способ получения микрокапсулированной формы коревой вакцины для перорального применения

Формула изобретения

1. Способ получения микрокапсулированной формы коревой вакцины для перорального применения, включающий приготовление капсулируемого материала в виде субстанции вируса кори, диспергирование ее в водорастворимом заряженном полиэлектролите, получение коацервата для формирования оболочек капсул, введение отвердителя и сушку готовых микрокапсул, отличающийся тем, что отвердитель вводят в заряженный полиэлектролит одновременно с субстанцией вируса кори до конечной концентрации полиэлектролита и отвердителя, не вызывающей разделение фаз в растворе препарата; микрокапсулы получают в результате сложной коацервации заряженного полиэлектролита и отвердителя с образованием комплекса путем замораживания раствора со скоростью 0,1-3,0^oС в минуту до температуры ниже температуры стеклования аморфной фазы, оставшейся после кристаллизации льда, а процесс сушки микрокапсул производят лиофилизацией.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве субстанции вируса кори используют субстанцию живого вируса, которую получают путем размножения вируса на клеточном субстрате, с титром не менее 5,2 lgТЦД₅₀/0,5 мл сбора вируссодержащей жидкости, освобождения продукта от клеточного детрита и введения в него стабилизирующей добавки.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что замораживание раствора препарата производят до температуры не выше -40^oС.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что конечная концентрация полиэлектролита, связующего (отвердителя) и стабилизирующей добавки к жидком полуфабрикате составляет (0,001-2,5), (2,5-5,5) и (2,5-5,5) вес. % соответственно.

5. Способ по пп. 1 и 4, отличающийся тем, что в качестве полиэлектролита используют альгинат натрия, полиакриловую кислоту, или сополимер акриловой кислоты, или смесь полиакриловой кислоты с поливинилпирролидоном в соотношении (0,5-2,0): 1, в качестве связующего (отвердителя) - желатозу, или смесь желатозы с хитозаном в соотношении (5,0-15,0): 1, или смесь желатозы со спермидином в соотношении (5,0-15,0): 1, а в качестве стабилизатора - сорбит.

6. Способ по п. 4, отличающийся тем, что перед замораживанием жидкий полуфабрикат разливают в ампулы, а после лиофильной сушки ампулы заполняют инертным газом и запаивают.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к технологии получения микрокапсул и может быть использовано в фармацевтической промышленности для производства вакцин и лечебно-профилактических препаратов.

Известны способы получения желатиновых микрокапсул эмульгированием капсулируемой жидкости (масла) в смеси раствора желатины и сульфата натрия с последующим отверждением микрокапсул дубящим веществом [1].

Известен другой способ получения микрокапсул, включающий смешивание капсулируемого вещества (комплекс витаминов А, Д и Е в растворе масла) с гидрофильным коллоидом, например желатиной, с получением эмульсии, получение коацервата для формирования оболочек микрокапсул путем понижения температуры эмульсии до +5^oС, отверждение оболочек обработкой их формальдегидом в присутствии щелочи, промывку, фильтрование и сушку микрокапсул (Патент США 3539465, НКл. 424-37, опубл. 1977 г.) [2].

Недостатком данных способов [1, 2] является значительные потери (до 90% и более) капсулируемого вещества в процессе формирования микрокапсул, если в качестве капсулируемого вещества используют жидкие водорастворимые субстанции, например субстанцию вируса кори, т.к. вирус в процессе формирования микрокапсул легко переходит в среду диспергирования. Кроме того, недостатком этого метода является сложность технологического процесса и использование органических веществ, например растворителей, которые в процессе капсулирования вирусных частиц могут инактивировать последние.

Известны способы получения микрокапсул как системы доставки антигена в Пейеровы бляшки размером от 1 до 10 мкм, например, методом получения эмульсии вода - в - масле [3, 4] или двойной эмульсии [5] вода - в - масле - в - воде.

Недостатками этих способов является сложность технологического процесса и использование органических растворителей, которые в процессе капсулирования вирусных частиц могут инактивировать последние.

Известен метод диспергирования водного раствора анионного полимера, содержащего капсулированное вещество (ротавирусные частицы), в водный раствор связывающего реагента, например диспергирование альгината натрия (отрицательно заряженного полимера) в виде капелек размером 5 мкм в водный раствор спермина гидрохлорида (соли амина) [6]. В результате формируются монодисперсные микрокапсулы вирусной вакцины размером от 1 до 10 мкм (преимущественно 2 мкм), которые вызывают у мышей выраженную индукцию гуморального ответа.

К недостаткам этого метода можно отнести:

а) только 1-6% от общего количества инфекционного вируса включается в матрицу альгинат-сперминовой микрокапсулы, т.к. обычно микрокапсулирование в водной среде с применением водорастворимых полимеров в качестве материала оболочек микрокапсул используют вещества, не смешивающиеся или не растворяющиеся в воде, тогда как вирусная суспензия хорошо растворима в воде, и вирус легко переходит в среду диспергирования;

б) сложность технологического процесса, увеличение расхода вируссодержащей жидкости и необходимость дополнительного оборудования приводит к значительному удорожанию вакцины.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ получения микрокапсулированной формы вирусной вакцины, включающий приготовление капсулируемого материала в виде субстанции, например вируса кори, диспергирование ее в водорастворимом заряженном полиэлектролите полифосфазене, получение коацервата для формирования оболочек капсул путем введения в смесь раствора соли одновалентного металла, например раствора хлористого натрия, обработку полученных микрокапсул отвердителем путем дубления их солью мультивалентного иона, например хлористым кальцием, и сушку готовых микрокапсул (Патент США 5807757, МПК А 61 К 39/00; А 61 К 9/50, опубл. 15.09.98 г.) [7].

Недостатком указанного способа-прототипа является то, что в нем используют такой новый полиэлектролит, как полифосфазен (материал оболочки), который не выпускается промышленностью, не разрешен к применению в фармацевтической и пищевой промышленностях и имеет сложный синтез, на который влияет множество факторов (температура реакции, начальное соотношение реагентов, комплекс растворителей и др.) вследствие чего трудно контролировать степень и регулярность нуклеофильного замещения получаемого полимера. Полиэлектролит с нестабильными физико-химическими свойствами не обеспечивает получение микрокапсул с заданными характеристиками, например размер и прочность микрокапсул и др.

Техническим результатом предлагаемого способа является получение микрокапсулированной формы живой коревой вакцины со стабильными характеристиками (размером частиц 0,2-10 мкм, сроком хранения вакцины не менее 1 года) с использованием реагентов, разрешенных к применению в фармацевтической и пищевой промышленностях.

Указанный результат достигается тем, что в способе получения микрокапсулированной формы живой вирусной вакцины, включающем приготовление капсулируемого материала в виде субстанции вируса кори, диспергирование ее в водорастворимом заряженном полиэлектролите, получение коацервата для формирования оболочек капсул, введение отвердителя и сушку готовых микрокапсул, согласно изобретению отвердитель вводят в заряженный полиэлектролит одновременно с субстанцией вируса кори до конечной концентрации полиэлектролита и отвердителя, не вызывающей разделение фаз в растворе препарата; микрокапсулы получают в результате сложной коацервации заряженного полиэлектролита и отвердителя с образованием комплекса путем замораживания раствора со скоростью 0,1-3,0^oС в минуту до температуры ниже температуры стеклования аморфной фазы, оставшейся после кристаллизации льда, а процесс сушки микрокапсул производят лиофилизацией.

Причем перед замораживанием жидкий полуфабрикат разливают в ампулы, а после лиофильной сушки ампулы заполняют инертным газом и запаивают.

В качестве субстанции вируса кори используют субстанцию живого вируса, которую получают путем размножения вируса на клеточном субстрате, с титром не менее 5,2 lgTЦД₅₀/0,5 мл, сбора вируссодержащей жидкости, освобождения продукта от клеточного детрита и введения в него стабилизирующей добавки.

Замораживание раствора препарата производят до температуры не выше - 40^oС.

Конечная концентрация полиэлектролита, связующего (отвердителя) и стабилизирующей добавки в жидком полуфабрикате составляет (0,001-2,5), (2,5-5,5) и (2,5-5,5) весовых процентов соответственно.

В качестве полиэлектролита используют альгинат натрия, полиакриловую кислоту или сополимер акриловой кислоты, или смесь полиакриловой кислоты с поливинилпирролидоном в соотношении (0,5-2,0): 1, в качестве связующего (отвердителя) - желатозу или смесь желатозы с хитозаном в соотношении (5,0-15,0): 1, или смесь желатозы со спермидином в соотношении (5,0-15,0):1, а в качестве стабилизатора - сорбит.

Следует отметить, что все соотношения между исходными компонентами полимеров выбраны, исходя из оптимального выхода коацервата с размером частиц в диапазоне 0,2-10 мкм. При совместной коацервации водорастворимого полимера или полимеров, способных диссоциировать на ионы при рН, близких к физиологическому, обеспечивается сохранность живого вируса кори в процессе микрокапсулирования. Коацервация обусловлена понижением растворимости полимера (одного из полимеров) при понижении температуры и первичной кристаллизации льда, вследствие чего концентрация полимера в маточном растворе (жидкой фазе, оставшейся после первичной кристаллизации льда) увеличивается. Полученный коацерват вместе с равновесной жидкостью подвергается дальнейшему замораживанию и лиофильному высушиванию. Концентрирование (понижение растворимости) полимера проводится за счет первичной кристаллизации льда, а не за счет выпаривания или изменения состава раствора, как правило, добавлением органических растворителей или избыточного полимера (аналоги [1-7]), что не вызывает инактивации живого вируса или его существенного разбавления (не более 1-20%). Весь процесс микрокапсулирования заключается в сведении растворов полимеров с жидким полуфабрикатом вакцины (вируссодержащая жидкость, стабилизированная частично гидролизованным желатином и сорбитом), замораживании полученного раствора с определенной скоростью и лиофилизации.

Необратимость процесса коацервации в предлагаемом способе обусловлена взаимодействием между положительными и отрицательными зарядами различных молекул реакционной смеси и возможно усилением взаимодействия между ними, происходящем при кристаллизации льда. Как известно, при кристаллизации льда возникают большие давления, которые создают условия для более близкого сближения противоположно заряженных ионов и, как следствие, образования устойчивого комплекса.

Ниже приведена характеристика компонентов, используемых для получения микрокапсул:

- полиакриловая кислота (ПАК) - молекулярная масса (MM) ~ 31000 Да, опытное производство АОЗТ "Delivery System International";

- сополимер акриловой кислоты, полученный этерификацией исходной ПАК (синтез отличается тем, что проводится в режиме автокатализа, на основе высокоочищенной ПАК, что обеспечивает отсутствие токсичности), опытное производство АОЗТ "Delivery System International";

- альгинат натрия пищевой (вязкость 1% раствора в градусах Энглера 6,5 Е^o, при 20^oС), Архангельский опытный водорослевый комбинат;

- хитозан ММ -35000 Da, ЗАО "Биопрогресс";

- низкомолекулярное вещество спермидин - Н₂N(СН₂)₄NН(СН₂)₃NН₂ - (3-аминопропил-4-аминобутиламин), Sigma;

- поли-N-винилпирролидон (ПВП) (марка Kollidon 90F). BASF AG.

На фиг.1 представлен график зависимости относительной вязкости полимеров от рН; на фиг. 2 изображены электронные фотографии микрокапсул, сформированных с использованием: а) 1%-ного сополимера полиакриловой кислоты; б) 0,1%-ного сополимера полиакриловой кислоты (увеличение 5000); на фиг.3 - строение лиофилизированного препарата коревой вакцины, содержащего комплексы альгинат натрия/спермидин (увеличение 2500, 10000 соответственно); на фиг.4 представлена атомно-силовая микроскопия лиофилизированного препарата коревой вакцины, содержащего 0,1%-ного сополимера полиакриловой кислоты.

Ниже приведены примеры конкретного выполнения способа получения микрокапсулированной формы живой коревой вакцины.

Пример 1. Приготовление жидкой субстанции живой коревой вакцины (ЖКВ)

Культуру клеток фибробластов японских перепелов получают путем трипсинизации эмбрионов раствором трипсина - версена при 37^oС. Клеточную смесь центрифугируют, клетки ресуспендируют в ростовой среде и рассеивают в матрасы или роллеры из расчета 500 и 950 тыс. кл./мл соответственно. Выращивание проводят при 35^oС до образования монослоя. При суспензионном заражении вирус добавляют во взвесь клеток с множественностью заражения 0,1-0,001ТЦД₅₀/кл. После образования монослоя клетки подвергают 6-кратным отмывкам для освобождения от балластных белков, далее культивируют при температуре (351)^oС и частоте вращения роллеров 2-12 об/мин. При появлении цитопатического действия вируса на клетки осуществляют сбор вируссодержащей жидкости с интервалом 1-3 суток с последующей заменой поддерживающей среды. Индивидуальные вирусные сливы со специфической активностью не ниже 5,2 lgТЦД₅₀/0,5 мл объединяют и освобождают фильтрованием от клеточного детрита. В суспензию добавляют стерильный раствор 50%-ного сорбита до конечной концентрации 5 весовых процентов в жидком полуфабрикате.

Пример 2. Получение микрокапсулированной формы ЖКВ с оболочкой на основе альгината натрия

Стерильную вируссодержащую жидкость получают как в примере 1. К стерильной вируссодержащей жидкости со специфической активностью не менее 5,2 lgТЦД₅₀/0,5 мл при непрерывном перемешивании одновременно с раствором сорбита добавляют стерильные водные растворы 25%-ной желатозы (мол. вес 3000) и 2%-ного альгината натрия до конечных концентраций 5,0 и 0,5 весовых процентов соответственно. Полученный жидкий полуфабрикат вакцины разливают в ампулы ВПШ-3 по 0,5 мл в каждую и замораживают при температуре -60^oС в течение 18 часов. Продукт лиофильно высушивают в течение 48 часов в стерильных условиях. После окончания сушки ампулы заполняют инертным газом (аргоном), запаивают.

Пример 3. Получение микрокапсулированной формы ЖКВ с оболочкой на основе альгината натрия и хитозана

Стерильную вируссодержащую жидкость получают как в примере 1. К стерильной вируссодержащей жидкости со специфической активностью не менее 5,2 lgTЦД₅₀/0,5 мл при непрерывном перемешивании добавляют стерильные растворы 25%-ной желатозы (мол. вес 3000), 2%-ного альгината натрия и 2%-ного хитозана последовательно до конечных концентраций 5,0; 0,5 и 0,35 весовых процентов соответственно. Полученный жидкий полуфабрикат вакцины разливают в ампулы ВПШ-3 по 0,5 мл в каждую и замораживают при температуре -60^oС в течение 18 часов. Продукт лиофильно высушивают в течение 48 часов в стерильных условиях. После окончания сушки ампулы заполняют инертным газом (аргоном), запаивают.

Пример 4. Получение микрокапсулированной формы ЖКВ с оболочкой на основе альгината натрия и спермидина

Стерильную вируссодержащую жидкость получают как в примере 1. К стерильной вируссодержащей жидкости со специфической активностью не менее 5,2 lg ТЦД₅₀/0,5 мл при непрерывном перемешивании добавляют стерильные водные растворы 25%-ной желатозы (мол. вес 3000), 2%-ного альгината натрия и 75%-ный раствор спермидина последовательно до конечных концентраций 5,0; 0,5 и 0,33 весовых процентов соответственно. Полученный жидкий полуфабрикат вакцины разливают в ампулы ВПШ-3 по 0,5 мл в каждую и замораживают при температуре -60^oС в течение 18 часов. Продукт лиофильно высушивают в течение 48 часов в стерильных условиях. После окончания сушки ампулы заполняют инертным газом (аргоном), запаивают.

Пример 5. Получение микрокапсулированной формы ЖКВ с оболочкой на основе полиакриловой кислоты

Стерильную вируссодержащую жидкость получают как в примере 1. К стерильной вируссодержащей жидкости со специфической активностью не менее 5,2 lg ТЦД₅₀/0,5 мл при непрерывном перемешивании добавляют стерильные водные растворы 25%-ной желатозы (мол. вес 3000) и 5%-ного раствора полиакриловой кислоты последовательно до конечных концентраций 5,0 и 0,5 весовых процентов соответственно. Полученный жидкий полуфабрикат вакцины разливают в ампулы ВПШ-3 по 0,5 мл в каждую и замораживают при температуре -60^oС в течение 18 часов. Продукт лиофильно высушивают в течение 48 часов в стерильных условиях. После окончания сушки ампулы заполняют инертным газом (аргоном), запаивают.

Пример 6. Получение микрокапсулированной формы ЖКВ с оболочкой на основе сополимера акриловой кислоты

Стерильную вируссодержащую жидкость получают как в примере 1. К стерильной вируссодержащей жидкости со специфической активностью не менее 5,2 lgТЦД₅₀/0,5 мл при непрерывном перемешивании добавляют стерильные водные растворы 25%-ной желатозы (мол. вес 3000) и 2%-ного раствора сополимера акриловой кислоты и этилового спирта со степенью замещения 43% (СП) последовательно до конечных концентраций 5,0 и 1,0 весовых процентов соответственно. Полученный жидкий полуфабрикат вакцины разливают в ампулы ВПШ-3 по 0,5 мл в каждую и замораживают при температуре -60^oС в течение 18 часов. Продукт лиофильно высушивают в течение 48 часов в стерильных условиях. После окончания сушки ампулы заполняют инертным газом (аргоном), запаивают.

Пример 7. Получение микрокапсулированной формы ЖКВ с оболочкой на основе сополимера акриловой кислоты

Стерильную вируссодержащую жидкость получают как в примере 1. К стерильной вируссодержащей жидкости со специфической активностью не менее 5,2 lgТЦД₅₀/0,5 мл при непрерывном перемешивании добавляют стерильные водные растворы 25%-ной желатозы (мол. вес 3000) и 2%-ного раствора сополимера акриловой кислоты последовательно до конечных концентраций 5,0 и 0,1 весовых процентов соответственно. Полученный жидкий полуфабрикат вакцины разливают в ампулы ВПШ-3 по 0,5 мл в каждую и замораживают при температуре -60^oС в течение 18 часов. Продукт лиофильно высушивают в течение 48 часов в стерильных условиях. После окончания сушки ампулы заполняют инертным газом (аргоном), запаивают.

Пример 8. Получение микрокапсулированной формы ЖКВ с оболочкой на основе полиакриловой кислоты и поливинилпирролидона

Стерильную вируссодержащую жидкость получают как в примере 1. К стерильной вируссодержащей жидкости со специфической активностью не менее 5,2 дgTЦД₅₀/0,5 мл при непрерывном перемешивании добавляют стерильные водные растворы 25%-ной желатозы (мол. вес 3000), 5%-ного раствора полиакриловой кислоты и 5%-ного раствора поливинилпирролидона последовательно до конечных концентраций 5,0; 0,5 и 0,75 весовых процентов соответственно. Полученный жидкий полуфабрикат вакцины разливают в ампулы ВПШ-3 по 0,5 мл в каждую и замораживают при температуре -60^oС в течение 18 часов. Продукт лиофильно высушивают в течение 48 часов в стерильных условиях. После окончания сушки ампулы заполняют инертным газом (аргоном), запаивают.

Методом вискозиметрии изучена зависимость конформации от рН (фиг.1) полиакриловой кислоты (ПАК), ее сополимера и хитозана (рН-зависимые полимеры). Определены диапазоны рН, при которых полимер наиболее диссоциирован и находится в "развернутом" состоянии, переходная область, область "свернутого" состояния и значение рН, при котором он выпадает в осадок.

Пример 9. Определение специфической активности препарата

Специфическую активность вируссодержащего материала определяли по цитопатическому действию на культуру клеток Vero в соответствии с ФС 42-3092-00 "Вакцина коревая культуральная живая сухая". Для определения специфической активности содержимое ампулы, полученное в соответствии с одним из примеров 1-8, растворяют в 0,5 мл среды RPMI и титруют в 96 - луночных культуральных планшетах на культуре клеток VERO по цитопатическому действию в соответствии с [8]. Для микрокапсулированных форм ЖКВ из примеров 3 и 4 не удается определить специфическую активность на культуре клеток (титр2 lgTЦД₅₀/0,5 мл) вследствие трудности раскрытия микрокапсул в модельной системе in vitro. Специфическую активность этих образцов определяют в системе in vivo.

Для образцов вакцины, изготовленных в примерах 1-8, результаты определения специфической активности приведены в табл.1. Из приведенных данных видно, что для образцов 5 и 8 падение специфической активности в тесте на ускоренное старение не превышает 1,5 lgТЦД₅₀/0,5 мл, а для образца 7-1 lgТЦД₅₀/0,5 мл (удовлетворяет требованию ВОЗ для термостабильных вакцин).

Пример 10. Исследование иммуногенности препаратов на животных

Иммуногенность полученных образцов вакцины в системе in vivo определяли путем пероральной иммунизации морских свинок. Для этого лиофилизированные образцы препаратов растворяли в 0,5-1 мл дистиллированной воды, после чего с помощью пипетки вводили перорально морским свинкам (весом 200-250 г), по 6 животных в группе, одно - или двухкратно. Параллельно контрольным животным вводили подкожно или перорально по одной дозе инъекционной формы живой коревой вакцины, предварительно разведенной в 0,5 мл растворителя для коревой вакцины. На 28 сутки после иммунизации осуществляли забор крови; сыворотки крови исследовали в реакции торможения гемагглютинации с 4 АЕ твин-эфирного антигена вируса кори в соответствии с ФС 42-3092-00 "Вакцина коревая культуральная живая сухая".

Результаты приведены в табл. 2. Как видно из представленных в таблице результатов, микрокапсулированная форма вакцины вызывает у свинок выраженную индукцию гуморального ответа, превышающую ответ на введение традиционной формы ЖКВ.

Пример 11. Результаты морфологических исследований микрокапсул

Для определения строения лиофилизированных препаратов применяли метод криофрактографии с использованием криофрактографической установки BAF-400D (Balzers, Лихтенштейн). Для заполнения пустот изучаемый препарат заключали в специально подобранную матрицу; каплю полученной субстанции замораживали до температуры минус 100^oС и разламывали в вакууме ножом, охлажденным до температуры жидкого азота. Затем на поверхности реплики без нарушения вакуума формировали платино-углеродную реплику, которую далее очищали от остатков препарата и матрицы в соответствующих травителях. Полученный препарат изучали в электронном микроскопе Н600 (Hitachi, Япония).

Для атомно-силовой микроскопии лиофилизированный препарат растворяли в дистиллированной воде, далее каплю препарата наносили на поверхность предметного стекла. После высушивания водорастворимые компоненты удаляли промывкой и исследовали препарат с помощью атомно-силового микроскопа Solver P47BIO (NT-MDT, Россия) в полуконтактном режиме.

Изучение структуры микрокапсул проводили с помощью просвечивающей электронной микроскопии по методу негативного контрастирования. Для этого исследуемые образцы вакцины растворяли в воде, наносили на сетки, покрытые формваром. Контрастирование проводили в растворе фосфорно-вольфрамовой кислоты при рН=7,0.

С помощью просвечивающей электронной микроскопии было установлено, что микрокапсулы имеют округлую форму и четкие границы (фиг.2). Исследование препаратов методом криофрактографии показало наличие полиморфных микрочастиц неправильной формы размером 1-3 мкм (фиг.3). В атомно-силовом микроскопе определялись как единичные, так и объединенные в группы овальные структуры высотой 0,6-1 мкм с горизонтальными размерами 1-2 мкм (фиг.4).

По данным электронной микроскопии в просмотренных полях свободных вирусных частиц (не заключенных внутрь микрокапсул) не обнаружено.

Микрокапсулы живой коревой вакцины, полученные предлагаемым способом, устойчивы в водной среде при рН от 2 до 9 в течение 24 часов и в лиофилизированном состоянии в течение 12 месяцев (время наблюдения).

Источники информации

1. Солодовник В.Д. Микрокапсулирование. - Москва, Химия, 1980, с.54-57.

2. Патент США 3539465, НКл. 424-37, 1977 г.

3. J.H. Eldridge, J.K. Staas, J.A. Meulbroek, J.R. McGhee, T.R. Tice and R.M. Gilley. Biodegradable microspheres as a vaccine delivery system. Molecular Immunology, Vol.28, No.3, pp.287-294, 1991.

4. Патент США 5075109, МПК А 61 К 9/50, 24.12. 1991.

5. Conwey, В.R., Alpar, H.0., Lewis, D.A. Studies on the optimization of loading and release kinetics of interferon-gamma from polylactide microspheres. Proc. Int. Symp. Contr. Rel. Bioact. Mater. 21:284-285, 1994.

6. P. A. Offit, С.A. Khoury, С.A. Moser, H.F. Clark, J.E. Kirm and Т.J. Speaker. Enhancement of Rotavirus Immunogenicity by Microencapsulation. Virology, 203(1), 134-143, 1994/

7. Патент США 5807757, МПК А 61 К 39/00; А 61 К 9/50, 15.09.98 г. (прототип).

8. Ф.С.42-3092-00 "Вакцина коревая культуральная живая сухая".