способ предупреждения беременности

Формула изобретения

1. Способ предупреждения нежелательной беременности у индивидуума, включающий интравагинальное введение индивидууму эффективного количества состава, содержащего узко- или монодисперсный конденсационный полимер ароматической сульфокислоты и альдегида или его фармацевтически приемлемую соль в физиологически приемлемом носителе, причем указанный конденсационный полимер имеет молекулярный вес менее примерно 50 кДа, или имеет в среднем от примерно 0,5 до примерно 2,0 сульфокислотных групп на одну ароматическую группу.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что конденсационный полимер является конденсационным полимером нафталинсульфокислоты и формальдегида.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что конденсационный полимер имеет молекулярный вес между примерно 0,7 кДа и примерно 50 кДа, более предпочтительно между примерно 1,3 кДа и примерно 30 кДа, наиболее предпочтительно между примерно 4 кДа и 12 кДа.

4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что конденсационный полимер имеет в среднем примерно 1 сульфокислотную группу на ароматическую группу.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что состав вводится непосредственно перед половым сношением.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что состав является гелем, или кремом, или пеной.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что полимер присутствует в составе в концентрации между примерно 1 и 10% по весу предпочтительно в концентрации, равной примерно 4% по весу.

8. Способ предупреждения нежелательной беременности у индивидуума, включающий вагинальное введение геля, содержащего конденсационный полимер нафталинсульфокислоты и формальдегида в количестве между примерно 1 и примерно 10 вес. %.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что полимер имеет молекулярный вес, примерно равный 5 кДа.

Описание изобретения к патенту

Многие конденсационные полимеры формальдегида и ароматических сульфокислот были описаны ранее. Патент США 4604404 и заявки на изобретения США 08/467725, 08/467725, 08/245619 и 08/156443, содержание которых включены в настоящую заявку в качестве ссылки, раскрывают сущность использования таких полимеров в качестве противовирусных агентов, действующих против вируса Herpes simplex и ВИЧ-инфекции.

Однако в этих источниках отсутствуют информация или предложения по использованию таких полимеров для предупреждения беременности.

Спермицидные рецептуры являются популярными формами обратимой контрацепции в США (Forrest J.D. и Fordyce R.R. Fam. Plann. Perspect. 20:112-118 (1988)). Большинство интравагинальных контрацептивных рецептур в качестве активного ингредиента содержат спермицид, ноноксинол-9 (N9). Эти рецептуры, обычно кремы, гели или пены, обычно эффективны сразу же после нанесения, и могут быть введены примерно за час до полового сношения (Hatcher R.A. et al. , "Contraceptive Technology, 16^th Revised Edition, New York, Irvington Publishers (1994)). Вагинальные контрацептивные пленки, такие как "VCF" (Apothecus, Inc., Oyster Bay, NY), появились на рынке позже, по крайней мере в США. В противоположность другим интравагинальным контрацептивам, пленки необходимо вводить за несколько минут до полового сношения, чтобы гарантировать адекватное растворение и дисперсию до контакта со спермой.

При использовании отдельно спермициды дают частоту неблагоприятных исходов, равную примерно 21% (то есть, обычно случайная беременность в течение первого года использования возникает у 21% партнерш, использующих эти продукты). Как сообщают, эффективность значительно повышается, если спермициды используются в комбинации с барьерными методами, например презервативами (Hatcher, R.A. et al., "Contraceptive Technology, 16^th Revised Edition, New York, Irvington Publishers (1994)).

Данное изобретение базируется на установлении того факта, что конденсационные полимеры ароматических сульфокислот и альдегида и их фракции, в частности полимеры формальдегида и нафталинсульфокислоты, могут препятствовать беременности или предупреждать ее. Предупреждение или препятствие беременности определяют как процесс, включающий, например, предупреждение или препятствие для оплодотворения, зачатия или имплантации оплодотворенной яйцеклетки или эмбриона в эндометрий матки у самки животного. Было установлено, что соединения по настоящему изобретению мало раздражают или вообще не раздражают влагалища. На основании этих результатов конденсационные полимеры ароматических сульфокислот и альдегида и их фракции могут быть использованы в качестве контрацептивных препаратов. Поэтому изобретение также относится к использованию описанных соединений в производстве медикамента для предупреждения беременности или контрацептивного средства.

Получение конденсационных полимеров альдегидов и ароматических сульфокислот в целом известно в данной области техники. Предпочтительные полимеры имеют общую структуру:



Ароматические сульфокислоты, при использовании здесь, включают ароматические карбоциклические и гетероциклические кольца, замещенные одним или несколькими радикалами сульфокислоты (например, х может быть от 1 до 4). Ароматические карбоциклические кольца (Аr) включают, например, фенил, нафтил, тетрагидронафтил, бифенил, фенилалкилфенил, фенилалкенилфенил, феноксифенил, фенилтиофенил и феноксиалкоксифенил. Ароматические гетероциклические кольца (Аr) включают, например, пиридинил, пиримидинил, хинолинил, тиофенил, фуранил, пиразолил, имидазолил, пирролил и тиазолил. Альдегиды (CHRO), пригодные для получения соединений по данному изобретению, включают, например, параформальдегид или формальдегид, замещенный или незамещенный уксусный альдегид, пропионовый альдегид и бензальдегид. Предпочтительно альдегид является формальдегидом. Соответственно R в формуле может быть водородом, замещенным или незамещенным алкилом (предпочтительно - низшим алкилом), замещенным или незамещенным арилом (таким как фенил). Заместители включают, например, алкил, алкоксигруппу, арил, арилоксигруппу, галоген, гидроксил, аминогруппу, алкиламиногруппу, диалкиламиногруппу, карбоксильную группу, сульфонат и фосфонат. Полимер может быть свободной кислотой, сложным эфиром или фармацевтически приемлемой солью. Поэтому М может быть водородом, фармацевтически приемлемым катионом (например, щелочным металлом, щелочно-земельным металлом или аммониевой группой) или блокирующей сульфонат группой, которая будет предпочтительно расщепляться или гидролизоваться in vivo (например, линейным или разветвленным алкилом). Термин "полимер", при использовании здесь, включает любое соединение, образованное путем соединения двух или нескольких мономеров или повторяющихся элементов (например, n является целым числом, равным двум или более). Патент США 4604404 приводит примеры подходящих полимеров, пригодных для использования здесь, и способы их получения, эти данные включены сюда посредством ссылок. Полимеры также описаны в заявках США 08/467725, 08/245619 и 08/156443, содержание которых включенo в настоящую заявку в качестве ссылки.

Особо предпочтительным полимером является продукт конденсации нафталинсульфокислоты и формальдегида с формулой:



где х равно 1 или 2;

R₂ является водородом, алкилом, алкоксигруппой или анионной группой, такой как карбоксил и фосфонат;

М является водородом или фармацевтически приемлемым катионом.

В некоторых случаях одна или несколько групп сульфокислоты могут быть необратимо заблокированы.

Полимеры по настоящему изобретению также включают сополимеры, куда альдегид и/или ароматическая сульфокислота добавлены в виде смесей различных альдегидов и/или ароматических сульфокислот (таких, как определенные выше). Также включены сополимеры, куда добавлена ароматическая группа, не замещенная сульфокислотой. Например, ароматическая группа может быть карбоциклической или гетероциклической группой (которые определены выше), не замещенной или замещенной одной или несколькими группами, такими как алкильная, алкоксигруппа, арильная, арилоксигруппа, галогеновая, гидроксильная, сульфонамидная, карбоксильная или фосфонатная.

Предпочтительно, чтобы молекулярный вес полимера (MB) был меньше, чем примерно 50 кДа, и/или больше, чем примерно 0,7 кДа. Более предпочтительны полимеры с молекулярным весом между примерно 1,3 и примерно 30 кДа, или между примерно 4 и примерно 12 кДа. Особенно благоприятным полимером является конденсат 2-нафталинсульфокислоты и формальдегида с молекулярным весом 51 кДа.

Предпочтительно, чтобы среднее число молекул сульфокислоты на ароматическую группу было равно примерно от 0,5 до 2,0, наиболее предпочтительно - примерно 1,0.

Полимеры с узко- или монодисперсным молекулярным весом могут быть получены при помощи методов фракционирования, в целом известных в данной области техники (см., например, Polymer Fractionation, Editors, Cantow and Manfred, Jr. , (Acad. Press) 1967), таких как преципитация в селективных растворителях, гель-фильтрационная хроматография, преципитация в солевых растворах и диафильтрация. Альтернативно, полимеры могут быть произведены при помощи постадийной или управляемой конденсации нафталинсульфокислоты и формальдегида.

"Узкодисперсный полимер" определяют как полимерную композицию, в которой ее компоненты имеют в основном одинаковый молекулярный вес. Например, узкодисперсный полимер включает полимерные композиции, где полидисперсность меньше примерно 2, предпочтительно - меньше примерно 1,5, и более предпочтительно - меньше примерно 1,2. "Монодисперсный полимер" определяют как полимерную композицию, где практически все компоненты имеют одинаковый молекулярный вес, например тетрамер, пентамер, гексамер, гептамер, октамер, нонамер и т.п.

Как описано выше, конденсационный полимер может, по выбору, вводиться в виде фармацевтически приемлемой соли. Примеры подходящих солей включают соли щелочных металлов, щелочно-земельных металлов и аммония, такие как соли кальция, натрия, калия, аммония и алкил- или ариламмония (такие как соли триметиламмония, триэтиламмония и триэтаноламмония (троламина)).

Препарат или полимер по настоящему изобретению может быть введен интравагинально (например, в качестве контрацептивной рецептуры, суппозитория или смазки) в дозировочных рецептурах, содержащих физиологически приемлемый носитель и, по выбору, вещества, усиливающие действие, и консерванты. Подходящие рецептуры включают физиологически приемлемые гели, пены и кремы. Носители включают солевые водные растворы, раствор Рингера и изотонический раствор хлористого натрия. В частности, могут быть использованы раствор хлористого натрия для инъекций USP (0,9%), раствор Рингера для инъекций USP, раствор Рингера для инъекций с лактатом USP, раствор лактата натрия для инъекций USP, раствор декстрозы для инъекций USP (5% или 10%), бактериостатическая вода для инъекций USP и стерильная вода для инъекций USP. В другом примере осуществления изобретения соединение формируют, наносят или распыляют, например, в виде пленки, на контрацептивное средство, такое как презерватив (включая мужские презервативы и женские презервативы, как в случае женского презерватива REALITY (Women"s Health Company), патент США 4735621) или диафрагма. Специфическая доза активного ингредиента будет зависеть от многих факторов, включая биологическую активность отдельного препарата и общее состояние здоровья пациента или индивидуума.

Типично, соединения будет включено в рецептуру в виде геля с концентрацией от примерно 0,5 до примерно 50%, предпочтительно от примерно 1 до примерно 10% (весовых). Гелеобразующие агенты для фармацевтических рецептур в целом известны в данной области. Например, гелеобразующим агентом может быть гидроксиэтилцеллюлоза (такая как Hydroxyethyl Cellulose 250 ННХ, (Natrosol)), гуаровая смола, целлюлозная смола, поперечно-связанная полиакриловая кислота (такая как Carbopol 1342, Carbomer 974B, Carbomer 980, Carbomer 910, Carbomer 1382) или Тероновый полиоксимер. Особо предпочтительным желирующим агентом является Carbomer 1382, сополимер акриловой кислоты и длинноцепочечного метакрилата, поперечно-связанного с аллиловыми эфирами пентаэритрола. Агент обычно добавляют в количестве от примерно 1 до примерно 5% по весу.

Соединение или рецептуру обычно вводят перед половым сношением или после полового сношения (например, не более чем за час до или в течение двенадцати часов после полового сношения), как, например, непосредственно до или после полового сношения (например, в течение 30 минут до или одного часа после полового сношения). Соединение можно вводить открыто (с согласия партнера мужского пола) или скрыто (без информирования или согласия партнера мужского пола).

Преимущественно, соединение вводят в количестве, которое эффективно для действия не только в качестве контрацептива, но и в качестве противовирусного или противобактериального агента (например, в количестве, которое ингибирует ВИЧ-инфекцию, или инфекцию вирусом герпеса, или другие заболевания, передаваемые половым путем). Другие противовирусные агенты, которые нарушают репликацию вируса ВИЧ, можно вводить вместе с этим препаратом в соответствии со способами по настоящему изобретению с синергическим результатом в некоторых случаях. Совместное введение противовирусных агентов может эффективно ингибировать различные стадии жизненного цикла вируса, оптимизируя таким образом терапевтический эффект препарата по данному изобретению, снижая или устраняя инфекционность вируса и симптомы, связанные с ней. Например, агенты, ингибирующие обратную транскриптазу вируса ВИЧ (такие как азидотимидин (АЗТ), дидезоксиинозин (ддИ), ламивидин, ставудин или РМРА), ингибиторы интеграции, транскрипции или трансляции (обратные изомеры олигонуклеотидов), прочие ингибиторы слияния/связывания, ингибиторы сборки/выделения (например, интерферон), ингибиторы ВИЧ-протеазы (такие как Саквинавир, Индинавир, Ритонавир, Нелфинавир, VX-478) или ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (такие как делавирдин или невирапин) могут вводиться совместно с конденсационным полимером, отдельно или в качестве отдельной дозировочной рецептуры, содержащей конденсационный полимер и другой(ие) антивирусный(е) агент(ы).

Препарат по данному изобретению также может быть введен вместе с дополнительными контрацептивными рецептурами, такими как ноноксинол-9, октоксинол, хлоргексидин, бензалкония хлорид и менфегол.

Изобретение имеет преимущество перед другими способами ингибирования зачатия, так как оно не создает опасности аварийного отказа в условиях риска (как в случае мужских и женских презервативов), не требует участия и/или согласия партнера-мужчины (как в случае мужских и женских презервативов), не имеет побочных эффектов на половые пути (как внутриматочные устройства), может быть дополнительно эффективно в отношении заболеваний, передаваемых половым путем (ЗППП, что не показано для спермицидов и оральных контрацептивов), не требует ежедневного введения для обеспечения эффективности (как в случае оральных контрацептивов) и в основном не всасывается в системный кровоток, за счет чего предотвращаются побочные эффекты, объясняемые системным введением (как в случае оральных контрацептивов).

Изобретение далее будет иллюстрировано следующими не ограничивающими изобретение примерами.

Пример 1. Синтез конденсатов: полимеризация.

Смесь натриевой соли 2-нафталинсульфокислоты (1,15 г, 5 ммоль), 37% водного раствора формальдегида (0,65 мл, ~ 6 ммоль) и серной кислоты (0,7 г концентрированной серной кислоты в 0,5 мл воды) нагревали до 98-100^oС в течение 43 ч Реакционную смесь затем разводили водой (30 мл), нейтрализовали карбонатом кальция до рН 7 и фильтровали, фильтрат выпаривали до сухости с выходом 1,22 г конденсата полимера.

Вышеизложенный эксперимент повторяли, модифицируя параметры реакции, как проиллюстрировано в табл. 1.

Пример 15. Синтез конденсационного полимера 2-нафталинсульфокислоты и формальдегида.

Смесь 5,7 г натриевой соли 2-нафталинсульфокислоты (23 ммоль) соединяли с ~ 3 мл 37% формальдегида (~43 ммоль), 1,9 мл концентрированной серной кислоты, добавляли 5 мл воды и нагревали в герметически закрытой пробирке в течение ~ 24 ч при 120-130^oС. Реакционную смесь разводили водой (~ 20 мл) и нейтрализовали до рН 7 при помощи NaOH. Нейтрализованную реакционную смесь концентрировали до сухости с получением ~ 11 г вещества, которое состояло из конденсата и солей.

Синтез конденсатов: постадийный.

Пример 16. 5-Бром-2-нафталинсульфокислота.

5-амино-2-нафталинсульфокислоту (1,15 г, 50 ммоль) растворяли в 100 мл 15 0,5 N раствора NaOH при перемешивании. Темно-красный раствор охлаждали до 0^oС добавлением льда (~ 100 г). До полного растворения льда по каплям добавляли 20 мл 40% водного раствора НВr, и образовавшуюся суспензию выдерживали при температуре от -5 до 0^oС, затем через 30 мин добавляли 10 мл водного раствора NaNO₂ (3,65 г). Смесь непрерывно перемешивали в течение 30 мин при температуре -5 ~ 0^oС. Непрореагировавший NaNO₂ разрушали путем добавления 350 мг мочевины в конце реакции. Образовавшуюся темную диазониевую суспензию хранили при температуре ниже 0^oС и добавляли по каплям в течение часа к раствору CuBr (7,15 г) в 40 мл 40% НВr при 70^oС при энергичном перемешивании (раствор CuBr находился в колбе на 1000 мл). Темную смесь перемешивали при 80^oС в течение 40 мин, затем охлаждали до комнатной температуры и обрабатывали 200 мл воды. Преципитат собирали в воронку Бюхнера и промывали примерно 50 мл воды. После высушивания под вакуумом было получено 13,9 г сырого продукта. Сырое соединение нагревали с обратным холодильником в 500 мл воды в течение 2 ч, охлаждали до комнатной температуры и фильтровали. Фильтрат выпаривали до сухости, а твердое вещество сушили в вакууме с выходом 8,23 г (57% выход) чистого продукта.

Чистоту продукта проверяли при помощи обратнофазной жидкостной хроматографии высокого давления и ¹H-ЯМР (250 МГц).

Пример 17. 8"-Метилен-бис-5-бром-2-нафталинсульфокислота (натриевая соль).

Смесь 5-бром-2-нафталинсульфокислоты (17,22 г), ТФУК (200 мл), смолы Amberlyst-15 (17 г, Aldrich), параформальдегида (4,5 г) и Н₂O (50 мл) нагревали до 130^oС в течение 14 ч в закрытой толстостенной пробирке. После охлаждения до комнатной температуры смесь фильтровали в воронку Бюхнера, а собранное твердое вещество промывали примерно 10 мл ТФУК, растворяли в 250 мл метанола/воды (4/1) и фильтровали. Фильтрат выпаривали до сухости, а твердое вещество суспензировали в 80 мл воды и нейтрализовали до рН ~ 8 10 М раствором NaOH. Твердое вещество отфильтровывали, промывали 60 мл ацетона и сушили в вакууме в течение ночи. Было получено 15.03 г (80% выход) чистого продукта.

Пример 18. 8,8"-Метилен-бис-2-нафталинсульфокислота.

Суспензию 8,8"-метилен-бис-5-бром-2-нафталинсульфокислоты (натриевой соли, 6,30 г) медленно добавляли к NaOH (0,32 г) в 300 мл метилового спирта с Pd-С (10%, 5,0 г) в атмосфере аргона. Суспензию встряхивали при давлении H₂, равном 50 фунтам на квадратный дюйм, в течение 18 ч. Затем смесь фильтровали, а фильтрат пропускали через колонку, набитую ~ 20 г смолы IR-120. Растворитель удаляли на ротационном испарителе, а остаток растворяли в 200 мл воды, после чего снова фильтровали. Фильтрат нейтрализовали 5 М раствором NaOH до рН ~ 7 и концентрировали до объема ~ 50 мл, затем медленно при встряхивании добавляли 300 мл ацетона. Образовавшийся белый преципитат собирали в воронку Бюхнера, промывали 20 мл ацетона и сушили в вакууме с образованием 3,51 г сухого продукта (натриевой соли).

Примеры 19 и 20. Олигомеризация тетрамера и гексамера соответственно.

5,11 г натриевой соли димера превращали в свободную кислоту при пропускании через колонку со смолой IR-120 в воде. Воду удаляли на ротационном испарителе, а остаток вновь растворяли в 10 мл воды и переносили в 50 мл ТФУК в толстостенной колбе, затем добавляли параформальдегид (0,195 г), и колбу герметически закрывали. Раствор перемешивали при 60-65^oС в течение 15 ч. Растворитель удаляли, а остаток растворяли в метаноле, наносили на силикагель и переносили в колонку с силикагелем (ЕМ Science, силикагель для колонки 60 F-254, 230-400 меш), где производили элюцию, начиная с раствора ТГФ: метанол: Н₂О в соотношении 16:1:1 и заканчивая соотношением 5:1:1.

Твердое вещество из тетрамерной фракции нейтрализовали до рН ~ 7 при помощи 5 М NaOH в 5 мл воды и добавляли 5 мл метилового спирта и 125 мл ацетона для получения 0,94 г преципитата. Соль превращали в свободную кислоту путем пропускания через смолу IR-120, и было получено 0,73 г сухого тетрамера.

Из гексамерной фракции было получено 0,21 г гексамера тем же способом, который описан для тетрамера.

3,5 г исходного материала димера было выделено обратно из первой фракции.

Пример 21. Октамер.

Смесь тетрамера (130 мг), смолы Amberlyst-15 (150 мг), воды (0,4 мл) и 2 мл раствора параформальдегида в ТФУК (1 мг/мл) перемешивали при 85^oС в течение 15 ч во флаконе для проб, закрытом тефлоновым колпачком. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, разводили 5 мл воды и фильтровали. Фильтрат выпаривали до сухости, растворяли в метаноле и наносили на силикагель, затем пропускали через колонку, где тетрамер элюировали раствором ТГФ:изопропанола:Н₂O в соотношении 6:1:1, а октамер элюировали раствором метанола: Н₂O (85:15). Из второй фракции было получено 50 мг сырого октамера.

Сырой октамер пропускали через смолу IR-120, очищали при помощи обратнофазной препаративной жидкостной хроматографии высокого давления, и было получено 15 мг октамера (уровень чистоты 96,6% по данным аналитической жидкостной хроматографии высокого давления),

Пример 22. Эксклюзионная хроматография для фракционирования по размеру/

Аликвоты растворов синтетических полимеров фракционировали по размеру с использованием насоса Waters M625, диодного детектора М996, системы программного обеспечения Millenium и либо двух колонок Waters Ultrahydrogel (7,8х300 мм; объемная скорость подвижной фазы 1 мл/мин) с порами 6 мкм - 250 ангстрем, либо колонки TosoHaas G3000PW на 17 мкм (21,5х600 мм), соединенной с колонкой TSK-Gel Guard PWH (21,5х75 мм; объемная скорость 3 мл/мин). Подвижная фаза состояла из 0,2 М раствора ацетата аммония (рН 6,2), приготовленного из ледяной уксусной кислоты (Baker Analysed HPLC Reagent) и гидроокиси аммония (25%, Mallinckrodt), и 35% ацетонитрила (B&J Brand). Перед использованием подвижную фазу фильтровали через нейлоновую мембрану с диаметром пор 0,45 мкм и распыляли в атмосфере гелия качества 5. Раствор синтезированных проб с 2,2-10 мг вещества в объеме воды MilliQ до 200 мкл инъецировали на колонки Ultrahydrogel, либо 40-300 мг вещества в подвижной фазе на основе воды MilliQ объемом до 2 мл (50:50, по объему) инъецировали на колонки TosoHaas с последующей обработкой ультразвуком (Branson 2200), вихревым перемешиванием и фильтрованием (0,45 мкм Acrodisc, Gelman Sciences). Собранные фракции объединяли в соответствии со временем элюции. Сопоставимые хроматографические профили при измерениях поглощения света демонстрировали в повторных опытах, и растворитель удаляли с использованием высокоскоростных вакуумных приборов Savant при высокой температуре (либо SC200 и Vapornet VN100, либо Plus SC210A). Остаток повторно растворяли в воде и повторно высушивали для удаления следов растворителя. Вещество взвешивали, растворяли в воде и нормировали до исходных концентраций, измеряя поглощение света при длине волны 290 нм по сравнению со стандартными растворами.

Вещество по примеру 12, см. табл. 1 выше, фракционировали таким образом для получения фракций полимера, имевших наивероятнейший молекулярный вес (НМВ) 31 кДа (средний молекулярный вес (СМВ) 38 кДа); НМВ 16 кДа (СМВ 22 кДа); НМВ 10 кДа (СМВ 15 кДа); и НМВ 5,6 кДа (СМВ 10 кДа).

Пример 23. Методология светорассеяния.

Пробы подвергали аналитической жидкостной хроматографии высокого давления с использованием насоса Waters 625 и модифицированного детектора 410 RI, который содержал встроенный детектор интенсивности рассеянного лазерного излучения PD2000 (Precision Detectors, Inc., Amherst, MA). Эта система была оборудована колонкой Waters Ultra-Hydrogel 250 для гель-фильтрационной хроматографии водных растворов (внутренний диаметр 7,8 ммх300 мм, размер пор 250 ангстрем, граница эксклюзии 8х10⁴, РЕО). Подвижная фаза состояла из 65% 0,2М ацетата аммония с рН 6,5 и 35% ацетонитрила при изократическом способе с объемной скоростью 1 мл/мин. Элюцию регистрировали при помощи RI, рассеяния света под малым (15^o) и большим углом (90^o), и на основании этой информации были определены диапазоны молекулярных весов.

Пример 24. Фракционирование полимера

Соли, образовавшиеся в процессе нейтрализации, удаляли из полимера, полученного в примере 15, посредством процесса фракционирования при добавлении полярного органического растворителя (ацетона, этанола или метанола). Водный раствор конечной реакционной смеси (~ 10 г/20 мл) обрабатывали возрастающими количествами органических растворителей. Начальный органический растворитель приводил к образованию нижнего слоя растворенными солями.

После того, как большая часть соли была удалена, производили фракционирование материала на фракции с более однородными распределениями молекулярных весов. Добавляли дополнительное количество растворителя для образования нижнего, более темного слоя. Объем добавленного органического растворителя определяли путем мониторинга двух фаз при гельпроникающей жидкостной хроматографии. В основном, вещество с более высоким молекулярным весом перемещалось в нижний слой, а вещество с меньшим молекулярным весом оставалось в верхнем слое.

Когда желаемый диапазон молекулярных весов был определен, его выделяли одним из нескольких способов. Первым способом было простое удаление всего летучего растворителя из вещества (посредством сочетания ротационного испарения при пониженном давлении и вакуумного термостата). Второй способ состоял в диспергировании раствора продукта в большом избытке полярного органического растворителя (ацетона, этанола или метанола) и сборе образовавшегося твердого вещества путем фильтрации.

Получение вещества в соответствии с вышеприведенным описанием реакции и процесс фракционирования дали несколько узких диапазонов молекулярных весов (~ 3К, ~ 5К, ~ 10К, ~ 25К, ЕХ 15/3, EX 15/5, EX 15/10 и EX 15/25 соответственно).

Пример 25.

Натриевую соль 2-нафталинсульфокислоты (1000 г) добавляли в стеклянный реактор с 8925 мл этилового спирта, 3800 мл деионизированной воды и 10 г углерода. Смесь нагревали примерно до 78^oС и фильтровали через целит. Смесь охлаждали до температуры окружающей среды и выдерживали в течение примерно 6 ч. Влажные кристаллы собирали путем фильтрации и высушивали в вакуумном термостате (80^oС/25" вакуума) до постоянного веса. Средний выход был равен 59%.

Перекристаллизованную 2-нафталинсульфокислоту (1000 г, полученную так, как указано выше) затем соединяли с водой (866 г) и 99% серной кислотой (330 мл). Реактор герметично закрывали и нагревали при взбалтывании до примерно 105^oС на масляной бане с температурой 130^oС. Формальдегид (502 г, 37% водный раствор) добавляли к реактору в течение 45 мин. Реактор выдерживали в этом состоянии в течение примерно 10 ч. По ходу реакции внутреннее давление росло примерно до 11 фунтов на квадратный дюйм.

После завершения реакции содержимое реактора охлаждали и разводили 500 г деионизированной воды. рН регулировали от значения ниже 1 до рН, примерно равного 7, путем добавления примерно 500 г NaOH. Реакция давала минимум около 90% нефракционированного полимера.

Соли, образовавшиеся в процессе нейтрализации, удаляли при фракционировании посредством добавления 10 л ацетона, что приводило к образованию двух слоев. Нижний слой отбрасывали. К верхнему слою добавляли 2 л ацетона, что вновь приводило к образованию двух слоев, причем верхний слой отбрасывали. Примерно 600 г воды добавляли к нижнему слою вместе с примерно 1,4 л ацетона, что вновь приводило к образованию двух слоев. Нижний слой отбрасывали, верхний слой переносили в другой сосуд и обрабатывали примерно 1,2 л ацетона. Образовавшийся верхний слой отбрасывали, а к нижнему слою добавляли примерно 520 мл воды. Раствор концентрировали, переносили в вакуумный термостат и сушили при 80^oС/24" вакуума до постоянного веса. Фракционирование регистрировали при помощи гельфильтрационной жидкостной хроматографии. Процесс давал выход конденсационного полимера с молекулярным весом примерно между 4000-6000 дальтон (средний выход 11%).

Пример 26.

Определенные количества вещества по примеру 25 (10% водный раствор), очищенной воды (USP) и молочной кислоты (1% водный раствор, весовые проценты) тщательно перемешивали в количествах, указанных в табл. 2. Во время смешивания добавляли установленное количество Carbomer 1382 (BF Goodrich, Cleveland, ОН), и взбалтывание продолжали до гидратирования Carbomer. Добавляли 50% водный раствор (весовые проценты) Троламина (Spectrum, New Brunswick, NJ) при перемешивании. Регистрировали рН.

Гели разливали в 16х76 мм алюминиевые пробирки с эпоксидным покрытием и полипропиленовыми колпачками и определенным диаметром шейки 16 (Montebello). Количество налитого геля было равно примерно 3,7 г. Пробирки герметично закрывали, а затем стерилизовали в автоклаве при 121^oС в течение 20 мин.

Пример 27. Биологическая активность.

Потенциальные раздражающие эффекты 0,1, 1 и 4% (рецептуры 3,5 и 6) концентраций полимера в рецептурах, приведенных выше (называемый далее гель PRO 2000), оценивали во влагалищах новозеландских белых кроликов. По пять крольчих в каждой из 5 групп ежедневно получали в свод влагалища дозу, равную 1 мл, геля PRO 2000, геля-носителя (рецептура 2) или 4% рецептуру с ноноксинолом-9 (Conceptrol; включен для сравнения). Обработку повторяли в течение 14 последовательных дней. Через день после введения последней дозы кроликов умерщвляли, и ткань влагалища удаляли для гистопатологической оценки. Все кролики оставались живыми в течение срока исследования и не обнаруживали ни клинических признаков системной токсичности, ни внешних признаков раздражения. Кролики обычно прибавляли в весе во время исследования. Гистопатологически степени раздражения были оценены как слабые в каждой группе, подвергавшейся обработке, и находились в допустимых пределах для данного теста.

Эффект гелей PRO 2000 на исход беременности был изучен на искусственно осемененных кроликах. Четырем группам, каждая из которых состояла из десяти самок кроликов, интравагинально вводили гель-носитель (рецептура 1), 4% рецептуру ноноксинола-9 (Conceptrol), 0,5% геля PRO 2000 (рецептура 4) или 4% гель PRO 2000 (рецептура 7). Кроликам вводили препарат один раз в день (1 мл/дозу), начиная с дня до искусственного осеменения до 7 дня беременности. В 0 день беременности самкам вводили дозу, а затем через 15-30 мин осеменяли их 0,5 мл разведенного семени, полученного от плодовитых самцов. В день беременности 19 самок умерщвляли и вскрывали, отмечали состояние их беременности и (для каждой беременной крольчихи) регистрировали число желтых тел, плодов и мест имплантации. Положительный контроль (Conceptrol) в этом эксперименте был контрацептивом: девять из десяти крольчих в группе, получавшей Conceptrol, не были беременными. Гель-носитель не оказал влияния на исход беременности: две из десяти крольчих в группе с гелем-носителем не были беременными, доля, соответствующая полученной в этой лаборатории частоте успешных зачатий после искусственного осеменения (85-90%). По сравнению с группой, получавшей гель-носитель, меньше животных, получавших 4% гель PRO 2000, были беременными: три из десяти крольчих. Введение 0,5% геля PRO 2000 не оказало эффекта на число забеременевших крольчих: девять из десяти крольчих были беременными. Эти результаты были получены на тот день, когда кроликов вскрывали для оценки состояния беременности.

Чистый лекарственный препарат был оценен в отношении его способности ингибировать гиалуронидазу, фермент, который увеличивает проницаемость кумулятивного слоя, что необходимо для связывания сперматозоида с яйцеклеткой. Активность гиалуронидазы количественно оценивали посредством измерения уровня гидролиза гиалуроновой кислоты в присутствии различных концентраций полимера по примеру 25. Фермент предварительно инкубировали с тестируемым агентом в течение 10 мин, затем начинали реакцию путем добавления субстрата. Тридцатиминутные инкубации производили при комнатной температуре, затем колориметрически определяли продукт реакции. IC₅₀ полимера определили как равную примерно 6 мкг/мл. Обнаружили, что полимер является высокоэффективным, предположительно необратимым ингибитором гиалуронидазы. Пока не известно, способствует ли это свойство контрацептивной эффективности.

Гель PRO 2000 оценивался на совместимость с латексными презервативами. С использованием стандартных методов тестирования, способность к разрыву при повышенном давлении воздуха и физические свойства латексных презервативов без смазки оценивали непосредственно после разворачивания или после обработки 4% гелем PRO 2000 (30 мин при 37^oС, относительная влажность 95%). Гель не оказывал неблагоприятного влияния на свойства презерватива.

Несмотря на то, что настоящее изобретение было подробно продемонстрировано и описано со ссылками на предпочтительные примеры осуществления, специалистам в данной области будет понятно, что могут быть произведены различные изменения формы и деталей без отхода от сущности и объема изобретения, определенных в прилагаемой формуле. Специалисты в данной области смогут обнаружить, используя не более чем традиционное экспериментирование, многие эквиваленты специфических примеров осуществления изобретения, конкретно описанных здесь. Такие эквиваленты следует рассматривать, как охваченные формулой изобретения.