аналоги паратиреоидного гормона для лечения остеопороза

Формула изобретения

1. Аналог паратиреоидного гормона человека hPTH и его фармацевтически приемлемые соли, имеющие аминокислотную последовательность

R-NH-Rl-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R2-His-Asn-Leu-Gly-Lys-R3-R4-R5-R6-R7-Glu-Arg-Val-R8-Trp-Leu-R9-R10-R11-Leu-R12-R13-Y (SEQ ID NO 23),

где R=водород;

Rl- Ser,

R2=Met или Nle;

R3=His или водорастворимая аминокислота;

R4=Leu или водорастворимая аминокислота;

R5=Asn или водорастворимая аминокислота;

R6=Ser или водорастворимая аминокислота;

R7=Met или Nle;

R8=Glu, Lys, Cys, Orn или Asn;

R9=Arg;

R10=Lys, Orn, Cys, Glu или Asp;

R11=Lys, Leu, Asp, Gln, Ala, Nle, Ile или Туг;

R12=Gln;

R13=Asp, Cys или Lys;

X=OH, NH₂;

Y=X, Val-X или Val-His-Asn-Phe-X,

циклизованную между одной из пар аминокислот 22 и 26, 26 и 30 или, когда R11 и R13 представляют собой Lys или Asp, 27 и 30.

2. Аналог по п.1, отличающийся тем, что он циклизован в форме лактама между одной из пар аминокислот 22/26, 26/30 или, когда R11 и R13 представляют собой Lys или Asp, 27/30; либо он циклизован в форме дисульфидного мостика между Cys парами 22/26 или 26/30.

3. Аналог по п.1, отличающийся тем, что циклизация имеет место в форме лактама или дисульфидного мостика между Cys парами 22/26.

4. Аналог по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что лактам представляет собой 22-26 лактам.

5. Аналог по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что Х представляет собой NH₂.

6. Аналог по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что R11 представляет собой Lys или Leu.

7. Аналог по п.6, отличающийся тем, что R2 и R7 представляют собой Met.

8. Аналог по п.7, отличающийся тем, что R8 представляет собой Glu, R10 представляет собой Lys, a R13 представляет собой Asp.

9. Аналог по п.8, отличающийся тем, что R3 представляет собой His или Lys, R4 представляет собой Leu, Lys или Arg, R5 представляет собой Asn или Lys.

10. Аналог по п.8, отличающийся тем, что R3-R6 представляют собой His-Lys-Lys-Lys, His-Leu-Lys-Lys, Lys-Lys-Lys-Lys или His-Leu-Lys-Ser.

11. Аналог по п.1, отличающийся тем, что он имеет SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 19.

12. Аналог по п. 1, включающий в себя аналог паратиреоидного гормона человека hPTH (1-31), в положении 27 которого находится Lys, Leu, Ile, Nle или Met и который циклизован между Glu²² и Lys²⁶ с образованием лактама.

13. Аналог по п.12, отличающийся тем, что гидрофобный остаток представляет собой Leu, а аналог имеет либо С-концевое амидное окончание, либо С-концевое карбоксильное окончание.

14. Аналог по п.12, отличающийся тем, что он имеет SEQ ID NO: 3.

15. Композиция, предназначенная для лечения остеопороза теплокровного животного, содержащая аналог паратиреоидного гормона человека (hPTH)-(l-31) по п. 12, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом.

16. Композиция по п.15, отличающаяся тем, что в аналоге в положении 27 находится Leu.

17. Композиция по п.15, отличающаяся тем, что аналог имеет SEQ ID N0:3.

18. Способ лечения остеопороза теплокровного животного, при котором такому теплокровному животному вводят терапевтически эффективное количество аналога паратиреоидного гормона человека (hPTH)-(1-31) по п.12.

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что в положении 27 находится Leu.

20. Способ по п.18, отличающийся тем, что аналог имеет SEQ ID NO: 3.

Приоритеты по пунктам и признакам:

02.08.1996 по пп.1-9 при R=водород, R1=Ser, R2=Met, R3=His, R4=Leu, R5= Asn, R6=Ser, R7=Met, R8=Glu, R9=Arg, R10=Lys, R11=Lys,Leu,Nle,Ile, R12=Gln, R13= Asp, X=OH, NH₂ и Y=Val-X, циклизация между парами аминокислот 22 и 26, 26 и 30, циклизация в форме лактама; по п.11 при SED ID NO 6, пп.12-20;

14.03.1997 по пп. 1-9 при R2=Nle, R3=водорастворимая кислота, R4=водорастворимая кислота, R5=водорастворимая кислота, R6=водорастворимая кислота, R7= Nle, R8= Lys, Cys, Orn, Asp, R10=Orn,Cys,Glu,Asp, R11=Asp,Gln,Ala,Tyr, R13= Cys, Lys, Y=X, циклизация между парами аминокислот 27 и 30, если R11 или R13 представляют собой Lys или Arg, циклизация в форме дисульфидного мостика между Cys парами 22/26 или 26/30; п.10, по п.11 при SEQ ID NO 7;

01.08.1997 по признаку: Y= Val-His-Asn-Phe-X, по п.11 при SEQ ID Nos 8-16, 18, 19.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения

Данное изобретение относится к аналогам паратиреоидного гормона (паратгормона) человека, который, как обнаружено, является эффективным при лечении остеопороза.

Предпосылки изобретения

Остеопороз является основной причиной нетрудоспособности у пожилых, в частности, у пожилых женщин. Недавно поняли, что паратгормон человека (hРТН) и некоторые его аналоги являются стимуляторами костного роста, что является полезным при лечении остеопороза. Остеопороз представляет собой прогрессирующее заболевание, которое приводит к снижению общей костной массы и повышенной хрупкости кости. Это часто приводит к спонтанным переломам костей, несущих нагрузку, а также к физическому и психическому истощению, характерному для обездвиживающих повреждений. Постклимактерический остеопороз вызывается исчезновением эстрогенов, которое запускает механизм ускорения костного обмена десятилетней длительности с повышенной несбалансированностью между резорбцией старой кости и образованием новой кости. Это приводит к утончению, повышенной пористости и истощению трабекул костей, несущих нагрузку. Остеопороз часто сочетается с гипертиреозом, гиперпаратиреозом, синдромом Кушинга и применением некоторых стероидных лекарственных средств. Исторически лечебные средства включали в себя повышение содержания кальция в диете, эстрогенную терапию и повышенные дозы витамина D, но главным образом с такими агентами, как антирезорбтивы, которые ингибируют резорбцию костей остеокластами.

Паратгормон (РТН) продуцируется паращитовидной железой и является главным регулятором уровней кальция в крови. РТН представляет собой полипептид, и можно получить синтетические полипептиды с помощью способа, описанного Erickson и Merrifield (The Proteins, изд. Neurath et al., Academic Press, New York, 1976, page 257) и модифицированного способом Hodges et al. (1988) (Peptide Research 1, 19) или способом Atherton, E. и Sheppard, R.C. (Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1989).

Когда уровень сывороточного кальция снижается ниже нормального, паращитовидная железа высвобождает РТН, и уровень кальция повышается в результате резорбции костного кальция, повышения поглощения кальция из кишечника и повышения почечной реабсорбции кальция из образующейся мочи в почечных канальцах. Хотя непрерывно вливаемые низкие уровни РТН могут удалять кальций из кости, те же низкие дозы при интермиттирующей инъекции могут фактически способствовать костному росту.

Tregear (Патент США 4086196) описал аналоги РТН человека и заявил, что от 27 до 34 первых аминокислот являются наиболее эффективными с точки зрения стимуляции аденилатциклазы в клеточном анализе in vitro. Rosenblatt в Патенте США 4771124 описал свойство аналогов hРТН, в которых Тrр²³ замещен аминокислотами фенилаланином, лейцином, норлейцином, валином, тирозином, -нафтилаланином или -нафтилаланином, как антагонистов РТН. У данных модифицированных аналогов hРТН удалены также 2 и 6 N-концевые аминокислоты, в результате чего теряется большая часть агонистических активностей при использовании для лечения остеопороза. Данные аналоги были разработаны в качестве ингибиторов РТН и пептида, родственного РТН. Аналоги были заявлены как возможно полезные при лечении гиперкальцемии, связанной с некоторыми опухолями.

Pang et al. , WО 93/06845, опубликована 15 апреля 1993, описал аналоги hPTH, которые несут замены Arg²⁵, Lys²⁶, Lys²⁷ различными аминокислотами, включая аланин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутамин, глутаминовую кислоту, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин или валин. Они заявлены без подтверждающих данных испытаний на животном или человеке как являющиеся эффективными при лечении остеопороза с минимальными воздействиями на кровяное давление и гладкую мускулатуру.

РТН действует через активацию двух систем вторичных мессенджеров - аденилатциклазы (АС), активируемой G_s-белком, и фосфолипазы C, активируемой G_q-белком. Последняя приводит к стимуляции активности мембраносвязанной протеинкиназы C_s (PKC). Показано, что для активности РКС требуются остатки РТН с 29 по 32 (Jouishomme et al. (1994) J. Bone Mineral Res. 9 (1179-1189). Установлено, что увеличение костного роста, то есть тот эффект, который является полезным при лечении остеопороза, связан со способностью пептидной последовательности повышать активность АС. Показано, что нативная последовательность РТН обладает всеми этими активностями. Последовательность hPTH-(1-34) типично представлена как (А):

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe-OH (SEQ ID 22) A

Следующий линейный аналог, hPTH-(1-31)-NH₂, данные для которого включены в табл. 1 ниже, обладает только АС-стимулирующей активностью, и показано, что он является полностью активным в восстановлении разрежения кости на модели овариэктомированной крысы (Rixon, R.H. et al. (1994) J. Bone Mineral Res. 9, 1179-1189; Whitfield et al. (1996), Calcified Tissue Int. 58, 81-87; Willick et al., Патент США 5556940, опубликован 17 сентября 1996):

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val-NH₂ В

Вышеуказанная молекула В может иметь свободное карбоксильное окончание вместо изображенного амидного окончания.

Задачей настоящего изобретения является создание новых аналогов РТН с большей метаболической стабильностью, повышенной активностью в восстановлении кости, повышенной АС активностью и минимальными клиническими побочными эффектами.

Краткая сущность изобретения

По одному аспекту изобретения предлагается паратгормон человека hРТН и его фармацевтически приемлемые соли, имеющие аминокислотную последовательность

R-NH-R1-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R2-His-Asn-Leu-Gly-Lys-R3-R4-R5-R6-R7-Glu-Arg-Val-R8-Trp-Leu-R9-R10-R11-Leu-R12-R13-Y (SEQ ID 23),

где

R=водород,

R1=Ser,

R2=Met или Nle,

R3=His или водорастворимая аминокислота,

R4=Leu или водорастворимая аминокислота,

R5=Asn или водорастворимая аминокислота,

R6=Ser или водорастворимая аминокислота,

R7=Met или NIe,

R8=Glu, Lys, Cys, Orn или Asp,

R9=Arg,

R10=Lys, Orn, Cys, Glu или Asp,

R11=Lys, Leu, Asp, Gln, Ala, NIe, Ile или Туг,

R12=Gln,

R13=Asp, Cys или Lys,

X=OH, NH₂ и

Y= X, Val-X, или Val-His-Asn-Phe-X (SEQ ID 24), циклизованную как между парами аминокислот 22 и 26, 26 и 30 или 27 и 30, если R11 или R13 представляют собой Lys или Asp.

Примеры солей включают в себя соли неорганических кислот, соли органических кислот, таких как муравьиная кислота, уксусная кислота, винная кислота и лимонная кислота, соли неорганических оснований, таких как натрий и аммоний, и соли органических оснований, таких как триэтиламин, этиламин и метиламин.

По другому признаку настоящего изобретения циклизация осуществляется путем образования лактамов, заключающегося в связывании боковых цепей выбранных аминокислотных пар, как например между природными остатками 22 и 26, либо 26 и 30. Предполагаются также другие типы циклизаций, такие как образование дисульфидного мостика, например между Суs содержащими аналогами Cys²²-Cys²⁶ и Cys²⁶-Cys³⁰.

Обнаружили также, что замены различных аминокислот являются эффективными. Lys²⁷ может быть заменен Leu либо различными другими естественно встречающимися гидрофобными или полярными остатками. Другим фактором является то, насколько хорошо данный остаток соответствует рецептору. Аlа не является таким гидрофобным, как Leu. Lys и Туr, как правило, считаются полярными, но тем не менее имеют гидрофобные взаимодействия с рецептором. Lys, например, может складываться таким образом, что его гидрофобная часть взаимодействует с другими гидрофобными остатками в рецепторе, a NH₂ доступна для растворителя. Такие замены включают в себя орнитин, цитруллин, -аминомасляную кислоту, аланин, норлейцин, изолейцин и тирозин, либо любую нормальную или разветвленную -амино алифатическую кислоту, имеющую от 2 до 10 атомов углерода в боковой цепи, любой такой аналог, имеющий полярную или заряженную группу на конце алифатической цепи. Примеры полярных или заряженных групп включают в себя: амино, карбоксил, ацетамидо, гуанидо и уреидо. Хотя оказывается, что Leu²⁷ является лучшей заменой, также оказывается, что многие другие замены в положении 27 сохраняют почти полную активность и также могут обладать желаемыми свойствами, такими как повышенная протеолитическая стабильность или водорастворимость, и ожидается, что Il, норлейцин, Met и орнитин являются наиболее активными.

Данная замена приводит к стабилизации -спирали в рецептор-связывающем районе гормона. Это подтверждено исследованием спектра циркулярного дихроизма лактамных аналогов по сравнению со спектром циркулярного дихроизма линейной молекулы [Leu²⁷]-hPTH-(1-31)-NH₂. Спектры циркулярного дихроизма являются высоко чувствительными к присутствию -спиральной вторичной структуры, и эта методика использована, чтобы продемонстрировать наличие -спирали в фрагментах hPTH (Neugebauer et al. (1991) Biochemistry 31, 2056-2063). Кроме того, показана стабилизация -спирали при образовании вышеупомянутых лактамов в hPTH-(20-34)-NH₂ (Neugebauer et al. (1994) Int. J. Protein Peptide Res. 43, 555-562). Существует потенциальная амфифильная -спираль между остатками 21 и 31 hPTH-(1-31)-NH₂, и представлены данные, показывающие, что гидрофобная поверхность этой спирали взаимодействует с рецептором РТН (Neugebauer, W. (1995) et al. Biochemistry 34, 8835-8842; Gardella, T.J. et al. (1993), Endocrinology 132, 2024-2030).

Обнаружено, что наиболее эффективная циклизация включает в себя образование лактама, например либо между остатками Glu²² и Lys²⁶, либо между Lys²⁶ и Asp³⁰. Возможны также другие циклизации, как например между Lys²⁷ и Asp³⁰, хотя обнаружено, что данный лактам оказывает некоторое дестабилизирующее воздействие на -спираль.

Более конкретно, исследования связывания с рецептором фрагментов РТН выявили главный связывающий район между остатками 14-34¹. Авторы изобретения предположили, что остатки 17-29 -спирали также связываются с рецептором РТН, и что амфифильная часть данной -спирали связывается своей гидрофобной поверхностью с рецептором². Данная модель согласуется с результатами исследования аналогов рецептор-связывающего района³.

ЯМР исследования показали, что даже модельный пептид, который является высоко спиральным, как обнаружено с помощью CD, также образует множество неспиральных конформаций. Таким образом, структуру рецептор-связанного пептидного гормона, такого как РТН, нельзя достоверно предположить исходя из его свободной структуры в растворе. Ограниченные аналоги пептидных гормонов использовали, чтобы лимитировать количество конформационных состояний, доступных для пептида⁸. Исследование последовательности hPTH выявляет 3 возможных солевых мостика между остатками 17-29, которые могут либо стабилизировать, либо дестабилизировать -спираль. Эти мостики находятся между Glu²² и Lys²⁶ и между Lys²⁶ и Asp³⁰, и ожидается, что оба они стабилизируют -спираль, а также между Lys²⁷ и Asp³⁰, и ожидается, что они дестабилизируют -спираль⁴. Образование лактама между данными парами остатков должно ограничивать конформации, доступные для hPTH в этом спиральном районе. Кроме того, два из этих лактамов, Glu²² - Lys²⁶ и Lys²⁶ - Asp³⁰, для которых ожидается, что они стабилизируют -спиральную структуру, локализованы на полярной стороне амфифильной части -спирали. Для третьего, Lys²⁷ - Asp³⁰, ожидается, что он по меньшей мере частично дестабилизирует -спираль и включает в себя остаток Lys²⁷, который находится на гидрофобной поверхности амфифильной спирали. Циклизация, как, например, между положениями 25 и 29, также может происходить, если Lys и Оrn замещают Аrg в положении 25, и если Gln²⁹ заменен Glu или Asp.

Замена Leu на Lys²⁷ имеет результатом более гидрофобный остаток на гидрофобной поверхности амфифильной спирали. Это приводит к повышенной активности, стимулирующей аденилатциклазу, в клеточной линии ROS. Специалистам следует учитывать, что другие такие замены, обсуждаемые выше, вероятно должны приводить к аналогам с такими же или повышенными активностями.

Ожидается, что комбинированный эффект замены и образования лактама стабилизирует -спираль, повышает биологическую активность и защищает данный район молекулы от протеолитического расщепления. Наличие амида на С-конце является предпочтительным в том смысле, что, кроме того, ожидается, что это защищает пептид от экзопротеолитического расщепления, хотя некоторые пептидазы могут гидролизовать их (Leslie, F.M. and Goldstein, A. (1982) Neuropeptides 2, 185-196).

Обнаружено также, что возможно успешно осуществлять и другие аминокислотные замены. Конкретно, авторы заменили чувствительный к окислению остаток Met в положениях 8, 18 естественно встречающимся гидрофобным остатком NIe, как описано в Japanese Patent publication 61-24598. Следует также ожидать, что другие такие гидрофобные остатки, как Leu, Ile, Val, Phe и Тrр будут также пригодны, как описано в Патенте США 5393869, Nakagawa et al.

Обратные лактамы также предполагаются. Например, авторы изобретения показали эффективность переключения Lys²²-Glu²⁶. Поэтому следует ожидать, что подобные переключения, как между лактамами 26-30 и 27-30, можно успешно осуществлять.

Другая замена в предпочтительном 22-26 лактамном сайте, в дополнение к вышеупомянутой Cys-Cys, то есть Asp²²-Orn²⁶, была сделана, чтобы проиллюстрировать, что возможно успешно получать различные размеры циклизации/кольца.

В Патенте США 5393869, Nakagawa et al., и Патенте США 5434246, Fukuda et al. сообщалось о некоторых замещенных аналогах hРТН, обладающих существенной АС активностью и, возможно, обладающих повышенными стабильностями к протеолитической атаке, в частности

1. Ser-1 на Aib (-аминоизомасляная кислота).

2. Lys-27 на Gln (сообщалось, что обладает 2,5х АС активностью).

3. Остатки 14, 15, 16, 17 на Lys, в целом или частично (сообщалось, что намного повышает активность - до 8х. Это может быть связано с повышением водорастворимости. Ожидается, что in vivo они являются более лабильными к трипсиноподобным ферментам). Авторы заявляют, что данный тетрапептид (остатки 14-17, включительно) является таким, что в нем есть по меньшей мере одна водорастворимая аминокислота. Например, His-14 или Lys-14; Leu-15, Lys-15 или Arg-15; Asn-16, Orn-16, Hci (гомоцитруллин)-16, Asp-16, Arg-16, Lys-16, Dlys-16, Ser-16 или Gly-16; и 17-Ser, 17-Lys, 17-Asp или 17-Arg. Может включать также Glu, например.

4. Arg 25 на His для минимизации протеазной атаки. Поскольку описываемые в данном изобретении лактамы, в частности с Leu или другой гидрофобной аминокислотой в положении 27, могут стать до некоторой степени нерастворимыми, а также трудно растворимыми, следует ожидать, что те же замены могут быть пригодны для описываемых лактамов.

Специалистам следует также учитывать, что, хотя циклические 1-31 h-РТН могут являться предпочтительными, следует ожидать исходя из представленных здесь данных, что циклические фрагменты в пределах от 1-30 до 1-37 также будут эффективны. В частности, в литературе не имеется данных, что наличие дополнительных аминокислот вплоть до 37 влияет на биологические свойства гормона, в частности представлены включенные здесь данные, подтверждающие 1-34.

Лактамы по изобретению можно получить с помощью известных методик, описанных ниже, и можно применять их для стимуляции костного роста, для восстановления кости и для того, чтобы способствовать заживлению кости при различных обстоятельствах, как например при лечении остеопороза и обычных переломов.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показана структура природного РТН человека, остатки 1-31 (SEQ ID :1).

На фиг. 2 показана структура [Leu²⁷]циклo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂ (SEQ ID :3).

На фиг. 3 показана структура [Leu²⁷]цикло(Lys²⁶-Asp³⁰)-hPTH-(1-31)-NH₂ (SEQ ID :4).

На фиг. 4 показаны активности аналогов по изобретению в стимуляции аденилатциклазы клеток ROS 17/2.

На фиг.5 показаны репрезентативные гистологические срезы костей, полученные по окончании 8 недель после OVX, иллюстрирующие различные способности hРТН-(1-31)-NН₂ и его лактамных производных предотвращать разрежение кости и стимулировать костный рост у овариэктомированных (OVX) крыс Sprague-Dawley.

На фиг. 6 показан объем губчатой кости контрольных животных и животных, которых лечили hРТН, для крыс с исходно тяжелым истощением кости. Лечение животных начинали через 9 недель после OVX. [Leu²⁷]циклo[Glu²²-Lys²⁶]hPTH-(1-31)-NH₂ являлся наиболее эффективным из фрагментов, восстанавливая кости до объемов нормальных контрольных крыс.

На фиг.7 показана толщина трабекул бедренных костей крыс для нормальных, овариэктомированных (OVX), ложно-овариэктомированных животных и животных, которых лечили hPTH-(1-31)-NH₂, [Leu²⁷]циклo(Glu²²-Lys²⁶)-hРТН-(1-31)-NH₂ и [Leu²⁷]цикло(Lуs²⁶-Аsр³⁰)-hРТН-(1-31)-NH₂.

На фиг. 8 показано максимальное понижение кровяного давления и время до максимального понижения кровяного давления при добавлении 0,8 нмоль/100 г дозы hPTH-(1-31)-NH₂, [Leu²⁷]цикло(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂ или [Leu²⁷] цикло(Lys²⁶-Asp³⁰)-hPTH-(1-31)-NH₂. Пептиды вводили либо подкожно (незаштрихованная полоса), либо внутривенно (заштрихованная полоса).

На фиг.9 показана структура [Leu²⁷]-hPTH-(1-31)-NH₂ (SEQ ID :5).

На фиг.10 показана структура цикло(Lys²⁷-Asp³⁰)-hPTH-(1-31)-NH₂ (SEQ ID :6).

На фиг. 11 показана структура [Leu²⁷]циклo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-30)-NH₂ (SEQ ID :7).

На фиг.12 показаны активности, стимулирующие аденилатциклазу, различных аналогов по изобретению.

На фиг. 13 показаны гипотензивные действия hPTH-(1-31)-NH₂ и hРТН-(1-30)-NH₂ и их циклических аналогов.

Фиг. 14 представляет собой график, иллюстрирующий воздействие различных дозировок линейного hPTH-(1-31)-NH₂ на костный рост.

На фиг. 15 показана структура [Leu²⁷]цикло(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-OH (SEQ ID :8).

На фиг. 16 показана структура [Leu²⁷]циклo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-34)-NH₂ (SEQ ID :9).

На фиг. 17 показана структура [Leu²⁷]цикло(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-34)-OH (SEQ ID :10).

На фиг. 18 показана структура [Ala²⁷]цикло(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂ (SEQ ID :11).

На фиг. 19 показана структура [NIe²⁷]цикло(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂ (SEQ ID : 12).

На фиг.20 показана структура [NIe^8,18; Leu²⁷]цикло(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂ (SEQ ID :13).

На фиг.21 показана структура цикло(Glu²²-Lys²⁶)- hPTH-(1-31)-NH₂ (SEQ ID : 14).

На фиг. 22 показана структура [Ile²⁷]цикло(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂ (SEQ ID : 15).

На фиг. 23 показана структура [Tyr²⁷]цикло(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂ (SEQ ID :16).

На фиг.24 показана структура -aцeтил-[Leu²⁷]циклo(Glu²²-Lys²⁶)- hРТН-(1-31)-NH₂ (SEQ ID :17).

На фиг. 25 показана структура [Leu²⁷]цикло(Lys²²-Glu²⁶)- hРТН-(1-31)-NН₂ (SEQ ID :18).

На фиг. 26 показана структура [Leu²⁷]цикло(Аsр²²-Оrn²⁶)- hPTH-(1-31)-NH₂ (SEQ ID :19).

На фиг. 27 показана структура [Cys²²; Cys²⁶; Leu²⁷] цикло(Сys²²-Cys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂ (SEQ ID :20).

На фиг. 28 показана структура [Cys²⁶; Cys³⁰; Leu²⁷] цикло(Cys²⁶-Cys³⁰)-hРТН-(1-31)-NН₂ (SEQ ID :21).

Получение аналогов гормона

Методика твердофазного пептидного синтеза, разработанная R.B.Merrifield ("Solid-Phase Peptide Synthesis", Advances in Enzymology 32, 221-296, 1969), включенная здесь путем ссылки, широко и успешно применяется для синтеза полипептидов, таких как паратгормон. Стратегия основана на наличии карбоксил-терминальной аминокислоты пептида, присоединенной к твердому носителю. Последующие аминокислоты затем добавляют в большом избытке. N-концевую -аминогруппу защищают таким образом, что данную защитную группу можно удалить без удаления пептида с твердого носителя. В химический процесс, используемый здесь, включена модификация исходного способа по Меррифилду, на который ссылаются как на Fmoc-подход. Группу Fmoc (фторенилметоксикарбонил) можно удалить с использованием мягких щелочных условий, которые оставляют щелочестабильные защитные группы боковой цепи и связь с носителем незатронутыми. Данная методика описана Е. Atherton и R.C. Sheppard ("Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach", IRL Press, New York, N.Y.), включенная здесь путем ссылки.

Пример 1

Синтез и очистка линейных hРТН-(1-31)-амидных аналогов

-аминогруппы аминокислот защищали с использованием 9-фторенил-метоксикарбонила (Fmoc) в процессе связывания. Связывания осуществляли с использованием смеси гидроксибензотриазола (HOBt), 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония тетрафторбората (TBTU) и диизопропилэтиламина (DIPEA). Использовали 4-кратный избыток активированных аминокислот при двойном связывании при добавлении остатков Asn, Gln, His, Val и Ile. Время связывания для добавлений Аrg и Gly увеличивали от 30 до 60 мин. Связывание первого остатка (Val³¹) с носителем (Tentagel* R, Rapp Polymere, Tubingen, Germany) осуществляли вручную. Все другие стадии осуществляли на автоматическом синтезаторе пептидов PerSeptive Biosystems* Model 9050 Plus. Защиты боковых цепей представляли собой следующее: Аrg (2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил); Glu, Asp и Ser (трет-бутил); His, Gln и Asn (тритил); Тrр (трет-бутоксикарбонил).

После удаления Fmoc с N-концевого Ser содержащую пептид смолу промывали DCM, затем отщепляли пептид от смолы посредством встряхивания с 7,5 мл реагента К (6,19 мл TFA, 0,38 мл каждого из: воды, 90% фенол/воды и тиоанизола, и 0,19 мл 1,2-этандитиола) в течение 4 ч при 20^oС. Отщепленную пептидную смесь отделяли посредством фильтрования и осаждали посредством добавления к трет-бутил-метилэфиру. Осадок собирали посредством центрифугирования, дважды промывали трет-бутил-метилэфиром, затем высушивали посредством вакуумного центрифугирования.

Сырой продукт растворяли в 14 мл 15% ацетонитрила/вода, 0,1% TFA и подвергали хроматографии на колонке Vydac* C₁₈ (10 мкм, 1х25 см). Продукт элюировали 1%/мин градиентом ацетонитрила (14-40%) в 0,1% TFA в воде. Чистоту конечного продукта оценивали посредством аналитической ВЭЖХ на колонке Vydac* C₁₈ (10 мкм, 0,4х25 см) и посредством анализа молекулярной массы на масс-спектрометре с ионизацией электроразбрызгиванием (VG Quattro). Данные для полученного таким образом hPTH-(1-31)-NH₂ приводятся в табл. 1 ниже.

Пример 2

Синтез и очистка циклических аналогов

[Leu²⁷] циклo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂. Данный пептид синтезировали, как описано в примере 1, с замещением Lys-Alloc и Glu-OAII в положениях 26 и 22, соответственно. После добавления Fmoc-Ser¹⁷ пептид-содержащую смолу удаляли из колонки в реакционный флакон (Minivial^*, Applied Science), суспендировали в 1,7 мл раствора тетракис(трифенилфосфин)палладия(0) (0,24 ммоль), 5% уксусной кислоты и 2,5% N-метилморфолина (NMM) в дихлорметане (DCM) в атмосфере аргона, затем встряхивали при 20^oС в течение 6 ч для удаления аллил- и аллок-защитных групп (Sole, N.A. et al. (1993) в Peptides: Chemistry, Structure and Biology, изд. Smith, J. and Hodges, R., ESCOM pp. 93-94), что включено здесь путем ссылки. Пептид-содержащую смолу затем промывали с использованием 0,5% диэтилдитиокарбамата (DEDT), 0,5% NMM в DMF (50 мл), затем DMF (50 мл) и DCM (50 мл). Пептид (0,06 ммоль) циклизовали посредством встряхивания с 0,06 ммоль 1-гидрокси-7-азабензотриазола (HOAt)/0,12 ммоля NMM в 2 мл DMF в течение 14 ч при 20^oС (Carpino, L.A. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115, 4397-4398). Пептид-содержащую смолу фильтровали, затем промывали один раз DMF, снова заполняли ею колонку и промывали DMF, пока пузыри не удалялись из суспензии. Оставшийся синтез осуществляли, как в примере 1, за исключением того, что N-концевую Fmoc группу не удаляли. Fmoc-пептид отщепляли от смолы с использованием реагента К, как описано выше. ВЭЖХ осуществляли как в примере 1 с удалением группы Fmoc перед проведением конечной ВЭЖХ.

Аналог [Lеu²⁷] цикло(Lуs²⁶-Аsр³⁰)-hРТН-(1-31)-NH₂ получали аналогичным способом.

Пример 3

Аденилатциклазные анализы

Способность аналогов hPTH связываться с рецепторами и активировать сигнальный механизм, связанный с аденилатциклазой, определяли на компетентной к дифференцировке, остеобластоподобной клеточной линии ROS 17/2 остеосаркомы крысы (ROS). Известно, что данная активность тесно связана со способностью аналога к восстановлению костной массы у овариэктомированной крысы. Активность, стимулирующую аденилатциклазу, оценивали с помощью предварительного мечения клеточного пула АТФ [³Н]-аденином и последующего измерения количества [³H]-циклического АМФ, продуцируемого из [³H]-АТФ в течение первых 10 мин экспозиции с конкретным аналогом. Данная методика основывалась на методике, описанной Whitfield et al. (J. Cellular Physiology 150, 299-303, 1992), включенной здесь путем ссылки.

Результаты по аденилатциклазе отражены в табл. 2 ниже в виде концентрации, необходимой для проявления половины максимального увеличения АС активности. Эти данные также изображены на фиг.4. На фиг.4 закрашенные кружки показывают стимулирующую аденилатциклазу активность, hPTH-(1-31)-NH₂, а активности [Leu²⁷]цикло(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂ и [Leu²⁷]цикло(Lys²⁶-Asp³⁰)-hPTH-(1-31)NH₂ показаны с помощью незакрашенных и закрашенных треугольников, соответственно.

Пример 4

Определение анаболических активностей аналогов hРТН с использованием модели овариэктомированной крысы

Дозировки:

Дозы были основаны на данных доза-ответ по hРТН-(1-31)-NН₂. Костеобразующую эффективность hPTH-(1-31)-NH₂ тестировали с использованием нескольких доз (0,8, 0,6, 0,4 и 0,2 нмоль/100 г массы тела) и регенеративной модели, или модели скорее для оценки лечения, чем профилактики.¹¹ Овариэктомированных крыс 3-месячного возраста оставляли на 9 недель, чтобы дать по большей части не пластинчатой бедренной губчатой кости тяжело истощиться, прежде чем начинать ежесуточные инъекции в течение 6 недель. К концу 9-й недели они теряли примерно 75% костной массы бедренной губчатой кости. На фиг. 14 показано зависимое от дозы увеличение средней толщины трабекул, вызванное отложением костных пластинок, которое было получено в результате 36 инъекций 4 различных доз фрагмента. Фрагмент также был способен стимулировать рост губчатой кости у крыс значительно более старшего возраста. Таким образом, 36 инъекций дозы среднего диапазона 0,6 нмоль/100 г массы тела hРТН-(1-31)-NН₂ были способны значительно увеличить среднюю толщину трабекул по сравнению с обычной исходной величиной предварительно истощенной (9 недель после OVX) бедренной губчатой кости крыс в возрасте 1 года, и были так же эффективны, как hРТН-(1-84). Соответственно, в дальнейших опытах использовали дозировку 0,6 нмоль/100 г массы тела.

Полное описание протокола дано Rixon et al. (J. Bone & Mineral Research 9, 1179-1189, 1984) и Whitfield et al. (Calcif. Tissue Int. 58, 81-87, 1996), включенных здесь путем ссылки. Нормальных, ложно-OVX (овариэктомированных) и OVX крыс Sprague-Dawley (3-месячного возраста: 255-260 г) получали от Charles River Laboratories (St. Constant, QC). Крыс случайным образом разделяли на группы по 8 животных при получении. Крысы получали свободный доступ к пище и воде. Незапланированных смертей не было. Животные получали по 6 подкожных инъекций за неделю по одному разу в сутки, начиная с конца второй недели после OVX и заканчивая в конце 8-й недели после OVX (то есть, 36 инъекций). Восемь ложно-OVX и 8 OVX контрольных крыс получали 36 инъекций растворителя (0,15 М NaCl содержащий 0,001 н. HCl), тогда как 8 OVX крыс получали 0,6 нмоль фрагмента в растворителе/100 г массы тела. В конце 8-й недели после OVX бедренные кости извлекали, выделяли, очищали, разрезали пополам в среднем диафизе и проксимальную половину отбрасывали. После удаления эпифиза каждую половину бедренной кости расщепляли по длине на две части и вымывали костный мозг.

Костеобразующие эффективности фрагментов оценивали исходя из изменений в средней толщине (площадь/периметр) трабекулы в дистальных половинах бедренных костей из животных, которых лечили по-разному. Чтобы измерить среднюю толщину трабекулы, две деминерализованные половины бедренных костей от каждой крысы дегидратировали и заключали в парафин. Получали продольные срезы 10 мкм из средней плоскости каждой "кости, а затем окрашивали их быстродействующим красителем Сандерсона для костной ткани (Surgipath Medical Industries, Inc. , Winnipeg, MB, Canada). Среднюю толщину трабекулы измеряли с использованием системы визуализации М4 и программного обеспечения для морфометрии кости от Imaging Research Inc. (St. Catherines, ON, Canada).

Репрезентативные гистологические срезы костей, полученные в конце 8 недель после OVX, показаны на фиг. 5. Далее результаты представлены в виде диаграммы на фиг.7. Столбики показывают величины толщины трабекул нормальных, овариэктомированных (OVX), ложно-OVX, hPTH-(1-31)-NH₂, [Leu²⁷]цикло(Glu²²-Lys²⁶)- hPTH-(1-31)-NH₂ и [Leu²⁷]цикло(Lys²⁶-Asp³⁰)-hPTH-(1-31)-NH₂. [Leu²⁷]циклo(Glu²²-Lys²⁶)- hPTH-(1-31)-NH₂ проявляет особенно высокую активность по сравнению с линейным аналогом, hPTH-(1-31)-NH₂. Показано, что данный линейный аналог является полностью активным при восстановлении кости, но использует только один путь передачи клеточного сигнала (АС-активированный). Таким образом, ожидается, что данные циклические аналоги, как и их линейный аналог, обладают меньшими нежелательными клиническими побочными эффектами, чем их более длинные двойники, такие как hPTH-(1-34) или hPTH-(1-84), которые активируют оба механизма передачи клеточного сигнала.

Пример 5

Восстановление кости с помощью аналогов hРТН у крыс с тяжелым истощением губчатой кости

В данном втором примере восстановления кости сравниваются способности лактамных фрагментов восстанавливать тяжело истощенную губчатую кость. В данном эксперименте 6-недельную программу инъекций по одному разу в сутки 0,6 нмоль пептида/100 г массы тела молодым половозрелым крысам задерживали до конца 9-й недели после OVX. В это время 75% их губчатой кости было разрежено. Как видно на фиг.6, наиболее эффективным из фрагментов был [Leu²⁷] циклo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂. Он восстанавливал объем губчатой кости до объемов кости нормальных контрольных крыс.

Пример 6

Гипотензивные эффекты аналогов hPTH

Самок крыс Sprague-Dawley (массой свыше 290 г) анестезировали с использованием инъецируемого внутрибрюшинно пентобарбитала натрия (65 мг/кг массы тела). За ректальной температурой следили с использованием термистора YS1402 (Yellow Springs Instrument Co., Inc. Yellow Springs, ОН) и поддерживали ее между 36,0 и 38,5^oC в течение всего эксперимента. За ушной температурой также следили с использованием кожухового термистора YSI. Хвостовую артерию обнажали, канюлировали с использованием катетера Jelco 25-glV (Johnson and Johnson Medical Inc. , Arlington, TX) и соединяли с датчиком давления Статама, сигналы с которого регистрировали пальцевым методом с использованием Biopac Systems MP100 Monitor (Harvard Instruments, Saint Laurent, QC, Canada). Для внутривенной инъекции РТН или одного из его фрагментов обнажали также бедренную вену. После операции крысе давали возможность стабилизироваться в течение 8 мин, после чего РТН или один из его фрагментов (растворенный в подкисленном физиологическом растворе, содержащем 0,001 н. HCl) инъецировали в бедренную вену или под кожу живота. Данные собирали в течение 12 мин после внутривенной инъекции или в течение 22 мин после подкожной инъекции. На фиг.8 показано максимальное понижение кровяного давления и время до максимального понижения при добавлении дозы в 0,8 нмоль/100 г [Leu²⁷] цикло(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂ или [Leu²⁷] цикло(Lys²⁶-Asp³⁰)-hPTH-(1-31)-NH₂ для введения посредством либо подкожного (незаштрихованная полоса), либо внутривенного (заштрихованная полоса) пути введения. Аналог [Leu²⁷]циклo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂ проявляет повышенную биологическую доступность по сравнению с [Leu²⁷]цикло(Lys²⁶-Asp³⁰)-hPTH-(1-31)-NH₂. На это указывает значительно более короткое время, требующееся для понижения кровяного давления до минимума после подкожной инъекции. Оба циклических аналога проявляют повышенные гипотензивные эффекты при подкожной инъекции по сравнению с hРТН-(1-31)-NH₂. Таким образом, ожидается, что каждый циклический лактамный аналог при подкожной инъекции обладает более желательными свойствами, чем линейный двойник. Эти свойства включают в себя большую биологическую доступность, являющуюся результатом повышенной устойчивости к протеазам и/или повышенной способности к транспортировке из липидного окружения. Последнее может быть связано со стабилизацией амфифильной спирали около С-конца гормона.

Дальнейшие результаты:

С целью получения данных результатов пептиды обозначали следующим образом:

hPTH-(1-31)-NH₂ (1); [Leu²⁷] -hPTH-(1-31)-NH₂ (2) (фиг.9); [Leu²⁷]цикло(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂ (3) (фиг.2); [Lеu²⁷]цикло(Lуs²⁶-Аsр³⁰)-hPTH-(1-31)-NH₂ (4); цикло(Lуs²⁷-Аsр³⁰)-hРТН-(1-31)-NН₂ (5) (фиг.10); hРТН-(1-30)-NH₂ (6); [Leu²⁷] - hPTH-(1-30)-NH₂ (7); [Leu²⁷] цикло(Glu²²-Lys²⁶)-hРТН-(1-30)-NH₂ (8).

Аденилатциклазные активности. Ранее авторы изобретения сообщали, что [Leu²⁷]-hPTH-(1-34)-NH₂ является более активным в стимуляции АС активности в клеточной линии ROS, чем hPTH-(1-34)-NH₂.⁵ Авторы изобретения также обнаружили, что пептид 2 (EC₅₀ 11,55,2 нМ) является более активным, чем нативная последовательность 1 (ЕС₅₀ 19,93,9 нМ) (фиг.12). Изображены пептиды 1 (); 2 (); 3 (); 4 ; 5 (О). Образование лактама между Glu²² и Lys²⁶ (3) индуцировало еще большую АС-стимулирующую активность с величинами EC₅₀ 3,30,3 нМ (фиг.12). Таким образом, чистый эффект этой циклизации и замены Lys²⁷ на Leu состоит примерно в 6-кратном повышении активности. Напротив, образование лактама либо между Lys²⁶ и Аsр³⁰ (4), либо между Lys²⁷ и Аsр³⁰ (5) приводило к потере стимуляции аденилатциклазы по сравнению с их исходными линейными последовательностями. Таким образом, лактам 26-30 (4) обладает немного меньшей активностью, чем его линейная форма, с EC₅₀ 17,03,3 нМ по сравнению с 11,55,2 нМ для (2). Образование лактама 27-30 (5) более заметно снижает активность исходного линейного пептида, обладая EC₅₀ 40,34,4 нМ по сравнению с 193,9 нМ для (1).

Авторы изобретения ранее сообщали, что hPTH-(1-30)-NH₂ (6) обладает АС-стимулирующей активностью (EC₅₀, 20 нМ), близкой к таковой для аналога 1. В настоящее время авторы изобретения обнаружили, что [Lеu²⁷]-hРТН-(1-30)NH₂ (7) и цикло(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-30)-NH₂ (8) (фиг.11) обладают АС-стимулирующей активностью, близкой к активности пептида 6.

Гипотензивные эффекты:

На фиг.13 показано гипотензивное действие линейных (6 и 7) и циклических лактамных аналогов (3 и 8). Показано максимальное понижение кровяного давления (сверху), полученное при инъецировании крысе 0,8 нмоль аналога/100 г массы тела, и время, затраченное на достижение максимального понижения кровяного давления (ниже). Аналоги (слева направо пептиды 8, 7, 6, 3) инъецировали либо внутривенно (темный столбик), либо подкожно (незакрашенный столбик). Удаление Val³¹ привело к тому, что все аналоги 6, 7 и 8 обладали значительно (р<0,05) сниженной скоростью транспорта пептидов, инъецированных подкожно, в сосудистую систему (фиг.13). Действительные значения общего понижения кровяного давления для пептидов 6 и 8, тем не менее, отличались незначительно (р>0,05) от таковых для других аналогов при введении либо подкожно, либо внутривенно, за исключением пептида 5.

АНАЛИЗ. СВЯЗЫВАЮЩИЙ ГИПОТЕНЗИВНЫЙ ЭФФЕКТ С ОСТЕОГЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Как описано в примере 6 и проиллюстрировано на фиг.8, быстрый гипотензивный эффект, наблюдаемый после подкожной инъекции аналогов hPTH, коррелирует с остеогенной активностью. Соответственно, данный анализ является полезным для скриннинга подходящих аналогов hPTH на остеогенный эффект и для того, чтобы элиминировать негипотензивные конструкции без необходимости жертвовать подопытными лабораторными животными.

Основываясь на истории вопроса, авторы изобретения использовали уникальный набор остеогенных и неостеогенных AC-, AC/PLC- или PLC-активирующих фрагментов РТН, чтобы определенно доказать, что только стимуляция АС снижает кровяное давление, и чтобы сравнить гипотензивные действия данных фрагментов при их подкожной или внутривенной инъекции самкам крыс. Авторы изобретения показали, что гипотензивный ответ запускается только АС- или AC/PLC-стимулирующими фрагментами, и что имеет место относительно низкий гипотензивный ответ на подкожную инъекцию и незначительно более высокий ответ на внутривенную инъекцию, что коррелирует с остеогенными активностями hPTH-(1-31)-NH₂, hPTH-(1-34) и hPTH-(1-84) у OVX крыс, но не коррелирует для hPTH-(1-30)-NH₂, который стимулирует АС и снижает кровяное давление, но не стимулирует костеобразование.

Конкретно, hPTH-(1-84) и его фрагменты hРТН-(1-34), hPTH-(1-31)-NH₂ и hPTH-(1-30)-NH₂ снижали давление в хвостовой артерии у анестезированной самки крыс Sprague-Dawley на 42,4-67,1% в течение примерно 1 мин после инъекции в бедренную вену, но снижали давление только на величину от 8,5 до 36,2% в течение от 2 до 19 мин после подкожной инъекции. hРТН-(1-84) и hPTH-(1-34) стимулируют как аденилатциклазу, так и фосфолипазу С в их клетках-мишенях, но гипотензивное действие должно было специфически стимулироваться активацией аденилатциклазы, поскольку hPTH-(1-30)-NH₂ и hPTH-(1-31)-NH₂, которые могут стимулировать только аденилатциклазу, обладали значительным гипотензивным эффектом при внутривенной инъекции, тогда как hРТН-(7-84), который может стимулировать только фосфолипазу С, не обладал значительным гипотензивным эффектом при внутривенной инъекции. Поскольку остеогенное действие РТН также опосредовано стимуляцией аденилатциклазы, ожидалось, что гипотензивный ответ можно использовать для скрининга новых конструкций РТН на возможную остеогенность. В действительности, остеогенная активность инъецированных подкожно hРТН-(1-31)-NН₂, hРТН-(1-34) и hРТН-(1-84) тесно коррелировала с их гипотензивной активностью, причем hРТН-(1-34) обладал намного большей гипотензивной активностью, значительно большей, чем две другие молекулы. hPTH-(1-31)-NH₂ и hРТН-(1-84) обладали остеогенной и гипотензивной активностью в равной степени. Однако данная корреляция нарушалась hРТН-(1-30)-NН₂, который стимулирует АС почти так же сильно, как hРТН-(1-31)-NН₂ и hРТН-(1-34), и снижает кровяное давление в той же степени, как и hРТН-(1-31)-NH₂, но не стимулирует костеобразование. Тем не менее, способность к значительному снижению артериального давления является общим свойством остеогенных РТН и РТН фрагментов и является, следовательно, быстро определяемым предварительным индикатором биологической активности РТН фрагментов in vivo.

Более конкретно, как hРТН-(1-34), так и hPTH-(1-31)-NH₂ обладали максимальной гипотензивной активностью при 0,8 нмоль/100 г массы тела.

Данный гипотензивный ответ сопровождался временным (20-30 мин) покраснением ушей и лап у крыс, что можно считать полезным визуальным качественным маркером.

Хотя АС- или AC/PLC-стимулирующие фрагменты, инъецированные внутривенно, были сильно гипотензивными, внутривенная инъекция 0,8 нмоль/100 г массы тела hРТН-(7-84), который способен стимулировать только PLC, только очень медленно (9,82,0 мин) и очень слабо снижала давление в хвостовой артерии на 3,281,0 мм рт. ст. по сравнению с быстрым (0,90,08 мин) снижением на 43,25,8 мм рт.ст., которое вызывается AC/PLC-стимулирующим hРТН-(1-84) или в равной степени быстрым снижением на 51,63,3 мм рт.ст., которое вызывается АС-стимулирующим hРТН-(1-31)-NН₂.

Одна подкожная инъекция АС- или AC/PLC-стимулирующего фрагмента вызывала намного более медленное и меньшее снижение давления в хвостовой артерии, чем внутривенная инъекция той же дозы. Например, 0,8 нмоль/100 г массы тела hРТН-(1-34), инъецированного подкожно, снижали давление только на 27,93,6 мм рт.ст. по сравнению с 50,95,6 мм рт.ст. при внутривенной инъекции. Та же доза hРТН-(1-31)-NН₂, инъецированная подкожно, снижала кровяное давление только на 11,1 1,6 мм рт.ст. по сравнению с 51,63,3 мм рт.ст. при инъекции внутривенно.

Не наблюдалось значительного различия между быстрыми и значительными снижениями давления в хвостовой артерии, вызванными внутривенно инъецированными hPTH-(1-84), hРТН-(1-34) и hPTH-(1-31)-NH₂, однако, hРТН-(1-34) был по меньшей мере в два раза более эффективным (Р<0,01), чем две другие молекулы, при подкожной инъекции.

Одним из факторов, которые влияют на гипотензивное действие и остеогенность подкожно инъецированного РТН или РТН фрагмента, является его способность к перемещению от сайта инъекции к его мишеням, прежде всего в сосудистой сети, а затем в костях, без его инактивации. Данная способность отражается во времени, которое требуется для понижения давления в хвостовой артерии до минимальной величины после инъекции. Укорочение молекулы РТН с С-конца с 84 по 31 остаток элиминировало ее способность стимулировать PLC без ослабления способности стимулировать АС и в девять раз уменьшало время, требующееся, чтобы давление в хвостовой артерии достигло своего минимума. Удаление еще одного остатка с образованием hРТН-(1-30)-NН₂ значительно увеличивало время, требующееся, чтобы кровяное давление снизилось до своего минимума, с 2,00,31 мин в случае hРТН-(1-31)-NН₂, до 13,82,3 мин. Однако, важно отметить, что hРТН-(1-31)-NН₂ требовалось не больше времени для снижения кровяного давления, чем hРТН-(1-84).

Использование в настоящем исследовании hPTH-(1-31)-NH₂, первой конструкции РТН, способной стимулировать АС так же сильно, как hРТН-(1-34), без активации PLC и стимуляции активности мембраносвязанной РКС, в настоящее время представило самое прямое доказательство, что гипотензивное действие РТН тесно связано с активацией АС. Следовательно, хотя внутривенная инъекция 0,8 нмоль/100 г массы тела hРТН-(7-84), который способен стимулировать только PLC/PKC, не влияла значительно на давление в хвостовой артерии, внутривенная инъекция той же дозы hРТН-(1-31)-NН₂ снижала давление в той же степени, как и hРТН-(1-34).

Поскольку АС также опосредует РТН-индуцированную стимуляцию кортикального и трабекулярного костеобразования у OVX крыс, оказывается, что запуск гипотензивного ответа у интактных самок крыс является простым, быстро измеряемым индикатором возможной остеогенности конструкций РТН. С другой стороны, неспособность снижать артериальное давление должна приводить к исключению фрагмента из дальнейшей оценки, избегая, таким образом, ненужного, длительного и дорогостоящего теста на остеогенность у OVX крыс. Гипотензивные ответы на внутривенную инъекцию РТН не коррелировали с остеогенностью. Однако, намного меньшие гипотензивные ответы на подкожно инъецированные hPTH-(1-31)NH₂, hРТН-(1-34) и hРТН-(1-84) соответствовали остеогенностям данных молекул, причем hРТН-(1-34) обладал самым сильным гипотензивным и остеогенным действием, а две другие молекулы являлись равными по эффективности друг другу, но менее эффективными, чем hРТН-(1-34), в снижении кровяного давления и стимуляции костеобразования. Но данная корреляция нарушалась hPTH-(1-30)-NH₂, который стимулирует АС почти так же сильно, как hРТН-(1-31)-NН₂ и hРТН-(1-34), и снижает кровяное давление в той же степени, как и hРТН-(1-31)NН₂, но не стимулирует костеобразование.¹¹ Причина данного отсутствия остеогенности неизвестна. Она не может быть связана только с тем, что hРТН-(1-30)-NН₂, инъецированному подкожно, требуется больше времени, чтобы снизить кровяное давление, поскольку hРТН-(1-84), инъецированному подкожно, требуется то же время, чтобы снизить кровяное давление, но тем не менее он обладает сильной остеогенностью. Очевидно, что остеогенный ответ зависит от сочетания многих различных факторов, которые обеспечивают доставку достаточно активного гормона или фрагмента гормона от сайта инъекции к зрелым остеобластам-мишеням, экспрессирующим рецептор РТН. Неспособность АС-стимулирующего, снижающего кровяное давление hРТН-(1-30)-NН₂ стимулировать костеобразование может являться результатом сочетания большей нестабильности, незначительно более высокой ЕС₅₀, необходимой для стимуляции АС, то есть 20 нМ вместо 16 нМ, как необходимо для hРТН-(1-31)-NН₂ и hРТН-(1-34), и длительного времени, необходимого для поступления в кровообращение из сайта инъекции.

Несмотря на неспособность hРТН-(1-30)-NН₂ проявлять остеогенность, способность к значительному снижению артериального давления тем не менее является общим свойством остеогенных РТН и, следовательно, представляет собой быстро определяемый индикатор возможной биологической активности фрагментов РТН in vivo. Из этого следует, что гипотензивный ответ также должен служить эффективным индикатором способности остеогенной РТН конструкции достигать своих мишеней после введения посредством перорального пути введения или других неинъекционных путей введения.

Дискомфорт и другие возможные последствия гипотензивного ответа на каждую инъекцию могут ограничивать готовность пациентов с остеопорозом согласиться на долговременное лечение РТН или РТН фрагментом. К счастью, в настоящее время для стимуляции костеобразования применяют интермиттирующие подкожные инъекции РТН, и все эти молекулы обладают намного меньшей гипотензивной активностью, если их инъецируют подкожно, чем если их инъецируют внутривенно. Как авторы изобретения также доказали ранее⁶"⁷, hPTH-(1-31)-NH₂ должен обладать дополнительным преимуществом в стимуляции АС без стимуляции PLC и любых возможных Са²⁺- и РКС-опосредованных побочных эффектов, которые она может запускать.

Пример 7

Цикло(Lуs²⁷-Аsр³⁰)-hРТН-(1-31)-NH₂ (5). Синтез осуществляли способом, аналогичным способу синтеза [Leu²⁷] -циклo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-31)-NH₂. Продукт обладал чистотой, оцененной как >95%, и молекулярной массой 3700,64 (0,38) (ожидаемая М+1=3700,14). Для подтверждения положения лактама определили последовательность пептида.

[Leu²⁷] -цикло(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(1-30)-NH₂ (8). Данный пептид синтезировали так же, как пептид 3, без добавления вручную Val к носителю. Продукт обладал частотой, оцененной как >97%, и молекулярной массой 3586,14 0,19) (ожидаемая М+1 =3685,99).

Аналоги по настоящему изобретению можно вводить теплокровному млекопитающему, нуждающемуся в этом, в частности человеку, посредством парентерального, местного или ректального введения, либо посредством ингаляции, либо посредством перорального приема. Препараты аналогов можно традиционно изготавливать в парентеральной лекарственной форме, смешивая от примерно 1 до примерно 300 мг на единицу дозировки с традиционным стандартным носителем, эксципиентом, связывающим веществом, консервантом, стабилизатором, красителем или тому подобным, как предусмотрено общепринятой фармацевтической практикой.

Для парентерального введения безболезненную подкожную инъекцию от 1 до 2 мл через ультратонкую иглу номер 30 для шприца должно быть необходимо делать не более чем один раз в сутки, в течение от одного года до двух лет, в зависимости от тяжести заболевания. Инъецируемый материал должен содержать материал по настоящему изобретению в водном изотоническом стерильном растворе или суспензии (возможно с консервантом, таким как фенол, или с солюбилизирующим агентом, таким как этилендиамин тетрауксусная кислота (ЭДТА)). Среди приемлемых носителей и растворителей, которые можно использовать, находится вода, мягко подкисленная вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, стерильные нелетучие масла традиционно используют в качестве растворителя или суспендирующей среды. Синтетические моноглицериды, диглицериды, жирные кислоты (такие как олеиновая кислота) находят применение в качестве нелетучего масла при получении препаратов для инъекций.

Для ректального введения аналоги по настоящему изобретению можно изготовлять в форме суппозиториев посредством смешивания с подходящим не раздражающим эксципиентом, таким как масло какао или полиэтиленгликоли.

Для местного применения аналоги по настоящему изобретению можно изготовлять в форме мазей, гелей, растворов, суспензий или кожных липких пластырей.

Ингаляцию можно осуществлять, например способом, описанным в опубликованной заявке РСТ WО 94/07514.

Суточная доза не должна превышать 0,05 мг/кг массы тела, или примерно 3,5 мг/человека массой 70 кг, в зависимости от активности конкретного соединения, возраста, массы, пола и состояния субъекта, которого лечат. Как должно быть хорошо известно, количество активного ингредиента, которое можно смешивать с материалами-носителями для получения разовой дозировки, будет варьировать в зависимости от субъекта, которого лечат, и конкретного способа введения.

Пример фармацевтической композиции 8

Раствор для инъекции 0,2%-ный может быть приготовлен, например, следующим образом:

Аналог hРТН (1-31) - 5,0 г

Натрия хлорид - 22,5 г

Фосфатный буфер рН 7,4 - 300,0 г

Деминерализованная вода - До 2500,0 мл

Активное вещество (аналог hРТН (1-31)) растворяют в 1000 мл воды и фильтруют через микрофильтр. Добавляют буферный раствор, и весь объем доводят до 2500 мл водой. Для получения стандартных лекарственных форм в стеклянные ампулы вносят порции по 1,0 или 2,5 мл каждая (каждая ампула содержит, соответственно, 2,0 или 5,0 мг активного вещества).

Все аналоги, приведенные в таблицах, были получены в соответствии с методиками, описанными выше.

Источники информации

1. Caulfield, М. Р.; МсКее, R. L; Goldman, М. Е.; Duong, L. Т.; Fisher, J. Е. ; Gay, С. Т.; DeHaven, P. A.; Levy, J. J.; Roubini, Е.; Nutt, R. F.; Chorev, M.; Rosenblatt, M. The Bovine Renal Parathyroid Hormone (PTH) Receptor Has Equal Affinity for 2 Different Amino Acid Sequences - The Receptor Binding Domains of PTH and PTH-Related Protein Are Located Within the 14-34 Region. Endocrinology 1990, 127, 83-87.

2. Neugebauer, W. ; Barbier, J.-R.; Sung, W. L; Whitfield, J. F.; Willick, G. E. Solution Structure and Adenylyl Cyclase Stimulating Activities of C-Terminal Truncated Human Parathyroid Hormone Analogues. Biochemistry 1995, 34, 8835-8842.

3. Gardella, T. J.; Wilson, A. K.; Keutmann, H. Т.; Oberstein, R.; Potts, J. Т. ; Kronenberg, H. M., and Nussbaum, S. R. Analysis of Parathyroid Hormone"s Principal Receptor-Binding Region by Site-Directed Mutagenesis and Analog Design. Endocrinology 1993, 132, 2024-2030.

4. Marqusee, S.; Baldwin, R. L. Helix Stabilization by Glu...Lys+ Salt Bridges in Short Peptides of De Novo Design. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1987, 84, 8898-8902.

5. Surewicz, W. К., Neugebauer, W.; Gagnon, L.; MacLean, S.; Whitfield, J. F.; Willick, G. E. Structure-Function Relationships in Human Parathyroid Hormone: The Essential Role of Amphiphilic-Helix. In Peptides: Chemistry, Structure, and Biology 1993; Smith, J.; Hodges, R., Eds.; ESCOM Leiden, The Netherlands, 1993, pp. 556-558.

6. Whitfield, J. F.; Morley, P.; Willick, G. E.; Ross, V.; Barbier, J. R.; Isaacs, R. J.; Ohannessianbarry, L. Stimulation of the Growth of Femoral Trabecular Bone in Ovariectomized Rats by the Novel Parathyroid Hormone Fragment, hPTH-(1-31)NH₂ (Ostabolin) Calcif. Tissue Int. 1996, 58, 81-87.

7. Whitfield, J. F. ; Morley, P. Small Bone-Building Fragments of Parathyroid Hormone: New Therapeutic Agents for Osteoporosis Trends Pharmacol. Sci. 1995 16, 382-386.