др. ). Дикие животные обязательно проходят карантин. И, если они относятся к редким видам, то используются способы отбора микроорганизмов, не травмирующие животных, например, отбирают только пробы свежих экскрементов.

Данное изобретение не ограничивает перечень вида растительноядных животных, живущих в разных климатических зонах и приспособленных к перевариванию грубых растительных кормов.

Для корма, производимого в Европейском регионе, из группы диких животных предпочтительно использовать представителей широко распространенных и относящихся к вредителям сельского хозяйства зеленоядных грызунов, например красной лесной, серой темной, серой обыкновенной, восточно-европейской полевок, зайцев и др. Из птиц наиболее перспективны глухари, тетерева, куропатки. Из рептилий перспективны черепахи, игуаны.

Предпочтительно подбирать отдельно источники выделения групп микроорганизмов для разных типов животных, птиц, рыб. В частности, для птиц, свиней, пушных зверей предпочтительно используют комплексы бактерий от животных-доноров: зеленоядных грызунов, зайцеобразных, даманов и др. Для сельскохозяйственных жвачных животных, например коров, предпочтительно используют группы микроорганизмов от сумчатых, неполнозубых (в частности, ленивца) и диких жвачных.

Высокоактивные азотфиксирующие целлюлолитические комплексы бактерий кишечника выделяют из содержимого слепой и ободочной кишки лесной красной полевки, серых полевок - темной, обыкновенной, восточно-европейской, кролика. У кролика кроме того, комплекс бактерий выделяют из цекотрофов. У грызунов - из мягкого кала. У ленивца комплекс бактерий выделяют из свежих фекалий.

Выделение самоподдерживающегося комплекса микроорганизмов из растительноядных животных осуществляют путем его инкубации, по крайней мере, в одной безазотистой среде, содержащей целлюлозу в качестве единственного источника углерода.

В качестве одного из примеров, которые не ограничивает выбор сред, ниже приведены примеры использования стандартной среды Эшби в модифицированном виде с использованием измельченной целлюлозы в качестве единственного источника углерода. Данные примеры не ограничивают применения других безазотистых сред, известных из литературных и патентных источников.

Пример 1. Пробы, в состав которых входит один вид микроорганизмов, например, Bacillus subtilis B-8130, выделенный из слепой кишки глухаря, инкубируют в жидкой безазотистой среде Эшби, содержащей в качестве единственного источника углерода измельченную фильтровальную бумагу до 2-15% (вес/объем), или иной целлюлозосодержащий мелкофракционный субстрат, например небеленая целлюлоза, измельченная шелуха семян подсолнечника, проса, гречихи, рапса, измельченные соплодия кокоса. Инкубацию проводят при температуре, выбранной из 18-70^oС. Для инкубации используют факультативно-анаэробные условия. Процесс инкубации осуществляют в период от 5 до 72 часов. О развитии микроорганизмов судят по микроскопическому контролю при увеличении х1000 фиксированных в пламени горелки мазков культурального содержимого, окрашенных карболовым генцианвиолетом, а также целлюлазной активности (не менее 90 ед/г сухого продукта ферментации, определяемой вискозиметрическим методом).

Пример 2. Ассоциацию микроорганизмов получают из преджелудка красной полевки, затем полученный комплекс размножают в большем объеме, для чего комплекс переносят в жидкую среду Эшби, в которую внесено 2% сахарозы и до 5% измельченной целлюлозы. В данную смесь возможно добавить 0,2% дрожжевого экстракта. Инкубацию проводят при температуре, выбранной из диапазона 18-70^oС, наиболее предпочтительно при температуре, выбранной из диапазона 35-37^oС. Для инкубации используют факультативно-анаэробные условия, для чего формируют высокий слой ферментируемой смеси или ведут процесс в заполненных не менее чем на 3/4 емкостях, закрытых крышками, и др. Процесс инкубации осуществляют в период от 5 до 48 часов.

Пример 3. Выращивают монокультуру или комплекс микроорганизмов, как это приведено в первом и втором примерах, и одновременно с этим размножают по крайней мере один из штаммов бактерий (например, Klebsiella pneumoniae ВКПМ В-8049) при температуре 35-37^oС в факультативно-анаэробных условиях от 24 до 48 часов на твердой среде Эшби с 2% сахарозы. Для последующего формирования комплекса выращенных микроорганизмов осуществляют смыв микрорганизма Klebsiella с твердой среды Эшби и добавляют указанный смыв в жидкую среду Эшби с выращенным комплексом микроорганизмов на целлюлозе.

Пример 4. При промышленном получении препарата возможно использовать ассоциацию бактерий, разработанную для определенного типа растительного сырья. Например, используют ассоциацию бактерий, выделенных из слепой кишки обыкновенной полевки, состоящую из Streptococcus mitis ВКПМ В-8048, Klebsiella pneumoniae ВКПМ В-8049, Proteus mirabilis ВКПМ В-8047, Bacillus macerans ВКПМ В-8050, для ферментной обработки соломы, шелухи семян подсолнечника, риса, проса, гречихи, кокосовых соплодий и др. Данная ассоциация депонирована во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов 28 ноября 2000г. В процессе инкубации ассоциации микроорганизмов на безазотистых средах с единственным источником углерода - измельченной целлюлозой за счет самоорганизации микроорганизмов устанавливается численное соотношение разных форм микроорганизмов, входящих в ассоциацию в эффективном количестве, достаточном для жизнедеятельности ассоциации.

Пример 5. Способ получения биологически активной добавки.

В данном изобретении процессу ферментативного гидролиза подвергают измельченный субстрат, содержащий целлюлозные волокна. Субстраты выбирают из группы: i) растительного сырья, выращенного на земле или в водной среде; ii) целлюлозосодержащих отходов (шелухи семян подсолнечника, гречихи, проса, овса, рапса, кукурузной кочерыжки, измельченной ржаной, пшеничной соломы, небеленой целлюлозы, кокосовых соплодий и др); iii) отходов лекарственных растений; iv) коры, листьев и опилок деревьев, например, с выраженной лечебной направленностью (дуб, эвкалипт, облепиха, лимонник и т.д.); v) комбинации пунктов i), ii), iii), iv).

Для проведения более эффективного процесса ферментативного гидролиза целлюлозосодержащее сырье или отходы предварительно измельчают на мелкие фракции, от 60 до 85% размеров которых не превышают 1 мм.

Ферментацию осуществляют твердофазным способом, для чего используют измельченное сырье и/или отходы. К воздушно-сухому субстрату добавляют воду до конечной влажности 50-70%, затем добавляют от 2 до 10% (об.%) посевного материала, содержащего не менее 10⁹ клеток /мл, смешивают его с измельченным сырьем и/или отходами и помещают в факультативно-анаэробные условия при температуре 18-70^oС. Факультативно-анаэробные условия создают, используя, например, закрытые полиэтиленовые мешки или герметичную пластиковую, металлическую или деревянную тару или специально разработанные емкости. Процесс ферментации осуществляют в диапазоне температур от 18 до 70^oС в течение 5-48 часов до тех пор, пока в субстрате целлюлазная активность будет составлять не менее 90 ед/г сухого продукта ферментации.

Введение в реакционную смесь селена в органической форме в виде препарата ДАФС-25 в регламентированной дозе увеличивает активность эндоглюканаз на 30%.

Полученная биологически активная добавка используется при приготовлении разных типов кормов. Ее количество составляет от 1 до 10% от общего количества корма, по весу в зависимости от вида и возраста животного, для которого применяется данная добавка. Возможна замена биологически активной добавкой соответствующей доли отдельных составляющих корма. Корм может быть приготовлен в сухом или влажном виде, или в виде суспензии. При приготовлении корма в сухом виде предпочтительно после добавления добавки и перемешивания осуществлять грануляцию корма известными способами. При приготовлении корма в виде суспензии необходимо учитывать сроки, при которых добавка сохраняет свою биологическую активность.

Для повышения биологической активности корма в полученный негранулированный корм можно дополнительно вводить микроэлемент селен в неорганической или органической форме, например, 0,5-1,0% раствор ДАФС-25 в растительном масле, в разрешенной к использованию дозе. ДАФС-25 можно вводить также в ферментируемую смесь перед началом процесса получения кормовой добавки. Корм с использованием ДАФС-25 применяют для взрослых и молодых животных.

Пример 6. Самоподдерживающийся комплекс микроорганизмов выделяют из фекалий обыкновенной полевки. Обрабатывают данным комплексом ржаную солому и определяют состав препарата.

Пример 7. Самоподдерживающийся комплекс микроорганизмов выделяют из мягких фекалий обыкновенной полевки. Обрабатывают данным комплексом шелуху семян подсолнечника и ржаную солому и определяют связывание ионов металлов за счет сорбентных свойств препарата. Данные по связыванию ионов металлов приведены в табл.2 и 3.

Пример 8. Проводят испытания биологически активной добавки на черных хорях. Препараты дают самцам черного хоря в виде добавки к комбикорму (по 1 г препарата на голову в день) в течение 10 дней. Контроль - самцы, не получавшие кормовой добавки. Состояние всех животных нормальное, поведение обычное, помет - без изменений.

Пример 9. Результаты кормления молодых хорьков стандартным кормом с 1% препарата из ржаной соломы с ДАФС-25

Пример 10. Результаты кормления молодых хорьков стандартным кормом с 1% препарата из шелухи семян подсолнечника с ДАФС-25.

Пример 11. Результаты кормления взрослых крыс комбикормом с 5% и 10% добавки препарата из лузги семян подсолнечника с ДАФС-25. Результаты потребления и переваримости лабораторными крысами корма и кормовой добавки (препарат из лузги семян подсолнечника с ДАФС-25) приведены в табл.6.

В опытах использовано 18 крыс, длительность опытов по кормлению составила 20 дней, балансового опыта - 3 дня. Из эксперимента следует, что лузга из препарата переварилась крысами практически на 50%, даже при введении 10% препарата.

Полученные препараты содержат: i) волокна микрофракционной целлюлозы; ii) комплекс целлюлолитических и азотфиксирующих бактерий, а также сопутствующие формы бактерий. Обогащенный азотом и продуктами метаболизма бактерий, содержащий целлюлозы препарат обладает высокими сорбционными свойствами.

Препарат обладает высокой биологической активностью, так как в процессе его производства не применяют высокую температуру, что приводит к сохранению комплекса целлюлолитических, азотфиксирующих и сопутствующих микроорганизмов, который дополнительно помогает пищеварению. Кроме того, в процессе прохождения компонентов добавки через желудочно-кишечный тракт из организма выводятся токсичные компоненты и шлаки. Это происходит за счет связывания токсичных компонентов и шлаков с развитой поверхностью, обладающей сорбционными свойствами.

Пример 12. Кормление животных препаратом из хвои, полученным с помощью азотфиксирующей целлюлолитической культуры B.subtilis GL.

Карликовых кроликов и морских свинок, находящихся в виварии ИПЭЭ им. А. Н. Северцова РАН, в течение 34 дней содержали на рационе, в котором 25% отрубей (для кроликов) и геркулеса (для морских свинок) заменили на такое же количество препарата из хвои.

Препарат был получен путем твердофазной ферментации измельченной хвои с помощью культуры Bacillus subtilis В-8130, выделенной из слепой кишки глухаря и депонированной в ВКПМ, и высушен при 60^oС. Контролем служили животные, получавшие обычный корм. Результаты кормления приведены в табл.7.

Эксперимент продемонстрировал положительное воздействие биологически активной кормовой добавки на организм карликовых кроликов и морских свинок.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Айбазов О.А. и др. Корм на основе целлюлозосодержащих отходов полеводства и способ его получения. RU 2050142 Int. C1, A 23 K 1/12, 20.12.1995.

2. Вольф В.В. и др. Способ получения белкового корма из древесных отходов RU 2092073 Int. C1, A 23 K 1/12, 10.10.1997.

3. Юдин Ю.И. и др. Способ приготовления корма из растительного сырья. SU 1287829 Int. C1, A 23 K 1/165, 07.02.87.

4. Lizak Y. Process of bio-conversion of industrial or agricultural cellulose containing organic wastes into a proteinaceous nutrition product US 5952020, US C1, 426/8, 14.09.1999.

5. Николичева Т.А. и др. Ассоциация микроорганизмов для скармливания молодняку крупного рогатого скота. SU 1671693 Int. C1, C 12 P 39/00, 23.08.1991.

6. Древко Р.Ф. и др. Способ приготовления белково-витаминно-минеральной кормовой смеси. RU 2082300 Int. C1, A 23 K 1/16, 27.06.1997.

7. Юхименко Л.Н. и др. Способ приготовления корма. RU 2140165 Int, C1, A 23 K 1/00, 27.10.1999.

8. Аль-Нури Я.М. Биопрепарат "АНТА-1" - кормовая добавка для бройлерных цыплят RU 2110927 Int. C1, A 23 K 1/165, 20.05.1998.

9. Reinhart G. A. Pet food product containing fermentable fibers and process for treating gastrointestinal disorders US 5616569, US C1, 514/54, 01.04.1997.

10. Саубенова М. Г. и др. Использование целлюлолитических бактерий в кормопроизводстве. Прикл. биохим. и микроб. (1998), т.34, 1, с.91-94.

11. Павлов Д. С. и др. Способ приготовления корма для животных из растительного сырья RU 2153813 Int. C1, A 23 K 1/165 (10.08.2000).