иммуногенная композиция, содержащая химерный полипептид вич, полипептиды и тест-система для обнаружения антител к вич

Формула изобретения

1. Иммуногенная композиция, содержащая химерный полипептид ВИЧ, характеризующаяся тем, что она представляет собой полноразмерный белок р24, слитый с иммунодоминантным фрагментом gp41, содержащим аминокислоты участка 575-616 или выбранные из него (гес 24-41), или слитый с иммунодоминантным фрагментом gp36, содержащим аминокислоты участка 575-616 или выбранные из него (гес 24-36), и фармакологически пригодный носитель и/или разбавитель.

2. Способ индукции иммунного ответа к ВИЧ1 или ВИЧ1/2 у млекопитающих, характеризующийся тем, что млекопитающим вводят иммуногенную композицию по п. 1, при этом для индукции иммунного ответа к ВИЧ1 млекопитающим вводят иммуногенную композицию, представляющую собой полноразмерный белок р24, слитый с иммунодоминантным фрагментом gp41, содержащим аминокислоты участка 575-616 или выбранные из него (гес 24-41), а для индукции иммунного ответа к ВИЧ1/2 млекопитающим вводят иммуногенную композицию, представляющую собой полноразмерный белок р24, слитый с иммунодоминантным фрагментом gp36, содержащим аминокислоты участка 575-616 или выбранные из него (гес 24-36).

3. Химерный полипептид ВИЧ, характеризующийся тем, что в случае ВИЧ1 он представляет собой полноразмерный белок р24, слитый с иммунодоминантным фрагментом gp41, содержащим аминокислоты участка 575-616 или выбранные из него (гес 24-41), а в случае ВИЧ1/2 он представляет собой полноразмерный белок р24, слитый с иммунодоминантным фрагментом gp36, содержащим аминокислоты участка 575-616 или выбранные из него (гес 24-36).

4. Химерный полипептид ВИЧ по п.3, отличающийся тем, что иммунодоминантный фрагмент gp41 имеет следующие аминокислотные последовательности: SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3.

5. Химерный полипептид ВИЧ по п.3, отличающийся тем, что иммунодоминантный фрагмент gp36 имеет следующие аминокислотные последовательности: SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5; SEQIDNO:6.

6. Молекула ДНК, кодирующая химерный полипептид ВИЧ по п.3, представляющая собой последовательность оснований SEQ ID NO:7 для химерного полипептида ВИЧ1 (гес 24-41) и SEQ ID NO:8 для химерного полипептида ВИЧ1/2 (гес 24-36).

7. Плазмидный вектор, пригодный для экспрессии в клетках Е.coli и содержащий молекулу ДНК по п.6.

8. Плазмидный вектор по п.7, отличающийся тем, что для экспрессии химерного полипептида ВИЧ1 (гес 24-41) он представляет собой плазмиду рЕТ15b, в которую вставлены по сайту рестрикции Barn H1 фрагмент ДНК SEQ ID NO:7, а по сайтам рестрикции Hind III - Eco R1 вставлен par-локус.

9. Плазмидный вектор по п.7, отличающийся тем, что для экспрессии химерного полипептида ВИЧ1/2 (гес 24-36) он представляет собой плазмиду рЕТ15b, в которую вставлены по сайту рестрикции Ваm H1 фрагмент ДНК SEQ ID NO:8, а по сайтам рестрикции Hind III-Eco R1 вставлен par-локус.

10. Поликлональные антитела к ВИЧ1 или ВИЧ1/2, представляющие собой иммуноглобулины класса IgG 2a, полученные при иммунизации химерным полипептидом по п.3 с титром не менее 30000 к фрагменту gp41 и gp36 и титром не менее 200000 к р24 в непрямом ИФА.

11. Тест-система для обнаружения антител к ВИЧ1 и ВИЧ2, включающая антигены ВИЧ, сорбированные на твердой подложке, и детектирующий реагент, отличающаяся тем, что в качестве антигенов она содержит химерные полипептиды по п. 3, при этом антиген ВИЧ1 представляет собой полноразмерный белок р24, слитый с иммунодоминантным фрагментом gp41, содержащим аминокислоты участка 575-616 или выбранные из него (гес 24-41), а антиген ВИЧ1/2 представляет собой полноразмерный белок р24, слитый с иммунодоминантным фрагментом gp36, содержащим аминокислоты участка 575-616 или выбранные из него (гес 24-36).

12. Тест-система по п.11, отличающаяся тем, что в качестве детектирующего реагента используют конъюгат антивидовых антител с пероксидазой хрена.

13. Тест-система по п.11, отличающаяся тем, что в качестве детектирующего реагента используют конъюгат антивидовых антител со щелочной фосфатазой.

14. Тест-система по п. 11, отличающаяся тем, что в качестве детектирующего реагента используют конъюгат А-белка St.aureus с пероксидазой хрена.

15. Тест-система по п. 11, отличающаяся тем, что в качестве детектирующего реагента используют конъюгат антивидовых антител с коллоидным углеродом.

16. Тест-система по п. 11, отличающаяся тем, что в качестве детектирующего реагента используют конъюгат А-белка St.aureus с коллоидным углеродом.

17. Тест-система по п. 11, отличающаяся тем, что в качестве детектирующего реагента используют химерные полипептиды по п.3, конъюгированные с пероксидазой хрена.

18. Тест-система по п.11, отличающаяся тем, в качестве детектирующего реагента используют химерные полипептиды по п.3, конъюгированные с коллоидным углеродом.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и касается иммуногенной композиции, содержащей химерный полипептид ВИЧ, способа индукции иммунного ответа к ВИЧ1 или к ВИЧ1/2, химерного полипептида ВИЧ1 и ВИЧ1/2, полученного рекомбинантным методом, молекулы ДНК, кодирующей химерный полипептид, плазмидного вектора для экспрессии химерного полипептида, поликлональных антител к ВИЧ1 или ВИЧ1/2 и тест-системы для обнаружения антител к ВИЧ1 и ВИЧ2.

Известно, что антитела к белкам, кодируемым геном GAG, являются ранним маркером инфекции ВИЧ, при этом антитела к белку р24 первыми появляются в сыворотке крови в процессе сероконверсии [1], а их уровень коррелирует с состоянием инфицированного человека (падает при появлении симптомов заболевания СПИД) [2, 3] и поэтому является прогностическим маркером инфекции ВИЧ. С другой стороны, именно GAG-белки довольно консервативны и, следовательно, позволяют выявлять антитела против различных субтипов ВИЧ. Поэтому белок р24 представляет особенный интерес при разработке вакцинных и диагностических препаратов.

Антигены, кодируемые геном ENV-gp41 ВИЧ1 и gp36 ВИЧ2, являются вирусными трансмембранными гликопротеинами. Для белков, кодируемых геном ENV, известна короткая иммунодоминантная последовательность (около 40 аминокислот), способная обеспечить распознавание более 90% ВИЧ-положительных образцов (содержащих антитела к ВИЧ). Наоборот, олигопептиды, воспроизводящие короткие последовательности белков, кодируемых геном GAG, узнают не более 50% позитивных сывороток [4] . Приемлемую иммунореактивность проявляют только протяженные белки [5].

Методы генной инженерии позволяют получать промышленные количества этих белков. Однако белки, экспрессируемые в системе Е. coli, не подвергаются посттрансляционной модификации, которая присуща белкам ВИЧ, образующимся в ходе инфекции, и, таким образом, иммунологические характеристики рекомбинантных белков могут несколько отличаться от свойств вирусных белков.

Известны тест-системы на основе рекомбинантных белков, в которых в составе одной тест-системы используется смесь антигенов, куда входят как протяженные антигены, слитые с белком-носителем (например, с бета-галактозидазой, глутатионтрансферазой и т.д. [6]), так и короткие фрагменты, слитые с белком-носителем. Однако белки, входящие в состав смеси, различаются по физико-химическим свойствам, что осложняет этапы экспрессии и очистки и ведет к удорожанию этих продуктов. Еще более важно то, что различие физико-химических свойств антигенов ведет к их неравномерной сорбции на твердую фазу из смеси белков, что вызывает снижение чувствительности и специфичности теста. Вышеуказанные недостатки можно преодолеть с помощью химерных структур, куда входит набор актуальных антигенных детерминант.

Первые конструкции без белка-носителя, кодирующие фрагменты р24 и иммунодоминантный участок gp41, были описаны в патентах США 5204259 и 5470720 и представлены химерньм рекомбинантным полипептидом, растворимым в водных растворах. На основе различных вариантов этих конструкций описаны диагностические системы для ИФА. В первом патенте описан ДНК-сегмент, кодирующий рекомбинантный ВИЧ р24 белок и ВИЧ p24-gp41 слитый белок, причем молекула ДНК способна экспрессировать оба этих белка. Описаны также клетки, трансформированные рекомбинантной ДНК, и метод получения слитого белка, а также диагностические системы с использованием слитого белка. В описании представлены аминокислотные последовательности, кодируемые этим сегментом ДНК, при этом слитый белок применяется для обнаружения антител против р24 или против gp41 ВИЧ1, преимущественно в ИФА. Во втором патенте описаны 4 разных химерных полипептида. При этом белок р24 разорван на длинную N-концевую часть (1-225 по нумерации авторов) и короткую С-концевую часть из 7 аминокислот, а между этими частями вставлен иммунореактивный фрагмент из gp41 и/или gp36 длиной от 15 до 20 аминокислот, но не более 35. Схема строения описанного химерного белка может быть представлена следующим образом: 1) (фрагмент р24 - фрагмент gp41 - фрагмент р24), 2) (фрагмент р24 - фрагмент gp36 - фрагмент р24), 3) (фрагмент р24 - фрагмент gp41 - фрагмент gp36 - фрагмент gp41 - фрагмент - gp41 - фрагмент р24), 4) (фрагмент р24 - фрагмент gp41 - фрагмент gp36 - фрагмент р24). В патенте также представлена структура ДНК-сегмента, кодирующего химерные полипептиды, а также рекомбинантная молекула ДНК, способная экспрессировать химерный полипептид в клетках Е. coli. Также описана ИФА диагностическая тест-система на основе химерных полипептидов, сорбированных на твердой подложке.

В патенте ЕР 0307149 описан твердофазный иммуноферментный анализ для определения антител против р24 и антител против gp41 ВИЧ1, основанный на использовании химерного белка, состоящего из аминокислотной последовательности GAG 121-356 и ENV последовательности, соответствующей аминокислотным остаткам 542-674 (нумерация по [7]). Химерный белок состоит из 379 аминокислот, процесс экспрессии рекомбинантного белка включает трансформацию хозяйских клеток, предпочтительно Е. coli, вектором, который включает ген, кодирующий указанный белок, и который в хозяйских клетках экспрессирует указанный белок, культивирование клеток и выделение белка. Однако ни в одном из указанных патентов химерные белки не использовались и не обсуждались для использования в вакцинных препаратах.

Описана [5] диагностическая система на основе рекомбинантных антигенов, копирующих ВИЧ1-специфические последовательности gp41 (аминокислоты 584-615, по нумерации авторов) и р24 (аминокислоты 78-437, по нумерации авторов) и ВИЧ2-специфическую последовательность gp36. Однако белок, описанный авторами статьи как рекомбинантный р24, фактически представляет собой длинный фрагмент предшественника ядерных (core) белков ВИЧ1-р55, куда входят фрагмент р17, полный р24 и фрагмент р15, и используется в составе смеси с рекомбинантным gp41, а не в виде химерного белка, а последовательность gp36 не приведена.

Описанные работы касаются слитых белков р24 с gp41, которые эффективно применяются в диагностических тест-системах. Использование слитых белков в качестве вакцинных препаратов не описано.

Описан новый иммуноген ВИЧ1, представляющий собой рекомбинантный водорастворимый химерный полипептид, содержащий фрагменты структурных белков ВИЧ1. Генная конструкция кодирует весь внутренний белок р24 и иммуногенный фрагмент gp41. Экспрессируемый химерный белок, очищенный до 99,99% гомогенности, дает сильный иммунный ответ на р24 ВИЧ1 с титром более 100 000 в ИФА [8, 9]. Авторы предлагают использовать указанный белок в качестве кандидатной вакцины. Однако в указанных материалах не приводится строение химерного полипептида.

В связи с вышеизложенным, целью данного изобретения является создание таких химерных белков p24-gp41 и p24-gp36, которые успешно могут применяться не только для диагностики, но и в качестве вакцинного препарата.

Задача данного изобретения заключается в разработке генной конструкции, экспрессирующей в клетках прокариот химерный рекомбинантный белок, содержащий в составе одной полипептидной цепи полноразмерный полипептид, конформационно близкий к вирусному белку р24, и иммунодоминантный фрагмент белка оболочки ВИЧ1 или ВИЧ2, и представляющий собой слитый белок, содержащий на N-конце полноразмерный р24, а на С-конце - иммунодоминантный фрагмент gp41 или gp36, и создание на базе полученных белков иммуногенной композиции, способной индуцировать сильный иммунный ответ у млекопитающих, а также высокоэффективной диагностической тест-системы для определения антител против ВИЧ1 и/или ВИЧ2.

Сущность данного изобретения включает: иммуногенную композицию, содержащую химерный полипептид ВИЧ, способ индукции иммунного ответа к ВИЧ1 или к ВИЧ1/2, молекулу ДНК, кодирующую химерный полипептид ВИЧ1 или ВИЧ1/2, плазмидный вектор для экспрессии в клетках прокариот химербного полипептида ВИЧ1 или ВИЧ 1/2, поликлональные антитела к ВИЧ1 или к ВИЧ 1/2, тест-систему для обнаружения антител к ВИЧ1 и ВИЧ2.

Данное изобретение включает группу изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.

Иммуногенная композиция, содержащая химерный полипептид ВИЧ, характеризующаяся тем, что она представляет собой полноразмерный белок р24, слитый с иммунодоминантным фрагментом gp41, содержащим аминокислоты участка 575-616 (здесь и далее нумерация по [7] и [10]), или выбранные из него (rec 24-41) (фиг. 1а), или слитый с иммунодоминантным фрагментом gp36, содержащим аминокислоты участка 575-616 или выбранные из него (rec 24-36) (фиг.1б), и фармакологически пригодный носитель и/или разбавитель.

Еще одним из аспектов изобретения является способ индукции иммунного ответа к ВИЧ1 или ВИЧ 1/2 у млекопитающих, характеризующийся тем, что млекопитающим вводят иммуногенную композицию по п.1, при этом для индукции иммунного ответа к ВИЧ1 млекопитающим вводят иммуногенную композицию, представляющую собой полноразмерный белок р24, слитый с иммунодоминантным фрагментом gp41, содержащим аминокислоты участка 575-616, или выбранные из него (rec 24-41), а для индукции иммунного ответа к ВИЧ 1/2 млекопитающим вводят иммуногенную композицию, представляющую собой полноразмерный белок р24, слитый с иммунодоминантным фрагментом gp36, содержащим аминокислоты участка 575-616, или выбранные из него (rec 24-36).

Для создания иммуногенной композиции разработан химерный полипептид ВИЧ, характеризующийся тем, что в случае ВИЧ1 он представляет собой полноразмерный белок р24, слитый с иммунодоминантным фрагментом gp41, содержащим аминокислоты участка 575-616, или выбранные из него (rec 24-41) (фиг.1a), а в случае ВИЧ1/2 он представляет собой полноразмерный белок р24, слитый с иммунодоминантным фрагментом gp36, содержащим аминокислоты участка 575-616 или выбранные из него (rec 24-36) (фиг.1б).

При этом иммунодоминантный фрагмент gp41 имеет следующие аминокислотные последовательности:

SEQ ID NО:1 575-616

L Q A R V T N I E K Y L Q D Q A R L N S W G C A F R Q V C H T T V P W P N D T L K P

SEQ ID NO:2 578-609

R V T N I E K Y L Q D Q A R L N S W G C A F R Q V C H T T V P W

SEQ ID NO:3 595-607

W G C A F R Q V C H T T V

а иммунодоминантный фрагмент gp36 имеет следующие аминокислотные последовательности:

SEQ ID NO:4 575-616

L Q A R V T N I E K Y L Q D Q A R L N S W G C A F R Q V C H T T V P W P N D T L K P

SEQ ID NO:5 578-609

R V T N I E K Y L Q D Q A R L N S W G C A F R Q V C H T T V P W

SEQ ID NO:6 595-607

W G C A F R Q V C H T T V

Молекула ДНК, кодирующая химерный полипептид ВИЧ, представляет собой последовательность оснований

SEQ ID NO:7 для химерного полипептида ВИЧ1 (rec 24-41) и

SEQ ID NO:8 для химерного полипептида ВИЧ1/2 (rec 24-36).

Плазмидный вектор, применяемый для экспрессии химерного полипептида ВИЧ, представляет собой вектор, пригодный для экспрессии в клетках Е.coli и содержащий молекулу ДНК SEQ ID NO:7 для химерного полипептида ВИЧ1 (rec 24-41) или SEQ ID NO:8 для химерного полипептида ВИЧ1/2 (rec 24-36).

Кроме того, предложен плазмидный вектор для экспрессии химерного полипептида ВИЧ1 (rec 24-41), представляющий собой плазмиду рЕТ15b, в которую вставлены по сайту рестрикции Bam HI фрагмент ДНК SEQ ID NO:7, а по сайтам рестрикции Hind III-Eco R1 вставлен par-локус.

Кроме того, плазмидный вектор для экспрессии химерного полипептида ВИЧ1/2 (rec 24-36) представляет собой плазмиду рЕТ15b, в которую вставлены по сайту рестрикции Bam HI фрагмент ДНК SEQ ID NO: 8, а по сайтам рестрикции Hind III-Eco R1 вставлен par-локус.

Изобретение также касается поликлональных антител к ВИЧ1 или ВИЧ1/2, которые представляют собой иммуноглобулины класса IgG 2a, полученные при иммунизации млекопитающих химерным полипептидом, с титром не менее 30 000 к фрагменту gp41 и gp36 и не менее 200 000 к р24 в непрямом ИФА.

Изобретение также включает тест-систему для обнаружения антител к ВИЧ, содержащую сорбированные на твердой подложке антигены ВИЧ, представленные химерными полипептидами, и детектирующий реагент, при этом антиген ВИЧ1 представляет собой полноразмерный белок р24, слитый с иммунодоминантным фрагментом gp41, содержащим аминокислоты участка 575-616 или выбранные из него (rec 24-41), а антиген ВИЧ 1/2 представляет собой полноразмерный белок р24, слитый с иммунодоминантным фрагментом gp36, содержащим аминокислоты участка 575-616 или выбранные из него (rec 24-36).

Вышеупомянутая тест-система в качестве детектирующего реагента может содержать конъюгат антивидовых антител с пероксидазой хрена.

Тест-система может также в качестве детектирующего реагента содержать конъюгат антивидовых антител со щелочной фосфатазой.

Тест-система может также содержать в качестве детектирующего реагента - конъюгат А-белка St. aureus с пероксидазой хрена.

Еще одним вариантом может быть тест-система, в качестве детектирующего реагента содержащая конъюгат антивидовых антител с коллоидным углеродом.

Тест-система может также содержать в качестве детектирующего реагента конъюгат А-белка St.aureus с коллоидным углеродом.

Еще один вариант тест-системы может содержать в качестве детектирующего реагента химерные полипептиды, конъюгированные с пероксидазой хрена.

Тест-система может также использовать в качестве детектирующего реагента химерные полипептиды, конъюгированные с коллоидным углеродом.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Химерную конструкцию, отвечающую целому белку gp24 и фрагменту gp41, собирают в промежуточной плазмиде, например pBS. Синтезируют праймеры, соответствующие 131-136 и 365-370 аминокислотной последовательности полноразмерной кДНК плазмиды рВН10 для р24 и соответственно 584-589 и 610-615 для фрагмента gp41. PCR-фрагменты поочередно клонируют в pBS. В качестве экспрессирующего вектора используют любую систему, пригодную для экспрессии в прокариотических клетках, например в Е. coli. Таким вектором может служить рЕТ15 или любой другой подходящий для этой цели, например pQE31 (Qiagen). Результатом экспрессии является химерный белок rec 24-41. Клетки обрабатывают 8М мочевиной и ультразвуком. Осветленный лизат сульфитируют и чистят на аффинной колонке с Ni2+ -агарозой, а затем на колонке с Q-сефарозой (Pharmacia). Чистоту продукта проверяют электрофорезом в PAAG. Белки используют для иммунизации, конъюгации с ферментом и иммуноферментного анализа (ИФА) и т.д.

Способность белков индуцировать иммуный ответ (иммуногенность препарата) проверяют на лабораторных животных. Кроликов весом 2 кг иммунизируют белком rec 24-41 или rec 24-36. Повторную иммунизацию проводят через 4 недели после первой. Кровь собирают из ушной вены и получают сыворотку обычным способом. Мышей иммунизируют внутрибрюшинно белком rec 24-41 или rec 24-36. Вторую иммунизацию проводят через 2 месяца после первой. Кровь собирают из шейной артерии через 7 дней после иммунизации и получают сыворотку как обычно.

В иммуногенных композициях в качестве физиологически пригодного носителя используется гидроокись алюминия, а в качестве фармакологически пригодного разбавителя любые подходящие растворы для парентерального применения.

Способность химерных полипептидов распознавать и выявлять антитела к ВИЧ проверяют следующим образом. Химерные полипептиды rec 24-41 и rec 24-36 сорбируют на твердой фазе, например в лунках полистиролового планшета, добавляют образцы сывороток крови инфицированных и неинфицированных ВИЧ людей в приемлемом разведении и проводят иммуноферментный анализ обычным способом, применяя один из детектирующих реагентов и колориметрический индикатор.

Примеры конкретного осуществления изобретения.

Пример 1. Получение плазмиды pET15par.

рЕТ 15b гидролизуют рестриктазой Hind III, достраивают липкие концы ДНК-полимеразой Т4, плазмиду выделяют набором Quiagen и лигируют с par-локусом, полученным по [11]. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки Е. coli штамм Nova-Blue (Novagen) по обычной методике [12]. Трансформированные клетки высевают на чашки с LB агаром, содержащим 25 мкг/мл канамицина. Выросшие колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клетки лизируют и выделяют плазмидную ДНК. Выделенную плазмидную ДНК обрабатывают рестриктазами Pst I и Hind III и гидролизат исследуют электорофорезом в 1%-ной агарозе. Гидролизат плазмидной ДНК рЕТ15-par имеет на электрофореграмме полосу ДНК размером 2270 пар оснований.

Пример 2. Получение плазмиды рЕТ15par(24-41).

Олигонуклеотиды для получения gp41 кинируют с помощью ДНК-киназы обычным способом [12], смешивают в эквимолярном соотношении, инкубируют при 95^oС 30 мин и отжигают до 15^oС в течение 2 часов в термостате, добавляют ДНК-лигазу и инкубируют ночь при 15^oС. Целевой фрагмент ДНК rес gp41 выделяют с помощью набора для выделения ДНК фирмы Qiagen.

Структура олигонуклеотидов для получения синтетической фрагмента gp41.

5" GAT CTG GGT ACC GAC GAC GAC GAC AAG AAG GCC ATG GCG ATA TCG GAT CTG CAG CGT GTT CTG GCT GTT GAA CGT TAC CTG AAA GAC CAG CAG CTG CTG GGT ATC TGG GGT TGC TCT GGT AAA CTG ATC TGC ACC ACC GCT GTT CCG TGG TAA TAA G 3"

5" GA TCC TTA TTA CCA CGG AAC AGC GGT GGT GCA GAT CAG TTT ACC AGA GCA ACC CCA GAT ACC CAG CAG CTG CTG GTC TTT CAG GTA ACG TTC AAC AGC CAG AAC ACG CTG CAG ATC CGA TAT CGC CAT GGC CTT CTT GTC GTC GTC GTC GGT ACC CA 3"

Для получения фрагмента rec р24 плазмиду рВН-10, содержащую полноразмерный геном ВИЧ1 [7], амплифицируют с помощью праймеров N1 и N2. Фрагмент ДНК выделяют с помощью набора для выделения ДНК фирмы Qiagen, гидролизуют рестриктазой BamH1 и очищают электрофорезом в 1%-ной агарозе.

Структура олигонуклеотидов для получения ПЦР-фрагмента р24 и ПЦР-фрагмента 24-41.

N1 GGGG GAT ССТ САА ААТ ТАС ССТ АТА GTG

N2 GGGG GG АТС САА TAG TTG GCT CAT TGC TTC

N3 GGGGG GAT ССТ TAT ТАС САС GCA AC

T7 ААТ ACG ACT CAC TAT AG

Для получения полноразмерного фрагмента ДНК, кодирующего белок rec 24-41, в пробирке 0,5 мл смешивают оба фрагмента ДНК (р24 и gp41) и проводят ПЦР с использованием праймеров N1 и N3. Целевой фрагмент выделяют, как описано выше, гидролизуют рестриктазой BamH1 и лигируют с вектором рЕТ15-par, гидролизованным той же рестриктазой. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки Е.coli штамм Nova-Blue (Novagen) по обычной методике [12]. Трансформированные клетки высевают на чашки с LB агаром, содержащим 25 мкг/мл канамицина. Выросшие колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клоны выращивают и выделяют плазмидную ДНК. Выделенную плазмидную ДНК анализируют ПЦР с использованием праймеров N3 и Т7. Структуру ДНК фрагмента подтверждают секвенированием по методу Сэнгера с использованием праймеров Т7 и N3 [12]. Структура ДНК фрагмента показана на фиг.1а, схема конструкции экспрессирующего вектора приведена на фиг.2а.

Пример 3. Получение плазмиды рЕТ15раг(24-36).

Структура олигонуклеотидов для получения синтетической фрагмента gp36.

5" GAT CTG GGT ACC GAC GAC GAC GAC AAG AAG GCC ATG GCG ATA TCG GAT CTG CAG GAG CGT GTT ACC GCT ATC GAA AAA TAC CTG CAG GAC CAG GCT CGT CTG AAC AGC TGG GGT TGC GCT TTC CGT CAG GTT TGC CAC ACC ACT GTT CCG TGG TAA TAA G 3"

5" A TCC TTA TTA CCA CGG AAC AGT GGT GTG GCA AAC CTG ACG GAA AGC GCA ACC CCA GCT GTT CAG ACG AGC CTG GCC CTG CAG GTA TTT TTC GAT AGC GGT AAC ACG CTC CTG CAG ATC CGA TAT CGC CAT GGC CTT CTT GTC GTC GTC GTC GGT ACC CA 3"

Фрагмент ДНК, кодирующий белок rec 24-36, получают так же, как описано в примере 1. Структура ДНК фрагмента показана на фиг. 1б, схема конструкции экспрессирующего вектора приведена на фиг. 2б.

Пример 4. Экспрессия, выделение и очистка rec 24-41 ВИЧ1.

Штамм Е.coli BL21 (DE3), содержащий плазмиду рЕТ15par(24-41), выращивают в 1 литре среды LB, содержащей 25 мг/л канамицина, при 37^oС до плотности 0,5 ОЕ (при 600 нм), добавляют ИПТГ (изопропилтиоглюкопиранозид) до концентрации 1 мМ, инкубируют еще в течение 4 часов и собирают клетки центрифугированием при 4000g. Клетки суспендируют в 50 мл 6 М мочевины, обрабатывают ультразвуком, к осветленному лизату добавляют тетратионат калия и сульфит натрия до концентрации 25 мМ и 100 мМ соответственно, инкубируют 16 ч и смесь хроматографируют на аффинной колонке с Ni2+ - агарозой (Qiagen) по прописи фирмы-производителя. Рехроматографию проводят на колонке с Q-сефарозой в 6 М мочевине и линейном градиенте NaCl (0-0,2 М). Чистоту продукта оценивают по электрофорезу в PAAG (фиг.3).

Для проведения рефолдинга к раствору белка добавляют цистеин до конечной концентрации 10 мМ, инкубируют 72 ч при ^oС и диализуют ступенчато против 6 М-1 М мочевины, а затем против 10 мМ NaHCO₃ и белок лиофилизуют. Аминокислотная последовательность гибридного полипептида, определенная на основании нуклеотидной последовательности, приведена на фиг.1а. Структура подтверждена масс-спектром MALDI-TOF и результатами триптического гидролиза.

Пример 5. Экспрессия, выделение и очистка rec 24-36 ВИЧ2.

Для получения белка используют штамм Е.coli BL21 (DE3), содержащий плазмиду рЕТ15par (24-36). Экспрессию, выделение и очистку белка проводят, как описано в примере 4. Аминокислотная последовательность гибридного полипептида, определенная на основании нуклеотидной последовательности, приведена на фиг. 1б.

Белки используют для иммунизации, конъюгации с ферментом и коллоидным углеродом иммуноферментного анализа (ИФА) и дот-анализа.

Пример 6. Непрямой иммуноферментный анализ (ИФА).

Антигены адсорбируют на поверхности лунок планшетов для ИФА (Greiner, 756071). Для этого растворы, содержащие смесь антигенов, являющихся предметом настоящего изобретения - ВИЧ1 rec 24-41 и ВИЧ1/2 rec 24-36 с концентрациями 8 мкг/мл каждого в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 9,5, вносят в лунки планшетов и выдерживают 40 час при комнатной температуре. Затем растворы удаляют и планшеты высушивают в течение 2 час при комнатной температуре. Для постановки ИФА в лунки вносят сыворотки ВИЧ-инфицированных пациентов или нормальные сыворотки не инфицированных ВИЧ людей, разведенные в PBSAT (фосфатный солевой буфер с альбумином и твином-20), и выдержают в течение 1 часа при 37^oС. Далее лунки промывают 4 раза PBST (фосфатным солевым буфером с твином-20). Затем в лунки внесли конъюгат пероксидазы хрена с антителами против IgG человека (Sigma, no A 0170) в рабочем разведении на PBSAT и выдерживают в течение одного часа при 37^oС. Затем лунки промывают 4 раза PBST. Далее в лунки добавляют субстрат пероксидазы (о-фенилендиамин дигидрохлорид 1,6 мг/мл, в цитратно-фосфатном буфере, рН 5,5, с 0,006% Н₂O₂) и выдерживают при комнатной температуре в темноте в течение 15 мин. Ферментативную реакцию останавливают добавлением 1N раствора серной кислоты, и оптическую плотность раствора в лунках определяют с помощью спектрофотометра-ридера МСС 340 при 492 нм. Результаты показаны в табл. 1.

Таким образом, непрямой вариант ИФА на основе рекомбинантных белков, являющихся предметом данного изобретения, обеспечивает распознавание 100% ВИЧ-положительных сывороток (477 из 477) при специфичности 100% (1032 отрицательных результата на 1032 отрицательных образца или ни одного положительного результата на 1032 отрицательных образца).

Подобным образом проводится постановка иммуноферментного анализа с применением в качестве проявляющего реагента щелочной фосфатазы, конъюгированной с антивидовыми антителами, но в этом случае из растворов для разведения образцов и конъюгата и промывающего раствора исключаются фосфаты, взамен которых используется трис, и применяется субстрат для фосфатазы, например паранитрофенилфосфат.

Иммуноферментный анализ также выполняют так, как описано в примере 6, с той разницей, что в качестве детектирующего реагента используется конъюгат А-белка St. aureus с пероксидазой хрена.

Пример 7. Иммуноферментный анализ с применением меченых антигенов.

Антигены адсорбируют на поверхности лунок планшетов для ИФА (Greiner, 756071). Для этого растворы, содержащие смесь очищенных антигенов, являющихся предметом настоящего изобретения - ВИЧ1 rec 24-41 и ВИЧ1/2 rec 24-36 - в концентрации 8 мкг/мл каждого в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 9,5, вносят в лунки планшетов и выдерживают 40 час при комнатной температуре. Затем растворы удаляют и планшеты высушивают в течение 2 час при комнатной температуре. Для получения индикаторных реагентов готовят (по [13]) конъюгаты с пероксидазой антигенов, являющихся предметом настоящего изобретения - ВИЧ1 rec 24-41 и ВИЧ1/2 rec 24-36. Для постановки ИФА в лунки вносят сыворотки ВИЧ-инфицированных пациентов или нормальные сыворотки не инфицированных ВИЧ людей, разведенные в PBSAT, и выдерживают в течение 1 часа при 37^oС. Далее лунки промывают 4 раза PBST. Затем в лунки вносят конъюгат пероксидазы хрена с антигенами, являющимися предметом настоящего изобретения, в рабочем разведении на PBSAT и выдерживают в течение одного часа при 37^oС. Затем лунки промывают 4 раза PBST. Далее в лунки добавляют субстрат пероксидазы (о-фенилендиамин дигидрохлорид 1,6 мг/мл, в цитратно-фосфатном буфере, рН 5,5, с 0,006% H₂O₂) и выдерживают при комнатной температуре в темноте в течение 30 мин. Ферментативную реакцию останавливают добавлением 1N раствора серной кислоты, и оптическую плотность раствора в лунках определяют с помощью спектрофотометра-ридера МСС 340 при 492 нм. Результаты показаны в табл.2.

Таким образом, иммунометрический вариант ИФА на основе рекомбинантных белков, являющихся предметом данного изобретения, обеспечивает распознавание 36 из 36 (100%) ВИЧ1 положительных сывороток при специфичности 100% (420 отрицательных результатов на 420 отрицательных образца или ни одного положительного результата на 420 ВИЧ-отрицательных образцов).

Пример 8. Дот-анализ (непрямой вариант, рекомбинантные белки, являющиеся предметом данного изобретения, сорбированы на твердой фазе - нитроцеллюлозной мембране, индикаторным реагентом является А-белок St. aureus, конъюгированный с коллоидным углеродом).

Для сорбции готовят раствор, содержащий смесь рекомбинантных белков, являющихся предметом настоящего изобретения - ВИЧ1 rec 24-41 и ВИЧ 1/2 rec 24-36 - с конечной концентрацией 200 мкг/мл каждого (т.е. всего 400 мкг/мл) в карбонатно-бикарбонатном буфере 0,05 М, рН 9,6. Этот раствор наносят на нитроцеллюлозную мембрану (Millipore, 5 мкм), предварительно размеченную на квадраты со стороной 1 см, по 1 мкл (т.е. по 0,4 мкг смеси антигенов) на точку, в центр каждого квадрата, и сушат на воздухе при комнатной температуре в течение 1 часа. Мембрану замачивают в блокирующем растворе (2% БСА на ФСБ-0,05% Tween-20) на 2-20 часов, затем извлекают из блокирующего раствора, помещают на фильтровальную бумагу и сушат на воздухе 4 часа. В качестве проявляющего реагента используют конъюгат А-белка с коллоидным углеродом. Результат реакции читают визуально. Позитивный результат проявляется в виде черного пятна (фиг.4).

Подобным образом выполняют постановку дот-анализа с использованием в качестве детектирующего реагента конъюгата антивидовых антител с коллоидным углеродом.

Аналогичным образом проводят дот-анализ в иммунометрическом варианте, когда химерные полипептиды, являющиеся предметом данного изобретения, сорбированы на твердой фазе - нитроцеллюлозной мембране, а в качестве детектирующего реагента используются химерные полипептиды, конъюгированные с коллоидньм углеродом.

Пример 9. Иммуногенные свойства водорастворимого рекомбинантного химерного белка ВИЧ1 rec 24-41.

Иммуногенность препарата проверяют на лабораторных животных. Кроликов породы "Шиншилла" весом 2 кг иммунизируют являющимся предметом данного изобретения белком ВИЧ1 rec 24-41 в физиологическом растворе, 1 мг на животное. Повторную иммунизацию проводят через 4 недели после первой. Кровь собирают из ушной вены и получают сыворотку обычным способом. Мышей линии (СВА х С57 В1/6) F1, самок, весом 16-18 г иммунизируют внутрибрюшинно являющимся предметом данного изобретения белком ВИЧ1 rec 24-41, 100 мкг в 0,5 мл физиологического раствора на животное. Вторую иммунизацию проводят через 2 месяца после первой. Кровь собирают из шейной артерии через 7 дней после иммунизации и получают сыворотку как обычно.

Иммунный ответ определяют с помощью ИФА. Для проведения ИФА антигены сорбируют на полистироловых планшетах Greiner 756071. Титр антител определяют в непрямом ИФА и в сэндвич-варианте. В непрямом ИФА проявляющим реагентом при анализе сывороток мышей служит конъюгат пероксидазы хрена с антителами козы против IgG мыши (Sigma, A 3673), а при анализе сывороток кролика - конъюгат А-белка St. aureus с пероксидазой (по [13]). Для сэндвич-варианта готовят конъюгаты рекомбинантных антигенов с пероксидазой (по [13]). Субстратом для колориметрической реакции служит (о-фенилендиамин дигидрохлорид 1,6 мг/мл, в цитратно-фосфатном буфере, рН 5,5, с 0,006% H₂O₂). Результаты регистрируют при 492 нм с помощью спектрофотометра МСС 340. Для каждого разведения сыворотки выполняют три параллельных определения и рассчитывают среднее значение А₄₉₂ За титр принимают такое разведение сыворотки, при котором на 25% превышает уровень среза. Поскольку препарат представляет собой химерный полипептид, содержащий полноразмерный белок р24 ВИЧ1 и слитый с ним фрагмент gp41 ВИЧ1, исследуют иммунный ответ на оба этих фрагмента. В таблице 3 приведены результаты исследования сывороток иммунизированных животных в ИФА с использованием сорбированных на планшете (на твердой фазе) рекомбинантных белков: ВИЧ1 gp41, содержащего только один ВИЧ-специфический фрагмент - участок gp41, ВИЧ1 р24, содержащего только один ВИЧ-специфический фрагмент - полноразмерный р24, и ВИЧ1 rec24-41, содержащего оба ВИЧ-специфических фрагмента - участок gp41 и полноразмерный р24, т.е. тот же антиген, который был использован для иммунизации.

Из таблицы 3 видно, что в ответ на введение химерного полипептида развивается сильный иммунный ответ как на gp41, так и на р24. Различие титров, определенных непрямым и сэндвич ИФА, объясняется разными условиями представления антигена на твердой фазе и связанной с этим разной доступностью детерминант.

Пример 10. Функциональная активность антител против химерного водорастворимого рекомбинантного антигена ВИЧ1 rec 24-41.

Оценку сходства химерного рекомбинантного антигена ВИЧ1 rec 24-41 с вирусным прототипом и способности антител, возникших у животных (мышей и кроликов, пример 9) при иммунизации указанным антигеном, узнавать белки культурального вируса проводят с помощью иммуноблота. Для этого используют полоски нитроцеллюлозы из коммерческого набора LavBlot (Sanofi Pasteur, Франция), на которые, после разделения в SDS-PAAG, перенесены белки культурального ВИЧ1. Полоски обрабатывают разведенными в PBSAT сыворотками животных, иммунизированных рекомбинантным антигеном ВИЧ1 rec 24-41, являющимся предметом данного изобретения, затем отмывают 3 раза PBST и обрабатывают индикаторными реагентами. В качестве индикаторных реагентов служат конъюгат пероксидазы с антителами козы против IgG мыши (Sigma, A 3673) (при детекции специфичности мышиных антител) и конъюгат пероксидазы с А-белком (при детекции специфичности кроличьих антител). Антитела, индуцированные у животных в ответ на иммунизацию рекомбинантным белком, узнают gp41 и р24 культурального вируса, а также предшественник белка р24-р55 (фиг.5). Следовательно, антитела, индуцированные рекомбинантным белком, специфически распознают естественный вирусный белок, что указывает на функциональную активность антител и на сходство строения рекомбинаного белка и вирусного прототипа.

Предыдущие описания и примеры приведены в качестве иллюстрации и не исчерпывают возможностей данного изобретения (последовательности приведены в конце описания).

Литература

1. Allain J. P., Laurian Y., Paul D.A., et al., Lancet, 1986, v.2, pp. 1233-1236.

2. Salk J., Nature, 1987, v.327, pp.473-476.

3. Хаитов P. M. , Трубченинова Л.П., Ефремова Е.В. и др., Иммунология, 1992, 5, стр.1-14.

4. Petrov R.V., Khaitov R.M., Sidorovich I.G., et al., Biomedical Science, 1990, v. 1, pp.239-244.

5. Сидорович И.Г., Шевалье А.Ф., Алексеев Т.А. и др.. Аллергия, астма и клиническая иммунология, 1999, 9, стр.139-141, М., Новости науки и техники, ВИНИТИ, РААКИ, Серия МЕДИЦИНА.

6. Debouck С. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, v. 84, pp. ++++8903-8906.

7. Mousing P. et al., Nature, 1985, v. 313, pp.450-458.

8. Sidorovich I.G., Chevalier A.F., Ignatjeva G.A. et al., Abstracts of 20^th Congress EAACI, Berlin, 9-13 May 2001, Allergy, suppl., 68, v. 56, p. 141, abstract no 427.

9. Nikolaeva I.A., Chevalier A.F., Ignatjeva G.A. et al., Abstracts of 11^th International Congress of Immunology, Stockholm, 22-27 July 2001, A8. Thu.5.19/1182, p.116, abstract 1182.

10. HIV sequence database, Los Alamos, 1989.

11. Meacock P.A., Cohen, S.N., Cell, 1980, v. 20, pp.529-542.

12. Маниатис Т., Фриг Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, Москва, Мир, 1984.

13. Nakane P. K. , Kawaoi A., J. Histochem. Cytochem.,1974, v. 22, pp. 1084-1090.