способ ферментативного получения цефалоспорина

Формула изобретения

1. Способ получения цефалоспорина общей формулы (I)



где R₀ - водород или C_1-3-алкокси;

Y - СН₂, кислород, сера или окисленная форма серы;

R₁ - любая из групп, выбранных из числа атома водорода, гидрокси, галогена, С_1-3-алкокси, необязательно замещенного, необязательно содержащего один или несколько гетероатомов, насыщенного или ненасыщенного, разветвленного или линейного С_1-5-алкила, необязательно замещенного, необязательно содержащего один или несколько гетероатомов С_5-8-циклоалкила, необязательно замещенного арила или гетероарила или необязательно замещенного бензила,

который включает a) ферментацию продуцирующего цефалоспорин микроорганизма в присутствии предшественника боковой N-цепи, b) экстракцию органическим растворителем N-замещенного цефалоспорина, присутствующего в ферментационном бульоне или жидкости, c) обратную экстракцию N-замещенного цефалоспорина водой, d) обработку водной фазы дикарбоксилатацилазой и е) необязательное выделение цефалоспорина формулы (I) из полученного таким образом конверсионного раствора путем кристаллизации, отличающийся чем, что перед экстракцией ферментационного бульона или жидкости органическим растворителем или перед дальнейшей обработкой обратного экстракта ферментационный бульон, или жидкость, или обратный экстракт инкубируют в кислом состоянии и при повышенной температуре.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что ферментационный бульон, или жидкость, или обратный экстракт инкубируют при рН ниже 4.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что ферментационный бульон, или жидкость, или обратный экстракт инкубируют при рН ниже 3.

4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что ферментационный бульон, или жидкость, или обратный экстракт инкубируют при 20-140^oС.

5. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что ферментационный бульон, или жидкость, или обратный экстракт инкубируют при 60^oС или выше.

6. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что ферментационный бульон, или жидкость, или обратный экстракт инкубируют при 60-80^oС.

7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что время инкубации в кислом состоянии и при повышенной температуре составляет менее 60 мин.

8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что экстракт в органическом растворителе, содержащий N-замещенный цефалоспорин, перед обратной экстракцией дополнительно промывают подкисленной водой с рН ниже 4.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанная вода имеет рН ниже 3.

10. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанная вода имеет рН ниже 2.

11. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что присутствующую в конверсионном растворе боковую цепь удаляют органическим растворителем перед кристаллизацией цефалоспорина формулы (I).

12. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что содержащий цефалоспорин водный раствор в одной или нескольких фазах, выбранных из группы, включающей ферментационный бульон, ферментационную жидкость, обратный экстракт, конверсионный раствор и раствор, содержащий растворенный цефалоспорин формулы (I), приводят в контакт с диоксидом углерода.

13. Способ по п.11, отличающийся тем, что диоксид углерода находится в твердой или газообразной форме или в виде раствора, содержащего карбонат-ионы.

14. Способ по любому из пп.1-13, отличающийся тем, что органический растворитель представляет амилацетат, бутилацетат, этилацетат, метилизобутилкетон, циклогексанон, изобутанол или н-бутанол.

15. Способ по любому из пп.1-14, отличающийся тем, что кристаллизацию цефалоспорина формулы (I) из конверсионного раствора или водной фазы осуществляют посредством добавления водного раствора или фазы в кристаллизатор, в котором фиксированный рН величиной 2,5-4,5 поддерживают с использованием подходящего титранта.

16. Способ по любому из пп.1-15, отличающийся тем, что кристаллизацию цефалоспорина формулы (I) из конверсионного раствора или водной фазы осуществляют посредством добавления водного раствора или фазы в ряд соединенных между собой кристаллизаторов, причем в это время используют интервал рН с применением подходящего титранта, начиная от рН в первой емкости, отличающегося от рН раствора 6-АРА на 0,5-2 единицы рН, и заканчивая при величине рН в последней емкости в интервале 2,5-4,5.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к извлечению ферментативно полученных цефалоспориновых соединений.

Полусинтетические способы получения цефалоспоринов исходят, в основном, из таких продуктов ферментации, как пенициллин G, пенициллин V и цефалоспорин С, которые превращают в соответствующие соединения с -лактамным циклом, например, так, как описано в К. Matsumoto, Bioprocess. Techn., 16, (1993), 67-88; J. G. Shewale & H. Sivaraman, Process Biochemistry, August 1989, 146-154; Т. A. Savidge, Biotechnology of Industrial Antibiotics (Ed. E.J. Vandamme) Marcel Dekker, New York, 1984, или J.G. Shewale et al. Process Biochemistry International, June 1990, 97-103. Полученные соединения с -лактамным циклом затем превращают в нужный антибиотик посредством присоединения подходящей боковой цепи, как описано, среди прочего, в ЕР 0339751, JP-A-53005185 и СН-А-640240. Посредством комбинаций боковых цепей и -лактамных циклов можно получить множество пенициллиновых и цефалоспориновых антибиотиков.

Известно, что 7-аминодезацетоксицефалоспорановая кислота (7-ADCA) и 7-аминоцефалоспорановая кислота (7-АСА) являются наиболее важными промежуточными соединениями, используемыми в фармацевтической промышленности для получения антибиотиков.

Например, 7-ADCA получают посредством химического или ферментативного расщепления (деацилирования) фенилацетил-7-ADCA с образованием 7-ADCA и фенилуксусной кислоты. Фенилацетил-7-ADCA обычно получают посредством химической обработки сульфоксида пенициллина G, который образуется из пенициллина G. При таком способе получения требуется большое количество химикатов для уверенности в том, что происходит нужная реакция. Этот способ как дорогостоящ, так и вносит проблемы с организацией сбора и удаления отходов. Кроме того, общий выход способа не так высок, как хотелось бы.

Чтобы преодолеть некоторые недостатки химического способа, разработан ферментативный способ получения 7-ADCA и 7-АСА, включая ферментативное получение N-замещенных -лактамов, таких как адипил-7-ADCA или адипил-7-АСА, с помощью рекомбинантного штамма Penicillium chrysogenum, способного экспрессировать синтазу дезацетоксицефалоспорановой кислоты (DAOCS), известную также как "экспандаза", из трансгена (ЕР 0532341, ЕР 0540210, WO 93/08287, WO 95/04148, WO 95/04149). Экспандаза обеспечивает расширение 5-членного кольца некоторых N-ацилированных пенициллановых кислот, в результате чего образуются соответствующие N-ацилированные дезацетоксицефалоспорановые кислоты.

Известные способы извлечения полученных химически или ферментативно пенициллановых и цефалоспорановых кислот неэффективны для целей извлечения N-замещенных -лактамных промежуточных соединений и деацилированных амино---лактамов. Основной проблемой при извлечении ферментативно полученных N-замещенных цефалоспориновых соединений, упомянутых здесь выше, является сложный состав бульона или культурального фильтрата. Бульон обычно содержит разнообразные пенициллановые кислоты, такие как -аминоадипил-6-пенициллановая кислота, -гидроксиадипил-6-пенициллановая кислота, 6-аминопенициллановая кислота (6-АРА), различные цефалоспорановые кислоты, в том числе -аминоадипил- и -гидроксиадипил-7-ADCA, и ряд белковых веществ. Известные процедуры извлечения не дают приемлемого качества образовавшихся цефалоспорановых кислот в смысле степени чистоты.

При ферментативном деацилировании это ведет к проблемам в отношении уменьшенного времени полужизни ферментов, пониженной степени биоконверсии и больших затрат при извлечении после биоконверсии и/или неприемлемых уровней загрязнения. Кроме того, после деацилирования такие примеси не допускают или по меньшей мере затрудняют извлечение нужного деацилированного цефалоспорина с нужными характеристиками.

Поэтому известные процедуры извлечения пенициллинов и цефалоспоринов не обеспечивают приемлемого качества конечного продукта; конечный продукт, например 7-ADCA или 7-АСА, содержит неприемлемое количество пенициллиновых компонентов как примесей.

Настоящее изобретение относится к улучшенному способу получения деацилированных -лактамов, например 7-ADCA или 7-АСА, из ферментационного бульона продуцирующего цефалоспорин микроорганизма.

В частности, настоящее изобретение относится к улучшенному способу получения цефалоспоринов, деацилированных по 7-аминогруппе и имеющих общую формулу (I)



где R₀ представляет водород или C_1-3-алкокси;

Y представляет CH₂, кислород, серу или окисленную форму серы;

R₁ представляет любую из групп, выбранных из числа атома водорода, гидрокси, галогена, C_1-3-алкокси, необязательно замещенного, необязательно содержащего один или несколько гетероатомов, насыщенного или ненасыщенного, разветвленного или линейного C_1-5-алкила, предпочтительно - метила, необязательно замещенного, необязательно содержащего один или несколько гетероатомов С_5-8-циклоалкила, необязательно замещенного арила или гетероарила, или необязательно замещенного бензила;

посредством ферментации продуцирующего цефалоспорин микроорганизма в присутствии предшественника боковой цепи, экстракции органическим растворителем N-замещенного цефалоспоринового соединения, присутствующего в ферментационном бульоне или жидкости, "обратной" экстракции N-замещенного цефалоспорина водой, обработки водной фазы дикарбоксилатацилазой и выделения кристаллического цефалоспоринового соединения формулы (I) из водной фазы, отличающемуся тем, что ферментационный бульон или жидкость, или "обратный" экстракт инкубируют в кислом состоянии и при повышенной температуре перед экстрагированием ферментационного бульона или жидкости органическим растворителем или перед дальнейшей обработкой обратного экстракта.

Дополнительные улучшения при этом способе получают путем промывания первого органического экстракта, содержащего N-замещенный цефалоспорин, подкисленной водой и/или путем обработки водных растворов цефалоспорина, полученных на одной или нескольких стадиях способа по изобретению, диоксидом углерода, и/или путем экстрагирования высвобожденной ферментативно боковой цепи органическим растворителем перед кристаллизацией деацилированного цефалоспорина.

Способ по изобретению будет давать лучшие общий выход и качество продукта, чем известные в настоящее время способы.

Далее подробнее описываются некоторые стадии нового способа извлечения, применяемого для получения деацилированного цефалоспорина из его N-ацилированного аналога, например 7-ADCA из адипил-7-ADCA иди 7-АСА из адипил-7-АСА.

Ферментационный бульон получают от любого подходящего процесса ферментации, например ферментации с использованием штамма Penicillium chrysogenum в присутствии подходящего предшественника боковой цепи, как упоминалось выше.

Биомассу отделяют от ферментационного бульона с использованием любой подходящей технологии, например центрифугирования или фильтрации, и получают ферментационную жидкость, содержащую цефалоспорин. Предпочтительно для получения указанного разделения применяют стадию фильтрации. Оставшиеся твердые вещества, необязательно, промывают.

Одним из препятствий получения N-замещенной цефалоспорановой кислоты является присутствие нежелательных загрязняющих -лактамных компонентов, в особенности, 6-аминопенициллановой кислоты (6-АРА), N-замещенной 6-АРА или -аминоадипил-7-ADCA.

В предпочтительном варианте воплощения изобретения загрязнения в заметной степени уменьшают посредством инкубации водного раствора, содержащего N-замещенный цефалоспорин, полученный на любой стадии способа изобретения, в кислом состоянии и при повышенной температуре. Водный раствор, содержащий N-замещенный цефалоспорин, подкисляют до рН ниже 4, предпочтительно ниже 3, с использованием одной или нескольких известных кислот, например, серной кислоты, соляной кислоты или азотной кислоты, или их сочетания. Рабочая температура находится в интервале от 20 до 140^oС, предпочтительно от 60 до 80^oС. Время пребывания при таких условиях составляет от нескольких суток до нескольких минут, предпочтительно - менее 60 минут, предпочтительнее - 1-30 мин.

Описанную выше стадию инкубации по изобретению можно применять к ферментационному бульону или жидкости, или к содержащему N-замещенный цефалоспорин водному обратному экстракту. Предпочтительно стадию инкубации применяют к ферментационному бульону или жидкости. Стадию инкубации можно также осуществлять либо перед, либо после отделения биомассы. Предпочтительно инкубацию осуществляют перед фильтрацией, чтобы иметь преимущество при фильтрации.

N-Замещенное цефалоспориновое соединение отделяют от водной фазы, т.е. ферментационного бульона или жидкости, посредством подкисления ферментационного бульона или жидкости и последующей экстракции N-замещенного цефалоспорина органическим растворителем. Подкисление обычно осуществляют до рН ниже 4, предпочтительно - ниже 3, и только в случае, когда ферментационный бульон или жидкость еще не подвергались описанной выше инкубации в кислом состоянии и при повышенной температуре. К ферментационному бульону или жидкости для значительного улучшения экстракции можно добавить подходящий деэмульгатор.

Предпочтительно органический растворитель выбирают из группы, состоящей из амилацетата, бутилацетата, этилацетата, метилизобутилкетона, циклогексанона, изобутанола или н-бутанола.

Экстракция органическим растворителем, как описано выше, не обладает удовлетворительной селективностью в отношении нежелательных -лактамов, таких как -аминоадипил-7-ADCA и 6-АРА. Поэтому в предпочтительном варианте воплощения изобретения осуществляют процесс промывки для специфического удаления этих соединений. Процесс промывки характеризуется" смешиванием экстракта в органическом растворителе с небольшим количеством подкисленной воды с последующим разделением фаз. Подкисленная вода типично имеет рН ниже 4, предпочтительно - ниже 3, предпочтительнее - ниже 2. Кроме того, фазовое отношение вода : растворитель типично составляет от 1:1 до 1:20, предпочтительно - 1:2 (вода:растворитель).

N-Замещенный цефалоспорин "обратно" экстрагируют водой обычным способом экстракции органической фазы щелочным раствором и получают водный обратный экстракт с рН в пределах 6-9. Типично, применяют фазовое coотношение 1:10 (вода : растворитель). Щелочной раствор представляет водный раствор, содержащий обычное неорганическое основание, например, NaOH или NН₃.

Экстракцию, промывку и обратную экстракцию осуществляют, предпочтительно, в ряде высокопроизводительных контактных экстракторов непрерывного действия, например в комбинации высокопроизводительного смесителя, например смесителя с высоким сдвиговым усилием, с разделением на центрифуге, предпочтительно - в 2-8, предпочтительнее - в 3-6, и наиболее предпочтительно - в 4-5.

После разделения фаз водную фазу, необязательно, очищают для удаления растворителя.

Затем водный раствор вводят в контакт с ферментом - подходящей дикарбоксилатацилазой для деацилирования N-замещенного цефалоспорина, например, для образования 7-ADCA или 7-АСА из соответствующих N-адипильных производных.

Микроорганизмы, которые, как обнаружено, продуцируют дикарбоксилатацилазу, представляют виды Alcaligenes, Arthrobacter, Achromobacter, Aspergillus, Acinetobacter, Bacillus и Pseudomonas. В особенности подходящие дикарбоксилатацилазы хорошо продуцируют следующие виды: Achromobacter xylosooxidans, Arthrobacter viscosis, Arthrobacker CA 128, Bacillus CA 78, Bacillus megaterium ATCC53667, Bacillus cereus, Bacillus laterosporus Jl, Paecilomyces C2106, вид N176 Pseudomonas diminuta, вид V22 Pseudomonas diminuta, Pseudomonas paucimobilis, Pseudomonas diminuta BL072, штамм С427 Pseudomonas, вид SE83 Pseudomonas, вид SE495 Pseudomonas, Pseudomonas ovalis ATCC950, вид SY77 Comamonas, Pseudomonas GK 16, Pseudomonas SY-77-1, вид А14 Pseudomonas, Pseudomonas vesicularis B965, Pseudomonas syringae, Ps putida ATCC17390, Ps aeroginosa NCTC 10701, Proteus vulgaris ATCC9634, Ps fragi DSM3881 и В. subtilus IF03025.

Дикарбоксилатацилазу можно получить из микроорганизма, который ее продуцирует, любым подходящим способом, например, так как описывается в US 4774179 для штамма SE83 вида Pseudomonas. Также можно экспрессировать гены, например, для дикарбоксилатацилаз SE83 или SY77 в различных подходящих хозяевах, таких как Е. coli, как сообщается в Matsuda et al., J. Bacteriology, 169, (1987), 5818-5820, для штамма SE83 и в US 5457032 для штамма SY77.

Ферменты, выделенные из указанных выше источников, часто относят к глутарилацилазам. Однако специфичность боковой цепи ферментов не ограничивается глутариловой боковой цепью, но включает также более мелкие и более крупные дикарбоксильные боковые цепи. Некоторые из дикарбоксилатацилаз выражают также активность гамма-глутамилтранспептидазы и поэтому иногда классифицируются как гамма-глутамилтранспептидазы.

Дикарбоксилатацилазу можно использовать в виде свободного фермента, а также в любой подходящей иммобилизованной форме, например, как описано в ЕР 0222462.

В одном из вариантов воплощения изобретения деацилированный цефалоспорин, например 7-ADCA или 7-АСА, выделяют из конверсионного раствора посредством кристаллизации в кислом состоянии. Типично, кристаллизацию деацилированного цефалоспорина из водного раствора осуществляют посредством корректировки рН водного раствора до кислого значения путем добавления к водному раствору титранта до тех пор, пока рН не достигнет величины в интервале 2,5-4,5, предпочтительно - величины 3-4.

В предпочтительном варианте воплощения изобретения кристаллизацию деацилированного цефалоспорина из водного раствора осуществляют путем добавления водного раствора в кристаллизатор, в котором фиксированный рН с величиной в интервале 2,5-4,5 поддерживают с использованием подходящего титранта.

В еще более предпочтительном варианте воплощения изобретения указанную кристаллизацию осуществляют путем постепенной корректировки рН водного раствора до конечной величины в интервале 2,5-4,5, посредством добавления водного раствора в ряд соединенных между собой кристаллизаторов, т.е., добавляя водный раствор в первую емкость, затем добавляя содержимое первой емкости во вторую емкость, затем добавляя содержимое второй емкости в третью емкость, и т.д., при этом интервал рН в соединенных между собой емкостях создают с использованием подходящего титранта, начиная с рН в первой емкости, который отличается на 0,5-2 единицы от рН водного раствора, содержащего деацилированный цефалоспорин, и заканчивая при рН в последней емкости с величиной в интервале 2,5-4,5. Удобно корректировать рН водного раствора, содержащего деацилированный цефалоспорин, до нужной конечной величины с использованием ряда из 2-6 соединенных друг с другом емкостей.

Например, для осуществления кристаллизации деацилированного цефалоспорина из конверсионного раствора можно применить снижение рН от 8 до 3 с использованием титранта, представляющего собой кислоту, такую как серная кислота, соляная кислота и/или азотная кислота, с применением ряда из 3-4 соединенных между собой емкостей.

Два описанных выше предпочтительных варианта воплощения изобретения предпочтительно выполнять непрерывным способом.

В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения боковую цепь, окрашенные продукты и содержащееся в малой концентрации непрореагировавшее соединение перед кристаллизацией удаляют из конверсионного раствора, следуя описанным ниже стадиям.

Конверсионный раствор подкисляют и приводят в контакт с органическим растворителем, например амилацетатом, бутилацетатом, этилацетатом, метилизобутилкетоном, циклогексаноном, изобутанолом или н-бутанолом, чтобы удалить боковую цепь перед кристаллизацией. Подкисление осуществляют кислотой, такой как серная кислота, соляная кислота или азотная кислота или их сочетанием, предпочтительно - серной кислотой, до рН ниже 3, предпочтительно - ниже 2. Неожиданно, кроме удаления боковой цепи, получают также удаление в высокой степени окрашенных примесей.

В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом воплощения изобретения содержание загрязняющих пенициллиновых компонентов, например цвиттерионной 6-АРА, которые присутствуют в водных содержащих цефалоспорин растворах, полученных на одной или нескольких стадиях способа по изобретению, таких как ферментационный бульон или жидкость, обратный экстракт, конверсионный раствор или раствор, содержащий растворенный деацилированный цефалоспорин формулы (I), заметно снижается при приведении в контакт загрязненной пенициллинами жидкости, типично с рН 5-7, с диоксидом углерода. Диоксид углерода можно добавлять к раствору любым подходящим способом, например, в твердой или газообразной форме или в виде раствора карбонат-ионов. Водный содержащий цефалоспорин раствор приводят в контакт с источником СО₂ при температуре 10-60^oС, предпочтительно 20-40^oС, когда указанный раствор насыщается молекулярным СО₂ в течение 4-10 часов. После уменьшения содержания пенициллиновых компонентов можно получить очищенные цефалоспориновые соединения формулы (I).

После экстракции боковой цепи органическим растворителем деацилированный цефалоспорин можно кристаллизовать из водной фазы несколькими способами, например способами, описанными выше для кристаллизации деацилированного цефалоспорина из водного раствора.

В предпочтительном способе действия рН водной фазы увеличивают до рН с величиной в пределах интервала 2,5-5, предпочтительно - в пределах интервала 3,5-4,5, посредством добавления раствора, содержащего деацилированный цефалоспорин, в один этап в кристаллизатор с нужной величиной рН или в ряд из 2-6 соединенных между собой кристаллизаторов, в которых применяется увеличение интервала рН. Эти процессы можно хорошо осуществлять непрерывным способом.

Кристаллы выделяют фильтрацией или центрифугированием и сушат в обычно применяемой сушилке непрерывного или периодического действия.

Все описанные выше стадии, например, стадии экстракции, промывки, обратной экстракции и кристаллизации, можно осуществлять в периодическом режиме или режиме с периодической загрузкой, но, по причинам устойчивости, предпочтительным является непрерывный способ.

Приведенный далее пример является только примером и не должен рассматриваться как какое-либо ограничение.

Пример

Образец в 1 л бульона с адипил-7-ADCA фильтруют для удаления биомассы. Мицелий промывают водопроводной водой и получают конечный объем фильтрата примерно 2 л.

Примерно 2 л фильтрата подкисляют при 40^oС 250 мл 6 N H₂SO₄ до рН 1,5. Добавляют н-бутанол в количестве 2/3 объема подкисленного фильтрата и после энергичного перемешивания разделяют. Водную фазу подвергают двум или большему числу таких обработок н-бутанолом. Затем объединенные органические фазы промывают порциями в 0,25 л подкисленной воды с рН 2. Получающуюся в результате органическую фазу экстрагируют "обратно" 245 мл 2 N раствора NaOH при 20^oС и после разделения фаз оставшийся в небольшом количестве в водной фазе н-бутанол удаляют посредством отгонки в вакууме.

Водную фазу (135 г) разбавляют при 30^oС деминерализованной водой до общего объема 650 мл и смешивают с 4 N NaOH до рН 8,5.

Добавляют 50 г иммобилизованного деацилирующего фермента и по истечении 2 часов при 30^oС, рН 8,5, после добавления 13,5 мл 4 N NaOH собирают водную фазу. Фильтрат экстрагируют 3 порциями по 125 мл насыщенного водой н-бутанола при рН 0,4. Во время экстракции добавляют всего 50,6 мл 37% НСl. Оставшуюся водную фазу нейтрализуют 56,5 мл 8 N NaOH и продукт кристаллизуют из водной фазы, свободной от капелек н-бутанола, посредством понижения рН до 5,3 с помощью 6 N H₂SO₄. Через 5 минут рН еще снижают до конечной величины 3,5. Всего используют 15 мл кислоты. Суспензию фильтруют и кристаллический остаток на фильтре промывают 50 мл воды, остаток на фильтре сушат и получают 4,1 г 7-ADCA со степенью чистоты 96%.