моноклональное антитело, способное распознавать антиген, вызывающий апоптоз миелоидных клеток костного мозга, и обладающее свойством вызывать апоптоз миеломных клеток, его фрагмент и гибридома

Формула изобретения

1. Моноклональное антитело, способное распознавать антиген, вызывающий апоптоз миелоидных клеток костного мозга, полученное путем иммунизации животных стромальными клетками селезенки, предварительно инокулированными рекомбинантным гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (rG-CSF), и обладающее свойством вызывать апоптоз миеломных клеток.

2. Моноклональное антитело по п.1, отличающееся тем, что принадлежит к классу IgG.

3. Моноклональное антитело по п.1, отличающееся тем, что получено путем использования человеческих спленоцитов стромальных клеток в качестве антигена.

4. Моноклональное антитело по п.1, отличающееся тем, что представляет собой ВМАР-1, продуцируемое гибридомой FERM ВР-4382.

5. Моноклональное антитело по п.1, отличающееся тем, что оно используется для лечения миелоцитной лейкемии.

6. F(ab)₂ фрагмент моноклонального антитела, охарактеризованного в п.1.

7. Гибридома FERM BR-4382, продуцирующая моноклональное антитело по п.4.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к новым моноклональным антителам, которые обладают способностью вызывать апоптоз миелоидных клеток и могут в этой связи рассматриваться как полезные лекарственные средства для применения в случае миелоцитарного лейкоза, а также к фрагментам таких антител, кроме того, изобретение относится к гибридоме, продуцирующей моноклональные антитела.

Поскольку моноклональные антитела настоящего изобретения используются в качестве антител, специфически распознающих и идентифицирующих антигены, которые вызывают апоптоз миелоидных клеток, а кроме того, сами обладают способностью вызывать апоптоз миелоидных клеток, на основе использования этих свойств они могут рассматриваться как лекарственные средства, эффективные для применения в случае миелоцитарного лейкоза.

Предпосылки создания изобретения

Гранулоцитарные колониестимулирующие факторы, такие как, например, рекомбинантные гранулоцитарные колониестимулирующие факторы [рГ-КСФ (rG-CSF)], были известны вначале как гуморальные факторы, стимулирующие дифференциацию и пролиферацию гранулоцитарных клеток, при этом в экспериментах на мышах in vivo было показано, что введение рГ-КСФ стимулирует гемопоэз в костном мозге и, кроме того, вызывает выраженный экстрамедуллярный гемопоэз, осуществляемый в селезенке при пролиферации гемопоэтических стволовых клеток и всех клеток-предшественников, имеющихся в процессе кроветворения в селезенке. Считается при этом, что механизм гемопоэза в селезенке, будучи экстрамедуллярным по своей природе, осуществляется благодаря модификациям в микросреде в процессе кроветворения в селезенке, которые возникают в связи со стимулирующим действием рГ-КСФ, повышающим гемопоэтический потенциал.

Исходя из этого авторы настоящего изобретения пометили стромальные клетки селезенки, в которые был введен рГ-КСФ, с целью определения уровня гемопоэтического потенциала в селезенке, далее установили гемопоэтическую клеточную линию стромы (CF-1 клетки) из селезенки мышей, которым был введен рГ-КСФ, для исследования существования факта повышения гемопоэтического потенциала под действием стромальных клеток, содержащих введенный рГ-КСФ, продемонстрировали, с применением гемопоэтических стромальных клеток, потенциальный эффект на гемопоэз и, наконец, определили колониестимулирующую активность in vitro, а также способность поддерживать гемопоэтические стволовые клетки in vitro (Blood, 80, 1914, 1992).

Однако несмотря на то, что на основе ряда стромальных клеток селезенки удалось получить клеточные линии (CF-1 клетки) и определить их цитологические характеристики, до сих пор еще не были получены специфические антитела, распознающие клеточную поверхность их антигенов, как не известны до настоящего времени и характеристики таких антител.

В этой связи авторы настоящего изобретения провели исследование с целью получения, на основе использования приведенной выше информации, касающейся стромальных клеток селезенки, а также результатов проведенных исследований, специфических антител, способных распознавать стромальные клетки селезенки, и приготовления далее моноклональных антител с использованием стромальных клеточных линий селезенки в качестве антигенов для иммунизации, в результате чего были получены новые, не известные ранее моноклональные антитела.

В ходе изучения свойств полученных моноклональных антител авторы неожиданно обнаружили, что упомянутые антитела обладают способностью вызывать апоптоз миелоидных клеток, и этот факт поставил точку в исследованиях, составивших предмет настоящего изобретения.

Раскрытие изобретения

Целью и объектом настоящего изобретения является создание новых моноклональных антител, обладающих способностью вызывать апоптоз миелоидных клеток и в этой связи интересных с точки зрения их применения для лечения миелоцитарного лейкоза, кроме того, получение их фрагментов, а также гибридомы, способной к продуцированию моноклонального антитела.

Моноклональное антитело настоящего изобретения является значимым с точки зрения его применения в качестве антитела, распознающего антигены, вызывающие апоптоз [он известен также как процесс саморазрушения клеток, явление, при котором ДНК ядерного хроматина расщепляется в нуклеосоме (с образованием так называемой "лэддер-последовательности"] , которое ведет в результате к гибели клетки) миелоидных клеток, а также использования свойственной ему функции идентификации таких антигенов или функции, определяемой их способностью вызывать апоптоз миелоидных клеток. В данном случае миелоидные клетки включают клетки, отличные от лимфоидных клеток, такие как нейтрофилы, мегакариоциты, миелобласты, миелоциты, тучные клетки, макрофаги, моноциты и эритробласты, так что в контексте настоящего изобретения термин "миелоидные клетки" имеет приведенные выше значения. До сих пор не были известны моноклональные антитела, обладающие способностью вызывать апоптоз миелоидных клеток, поэтому моноклональные антитела настоящего изобретения включают в себя все моноклональные антитела, способные вызывать апоптоз миелоидных клеток.

В общих чертах моноклональные антитела настоящего изобретения могут быть получены с помощью указанного ниже способа.

А именно: моноклональное антитело настоящего изобретения может быть получено, например, путем использования стромальных клеток селезенки, взятых от животных, с введенным в качестве антигена рГ-КСФ, иммунизации их, которую осуществляют по традиционно принятой методике слияния иммунизированных клеток с помощью стандартной процедуры слияния и клонирования слитых клеток с использованием известного метода клонирования.

В качестве предпочтительного способа получения моноклональных антител настоящего изобретения может быть приведен метод, включающий использование в качестве антигена CF-1 клеток, представляющих собой стромальные клетки селезенки животного, которому вводят рГ-КСФ, и которые установлены авторами настоящего изобретения в качестве культуральной клеточной линии (Blood, 80, 1914, 1992), слияние плазматических клеток (иммуноцитов) из млекопитающего, иммунизированного антигеном, с миеломными клетками млекопитающего, в частности мыши, клонирование полученных слитых клеток (гибридом), селекцию клонов, продуцирующих антитело настоящего изобретения, которое способно распознавать указанную клеточную линию среди других, и культивирование их с выходом целевого антитела.

Однако указанный метод приведен лишь в качестве одного из возможных примеров, так что в данном случае для получения, на основе того же способа, что и в случае CF-1 клеток, антител, связывающихся с интересующими миелоидными клетками человека, в качестве антигенов могут использоваться не только вышеупомянутые СF-1 клетки, но также и клеточные линии, полученные способом, аналогичным примененному в случае CF-1 клеток, из стромальных клеток селезенки человека.

В соответствии со способом получения таких моноклональных антител использование тех или иных млекопитающих, которые могут быть иммунизированы вышеупомянутым антигеном, не сковано особыми ограничениями; однако предпочтительно проводить отбор, принимая во внимание соответствие миеломных клеток для их использования в процедуре слияния клеток, при этом по данному способу оказывается предпочтительно работать с мышами, крысами и хомячками.

Иммунизацию осуществляют в соответствии с общепринятой методикой, в частности посредством введения с помощью инъекции стромальных клеток селезенки, таких как вышеупомянутые CF-1 клетки, в брюшную полость млекопитающего. Более специфично предпочтительно вводить их животному при разбавлении или суспендировании в соответствующем количестве фосфатно-буферного раствора (ФБР) или изотонического раствора хлорида натрия по нескольку раз ежемесячно. Предпочтительно, кроме того, использовать в качестве иммуноцитов клетки селезенки, отобранные по завершении последнего введения вышеупомянутых клеток.

В качестве второго компонента, необходимого для проведения слияния клеток, который представляет собой миеломные клетки, предпочтительно использование ряда известных клеточных линий, которые включают РЗ (РЗХ63 Аg 8.653) (Y. Immunol., 123, 1548, 1978), P3-V1 (Сurrent topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7, 1978), NS-1 (Eur. J. Immunol., 6, 511-519, 1976), MPC-11 (Cell, 8, 405-415, 1976), Sр 2/G-Ag 14 (Nature, 276, 269-270, 1978), FO (J. Immunol, Meth., 35, 1-21, 1980), S 194 (J. Exp. Med., 148, 313-323, 1978) и R 210 (Nature, 277, 131-133, 1979).

Слияние клеток при использовании вышеупомянутого иммуноцита и миеломной клетки может быть проведено в основных чертах с помощью одного из традиционных способов, например, по методу Мильштейна с соавт (Methods Enzymol., 73, 3-46, 1981).

Более специфично вышеупомянутое слияние клеток может быть проведено, например, в простой питательной среде в присутствии вещества, ускоряющего слияние. В качестве такого ускоряющего слияние клеток агента может использоваться полиэтиленгликоль (ПЭГ) и сендан вирус (HVY), а, кроме того, при необходимости усилить эффективность слияния практикуется добавление адъювантов, таких как диметилсульфоксид.

Что касается коэффициентов отношения иммуноцитов и миеломных клеток, то предпочтительно использование первого из них в 1-10-кратном количестве относительно второго компонента смеси для слияния клеток. В качестве примеров среды, применимой для проведения вышеупомянутой процедуры слияния, можно привести среду RРМ1-1640 и МGС среду (минимальную поддерживающую среду), которые хорошо подходят для осуществления пролиферации упомянутых миеломных клеток, а также ряд других сред, традиционно используемых для культивирования такого рода клеток которые, кроме того, могут содержать дополнительно сыворотку, в частности фетальную телячью сыворотку (ФТС).

Клеточное слияние проводят при смешивании описанных ранее количеств вышеупомянутых иммуноцитов и миеломных клеток в вышеупомянутой среде, при добавлении в среду, обычно в концентрации 30-60% (вес/объем), раствора ПЭГ, предварительно нагретого до температуры около 37^oС, например, такого ПЭГ, который имеет средний молекулярный вес в диапазоне от 1000 до 6000, с последующим перемешиванием. Затем последовательно, при повторении процедур добавления соответствующих сред друг за другом, центрифугировании реакционной смеси и удалении супернатантов могут быть получены целевые гибридомы.

Упомянутые гибридомы подвергают селекции при культивировании на обычной селективной среде, в частности на ГАТ среде (среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Культуру выращивают на ГАТ среде в течение периода времени, достаточного для того, чтобы клетки, отличные от гибридом (неслитые клетки), погибли, обычно этот процесс занимает от нескольких дней до нескольких недель. Затем с применением обычного метода ограниченных разведении проводят скрининг и клонирование гибридом.

Полученные гибридомы, способные к продуцированию моноклональных антител настоящего изобретения, могут быть далее подвергнуты субкультивированию, после чего они могут храниться в жидком азоте в течение длительного времени.

Для целей получения моноклональных антител настоящего изобретения от гибридом может быть применен метод, включающий культивирование гибридом по сбычной методике с получением их из супернатантов, или метод, включающий введение гибридомы с целью ее пролиферации в организм подходящего млекопитающего с получением их из асцита. Первый способ применяется для случаев получения антител высокой чистоты, тогда как второй - для целей массовой продукции антител.

Кроме того, антитела, получаемые при использовании вышеуказанных методов, могут быть очищены до высокой степени чистоты с помощью традиционных способов очистки, таких как высаливания, гель-фильтрация и аффинная хроматография.

Моноклональное антитело настоящего изобретения может быть любым таким антителом, обладающим специфическим свойством, более подробно описанным позже в разделе Примеров, а именно свойством вызывать апоптоз миелоидных клеток, при этом все несущие такое свойство антитела включены в рамки настоящего изобретения, независимо от вида антигенов; моноклональное антитело настоящего изобретения может быть применено на основе реализации этого его свойства в качестве лекарственного средства для лечения миелоцитарного лейкоза.

Нет необходимости говорить о том, что создание на основе моноклональных антител настоящего изобретения специфичной системы для идентификации и распознавания антигенов, вызывающих апоптоз миелоидных клеток, или для использования в качестве лекарственного средства при лечении миелоцитарного лейкоза, на основе реализации специфического свойства антител, а также все виды модификации и применения такой системы включены в рамки настоящего изобретения, в той мере, в какой все они применимы на практике с использованием метода, очевидного для каждого специалиста, обладающего средним уровнем знаний в данной области.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 приведены результаты иммунофлюоресцентного анализа (контроль в отсутствие антитела, CF-1 клетка).

На фиг. 2 приведены результаты исследования способности к связыванию GSPST-1 антитела с CF-1 клетками на основе иммунофлюоресцентного анализа.

На фиг.3 приведены результаты исследования способности к связыванию ВМАР-1 антитела с CF-1 клетками на основе иммунофлюоресцентного анализа.

На фиг.4 приведены результаты иммунофлюоресцентного анализа (контроль в отсутствие антитела, клетка костного мозга).

На фиг.5 приведены результаты исследования способности к связыванию G-SPST-1 антитела с клетками костного мозга на основе иммунофлюоресцентного анализа.

На фиг.6 приведены результаты исследования способности к связыванию BМАР-1 антитела с клетками костного мозга на основе иммунофлюоресцентного анализа.

На фиг.7 приведены результаты иммунофлюоресцентного анализа (контроль в отсутствие антитела, NFS-60).

На фиг. 8 приведены результаты исследования способности к связыванию GSPST-1 антитела с NFS-60 клетками на основе иммунофлюоресцентного анализа.

На фиг. 9 приведены результаты иммунофлюоресцентного анализа (контроль относительно lgG1, NFS-60).

На фиг. 10 приведены результаты исследования способности к связыванию ВMАР-1 антитела с NFS-60 клетками на основе иммунофлюоресцентного анализа.

На фиг. 11 проиллюстрирован метод количественного определения моноклонального антитела (ВМАР-1), ингибирующего пролиферацию NFS-60 клеток.

На фиг. 12 проиллюстрирован метод количественного определения моноклонального антитела (GS PST-1), ингибирующего трансплантацию костного мозга.

На фиг. 13 проиллюстрирован метод количественного определения моноклонального антитела (ВМАР-1), ингибирующего трансплантацию костного мозга.

На фиг.14 показаны [микрофотография (окраска гематоксилинэозином) образцов костного мозга ( 400)] клетки костного мозга (2), погибшие на 6 день после введения моноклонального антитела ВМАР-1 настоящего изобретения, и контроль (1) в отсутствие антитела.

На фиг.15 показано (фотография движения в электрофорезе) образование лэддер-последовательности ДНК в клетках костного мозга, которое наблюдается в том случае, когда вводят моноклональное антитело ВМАР-1 настоящего изобретения.

На фиг. 16 проиллюстрирован количественный метод определения цитотоксичности с использованием L 929 клеток и ФНОa-(ТNFa) (фактора некроза опухолевых клеток альфа).

На фиг. 17 проиллюстрирован количественный метод определения цитотоксичности с помощью моноклонального антитела (ВМАР-1).

На фиг. 18 приведены результаты иммунофлюоресцентного анализа (контроль относительно lgG2a крысы, BWV1).

На фиг. 19 приведены результаты исследования способности к связыванию антитела к мышиному главному комплексу чисто совместимости ГКГ класса 1 с BWV1 клетками на основе иммунофлюоресцентного анализа.

На фиг. 20 приведены результаты иммунофлюоресцентного анализа (контроль относительно lgG1 крысы, BWV1).

На фиг. 21 приведены результаты исследования способности к связыванию ВМАР-1 антитела с BWV 1 клетками на основе иммунофлюоресцентного анализа.

Объяснение символов

а: ДНК из тимуса мыши, которой был введен ВМАР-1 (24 часа)

б: ДНК из костного мозга мыши, которой был введен ВМАР-1 (24 часа)

в: ДНК из костного мозга мыши, которой был введен ВМАР-1 (8 часов)

г: ДНК из костного мозга мыши, которой был введен ВМАР-1 (4 часа)

д: ДНК из костного мозга необработанной мыши (клетки костного мозга)

е: Маркер для определения молекулярного веса

Далее следует подробное описание настоящего изобретения в соответствии с ссылочной процедурной и примером, не ограничивающими объема настоящего изобретения.

Ссылочная Процедура

Создание линии стромальных клеток селезенки и ее характеристика

1) Создание линии стромальных клеток селезенки

Линию стромальных клеток селезенки создают на основе первичной культуры клеток селезенки мыши C57BL/6y, которой вводили рГ-КСФ в дозе 100 мкг/кг в течение 5 дней.

Процедура заключалась в следующем: после завершения введения рГ-КСФ в асептических условиях из животного удаляют селезенку, культивируют ее в инкубаторе при температуре 37^oС в условиях 5% содержания СО₂ в течение 6 недель в пластиковой колбе с площадью основания 25 см³ [Корнинг Ко. (Corning Со.)], используя среду Дульбекко в модификации Искова (IMDM) [ (Boehringer-Мannheim Co. )] в которую внесены инактивированная нагреванием 10% фетальная телячья сыворотка[ФТС (FBS [Санко Юниаку, Токио (Sanko Junyaku, Tokyo)] 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, при этом указанную среду заменяют свежей средой культивирования два раза в неделю.

В конфлюентной культуре отбирают популяции слипшихся клеток (стромальных клеток) из колбы с применением ФБР, не содержащего Са и Мg, в который внесены 0,95% трипсин и 0,02% ЭДТА (Сигма Кемикал Ко.), и переносят в новые колбы. Такие действия повторяют один или два раза в неделю. Сначала (первые десять раз) коэффициент расщепления клеток составляет от 1/4 до 1/8, впоследствии он снижается до величин в диапазоне от 1/16 до 1/32. Приблизительно после 10-го переноса стромальные клетки становятся гомогенными и фибробластоидными.

К 20-му разу проведения вышеописанной процедуры стромальные клетки отбирают и направляют на клеточное клонирование с использованием методики ограниченных разведении; клеточное клонирование повторяют дважды с установлением линии стромальных клеток (клеточная линия CF-1).

Далее эти клетки поддерживают в колбе с площадью основания 25 см³ (Корнинг Ко.) в 5 мл среды 1 МDМ с добавлением 10% инактивированной нагреванием ФТС и проводят субкультивирование каждые пять дней при коэффициенте расщепления 1/32. Линии стромальных клеток селезенки могут быть созданы не только на основе мыши, но и из других животных; так, например, с использованием вышеописанного способа могут быть получены стромальные клеточные линии человека посредством трансформации клеток вектором аденовируса SV-40 (J. Cell Рhysiol., 148, 245, 1991).

2) Характеристика CF-1 клеток

CF-1 клетки, установленные описанным выше способом в виде клеточной линии, исследовали с применением стандартных цитохимических методов анализа на содержание щелочной фосфатазы, кислой фосфатазы, -глюкуронидазы, -нафтил-ацетат-эстеразы. При изучении CF-1 клеток методами иммуноферментной гистохимии использовали следующие моноклональные и поликлональные антитела: macI [Cepo Tek. (Sero Tec. )] , антиген, связанный с фактором VIII [Дакопаттс (Dacopatts)], коллаген типа I, коллаген типа III и фибронектин [Кемикон Интернэшнл Инк. (Chemicon International Inc.)]. Фагоцитоз исследовали по поглощению латексных гранул (размер частиц 1,09 мкм. Сигма), а способность CF-1 клеток превращаться в адипоциты определяли при воздействии фосфата гидрокортизона (Сигма) в дозе 10^-6 моль/л в течение 4 недель на конфлюентную культуру, находящуюся в колбе с площадью основания 25 см².

В результате проведенных исследований было показано, что СF-1 клетки не содержат щелочной фосфотазы, антигена, связанного с фактором VIII, mac 1, кроме того, при исследовании фагоцитоза были получены отрицательные результаты, тогда как положительные данные были показаны при тестировании их на наличие коллагена типа I, коллагена типа III и фибронектина. CF-1 клетки не демонстрировали трансформации в адипоциты в течение 4 недель в конфлюентной культуре при наличии гидрокортизона в дозе 10 моль/л, хотя СF-1 клетки содержат, как было показано, следы липида. На основании этих результатов был сделан вывод о том, что CF-1 клетки не обладают свойствами преадипоцитов, макрофагов и эндотелиальных клеток, и в этой связи их происхождение из других клеток, а именно из стромальных клеток.

3) Поддержание гемопоэтических стволовых клеток клетками CF-1

Для того, чтобы определить, способны ли CF-1 клетки поддерживать рост гемопоэтических стволовых клеток, с помощью техники Тилля и Макаллоха (Till and МcСulloch) было проведено тестирование на образование колониеобразующей единицы клеток селезенки (КОЕ-С) - тест на колониеобразующую способность селезеночных клеток. В ходе тестирования группу из 10 мышей облучали дозой в 900 cGy (MBK-1520R; Хитачи, Токио), после чего животным инъецировали внутривенно моноядерные клетки костного мозга (ВМ клетки) (1,010⁵ /организм, 5,010⁴ /организм или 2,510⁴ /организм) и СF 1 клетки (1,010⁵ /организм), а на 12-й день в селезенке подсчитывали количество образовавшихся колоний в виде КОЕ-С клонов (селезеночные колонии).

Было показано, что при трансплантации в организм облученных мышей моноядерных клеток костного мозга (ВМ клеток) и CF-1 клеток количество колоний каждой группы ВМ клеток значительно возрастает (от 1,4 до 1,8 раз) в сравнении с мышами, которым не вводили CF-1 клетки, при этом происходит также снижение уровня смертности, поскольку на 12-й день после трансплантации коэффициент выживания мышей с трансплантированными ВМ клетками и СF-1 клетками был выше, чем в случае мышей, несущих в качестве трансплантированных только ВМ клетки; эти результаты демонстрируют очевидную способность СF-1 клеток поддерживать рост гемопоэтических стволовых клеток.

Оптимальный способ реализации изобретения

Ниже приводится подробное описание такого варианта настоящего изобретения.

ПРИМЕР

Получение моноклональных антител

1) Антигены и иммунизация

Иммунизацию проводят с применением в качестве антигенов CF-1 клеток, полученных по вышеприведенной стандартной процедуре. Клетки культивируют в инкубаторе при температуре 37^oС и содержании 5% СО₂, в среде Дульбекко в модификации Искова (1МDМ среде) (), содержащей 10% фетальную телячью сыворотку (ФТС; Санко Юниаку).

Клетки обрабатывают 1 мМ ЭДТА/ФБР и с помощью пипетки отбирают из культуральной колбы. Затем клетки суспендируют в 1 мМ ЭДТА/ФБР до концентрации клеток примерно 110⁷ /мл, после чего полученную суспензию вводят крысам линии Вистар Имамих (Wistar Imamich) [крысы 7-недельного возраста, самки, полученные из исследовательской лаборатории по разведению животных (Animal Breeding Research Laboratory)] . Один мл клеточной суспензии, содержащей около 110⁷ клеток/мл, инъецируют в брюшную полость крысы в ходе первичной иммунизации, а через месяц вводят еще 1 мл клеточной суспензии, содержащей примерно 110⁷ клеток/мл. Далее с интервалом в один месяц вводят еще несколько раз 1 мл клеточной суспензии, содержащей приблизительно 110⁷ клеток/мл, а затем, после наблюдения реакции между антителом иммунизированной крысы и CF-1 клетками, вводят завершающую дозу иммунизации в 1 мл клеточной суспензии, содержащей около 110⁸ клеток/мл. Спустя три дня после введения завершающей дозы, крыс забивают и удаляют из них селезенки.

2) Слияние клеток

Селезенку после удаления из организма крысы измельчают, выделенные селезеночные клетки центрифугируют, суспендируют в 1МDМ среде () и тщательно промывают. С другой стороны, клетки, полученные при культивировании миеломной клеточной линии мышей Sp2/0-Agl4 (Nature, 276, 269-270, 1978) и находящиеся в среде 1МDМ () с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (ФТС; Санко Юниаку), так же промывают в вышеприведенной 1МDМ среде, после чего из них отбирают 110⁸ клеток, а из описанных ранее селезеночных клеток отбирают соответственно 210⁸ клеток и помещают обе аликвоты в центрифужную пробирку для осуществления по традиционной методике процесса слияния клеток под влиянием полиэтиленгликоля 4000 Нагараи Кадаку (Nagarai Kadaku)] (Сlin. Exp. Immunol., 42, 458-462, 1980).

Далее полученные слитые клетки распределяют по 96-гнездному планшету в 1MDM среде, содержащей 20% ФТС, и культивируют при температуре 37^oС и содержании 5% СO₂. Нa следующий день их осторожно переносят на селективную ГАТ среду, продолжая на ней культивирование.

С момента начала культивирования двa раза в неделю заменяют супернатанты на свежую ГАТ среду с целью продолжения роста культуры к поддержания пролиферации клеток.

После этого полученные после слияния гибридные клетки клонируют по традиционной методике с использованием способа ограниченных разведении. А именно: в соответствии с указанной традиционной методикой с применением способа ограниченных разведении клонируются только те клоны, которые обладают выраженными способностями к связыванию, при этом отслеживают их связывающую способность с антигенами, которые соединяются с антителами, находящимися в супернатантах таких гибридных клеток.

3) Скрининг

Скрининг слитых клеток (гибридом) проводят на основе опосредованной флюоресценции антител с использованием проточной цитометрии.

Скрининг клонов, продуцирующих целевые антитела, осуществляют с помощью CF-1 клеток в качестве клеток-мишеней. При этом клетки, суспендированные в реакционном буфере (ФБР с добавлением 2% ФТС и 0, 02% NaN₃), центрифугируют, а осадок вновь суспендируют в 100 мкл культурального супeрнатанта от выращивания гибридом (примерно 110⁶ клеток/100 мкл) и проводят реакцию при температуре 4^oС в течение 1 часа. После этого клетки промывaют еще рaз вышеописанным буфером, добавляют меченное флуоресцином козлиное антитело к lgG крысы (FC) (Кемикон) и проводят инкубацию в течение 1 часа.

По окончании еще одной стадии промывания клетки анализируют методом проточной цитометрии [ФАКСкан, Бектон Диккинсон (FACScan, Becton Dickinson)] .

4) Очистка антител

После скрининга по приведенному в 3) методу слитые клетки культивируют с использованием обычной методики, при этом образуемые антитела выделяют из супернатантов с помощью традиционной процедуры и далее очищают.

В соответствии с этой процедурой гибридом с высокими титрами антител к антигенам отбирают из ячеек, распределяют в культуре ткани на пластиковой чашке Петри (Корнинг Ко.), культивируют с целью пролиферации при температуре 37^oС и содержании 5% СО₂ и затем подвергают очистке по обычной методике для получения моноклональных антител GSPST-1 и ВМАР-1.

Для выделения GSPST-1 полученные клетки инъецируют в брюшную полость лишенных волосяного покрова мышей (nude) BAl.B/ cAJc1 - nu [мыши самцы, 8-недельного возраста, Ниппон Куреа (Nippon Kurea)]. Возникший асцит вскрывают через 10-14 дней, высаливают с применением 33% сульфата аммония и диализуют против ФБР. Что касается ВМАР-1 антител проводят крупномасштабное культивирование в минимальной поддерживающей среде (MEM), модифицированной по методу Исковa, содержащей 10% ФТС, после чего супернатанты концентрируют, высаливают с применением 33% сульфата аммония, диализуют против ФБР, снова очищают с применением набора колонок с протеином А (Амершам) и диализуют против ФБР. Далее, как было описано в Примере, CF-1 клетки используют в качестве антигенов для проведения иммунизации; однако возможно с применением того же способа получение моноклональных антител в случае использования других стромальных клеток, обладающих способностью поддерживать рост гемопоэтических стволовых клеток, так что настоящее изобретение не ограничивается вышеприведенными антителами, но включает также все моноклональные антитела, имеющие такие характеристики, а также все гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела.

Гибридома, продуцирующая моноклональное антитело ВМАР-1 настоящего изобретения, представляет собой гибридную клетку, полученную путем слияния селезеночной клетки из крысы Вистар Имамих и миеломной клетки из клеточной линии мышей Sр2/0-Аg14, которая была депонирована 9 августа 1993 г. под названием ВМАР-1 (гибридома из материала крысы и мыши) под депозитным номером FERM ВР-4382 в Национальном Институте Биологических Наук и Технологии Исследования Человека Агентства Промышленной Науки и Технологии в Японии (адрес: 1-3, Хигаши 1-хом, Тсукуба-ши, Ибараки 305, Япония) [National Institute of Bioscience and Human Technology, Agence of Industrial Science and Technolody in Japan (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-Shi, Ibaraki 305, Japan) международного депозитарного управления, действующего на основе Будапештского Договора по международной классификации депозитов микроорганизмов с целью их патентования.

5) Свойства антител

(i) Реакционная способность антител

(Реактивность относительно CF-1 клеток)

Результаты исследования с применением иммунофлюоресцентного анализа реакционной способности моноклональных антител GSРSТ-1 и ВМАР относительно CF-1 клеток показаны на фиг.1-3. Так на фиг.1 приведены данные по изучению контроля в отсутствие антитела, на фиг.2 представлены результаты исследования способности GSPST-1 к связыванию с CF-1 клетками, а на фиг.3 - результаты анализа связывающей способности ВМАР-1 также с CF-1 клетками. На этих фигурах вертикальные оси показывают относительное количество клеток, тогда как на горизонтальных осях приведены данные по интенсивности флюоресценции.

Как следует из фиг.1-3, моноклональные антитела GSРSТ-1 и ВМАР-1 характеризуются способностью как к связыванию с СF-1 клетками, так и к распознаванию поверхностных антигенов CF-1 клеток.

(Реактивность относительных клеток костного мозга)

Далее, на фиг. 4-6 представлены результаты исследования с применением метода проточной цитометрии [ФАКСкан, Бектон, диккинсон (FACScan, Becton Dickinson)] реакционной способности GSPST-1 и ВМАР-1 относительно клеток костного мозга. Так, нa фиг.4 приведены данные по изучению контроля в отсутствие антитела, на фиг. 5 представлены результаты исследования способности GSPST-1 к связыванию с клетками костного мозга, а на фиг.6 - результаты анализа связывающей способности ВМАР-1 также с клетками костного мозга. На этих фигурах вертикальные оси показывают относительное количество клеток, тогда как на горизонтальных осях приведены данные по интенсивности флюоресценции.

Как следует из фиг.4-6, у GSPST-1 полностью отсутствует способность к связыванию с клетками костного мозга, тогда как для ВМАР-1 характерна способность к связыванию со всеми клетками костного мозга.

(Реактивность относительно клеток миелоцитaрной лейкозной клеточной линии (F-60))

Результаты исследования с применением метода проточной цитометрии (ФАКСкан, Бектон Диккинсон) реакционной способности GSPST-1 и ВМАР-1 относительно NFS-60 клеток (Рroc. Natl. Acad. Sci, USA, 82, 6687-6691, 1985) представлены на фиг. 7-10. Так, на фиг. 7 приведены данные по изучению контроля в отсутствие антитела, на фиг. 8 представлены результаты исследования способности GSPST-1 к связыванию с NFS-60 клетками, на фиг. 9 - результаты анализа контроля с использованием имеющегося на рынке lgG1 крысы [Зимед (Zymed)] тогда как на фиг. 10 показаны результаты изучения связывающей способности ВМАР-1 также с NFS-60 клетками. На этих фигурах вертикальные оси показывают относительное количество клеток, тогда как на горизонтальных осях приведены данные по интенсивности флюоресценции.

Как следует из фиг.7-10, GSPST-1 не взаимодействует с NFS-60 клетками, тогда как ВМАР-1 обладает способностью к связыванию с NFS-60 клетками.

(Метод тестирования способности ВМАР-1 ингибировать прoфилерацию NFS-60 клеток)

На фиг.11 приведены результаты исследования действия ВМАР-1 на NFS-60 в присутствии 100 нг/мл КСФ (G-СGT) и 10^-6 М циклогексимида в соответствии с МТТ тестом [количественным методом определения с применением 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида)). С использованием 96-ячеечных микротитрационных плато к каждой ячейке, содержащей в 100 мкл 410³ NFS-60 клеток, добавляют по 10 мкл раствора ВМАР-1 в концентрациях 0, 10, 100 нг/мл, а также 1, 10, 100 мкг/мл и подсчитывают через два дня с применением МТТ метода количество живых клеток.

Как следует из данных фиг. 11, происходит выраженное ингибирование профилерации NFS-60 клеток под действием ВМАР-1.

(ii) Типирование антител

Далее в результате типирования подкласса lgG полученных моноклональных антител [c использованием набора Моно АбИД-СП (Зимед) (Мono AbID - Sp, Zimed) и меченного биотином мышиного антитела к lgG1 крысы (Зимед)] было показано, что GSPST-1 представляет собой lgG2a, a BMAP-1 является lgG1.

(iii) Способность ингибировать трансплантацию костного мозга

С целью дальнейшего изучения антитела настоящего изобретения были использованы в экспериментах по ингибированию трансплантации костного мозга. На фиг. 12 и 13 представлены полученные при этом результаты. Как следует из данных, приведенных на этих фигурах, BMAP-1 демонстрирует ингибирующий трансплантацию костного мозга эффект, тогда как CSPST-1 такое действие не свойственно. Указанные результаты получены при введении через хвостовые вены облученным летальной дозой радиации (900 cGy) мышам C57BL/6J клеток костного мозга в количестве 1,010⁵ в расчете на одно животное и моноклональных антител с последующим подсчетом числа клеточных колоний в селезенке. Вариант "Не обработанные" на фиг.13 относится к случаю, при котором клетки костного мозга не вводятся в исследуемое животное.

Как видно из фиг.13, в описываемом исследовании по ингибированию трансплантации костного мозга было подтверждено представление о том, что именно потому, что BMAP-1 может вступать во взаимодействие с клетками костного мозга, приводя в итоге к апоптозу, моноклональное антитело полностью ингибирует трансплантацию костного мозга в данном тесте. При этом, когда гибридому, продуцирующую ВМАР-1, вводят в брюшную полость лишенной волосяного покрова ньюд (nude) мыши, она погибает в тот момент, когдa содержимое асцита сосредоточивается в малом объеме. Кроме того, было показано, что все клетки костного мoзга погибают при внутривенном введении ВМАР-1 нормальным мышам C57BL/6J в расчете 50 мкг на животное, при этом на фиг.14 приведена микрофотография, демонстрирующая гибель клеток костного мозга на 6-й день после внутривенного введения ВМАР-1. Как видно из данной фотографии, в этом случае погибают не только лимфоидные клетки, но также нейтрофилы, мегакариоциты, миелобласты, миелоциты, тучные клетки, макрофаги, моноциты и эритробласты (так называемые миелоидные клетки). Кроме того, как следует из фиг. 15, при исследовании ДНК клеток костного мозга мыши, которой было введено ВМАР-1 антитело в расчете 30 мкг на животное, был продемонстрирован факт очевидного образования лэддер-последовательности ДНК, при этом было установлено, что указанная выше реакция ВМАР-1 с клетками костного мозга имеет место благодаря апоптозу.

PC регион lgG антитела ВМАР-1 переваривают пепсином (Сигма) и очищают с помощью GРС колонки в виде F (аb")2, после чего его вводят внутривенно мышам C57BL/6J в расчете на одно животное в количестве 33,5 мкг (что соответствует 50 мкг на животное lgG); в результате этого эксперимента было показано, что клетки костного мозга погибают в костном мозге. Ha основе вышеизложенных данных очевидно, что гибель клеток костного мозга под действием ВМАР-1 не связана ни с зависимой от антитела цитотоксичностью, ни с комплемент-зависимой клеточной цитотоксичностью.

Имеется сообщение о том, что в качестве антигена, вызывающего апоптоз, может функционировать белковый Fаs антиген клеточной поверхности; при этом экспрессия соответствующих Fas антигену мРНК была обнаружена в тимусе, сердце, печени, легких и яичнике, тогда как в костном мозге был продемонстрирован лишь невысокий уровень мРНК (J. Immunol., 148, 1274-1279, 1992), и в этой связи очевидно, что антигены, распознаваемые ВМАР-1, отличны от обычного известного Fas антигена.

Кроме того, с целью выяснения, не представляет ли антиген, распознаваемый ВМАР-1, ФНО рецептор (TNF - фактор некроза опухолевых клеток), исследовали функционирование ВМАР-1 с использованием L-929 клеток, реагирующих с ФНО, которые вызывают гибель клеток. Конечная концентрация мышиного ФНОa (TNFa) [Гензим (Genzym)] составляла в эксперименте 0, 1, 10, 100 пг/мл, а также 1, 10, 100 нг/мл и 1 мкг/мл, тогда как концентрация ВМАР-1 равнялась 0, 10, 100 пг/мл, 1, 10, 100 нг/мл, а также 1, 10 мкг/мл, а количество живых L-929 клеток измеряли по методу МТТ на второй день после добавления ФНОа (ТNFа) и ВМАР-1. Результаты эксперимента, как следует из данных фиг. 16 и 17, показывают, что тогда как под действием ФНОа, (ТNFа) происходит выраженное снижение количества L-929 клеток, ВМАР-1 такого эффекта на L-929 клетки не демонстрирует. Эти результаты наглядно показывают, что антиген, распознаваемый ВМАР-1, не является ФНОа, (TNFа) рецептором.

Результаты исследования с применением проточной цитометрии (ФАКСкан, Бектон, Диккинсон) с целью выяснения, не представляют ли антигены, распознаваемые ВМАР-1, антигены класса 1 главной системы тканевой совместимости (МНС), представлены на фиг.18-21.

Так, на фиг. 18 показаны результаты анализа контроля с использованием lgG1 крысы (Зимед), на фиг.19 - результаты анализа способности антитела к главной системе тканевой совместимости, класса (крысиный lqG2a, BMA) связываться с BWV1 клетками (мышиная лимфома, полученная на основе BW 5147 клеток), на фиг.20 приведены данные анализа контроля с использованием lgG1 крысы (Зимед), а на фиг.21 приведены результаты исследования связывающих способностей ВМАР-1 в отношении BWV1 клеток. На данных фигурах вертикальные оси показывают относительное количество клеток, тогда как на горизонтальных осях приведены данные по интенсивности флюоресценции. Как следует из приведенных результатов, ВМАР-1 не распознает BWV1 клетки, тогда как антитело из класса 1 главной системы тканевой совместимости (МНС) реагирует с BWV1 клетками.

Как уже было упомянуто выше, экспериментально был подтвержден тот факт, что ВМАР-1 обладает способностью вызывать апоптоз миелоидных клеток; в соответствии с тем, что, как известно авторам настоящего изобретения, до настоящего времени отсутствовала какая-либо информация о моноклональных антителах, способных вызывать апоптоз миелоидных клеток, моноклональные антитела настоящего изобретения, обладающие такой функцией, представляют собой новые антитела, открытые настоящими авторами. При этом, поскольку моноклональные антитела настоящего изобретения, представленные ВМАР-1, могут приводить, на основе способности этого моноклонального антитела вызывать апоптоз клеток костного мозга, к гибели рассматриваемых миелоцитарных лейкозных клеток, экспрессирующих высокий уровень антигенов, упомянутые моноклональные антитела пригодны для использования в качестве лекарственного средства для лечения миелоцитарного лейкоза.

Моноклональные антитела настоящего изобретения были подробно описаны выше, в разделе Примера; при этом, несмотря на то, что моноклональные антитела, обладающие в соответствии с настоящим изобретением способностью вызывать апоптоз миелоидных клеток, могут быть проиллюстрированы указанными выше примерами, настоящее изобретение ими не ограничивается, а включает все приготовленные таким же способом моноклональные антитела, обладающие теми же характеристиками и функциями, независимо от вида антигенов.

Промышленное применение

Поскольку моноклональные антитела настоящего изобретения могут использоваться как антитела, специфически распознающие и идентифицирующие антигены, вызывающие апоптоз миелоидных клеток, а, кроме того, обладают способностью непосредственно вызывать апоптоз миелоидных клеток, они могут на основе этого свойства, найти применение в медицине в качестве лекарственного препарата, эффективного для лечения миелоцитарного лейкоза.