производные 1,4,2,5-диоксадиазина

Формула изобретения

1. Производные 1,4,2,5-диоксадиазина общей формулы I



где R обозначает



R¹ обозначает N₃ или NO₂.

2. Производные 1,4,2,5-диоксадиазина по п. 1 как активаторы растворимой формы гуанилатциклазы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к новым химическим соединениям - производным 1,4,2,5-диоксадиазина общей формулы I:



где R =



R¹ = N₂ или NO₂.

Предпочтительно указанные соединения являются активаторами растворимой формы гуанилатциклазы (рГЦ).

Данное изобретение может быть использовано в биохимии и физиологии.

Гуанилатциклаза /КФ 4.6.1.2; гуанозин-5"-трифосфат-пирофосфатлиаза (циклизующая)/ является ферментом, катализирующим биосинтез гуанозин-3", 5"-циклофосфата (цГМФ) - вторичного мессенджера, выполняющего роль универсального регулятора внутриклеточного метаболизма (F. Murad "Regulation of cytosolic guanylyl cyclase by nitric oxide: The NO-cGMP signal transduction system" Adv. Pharmacol., 1994, v.26, p. 19-33). ГЦ существует в двух формах - мембранной и растворимой. В настоящее время установлено, что рГЦ играет ключевую роль в регуляции таких физиологических процессов, как сокращение и расслабление гладких мышц кровеносных сосудов и агрегация тромбоцитов.

Показано, что некоторые низкомолекулярные соединения, являющиеся активаторами рГЦ, независимо от цГМФ также могут влиять и на активность ряда других ферментных систем. Одним из таких биохимических объектов является глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа /никотинамидаденин-динуклеотид(НАД)-зависимая/ (ГАФД) (КФ 1.2.1.12), катализирующая окислительное фосфорилирование 3-фосфоглицеринового альдегида. В частности, оксид азота и его доноры, стимулирующие рГЦ, способны снижать активность ГАФД (напр., S. Dimmeler, F. Lottspeich, B. Brune "Nitric oxide causes ADP-ribosylation and inhibition of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase" J. Biol. Chem. 1992, v. 267, 24, p. 16771-16774; B. Brune, E.G. Lapetina "Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: a target for nitric oxide signaling" Adv. Pharmacol. 1995, v. 34, p. 351-360).

Создание соединений, обладающих повышенной специфичностью действия по отношению к рГЦ, представляет значительный интерес с точки зрения селективной регуляции цГМФ-зависимых физиологических процессов.

Известен 4-нитрохинолин-1-оксид формулы II:



оказывающий активирующее действие на рГЦ (Craven, P.A., De Rubertis, F. R, "Inhibition by retinol and butylated hydroxyanisol of carcinogen-mediated increases in guanylate cyclase activity and guanosine 3",5"-monophosphate accumulation" Cancer Res., 1977, v.37, p.4083-4097).

Данное соединение обладает мутагенными свойствами. Селективность его активирующего действия на рГЦ не исследовалась (в частности, влияние на активность ГАФД не изучено).

Известны различные 3,4-дизамещенные фуроксаны (1,2,5-оксадиазол-2-оксиды) общей формулы III:



где R¹ и R² - метил, фенил, фенилсульфонильная, нитрильная, метокси-, нитро- или аминогруппа, генерирующие оксид азота и активирующие рГЦ (R. Ferioli, G.C. Folco et al. "A new class of furoxan derivatives as NO-donors: mechanism of action and biological activity" Brit. J. Pharmacol. 1995, v. 144, 3, p. 816-820).

Специфичность влияния данных производных фуроксана на активность рГЦ не исследовалась.

Известен 3,6-бис(4-аминофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазин вышеуказанной формулы I в качестве продукта химического синтеза (В.Г. Андрианов, В.Г. Семенихина, А. В. Еремеев "Галогенангидриды 4-аминофуразан-3-карбогидроксимовой кислоты" Химия гетероцикл. соед., 1992, 5, с. 687-691).

Биохимические, физиологические и фармакологические свойства данного соединения не изучены.

Наиболее близким к соединениям настоящего изобретения по структуре и свойствам является 4,7-диметил-1,2,5-оксадиазоло[3,4-d] пиридазин-5,6-триоксид (ДОПТО) формулы IV:



содержащий в составе молекулы 1,2,5-оксадиазольный цикл и шестичленный гетероциклический фрагмент. ДОПТО является специфическим регулятором активности нуклеотид-зависимых ферментов, в частности, он активирует рГЦ и ингибирует ГАФД (патент РФ 2130490, C 12 N 9/88, 9/99, 1997 г.).

Несмотря на высокую степень активации рГЦ под действием ДОПТО, данное соединение являлось также эффективным ингибитором ГАФД.

Целью изобретения является создание новых гетероциклических активаторов растворимой формы гуанилатциклазы, обладающих улучшенными биохимическими свойствами, в частности, более выраженным и селективным активирующим действием на рГЦ.

Указанная цель достигается новыми производными 1,4,2,5-диоксадиазина вышеуказанной формулы I, где R имеет приведенные значения, активирующими рГЦ.

3,6-Бис(4-нитрофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазин был синтезирован способом, основанным на известной реакции окисления аминофуразанов до соответствующих нитропроизводных (напр., T.S. Novicova, T.M. Mel"nikova et al. "An effective method for the oxidation of aminofurazans to nitrofurazans" Mendeleev Commun. , 1994, p. 138-140) и заключающимся в обработке 3,6-бис(4-аминофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазина трифторнадуксусной кислотой при температуре 15-18^oС.

3,6-Бис(4-азидофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазин был получен способом, основанным на известной реакции диазотирования аминофуразанов с помощью растворов нитрита натрия в серной кислоте и обработкой промежуточных солей нитрозония азидами щелочных металлов (О.А. Ракитин, О.А. Залесова и др. Изв. РАН, сер. хим., 1993, N11, с. 1949-1954) и заключающимся во взаимодействии 3,6-бис(4-аминофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазина с раствором нитрита натрия в серной кислоте при температуре 10-12^oС с последующим разбавлением реакционной смеси фосфорной кислотой и добавлением водного раствора азида натрия.

Исходный 3,6-бис(4-аминофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазин был получен известным способом, основанным на реакции направленной димеризации нитрилоксидов и заключающимся во взаимодействии хлорангидрида (4-аминофуразан-3-ил)гидроксамовой кислоты с триэтиламином в инертном органическом растворителе (ацетонитриле) при температуре 0-5^oС (В.Г. Андрианов, В.Г. Семенихина, А.В. Еремеев "Галогенангидриды 4-аминофуразан-3-карбогидроксимовой кислоты". Химия гетероцикл. соед., 1992, 5, с. 687-691).

Данное изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. 3,6-Бис(4-нитрофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазин (1).

К раствору трифторнадуксусной кислоты, приготовленному осторожным добавлением 3,4 мл (0,24 моль) трифторуксусного ангидрида к 5,4 мл (0,2 моль) 90% перекиси водорода при охлаждении ледяной водой, при интенсивном перемешивании небольшими порциями прибавляют 1,26 г (0,005 моль) 3,6-бис(4-аминофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазина в течение 30 мин, поддерживая температуру 15-18^oС с помощью ледяной бани (при этом наблюдают сильную экзотермическую реакцию, которая может наступить после некоторого индукционного периода). После этого реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре до исчезновения исходного амина (контроль по ТСХ) и выливают в холодную воду. Выпавший твердый продукт отфильтровывают, промывают водой до нейтральной реакции промывных вод и высушивают на воздухе. После двукратной перекристаллизации из дихлорэтана получают 0,75 г целевого продукта (выход 20%). Т.пл. 101-102^oС. ИК спектр (KBr), , см^-1: 1675 сл., 1645 ср., 1587 с. , 1557 с., 1482 ср., 1358 ср., 1273 с., 1240 сл., 1088 с., 1030 с., 1011 ср. , 903 сл., 882 сл., 861 с., 827 с., 763 ср.

ЯМР ¹³С спектр (ДМСО-d₆), , м.д.: 160,53, 153,27, 140,55.

Найдено, %: С 23,22; N 36,17 (C₆N₈O₈).

Вычислено, %: С 23,08; N 35,89.

Пример 2. 3,6-Бис(4-азидофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазин.

К раствору 1.4 г (20 ммоль) нитрита натрия в 10 мл концентрированной серной кислоты, полученному при температуре не выше 15^oС, при перемешивании и температуре 10-12^oС прикапывают раствор 2.5 г (10 ммоль) 3,6-бис(4-аминофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазина в 30 мл серной кислоты. Реакционную смесь выдерживают в течение 30 мин при данной температуре, затем при перемешивании прибавляют 40 мл ортофосфорной кислоты, поддерживая температуру не выше 10^oС, перемешивают в течение 30 мин при 0-2^oС, затем порциями при интенсивном перемешивании и температуре не выше 15^oС прикапывают раствор 5 г (77 ммоль) азида натрия в 13 мл воды и перемешивают в течение 30 мин. После этого реакционную смесь выливают на лед (200 г), выделившийся в виде пены осадок отфильтровывают, промывают водой до нейтральной реакции промывных вод и высушивают при пониженном давлении в присутствии гидроокиси натрия. Получают 2,1 г целевого продукта (выход 66,2%). Соединение неустойчиво на свету и разлагается при хранении в виде раствора в полярных органических растворителях (диметилсульфоксиде, диметилформамиде, ацетоне, метаноле). Т.разл. 110-112^oС.

ЯМР ¹³С спектр (CDCl₃), , м.д.: 153,49; 153,14; 137,42.

Найдено, %: С 23,96; N 55,54 (С₆N₁₂O₄).

Вычислено, %: С 23,70; N 55,26.

Пример 3. Активация растворимой формы гуанилатциклазы производными 1,4,2,5-диоксадиазина.

Активность рГЦ измеряли в препаратах из легких свиньи, полученных известным способом. Активность фермента определяли по количеству [³²P]цГMФ, образовавшегося из [-³²Р]ГТФ, известным способом. Белок (около 0,2-0,5 мкг белка частично очищенного препарата из легких свиньи) на льду добавляли в инкубационную смесь (конечный объем проб 100 мкл), содержащую (конечные концентрации) 50 мМ трис-НСl рН 7,6, 1 мМ 3-изобутил-1-метилксантин, 5 мМ MgCl₂, 0,4 мг/мл креатинфосфокиназы, 5 мМ креатинфосфат, 2 мМ цГМФ, 0,2 мМ ГТФ, 10000-20000 имп/мин/пмоль [-³²Р]ГТФ (Изотоп, ИЯФ, Обнинск), а также 10 мМ ДТТ. При определении активирующего действия в среду инкубации вносили изучаемое соединение в концентрации 10 мкМ в виде раствора в водном ДМСО, а в контрольные пробы добавляли ДМСО до концентрации 0,02%. Контрольная проба показала отсутствие влияния ДМСО в указанной концентрации на базальную активность рГЦ. Пробы инкубировали при 37^oС в течение 15 мин. Реакцию останавливали кипячением проб в течение 2 мин. После охлаждения до комнатной температуры в пробы добавляли 0,5 мл 30 мМ Na₂CO₃ и 0.6 мл 36 мМ Zn(СН₃СОО)₂, перемешивали, инкубировали при 4^oС в течение 10 мин и центрифугировали при 15000 g в течение 5 мин. Супернатант наносили на хроматографические колонки с окисью алюминия, уравновешенные 1 М хлорной кислотой, которые затем промывали водой. Элюцию [³²P]цГMФ проводили 0,2 М формиатом аммония во флаконы для сцинтилляционного счета, и радиоактивность измеряли с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика известным способом.

Соединения настоящего изобретения, в зависимости от концентрации, повышали активность рГЦ из легких свиньи. В частности, соед. 1 активировало фермент в 4,0 (10 мкМ), 7,5 (50 мкМ) и 9,2 раз (100 мкМ), а соед. 2 - в 15,2 (50 мкМ) и 16,8 раз (100 мкМ). Известный структурный аналог, ДОПТО, в тех же условиях увеличивал активность рГЦ в 2,3 (25 мкМ) и 5,5 раз (50 мкМ).

Пример 4. Ингибирование глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы производными 1,4,2,5-диоксадиазина.

ГАФД, выделенную из мышц кролика известным способом (активность 100-105 ед. ) в концентрации 1,7 мкМ, проинкубировали в 20 мМ буфере HEPES-NaOH (pH 7,5) в присутствии 68 мкМ изучаемых соединений. В качестве контроля использовали ДМСО в концентрации 0,1%. В пробы также добавляли 2-меркаптоэтанол до концентрации 0,5 мМ. После инкубации при комнатной температуре аликвоты переносили в среду для измерения активности фермента, содержащую 0,1 М глициновый буфер (pH 8,9), 0,5 мМ НАД, 0,5 мМ глицеральдегид-3-фосфат и 20 мМ арсенат натрия и регистрировали прирост оптической плотности при 340 нм с помощью спектрофотометра в течение 15 с, регистрируя начальную скорость реакции. Соединения общей формулы I оказывали ингибирующее действие на активность ГАФД. Полученные результаты представлены в таблице.

Как вытекает из данных таблицы, соединения настоящего изобретения (в частности, 3,6-бис(4-нитрофуразан-3-ил)-1,4,2,5-диоксадиазин) при значительно более высоких концентрациях оказывали менее выраженное ингибирующее действие на активность ГАФД, что свидетельствовало о более селективном влиянии на активность рГЦ.

Таким образом, новые производные 1,4,2,5-диоксадиазина вышеуказанной формулы I являются представителями нового класса активаторов рГЦ, оказывающих более эффективное и селективное действие на данный фермент.