способ определения антибиотиков, содержащих -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления

Формула изобретения

1. Способ определения антибиотиков, содержащих -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения, включающий следующие стадии: а) приведение определенного объема указанной жидкости биологического происхождения в контакт с некоторым количеством распознающего агента и термостатирование полученной при этом смеси в условиях, в которых возможно комплексообразование антибиотиков, которые могут присутствовать в указанной биологической жидкости, с распознающим агентом, б) приведение смеси, полученной на стадии (а), в контакт с, по меньшей мере, одним эталонным антибиотиком, иммобилизованным на подложке, в условиях, которые делают возможным образование комплекса эталонного антибиотика с тем количеством распознающего агента, которое не прореагировало на стадии (а), и в) определение количества распознающего агента, связанного с подложкой, по которому судят о количестве антибиотика в исследуемой жидкости, отличающийся тем, что распознающий агент представляет собой рецептор, чувствительный к антибиотикам, содержащим -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамное кольцо, полученный из Bacillus licheniformis.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что рецептор, чувствительный к антибиотикам, содержащим -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамный цикл, представляет собой B1aR или рецептор B1aR-CTD.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что рецептор, чувствительный к антибиотикам, содержащим -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамный цикл, связывается меткой, выбранной из металлических коллоидных частиц, коллоидных частиц селена, углерода, серы или теллура и коллоидных частиц окрашенных синтетических латексов.

4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что рецептор, чувствительный к антибиотикам, содержащим -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамный цикл, связывается меткой, выбранной из флуоресцирующих веществ.

5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что рецептор, чувствительный к антибиотикам, содержащим -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамный цикл, связывается меткой, выбранной из ферментов, таких как щелочная фосфатаза, пероксидазы или -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамазы.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что рецептор, чувствительный к антибиотикам, связывается меткой-ферментом химически или генетически.

7. Способ по любому из пп.3-6, отличающийся тем, что рецептор, чувствительный к антибиотикам, содержащим -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамный цикл, связывается меткой перед стадией (а).

8. Способ по любому из пп.3-6, отличающийся тем, что рецептор, чувствительный к антибиотикам, содержащим -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамный цикл, связывается меткой во время или после стадии (а).

9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что стадии (а) и (б) проводят одновременно.

10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что подложку, применяемую на стадии (б), выбирают из пробирок, планшетов или стержней с нанесенным на их поверхность эталонным антибиотиком.

11. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что подложка, применяемая на стадии (б), представляет собой аналитическое устройство, состоящее из твердой панели (1), имеющей первый и второй конец, к которой прикреплены последовательно, начиная с первого конца, мембрана (2) для очистки анализируемой жидкости, мембрана (3), на которой иммобилизовано одно или более улавливающих веществ, и поглощающая мембрана (4).

12. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что подложка, применяемая на стадии (б), состоит из множества магнитных или немагнитных гранул (шариков).

13. Аналитический набор для определения антибиотиков в жидкости биологического происхождения способом по любому из пп.1-12, содержащий, по меньшей мере, один распознающий агент, чувствительный к антибиотикам, содержащим -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамный цикл, полученный из Bacillus licheniformis, и, по меньшей мере, один эталонный антибиотик, иммобилизованный на подложке.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к новым, быстрым и чувствительным способам определения антибиотиков, содержащих -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамный цикл, в биологической жидкости, использующим рецептор, восприимчивый к антибиотикам Bacillus licheniformis. содержащим -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамный цикл. Изобретение также относится к наборам для осуществления этих способов.

В настоящее время антибиотики очень широко используются не только в качестве терапевтических агентов при лечении инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, но также в качестве агентов для хранения пищевых продуктов и в качестве пищевых добавок, стимулирующих рост животных. Следовательно, все более ощущается необходимость в определении антибиотиков в сложных жидкостях биологического происхождения, таких как молоко, моча, кровь, сыворотка, слюна, мясные экстракты, ферментационные растворы или забуференные водные среды.

Примером являются молочные продукты, так как хорошо известно применение антибиотиков для лечения некоторых инфекционных заболеваний молочного крупного рогатого скота.

Однако по очевидным медицинским причинам молоко, употребляемое в пищу человеком, в принципе не должно содержать никаких следов антибиотиков. Более того, концентрация пенициллина 0,005 ед./мл или менее может оказывать вредное воздействие при производстве молочных продуктов, таких как сыр, йогурт и т.д.

Можно представить несколько ситуаций. В первом случае, например при определении наличия антибиотиков на ферме, перед тем как перенести в фургон, предпочтение должно быть отдано чрезвычайно быстрому (менее 5 минут) и простому тесту. Также можно представить себе применение такого быстрого теста, когда, например, применявшийся для лечения антибиотик известен и когда, кроме того, этот тест позволяет определить данный антибиотик в количествах, соответствующих национальному (федеральному) стандарту. Во втором случае, когда акцент делается не на скорость, важно определять большинство, если не все антибиотики в количествах, соответствующих национальным стандартам (эталонам).

Причиной этого является тот факт, что законы в некоторых странах требуют строго конкретных стандартов качества. Например, власти США требуют, чтобы концентрация следующих шести антибиотиков в молоке не превышала совершенно конкретных величин: пенициллин 5 ч. на млрд; ампициллин 10 ч. на млрд; амоксициллин 10 ч. на млрд; клоксациллин 10 ч. на млрд; цефапирин 20 ч. на млрд; цефтиофур 50 ч. на млрд. В Европейском Союзе приняты следующие стандарты качества: пенициллин 4 ч. на млрд; амоксициллин 4 ч. на млрд; ампициллин 4 ч. на млрд; клоксациллин 30 ч. на млрд; диклоксациллин 30 ч. на млрд; оксациллин 30 ч. на млрд; цефапирин 10 ч. на млрд; цефтиофур 100 ч. на млрд; цефхинон 20 ч. на млрд; нафциллин 30 ч. на млрд; цефазолин 50 ч. на млрд.

Следовательно, было бы полезно найти тест, который бы позволял определять большинство антибиотиков. Кроме того, можно полагать, что в молочной промышленности в отсутствие теста, которому присущи все свойства - скорость, чувствительность и простота - полезен тест, который дает возможность наилучшим образом сочетать эти три параметра, даже если он неполностью им отвечает.

Для определения антибиотиков, содержащих -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения уже предлагались различные виды анализов.

Эти анализы обычно используют методы определения, которые применяют распознающий агент (рецептор или антитело), который специфически распознает антибиотик или аналог этого антибиотика, и вещество-метку (радиоактивный элемент, фермент, флуоресцирующий агент), причем эти агенты в дальнейшем называются реагентами-детекторами (детекторами). В зависимости от выбранных элементов используемый метод называется радиоиммунанализ (RIA), радиорецепторный анализ (RRA), иммуноферментный анализ (EIA) и т.д. В основном эти анализы используют минимальное сочетание двух вышеуказанных элементов (детекторов), которое позволяет получать результат, величина которого есть показатель количества имеющегося аналита.

Следует отметить, что в зависимости от выбранного метода определения агент-метка может связываться либо с распознающим агентом, либо с антибиотиком или с аналогом антибиотика в условиях его распознавания распознающим агентом. Имеются способы, в которых распознающий агент, или антибиотик, или аналог антибиотика изначально содержит метку (например, меченый радиоактивным изотопом аналит).

В случае молочных продуктов многократно описанные анализы с целью определения аналита относятся к определению антибиотиков.

Патент США 4239852 описывает микробиологический способ определения антибиотиков, содержащих -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамный цикл, в молоке. Согласно этому способу пробу молока сначала термостатируют в присутствии частей клеток микроорганизма с высокой чувствительностью к антибиотикам Bacillus stearothermophilus. а затем в присутствии антибиотика с меткой ("меченого") - радиоактивным элементом или ферментом. Термостатирование осуществляют в условиях, которые позволяют антибиотикам, если они присутствуют в пробе, и меченому антибиотику связываться с частями клеток.

После термостатирования части клеток отделяют от смеси и затем промывают. Затем определяют количество меченого антибиотика, связанного с частями клеток, и сравнивают с эталоном. Количество меченого антибиотика, связанного с частями клеток, обратно пропорционально концентрации антибиотика, присутствующего в анализируемой пробе молока.

Этот способ требует исключительной осторожности, особенно на стадии отделения частей клеток от смеси. Кроме того, в своем наиболее чувствительном варианте, который позволяет определять до 0,01 ед./мл и даже до 0,001 ед./мл пенициллина G в молоке, этот способ использует антибиотик, меченый радиоактивным элементом (¹⁴С или ¹²⁵I). В этом случае определение количества антибиотика, возможно присутствующего в молоке, требует специальной аппаратуры, например такой, как сцинтилляционный счетчик. Кроме того, работа с радиоактивными продуктами даже в очень малых количествах для человека, проводящего анализ, неполностью свободна от риска.

В Европейской патентной заявке 593112 описан другой способ, позволяющий определять антибиотики в молоке. Этот способ использует белок, выделенный из чувствительного к антибиотику микроорганизма, такого как Bacillus stearothermophilus. Этот белок дополнительно метят ферментом, таким как пероксидаза. Анализ проводят следующим образом: пробу молока термостатируют в пробирке в присутствии меченого белка; после термостатирования молоко переносят во вторую пробирку, на стенках которой иммобилизован заданный антибиотик; проводят второе термостатирование и затем содержимое пробирки удаляют; стенки этой второй пробирки трижды смывают промывным раствором, который тоже сливают, а затем остатки из второй пробирки переносят на лист промокательной бумаги; затем во вторую пробирку добавляют окрашивающее вещество, ее снова термостатируют, потом добавляют раствор, замедляющий проявление красителя; окрашивание в пробирке сравнивают с окрашиванием стандартного образца антибиотика в параллельно проводимом идентичном тесте. Количество меченого белка, иммобилизованного па подложке и, следовательно, интенсивность окрашивания обратно пропорциональна количеству антибиотика в анализируемой пробе молока.

Согласно Примеру 1 этой патентной заявки этот тест позволяет обнаруживать пенициллин G вплоть до концентраций порядка 5 ч. на млрд и позволяет обнаруживать амоксициллин (5 ч. на млрд), ампициллин (10 ч. на млрд), цефапирин (5 ч. на млрд) и цефтиофур (5 ч. на млрд). Этот тест не дает возможность обнаруживать пенициллин, амоксициллин и ампициллин в количествах, отвечающих Европейским нормам, и, с другой стороны, этот тест достаточно сложен; он неполностью соответствует искомым в контексте данного изобретения критериям чувствительности и простоты.

Однако проведение анализа очень утомительно, особенно если его выполняет неквалифицированный персонал. И действительно, этот анализ содержит множество стадий, включая стадии переноса жидкости и остатков из одной емкости в другую и несколько стадий промывания. Если учитывать число и характер требующихся для проведения этого анализа стадий, получение надежного результата очень зависит от экспериментальной эрудиции исполнителя.

Кроме того, для расшифровки (объяснения) результата требуется параллельное проведение двух анализов, что удваивает и дополнительно усложняет операцию.

Описаны также другие ферментативные способы, которые позволяют определять низкие концентрации антибиотиков в молоке (J.M. Frere et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18(4), 506-510 (1980) и Европейские патенты ЕР 85667 и ЕР 468946), они основаны на применении специфического фермента, а именно растворимой внеклеточной D-аланил-D-аланинкарбоксипептидазы, продуцируемой Actinomadura R39 (далее называемой "фермент R39"). Фермент R39 обладает специфической активностью, гидролизуя D-аланил-D-аланин-группы различных пептидов, и также способен гидролизовать некоторые тиоэфиры.

Кроме того, фермент R39 реагирует с антибиотиками, содержащими -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамный цикл, очень быстро образуя неактивный и практически необратимый комплекс фермент-антибиотик.

В большинстве последних вариантов этого теста (ЕР 468946) заранее установленный объем образца для исследования термостатирутот с заранее установленным количеством фермента R39 в условиях, позволяющих -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамсодержащему антибиотику, возможно присутствующему в образце, реагировать с ферментом с образованием неактивного и практически необратимого эквимолекулярного комплекса фермент-антибиотик.

Затем заранее определенное количество тиоэфирного субстрата термостатируют с продуктом, полученным на первой стадии, в условиях, позволяющих гидролизовать субстрат с помощью остатка фермента R39, не образовавшего комплекс с антибиотиком при первом термостатировании. Количество образовавшейся при этом меркаптоалкановой кислоты определяют затем колориметрическим методом с помощью реагента, способного вызывать окрашивание при реакции со свободной группой SH меркаптоалкановой кислоты. Интенсивность окрашивания сравнивают с эталоном, полученным ранее с помощью образцов, содержащих известные количества антибиотиков. Количественное определение можно проводить с помощью спектрофотометра; при анализе молока может возникнуть необходимость в предварительном осветлении образца.

Согласно вариантам воплощения способа в патенте ЕР 468946 этот процесс позволяет определить в молоке 10 ч. на млрд пенициллина G при термостатировании в целом в течение 5 минут и около 2,5 ч на млрд пенициллина G при термостатировании в целом в течение 15 минут.

Учитывая критерии скорости, простоты и чувствительность, требующиеся от способов обнаружения антибиотиков в пищевых продуктах. Заявитель поставил себе целью поиск новых, более эффективных способов обнаружения антибиотиков в жидкости биологического происхождения. В частности, Заявитель поставил целью поиск методов обнаружения в одном тесте большинства антибиотиков, содержание которых котролируется властями в Европе и США. Кроме того, изучаемые методы должны давать возможность получать этот результат с помощью ограниченного числа стадий, проводимых предпочтительно неквалифицированным персоналом. Заявитель также исследовал способы достижения этих целей в течение более короткого времени термостатирования, чем в существующих способах.

Заявитель недавно открыл новые способы обнаружения антибиотиков, содержащих b-лактамный цикл, в биологической жидкости, которые позволяют достичь этих целей заслуживающим внимание образом.

Таким образом, данное изобретение относится к новым способам обнаружения антибиотиков, содержащих -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения, включающим следующие стадии:

а) приведение определенного объема указанной биологической жидкости в контакт с некоторым количеством распознающего агента и термостатирование полученной при этом смеси в условиях, в которых возможно комплексообразование антибиотиков, которые могут присутствовать в указанной биологической жидкости, с распознающим агентом,

б) приведение смеси, полученной на стадии (а), в контакт с, по меньшей мере, одним эталонным антибиотиком, иммобилизованным на подложке, в условиях, которые делают возможным образование комплекса эталонного антибиотика с тем количеством распознающего агента, которое не прореагировало на стадии (а), и

в) определение количества распознающего агента, связанного с подложкой, характеризующееся тем, что распознающий агент представляет собой рецептор, чувствительный к антибиотикам, содержащим -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамное кольцо, полученный из Bacillus lichеniformis.

Фигура 1 иллюстрирует подложку, которую можно использовать согласно данному изобретению, в виде устройства для термостатирования (анализа), содержащего твердую подложку (1), к которой прикреплены мембраны (2), (3) и (4). На фигуре 1а представлен вид спереди, а на фигуре 1в дан продольный разрез устройства для термостатирования.

Необычное осуществление способа по данному изобретению основано на использовании специфического распознающего агента, который представляет собой рецептор, чувствительный к антибиотикам, имеющим -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамный цикл, полученный из Bacillus licheniformis. т.е. белок B1aR, выделение и аминокислотная (пептидная) последовательность которого описаны в статье Y. Zhu et al., J. Bacteriol., 1137-1141, (1990), или BlaR-CTD-полипептид, представляющий собой карбоксильную концевую область BlaR, выделение и аминокислотная (пептидная) последовательность которого описаны в В. Joris et a1., FEMS Microbiology Letters, 107-114, (1990).

Применение рецепторов BlaR и B1aR-CTD по данному изобретению для обнаружения антибиотиков, содержащих -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамные циклы, имеет заметное преимущество перед используемыми до настоящего времени распознающими агентами. Это объясняется тем, что рецепторы BlaR и BlaR-CTD способны очень быстро образовывать комплексы с очень большим числом молекул антибиотиков и делать это за более короткое время термостатирования, чем требуется для известных распознающих агентов, таких, например, как рецепторы, полученные из Bacillus stearothermophilus.

В качестве примеров антибиотиков, которые можно определять в соответствии со способами по данному изобретению, можно указать следующие антибиотики: бензилпенициллин (или пенициллин G), ампициллин, амоксициллин, карбенициллин, метилциллин, клоксациллин, 6-АРА, монолактам, азтреонам, мециллинам, цефалексин, цефалоглицин, цефалоридин, нитроцефин, цефатоксим, цефуороксим, цефтиофур, цефапирин, 7-АСА. Более конкретно, способы по данному изобретению позволяют обнаруживать все антибиотики, контролируемые властями США и Европы, вплоть до допустимого уровня.

Способы по данному изобретению позволяют обнаруживать антибиотики, содержащие -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамный цикл, в жидкостях биологического происхождения, таких как молоко, моча, кровь, сыворотка, слюна, мясные экстракты, ферментационные жидкости или забуференные водные среды.

В соответствии с предпочтительным вариантом способа по изобретению распознающий агент применяют в форме, объединяющей его с меткой. Эта метка может иметь различную природу. Метка может быть в виде частиц, как, например, коллоидные частицы металлов (платины, золота, серебра и т.д.), коллоидные частицы селена, угля, серы или же коллоидные частицы окрашенных синтетических латексов. Метка также может быть флуоресцентным веществом, таким как активированный флуоресцеин (выпускаемый Boeringher-Mannheim Biochemica), флуоресцеинизоцианат, родамин-тетраметилизоцианат или любое другое флуоресцентное вещество, известное опытному специалисту. Метка также может быть ферментной, например, -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамаза, пероксидаза, фосфатаза и т.д. В этом случае рецепторы B1aR и B1aR-CTD химически или генетически связаны с этой ферментной меткой, образуя слитый белок.

Распознающий агент может соединяться с меткой обычными способами, известными опытным специалистам в данной области техники. Распознающий агент может либо непосредственно соединяться с меткой, либо с образованием промежуточного комплекса. Связь между распознающим агентом и меткой может возникать в различные периоды в ходе осуществления способа по изобретению. Согласно первому варианту способа связь между распознающим агентом и меткой возникает перед тем, как распознающий агент вступает в контакт с анализируемой биологической жидкостью. Согласно другим вариантам способа по изобретению связь между распознающим агентом и меткой может образовываться во время или после того, как распознающий агент вступает в контакт с образцом биологической жидкости. Предпочтительно, когда мочение распознающего агента происходит до того, как распознающий агент вступает в контакт с анализируемым образцом.

Первая стадия (а) способа по изобретению заключается в приведении в контакт заранее установленного объема биологической жидкости с некоторым количеством распознающего агента и термостатировании полученной смеси в условиях, в которых возможно образование комплекса между антибиотиками, возможно присутствующими в биологической жидкости, и распознающим агентом.

Биологическую жидкость (жидкость биологического происхождения) термостатируют с рецептором B1aR или B1aR-CTD в интервале температур от 4 до 60^oС. Предпочтительно, чтобы температура была 47^oС. Повышение температуры термостатирования уменьшает его продолжительность, и наоборот. Таким образом, всегда возможно уменьшить продолжительность процесса, повышая температуру.

На второй стадии (б) способа по данному изобретению смесь, полученную на стадии (а), приводят в контакт с, по меньшей мере, одним перечисленным антибиотиком, иммобилизованным на подложке.

Подложки, которые можно применять по данному изобретению, могут быть совершенно различными. Это могут быть твердые подложки, такие как трубки, пластины или стержни, покрытые препаратом указанных антибиотиков. Это может быть аналитическое устройство в виде твердой подложки (пластины), к которой прикреплены мембраны, причем в определенной зоне для детектирования (обнаружения) помещены одно или более улавливающих веществ. Это могут быть подложки в виде магнитных или немагнитных гранул (агароза, полистирол и т.д. ), способных образовывать гель и на которых иммобилизуется указанный антибиотик.

Один из перечисленных антибиотиков может иммобилизовываться на подложке хорошо известными специалистам в данной области техники способами, например ковалентной или нековалентной абсорбцией на подложке, при необходимости с помощью спейсера.

Согласно конкретному варианту способа по изобретению стадии (а) и (б) можно проводить одновременно.

Стадия (в) способа по данному изобретению заключается в определении количества рецепторов, закрепленных на подложке, на которой иммобилизован один из перечисленных антибиотиков. Способ, применяемый для этого определения, непосредственно связан с видом используемой метки. Если метка является ферментом, стадия определения включает реакцию, специфическую для фермента, которая дает, например, данное окрашивание. Если метка является флуоресцентным веществом, определение осуществляют, просто измеряя флуоресценцию подложки. В случае металлических частиц или окрашенных латексов наличие рецепторов, закрепленных на подложке, видно по окрашиванию, интенсивность которого прямо пропорциональна числу рецепторов, закрепленных на подложке. Вне зависимости от вида используемой метки интенсивность определяемого сигнала обратно пропорциональна количеству антибиотика в исследуемом образце.

Данное изобретение также относится к наборам для термостатирования (анализа), предназначенным для определения антибиотиков в жидкости биологического происхождения, содержащим, по меньшей мере, один распознающий агент, который включает рецептор, чувствительный к антибиотикам с -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамным циклом в молекуле, полученным из Bacillus licheniformis, и, по меньшей мере, один перечисленный антибиотик, иммобилизованный на подложке.

Следующие примеры иллюстрируют различные аспекты и способы осуществления данного изобретения, не ограничивая, однако, его объем.

ПРИМЕР 1. Определение антибиотиков, содержащих -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамный цикл, в молоке.

Данный пример иллюстрирует определение в молоке антибиотиков, содержащих -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамиый цикл, которые контролируются органами здравоохранения. В тесте, описанном в данном примере, используют рецептор B1aR-CTD, нанесенный на золотые шарики (гранулы), служащие метками, и подложку в виде аналитического устройства, представляющего собой твердую пластину (подложку), к которой прикреплены мембраны.

1.1. Нанесение BlaR-CTD на золотые гранулы (шарики)

1.1.1. Биотинилирование BlaR-CTD

Берут 3,79 мл раствора распознающего агента BlaR-CTD с концентрацией 6,6 мг/мл в натрий-фосфатном буфере, 20 мМ рН 7. Затем к этому раствору BlaR-CTD добавляют 41,71 мл бикарбонатного буфера (0,1 М бикарбоната натрия, рН 9) и 2 мл раствора эфира N-гидроксисукцинимида и 6-(биотинамидо)капроновой кислоты, также содержащего 2,23 мг/мл бикарбонатного буфера. Этот раствор осторожно перемешивают с помощью мешалки LABINCO для пробирок, имеющей ось вращения (выпускаемой VEL, Бельгия), со скоростью 2 оборота/мин в течение 2 часов при комнатной температуре и в темноте. 2,5 мл раствора буфера Tris, 1 М рН 8, термостатируют с реакционной смесью в тех же условиях в течение 30 минут. Полученный таким образом раствор подвергают диализу против буфера HNM (Hepes 100 мМ, рН 8, NаCl 100 мМ, MgCl₂ 50 мМ) в течение 24 часов.

Таким способом получают биотинилированный раствор BlaR-CTD, который разбавляют буфером HNM-BSA (Hepes 500 мМ, рН 8, NаCl 500 мМ, MgCL₂ 250 мМ, BSA - альбумин бычьей сыворотки - 10 мг/мл) до концентрации 250 мг биотинилированного BlaR-CTD на мл буфера. Этот раствор хранят при -20^oС.

1.1.2. Агент для мечения (метка)

В качестве метки применяют частицы золота с диаметром 40 нм, на которые нанесено (осадок) антитело козы против биотина в виде суспензий в 2 мМ водном растворе тетрабората натрия, рН 7,2, стабилизированных 0,1% азида натрия (выпускается British Biocell (Ret. GAB40)). Оптическая плотность таких суспензий при 520 нм равна примерно 10, а концентрация белка составляет около 24 мг/мл.

1.1.3. Нанесение (введение) биотинилированного BlaR-CTD на частицы золота

Раствор биотинилированного BlaR-CTD, приготовленный в Примере 3.1.1, разбавляют в 114,7 раз буфером НNM-BSA (Hepes 500 мМ, рН 8, NaCl 500 мМ, MgC₂ 250 мМ, BSA 10 мг/мл). При комнатной температуре смешивают 22,5 объемных частей этого разбавленного биотинилированного раствора BlaR-CTD, 7,5 объемных частей буфера НNM-BSA, 9,27 объемных частей суспензии частиц золота, применяемых для мечения биотинилированного BlaR-CTD, и 6 объемных частей указанной суспензии частиц золота (см. ниже Пример 3.1.4).

1.1.4. Отдельный эталон

В данном тесте используется отдельный эталон, дающий полосу, интенсивность которой позволяет быстро количественно определить антибиотик в образце.

Для этой цели используют частицы золота размером 40 нм, на которых осаждено антитело козы к кроличьему иммуноглобулину. Такие частицы выпускает British Biocell (Ref. GAB40) в виде суспензий в 2 мМ водном растворе тетрабората натрия с рН 7,2, стабилизированных 0,1% азида натрия. Оптическая плотность этих суспензий при 520 нМ равна, примерно, 3, а концентрация белка около 6 мг/мл.

1.2. Аналитическое устройство

Аналитическое устройство представляет собой твердую панель (1), которая имеет первый и второй конец, к которым прикреплены последовательно, начиная с первого конца,

- мембрана (2) для очистки анализируемой жидкости,

- мембрана (3), на которой иммобилизованы два улавливающие вещества (нужный антибиотик и вещество, способное связывать независимый (отдельный) эталон), и

- абсорбирующая мембрана (4).

1.2.1. Сборка аналитических устройств

Прежде всего с помощью ламинатора типа ламинатора Clamshell (выпускаемого BioDot, Inc.) собирают пластины (карты) размером 300-лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213006/8226.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">76,2 мм следующим образом.

Отрезают пластиковую прямоугольную подложку типа АrСаrе 8565 (выпускаемую Adhesive Research) размером 300-лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213006/8226.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">76,2 мм (твердая подложка (1)). Затем прямоугольную мембрану Leukosorb LK4 (выпускается Pall Gelman Sciences) размером 300-лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213006/8226.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">20 мм (мембрана (2)), прямоугольную мембрану Hi-Flow SX (выпускаемую Millipore) размером 300-лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213006/8226.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">25 мм (мембрана (3)), прямоугольник 3 мм-вой целлюлозной мембраны размером 300-лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213006/8226.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">40 мм (мембрана (4)).

Затем мембраны (2) и (4), затем (3) помещают в определенном положении нижней полуформы ламинатора. Твердую пластину (1), покрытую адгезивом, в свою очередь помещают на верхнюю половину (формы) аппарата адгезивом наружу. Мембраны, помещенные на нижнюю полуформу, приводят в контакт с липкой подложкой, закрывая ламинатор; мембраны удерживаются точно на месте за счет откачивания воздуха вакуум-насосом. Когда вакуум убирают, извлекают панель, которая состоит из твердой подложки (1) с закрепленными на ней мембранами (2), (3) и (4).

Затем осуществляют осаждение на мембране (3) следующих растворов: проксимальная (ближняя) сторона: первое улавливающее вещество; полоса No. 1; дистальная (дальняя) сторона: второе улавливающее вещество; полоса No. 2. Эти улавливающие вещества осаждают с помощью "Распределителя" типа X-Y Platform Biojet Quanti-3000 от Bio Dot Inc.

Осажденные растворы мгновенно упаривают, помещая всю пластину на одну минуту в сильный ток горячего воздуха при 60^oС.

Панели (пластины), полученные в результате сборки, разрезают на полосы с помощью ротационного устройства (выпускаемого BioDot, Kinematic или Akzo). Крайние полосы убирают, остальные полосы готовы к употреблению.

На чертеже показано такое аналитическое устройство.

Для хранения аналитические устройства помещают в светонепроницаемый, герметически запаянный контейнер в присутствии осушителя (Silgelac, France).

1.2.2. Первое улавливающее вещество. Эталонный антибиотик.

8 мл раствора, содержащего 213 мг человеческого гамма-глобулина (G4386, Sigma) и 8,6 мг гидрохлорида 2-иминотиолана (Aldrich, 33056-6) в натрийкарбонатном буфере (100 мМ, рН 9) термостатируют при 25^oС одни час.

Кроме того, 20 мл раствора, содержащего 119,8 мг цефалоспорина С и 54 мг 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата сульфосукцинимидила (sSMCC, 22322 Pierce) в натрийкарбонатном буфере (100 мМ, рН 9) термостатируют при 25^oС в течение одного часа.

Затем смешивают два вышеприготовленных раствора. рН образовавшегося раствора доводят до 7,1, добавляя 3 мл Na₂H₂PO₄ 500 мМ и раствор термостатируют при 25^oС в течение двух часов. Смесь, полученную после термостатнрования, трижды подвергают диализу против 1 литра натрийфосфатного буфера (10 мМ, рН 7,5). Образовавшийся раствор фильтруют через фильтр 0,22 мм, затем делят на аликвоты и замораживают при -20^oС до момента использования.

В момент использования аликвоты размораживают и перед осаждением на мембране к ним добавляют пищевой краситель так, чтобы показывать в любой момент точное положение осадка и характер отпечатка.

Первое улавливающее вещество позволяет фиксировать B1aR-CTD, прикрепленный к золотым частицам, присутствующий в избыточном количестве по сравнению с имеющимся в образце антибиотиком.

1.2.3. Второе улавливающее вещество. Вещество, способное фиксировать независимый эталон.

Для второго улавливающего вещества используют раствор кроличьего иммуноглобулина (Sigma I 5006) с концентрацией иммуноглобулина 0,5 мг/мл в 10 мМ натрийфосфатном буфере, рН 7,5, с 5 мг/мл человеческого гамма-глобулина. Это второе улавливающее вещество останавливает эталон по мере того, как жидкость движется по аналитическому устройству.

1.3. Определение антибиотиков в молоке

1.3.1. 3-х минутный тест - быстрый тест

Готовят 7 проб свежего молока, содержащего соответственно 0; 1; 2; 3; 4; 5 и 6 частей на миллиард пенициллина G. Затем каждый из этих растворов анализируют следующим образом.

Берут аликвоту пробы молока - 200 мкл - и 45,27 мкл раствора, приготовленного в Примере 1.1.3, и помещают в стеклянную колбу. Эту смесь термостатируют 1 минуту при 47^oС. Берут аналитическое устройство и помещают вертикально в стеклянной колбе так, чтобы первый конец аналитического устройства контактировал со смесью, а второй конец опирался о стенку стеклянной колбы. Смесь оставляют мигрировать по аналитическому устройству, термостатируя систему в течение 2 минут при 47^oС.

В Таблице 1 суммируются результаты, полученные для 7 испытуемых образцов. Величину интенсивности в пределах от 0 до 10 относят к определенным полосам, причем 10 обозначает самую интенсивную полосу, а 0 относится к наименее интенсивной полосе. По этой шкале величина 6 относится к полосе эталона. Интенсивность сигнала, наблюдаемого на 1 полосе (линии), обратно пропорциональна количеству пенициллина G в образце.

В этом примере, когда интенсивность первой полосы меньше интенсивности второй полосы, анализ (тест) считается положительным. Результаты, приведенные в Таблице 1, показывают, что этот тест позволяет обнаруживать менее 4 ч. на млрд пенициллина G в образце молока за 3 минуты.

В тех же условиях проводили также анализы других антибиотиков, содержащих b-лактамный цикл. Этот анализ, проводимый в течение 3 минут, позволяет определять содержание амоксициллина до 5 ч. на млрд, клоксациллина - до менее 10) ч. на млрд, диклоксациллина - до менее 20 ч. на млрд, оксациллина - до менее 20 ч. на млрд и цефапирина - до менее 20 ч. на млрд в пробе молока.

1.3.2. 5-минутный тест

Готовят 6 проб свежего молока, содержащих соответственно 0; 2; 4; 6; 8 и 10 ч. на миллиард клоксациллина. Каждый из этих растворов затем анализируют следующим образом.

Берут аликвоту пробы молока - 200 мкл - и 45,27 мкл раствора, приготовленного в Примере 1.1.3, и помещают в стеклянную колбу. Эту смесь термостатируют 3 минуты при 47^oС. Аналитическое устройство помещают вертикально в стеклянной колбе так, чтобы первый конец аналитического устройства контактировал со смесью, а второй конец опирался о стенку стеклянной колбы. Смесь оставляют подниматься (мигрировать) по аналитическому прибору, при этом всю систему термостатируют в течение 2 минут при 47^oС.

В Таблице 2, внизу, суммированы результаты, полученные для 6 анализируемых образцов. Величины интенсивности в интервале от 0 до 10 относятся к определяемой полосе, при этом 10 относится к наиболее интенсивной полосе, а 0 относится к наименее интенсивной полосе. По этой шкале величина 6 относится к полосе эталона. Интенсивность сигнала, наблюдаемого на 1 полосе (линии), обратно пропорциональна количеству клоксациллина в образце.

В этом примере, когда интенсивность первой полосы меньше интенсивности второй полосы, тест считается положительным. Результаты, приведенные в Таблице 2, показывают, что этот тест позволяет определять менее 4 ч. на млрд клоксациллина в молоке за 5 минут.

В тех же условиях проводили также анализы других антибиотиков, содержащих -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамный цикл. Этот анализ, проводящийся в течение 5 минут, позволяет определять до 3 ч. на млрд пенициллина G, до 4 ч. на млрд амоксициллина, до 8 ч. на млрд диклоксациллина, до 8 ч. на млрд оксациллина, до 16 ч. на млрд цефапирина, до 100 ч. на млрд цефтиофура, менее 20 ч. на млрд цефхинона, до 20 ч. на млрд нафциллина и до 60 ч. на млрд цефазолина в пробе молока.

Этот тест особенно пригоден в качестве сортировочного теста при разгрузке молочных фургонов в бункеры.

1.3.3. 9-минутный тест

Готовят 6 проб свежего молока, содержащих соответственно 0; 4; 6; 8; 10 и 12 ч. па миллиард цефапирина. Каждый из этих растворов затем анализируют следующим образом.

Берут аликвоту - 200 мкл пробы молока и 45,27 мкл раствора, приготовленного в Примере 1.1.3, и помещают в стеклянную колбу. Эту смесь термостатируют 7 минут при 47^oС. Аналитическое устройство помещают вертикально в стеклянной колбе так, чтобы первый конец аналитического устройства контактировал со смесью, а второй конец опирался о стенку стеклянной колбы. Смесь оставляют мигрировать по аналитическому устройству, при этом систему термостатируют в течение 2 минут при 47^oС.

В Таблице 3 суммированы результаты, полученные для 6 испытуемых образцов. Значения интенсивности в интервале от 0 до 10 относятся к определяемым полосам, причем 10 относится к наиболее интенсивной полосе, а 0 относится к наименее интенсивной полосе. По этой шкале значение 6 относится к полосе эталона. Интенсивность сигнала, относящегося к первой полосе, обратно пропорциональна количеству цефапирина в образце.

В этом примере, если первая полоса имеет интенсивность, меньшую чем интенсивность второй полосы, анализ считается положительным. Результаты, приведенные в Таблице 3, показывают, что этот тест позволяет определять до 6 ч. на млрд цефапирина в пробе молока за 9 минут.

В тех же условиях проводили тесты других антибиотиков, содержащих -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамный цикл. Этот 9-минутный тест позволяет обнаруживать до 3 ч. на млрд пенициллина G, до 4 ч. на млрд амоксициллина, до 4 ч. на млрд ампициллина, до 4 ч. на млрд клоксациллина, менее 8 ч. на млрд диклоксациллина, менее 8 ч. на млрд оксациллина, до 80 ч. на млрд цефтиофура, менее 20 ч. на млрд цефхинона, менее 20 ч. на млрд нафциллина и менее 45 ч. на млрд цефазолина в пробе молока.

Таким образом, этот проводимый за 9 минут тест позволяет обнаруживать все антибиотики, контролируемые Европейскими правительственными органами, вплоть до официальных норм, установленных этими органами.

1.3.4. 20-минутный тест

Готовят 6 проб свежего молока, содержащих соответственно 0; 20; 30; 40; 50 и 60 ч. на миллиард цефтиофура. Каждый из этих растворов затем анализируют следующим образом.

Аликвоту - 200 мкл пробы молока и 45,27 мкл раствора, приготовленного в Примере 1.1.3, помещают в стеклянную колбу. Эту смесь термостатируют 18 минут при 47^oС. Аналитическое устройство помещают вертикально в стеклянной колбе так, чтобы первый конец устройства соприкасался со смесью, а второй конец опирался о стенку стеклянной колбы. Смесь оставляют подниматься по аналитическому устройству, при этом систему термостатируют в течение 2 минут при 47^oС.

В таблице 4 суммированы результаты, полученные для 6 испытуемых образцов. Величины интенсивности в интервале от 0 до 10 относятся к определяемым полосам, причем значение 10 относится к наиболее интенсивной полосе, а 0 относится к наименее интенсивной полосе. По этой шкале значение 6 относится к полосе эталона. Интенсивность сигнала, относящегося к первой полосе, обратно пропорциональна количеству цефтиофура в образце.

В этом примере, если интенсивность первой полосы ниже интенсивности второй полосы, тест считается положительным. Результаты, представленные в Таблице 4, показывают, что этот тест позволяет обнаруживать цефтиофур в пробе молока в количествах до 30 ч. на млрд за 20 минут.

Этот 20-минутный тест позволяет, таким образом, обнаруживать в единственном тесте, все антибиотики, контролируемые в настоящее время властями США и Европы, вплоть до официальных норм, утвержденных ими.

ПРИМЕР 2. Определение 6 антибиотиков в молоке

Этот пример иллюстрирует обнаружение в молоке 6 антибиотиков, содержащих -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамный цикл, которые контролируются федеральными органами США. Тест, описанный в этом примере, использует рецептор B1aR-CTD в виде слитого белка с -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамазой и подложку в виде магнитных шариков (гранул).

2.1. Слитый белок BlaR-CTD--лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамаза

Слитый белок BlaR-CTD-b-лактамаза получают генетическим связыванием рецептора BlaR-CTD (В. Joris et al., FEMS Microbiology Letters, 107-114, (1990) с Zn b-лактамазой из Bacillus cereus (M. Hussain et al., 1985, J. Bact., 164:1, 223-229, 1985).

Связывание осуществляют следующим образом.

2.1.1. Конструкция плазмиды: осуществляют связывание 1/1 между генами BlaR-CTD-полипептида и b-лактамазой: ген, кодирующий -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамазу, вводят в фазе и за геном BlaR-CTD. Плазмида, образованная слиянием генов, проявляет устойчивость к канамицину. Слитый белок называется далее Fus 1.

2.1.2. Продуцирование

Штамм: плазмиду, несущую слитые гены, вводят в Е. Coli. Клоны с рекомбинантной плазмидой отбирают на LB + Km (50 мкг/мл).

Отбор: мечение клеточного экстракта радиоактивным антибиотиком с последующим электрофорезом на денатурирующем полиакриламидном геле показывает, что большая часть белка продуцируется в виде слитого белка с молекулярной массой около 50000. Однако при посттрансляционном расщеплении, по-видимому, очень малый процент (2%) этих молекул диссоциирует на две отдельные активности (активные формы).

Культивирование: 500 мл среды LB + Km (50 мкг/мл) инокулируют, используя рекомбинантные клетки, хранящиеся при -70^oС. "Прекультуру" термостатируют при 37^oС и перемешивают в течение ночи при 225 об/мин. 18 литров среды LB + Km (50 мкг/мл) инокулируют с помощью 500 мл этой культуры, оптическая плотность которой при 600 нм составляет 4. 18-литровая культура готова, когда оптическая плотность достигает значения 6.

2.1.3. Экстракция: сразу же после прекращения культивирования клетки отфильтровывают и центрифугируют. Надосадочную жидкость клеточного осадка, лизированного в дезинтеграторе, сохраняют. Она содержит слитый белок FUS1.

2.1.4. Очистка:

- Используемые буферы:

Буфер А: 20 мМ рН 8 Tris, 10% этиленгликоля, 50 мкм DTT;

Буфер В: буфер А + 1 М NaCl.

Слитый белок частично очищают ионной хроматографией и на молекулярных ситах. После осаждения экстракта и промывания на колонке QSFF (Pharmacia, Upsala) буфером А, FUS1 элюируют линейным градиентом буфера В. Затем активные фракции (-лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213029/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">0,25 М NaCl) объединяют и осаждают на молекулярных ситах G-100 (Pharmacia, Upsala); их элюируют буфером А. Среднюю специфическую активность выделенной порции оценивают в 30%.

2.1.5. Ингибирование b-лактамазы: слитый белок (9/10 объема) термостатируют с 50 мМ EDTA (1/10 объема) в течение 45 минут при 37^oС. Ингибирование проверяют, используя нитроцефин в 10 мМ какодилатном буфере рН 6,0. В присутствии или в отсутствие Zn сигнал должен быть соответственно положительным или отрицательным. После ингибирования эффективная концентрация, измеренная, исходя из активности -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамазы, составляет 7,74 пмол/мкл.

2.2. Твердая подложка: магнитные гранулы (шарики) - цефалоспорин С (эталонный антибиотик).

Используют частицы BioMag (выпускаемые DRG Instrument GmbH, Marburg, Germany под маркой AM 4100 В), NН₂-концы которых активированы глутаральдегидом следующим образом:

- один объем исходного раствора частиц BioMag 4100 промывают 4 раза 5-ю объемами 0,01 М рН 6,0 пиридинового буфера. Частицы в 2,5 объемах глутаральдегида в 5% пиридиновом буфере перемешивают при вращении в течение 3 часов при комнатной температуре. Затем их 10 раз промывают 2-мя объемами 0,01 М рН 7 буфера Kpi. Затем частицы снова суспендируют в 1 объеме 0,1 М цефалоспорина С в буфере Kpi и перемешивают при вращении в течение ночи при +4^oС. Заключительное отмывание проводят до полного исчезновения цефалоспорина С из 0,1 М буфера Kpi рН 7.

2.3. Определение в молоке 6 антибиотиков: пенициллина G, ампициллина, амоксициллина, клоксациллина, цефапирина и цефтиофура.

2.3.1. Используемые растворы:

- раствор 1:700 пикомолей слитого белка, лиофилизированного в 100 мМ, pН 8, Tris, 1 мг/мл BSA, 50 мМ EDTA, 50 мкм DTT, снова гидратируют 5 мл Milli-Q воды; для измерения требуется 50 мкл этого раствора.

- раствор 2: 2 мл частиц BioMag-цефалоспорин С, приготовленных в Примере 1.2, в 100% изопропаноле; для измерения требуется 20 мкл.

- раствор 3: 10 мМ, рН 6, какодилатного буфера, 1 М NаCl, лиофилизированный и регидратированный Milli-Q водой.

- раствор 4: 400 мл 10 мМ нитроцефина в ДМФА разбавляют до 40 мл раствором 3; для определения требуется 400 мкл.

2.3.2. Способ определения:

50 мкл раствора 1 в 500 мл проб разбавленного молока термостатируют при 47^oС в течение 2 минут. 20 мкл раствора 2 суспендируют в молоке, которое снова термостатируют 2 минуты при 47^oС. Парамагнитные частицы притягиваются к стенкам контейнера, когда надосадочную жидкость удаляют из пробирки. Частицы дважды промывают раствором 3, осуществляя тот же процесс с магнитом. Под конец 400 мкл раствора 4 термостатируют 3 минуты при 47^oС в присутствии частиц. Затем измеряют поглощение оставшегося раствора при 482 нм относительно раствора нитроцефина.

Этот способ позволяет определять 6 антибиотиков, для которых имеются нормы США, в концентрациях ниже установленных стандартов, т.е. 5 ч. на млрд пенициллина, 10 ч. на млрд ампициллина, 10 ч. на млрд амоксициллина, 10 ч. на млрд клоксациллина, 20 ч. на млрд цефапирина и 50 ч. на млрд цефтиофура.

ПРИМЕР 3. Определение 3 антибиотиков (пенициллина G, клоксациллина, цефтиофура) в молоке.

Данный пример иллюстрирует определение в молоке 3 антибиотиков, содержащих -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамный цикл, которые контролируются органами здравоохранения. Тест, описанный в этом примере, использует рецептор B1aR-CTD в виде двух слитых белков соответственно со щелочной фосфатазой и пероксидазой и подложку в виде микропланшета.

3.1. Слитый белок BlaR-CTD-щелочная фосфатаза.

Слитый белок BlaR-CTD-щелочная фосфатаза получают, химически связывая рецептор B1aR-CTD (В. Joris et al., FEMS Microbiology Letters, 107-114, (1990)) и активированную щелочную фосфатазу, выпускаемую Boehringer-Mannheim Biochemica под номером 1464752.

Связывание проводят следующим образом.

3.1.1. Конъюгация: осуществляют диализ B1aR-CTD и щелочной фосфатазы в 100 мМ буфера карбонат/бикарбонат натрия при рН 9,8. 15 наномолей B1aR-CTD термостатируют в присутствии 100 мкл активированной щелочной фосфатазы (20 мг/мл) в течение 2 часов при 25^oС.

3.1.2. Прекращение реакции: добавляют 40 мкл 2 мМ раствора триэтаноламина, рН 8, а затем 50 мкл 200 мМ раствора натрийборгидрида. Смесь 30 минут термостатируют при +4^oС. Затем добавляют 25 мкл 2 мМ раствора триэтаноламина, рН 8, после чего смесь снова термостатируют 2 часа при +4^oС.

3.1.3. Стабилизация связывания: добавляют 10 мкл 1 М раствора глицина, рН 7,0.

3.1.4. Перенос в буфер для хранения: 8 часов трижды проводят диализ реакционной смеси (около 300 мкл) против 0,5 литра 50 мМ буфера триэтаноламина, рМ 7,6, 150 мМ NаCl, 1 мМ MgCl₂, 0,5 мМ ZnCl₂, 10 мМ глицина при +4^oС.

3.1.5. Конечный титр: конечный титр связывания составляет 50 пмолей активного B1aR-CTD на мкл раствора.

3.2. Слитый белок BlaR-CTD-пероксидаза.

Слитый белок BlaR-CTD-пероксидаза получают, химически связывая рецептор BlaR-CTD (В. Joris et al., FEMS Microbiology Letters, 107-114, (1990)) и активированную пероксидазу, выпускаемую Boehringer-Mannheim Biochemica под индексом 1428861.

Связывание осуществляют следующим образом:

3.2.1. Конъюгация: диализ BlaR-CTD и пероксидазы проводят в 100 мМ буфере карбонат/бикарбонат натрия, рН 9,8. 40 наномолей BlaR-CTD термостатируют в присутствии 100 мкл активированной пероксидазы (16 мг/мл) в течение 2 часов при 25^oС.

3.2.2. Прекращение реакции: добавляют 40 мкл 2 мМ раствора триэтаноламина, рН 8, затем 50 мкл 200 мМ раствора натрийборгидрида. Смесь термостатируют 30 минут при +4^oС. Затем добавляют 25 мкл 2 мМ раствора триэтаноламина, рН 8, после чего смесь снова термостатируют 2 часа при +4^oС.

3.2.3. Стабилизация связывания: добавляют 10 мкл 1 М раствора глицина, рН 7.

3.2.4. Перенос в буфер для хранения: проводят трижды 8 часов диализ реакционной смеси (около 400 мкл) против 0,5 литра 10 мМ калийфосфатного буфера, рН 7,5, 200 мМ NaCl, 10 мМ глицина при +4^oС.

3.2.5. Конечный титр: конечный титр связывания составляет около 100 пмолей активного BlaR-CTD на мкл раствора.

3.3. Твердая подложка: микропланшет-цефалоспорин С.

3.3.1. Приготовление эталонного раствора антибиотика.

8 мл раствора, содержащего 213 мг человеческого гамма-глобулина (G4386, Sigma) и 8,6 мг гидрохлорида 2-иминотиолана (Aldrich, 33056-6) в натрийкарбонатном буфере (100 мМ, рН 9) термостатируют один час при 25^oС.

Отдельно 20 мл раствора, содержащего 119,8 мг цефалоспорина С и 54 мг 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1- карбоксилата сульфосукцинимидила (sSMCC, 22322 Pierce) в натрийкарбонатном буфере (100 мМ, рН 9) термостатируют один час при 25^oС.

Затем смешивают два вышеприготовленных раствора. рН полученного раствора доводят до 7,1, добавляя 3 мл 500 мМ Na₂H₂PO₄, и смесь термостатируют 2 часа при 25^oС. Смесь после термостатирования трижды подвергают диализу против 1 литра патрийфосфатного буфера (10 мМ, рН 7,5). Полученный раствор фильтруют через фильтр 0,22 мкм.

3.3.2. Покрытие микропланшетов эталонным антибиотиком.

Используют микропланшеты из полистирола марки NUNK (Immuno Plate: типа Maxisorp) или марки GREINER (microlon 600, индекс 705071) с высокой адсорбционной способностью по отношению к белку. Кюветы микропланшетов промывают 150 мМ РВS-буфером, рН 7,2. Затем аликвоту раствора, приготовленного в Примере 3.3.1, термостатируют 24 часа при ^oС в кюветах. После термостатирования кюветы отмывают трижды 150 мМ буфером PBS, рН 7,2, 0,1% Tween-20. Затем пробирку насыщают в течение двух часов при 20^oС 150 мМ PBS-буфером для насыщения, рН 7,2, 5% BSA. После трехкратного отмывания буфером для промывки пробирки сушат и хранят при 4^oС в сухом месте.

Для кювет, предназначенных для распознающего агента BlaR-CTD-щелочная фосфатаза, в качестве буфера для промывки используют 1 М диэтаноламин, рН 9,8, 0,5 мМ MgCl₂; в качестве буфера для промывки кювет, предназначенных для распознающего агента BlaR-CTD-пероксидаза, используют 50 мМ фосфат калия, pН 5.

3.4. Определение трех антибиотиков в молоке.

1,4 пикомоля меченого распознающего агента термостатируют в присутствии 100 мкл разбавленного молока в течение 5 минут при 47^oС. Молоко пипеткой переносят в кювету, предварительно обработанную, как указано в Примере 2.3. Затем молоко термостатируют 2 минуты при 47^oС. После удаления молока два раза промывают буфером для промывки (см. Пример 2.3.2.), 300 мкл буфера, содержащего субстрат для обнаружения (проявляющий субстрат), термостатируют 2 минуты в кювете (проявляющий субстрат для распознающего агента BlaR-CTD-пероксидаза: 50 мМ фосфат калия, рН 5, 9,1 мМ ABTS, 0,002% Н₂О₂; проявляющий субстрат для распознающего агента BlaR-CTD-щелочная фосфатаза: 1 М диэтаноламин, рН 9,8, 0,5 мМ MgCl₂, 10 мМ 4-NPP). Затем планшет помещают в автоматический спектрофотометр для планшетов ELISA, устанавливая длину волны 405 нм.

Этот тест позволяет определять наличие трех антибиотиков - пенициллина G, клоксациллина и цефтиофура - в контрольных пороговых концентрациях, требуемых федеральными властями США (пенициллин G - 5 ч. на млрд, клоксациллин - 10 ч. на млрд и цефтиофур - 50 ч. на млрд).

ПРИМЕР 4. Определение в молоке 6 антибиотиков: пенициллина G, ампициллина, амоксициллина, клоксациллина, цефапирина и цефтиофура.

Этот пример иллюстрирует обнаружение в молоке б антибиотиков, содержащих -лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения и аналитический набор для его осуществления, патент № 2213973" SRC="/images/patents/255/2213011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамный цикл, которые контролируются федеральными органами США, вплоть до норм, установленных этими органами в настоящее время. Тест, описанный в этом примере, использует рецептор BlaR-CTD в форме слитого белка со щелочной фосфатазой или пероксидазой, а подложку в виде пробирки с покрытием.

4.1. Слитый белок BlaR-CTD-щелочная фосфатаза.

См. Пример 3.1.

4.2. Твердая подложка: пробирка с нанесенным на нее эталонным антибиотиком.

В этом примере используют пробирки из полистирола марки NUNK (типа Maxisorp) с высокой адсорбирующей способностью по отношению к белку, которые обрабатывают раствором эталонного антибиотика, как указано в Примере 3.3.2.

4.3. Определение 6 антибиотиков в молоке.

7 пикомолей распознающего агента термостатируют в присутствии 500 мкл молока в течение 5 минут при 47^oС в пробирке Эппендорфа. Затем молоко пипеткой переносят в пробирку, обработанную, как описано в Примере 3.2. Затем молоко термостатируют 2 минуты при 47^oС. После удаления молока пробирку дважды отмывают 1 мл 1М буфера диэтаноламина, рН 9,8, 0,5 мМ MgCl₂. Затем добавляют 500 мкл буфера, содержащего 1 М диэтаноламина, рН 9,8, 0,5 мМ MgCl₂, 10 мМ 4-NРР-проявляющего субстрата и субстрат термостатируют 2 минуты при 47^oС. Поглощение надосадочной жидкости определяют с помощью спектрофотометра при длине волны 405 нм.

Этот способ позволяет определять 6 антибиотиков в количествах, соответствующих нормам, установленным федеральными властями США: пенициллин G в количествах менее 5 ч. на млрд; ампициллин в количествах менее 10 ч. на млрд; амоксициллин в количествах менее 10 ч. на млрд; клоксациллин в количествах менее 10 ч. на млрд; цефапирин в количествах менее 20 ч. на млрд; цефтиофур в количествах менее 50 ч. на млрд.