способ изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против парвовирусной инфекции свиней

Формула изобретения

1. Способ изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против парвовирусной инфекции свиней, включающий получение антигенного материала из штамма возбудителя инфекции, репродуцированного в чувствительной биологической системе, очистку антигенного материала от балластных примесей, инактивацию вируса, соединение антигенного материала с масляным адъювантом и контроль целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве возбудителя инфекции используют штамм Parvovirus suum, коллекция ВГНКИ "Вл-94-ДЕП", в эффективном количестве.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что из чувствительных биологических систем используют перевиваемую культуру клеток почки поросенка ППК.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что штамм "Вл-94-ДЕП" Parvovirus suum используют с биологической активностью не меньше 7,5 Ig ТЦД₅₀/см³.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что штамм "Вл-94-ДЕП" Parvovirus suum используют с гемагглютинирующей активностью не меньше 1:256 ГАЕ.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что из инактивантов используют аминоэтилэтиленимин.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что аминоэтилэтиленимин используют в виде 1%-ного водного раствора.

7. Способ по п. 5, отличающийся тем, что аминоэтилэтиленимин вносят в антигенный материал в концентрации 0,05-0,08%.

8. Способ по любому из пп.1 и 5-7, отличающийся тем, что инактивацию возбудителя инфекции ведут в течение 20-22 ч при 35-39^oС и рН 7,6-7,8.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что из масляных адъювантов используют масляный адъювант "Монтанид ИЗА 70".

10. Способ по п.1 или 9, отличающийся тем, что антигенный материал из штамма "Вл-94-ДЕП" Parvovirus suum соединяют с масляным адъювантом "Монтанид ИЗА 70" в соотношении, по меньшей мере, 1:2.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что из масляных адъювантов используют масляный адъювант "Монтанид ИЗА 206".

12. Способ по п.1 или 11, отличающийся тем, что антигенный материал из штамма "Вл-94-ДЕП" Parvovirus suum соединяют с масляным адъювантом "Монтанид ИЗА 206" в соотношении, по меньшей мере, 1:1.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении инактивированной эмульсионной вакцины против парвовирусной инфекции свиней (ПВИС).

ПВИС - контагиозная вирусная болезнь, проявляющаяся клинически только у супоросных свиноматок и характеризующаяся прохолостами, малочисленными пометами, рождением мумифицированных плодов, мертвых и слабых поросят и реже абортами.

Связь парвовируса свиней (ПВС) с нарушением воспроизводительной функции свиноматок в естественных условиях впервые была установлена в 1967 году в Великобритании, однако экспериментально болезнь была воспроизведена лишь через 10 лет.

Болезнь у свиноматок протекала, как правило, без видимых симптомов. Наблюдается лишь нарушение репродуктивной функции. Вирус проникает через плаценту, поражает плоды 1-й половины супоросности, вызывая их гибель и мумификацию.

Клинически болезнь проявляется в появлении прохолостов, абортов и преждевременных родов. При возникновении болезни в ранее благополучных хозяйствах рождение живых поросят на одну свиноматку в год снижается на 50-60%, в стационарно неблагополучных хозяйствах - на 10-20%. Основным средством борьбы с ПВИС является специфическая профилактика заболевания с помощью инактивированных и живых вакцин.

В настоящее время в мировом промышленном свиноводстве для специфической профилактики ПВИС широко используют инактивированные эмульсионные вакцины, приготовленные из гомологичного вируса, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток свиного происхождения. Указанными вакцинами иммунизируют молодых свиноматок не позже 30-го дня до осеменения. Вакцинация создает у свиноматок выраженный иммунитет и предупреждает передачу вируса эмбрионам и плодам (1, 2).

Однако технология изготовления инактивированных эмульсионных вакцин против ПВИС обладает недостатками, устранение которых остается актуальной задачей и служит основной предпосылкой для проведения исследований по ее усовершенствованию и решения вопроса защиты свиноводства нашей страны от этой инфекции.

Известен способ изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против ПВИС, включающий получение антигенного материала из штамма NADL-2 (коллекция АТСС VR-742) гомологичного вируса, репродуцированного в чувствительной биологической системе, очистку антигенного материала от балластных примесей, инактивацию вируса, соединение антигенного материала с масляным адъювантом и последующий контроль целевого продукта (3).

Основные недостатки этого способа состоят в том, что полученная с его использованием вакцина обладает низкой антигенной и иммуногенной активностью.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против ПВИС, включающий получение антигенного материала из штамма И-82 гомологичного вируса, репродуцированного в чувствительной биологической системе, очистку антигенного материала от балластных примесей, инактивацию вируса формальдегидом, соединение антигенного материала с масляным адъювантом и последующий контроль целевого продукта (4-7).

Способ-прототип имеет существенные недостатки:

- полученная в результате его использования вакцина обладает низкой антигенной и имуногенной активностью и не обеспечивает удовлетворительной защиты против эпизоотического ПВС, циркулирующего на территории Российской Федерации;

- в качестве инактиванта используют формальдегид, вызывающий деструктивные изменения вирусных белков и снижающий иммуногенную активность вакцины.

В задачу создания настоящего изобретения входила разработка способа изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против ПВИС, обладающей высокой антигенной и иммуногенной активностью и создающей напряженный и продолжительный иммунитет у привитых животных.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала инактивированных эмульсионных вакцин против ПВИС, обладающих высокой антигенной и иммуногенной активностью и создающих напряженный и продолжительный иммунитет у привитых животных.

Указанный технический результат от использования изобретения достигнут созданием способа изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против ПВИС, охарактеризованного следующей совокупностью признаков:

1. Способ изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против ПВИС.

2. Приготовление антигенного материала из штамма ПВС, репродуцированного в чувствительной биологической системе.

3. Из штаммов используют штамм "Вл-94" ПВС в эффективном количестве.

4. Из чувствительных биологических систем используют перевиваемую культуру клеток почки поросенка ППК.

5. Штамм "Вл-94" ПВС используют с биологической активностью не меньше 7,5 Ig ТЦД₅₀/см³.

6. Штамм "Вл-94" ПВС используют с гемагглютинирующей активностью (ГА-активностью) не меньше 1:256 ГАЕ.

7. Очистка антигенного материала от балластных примесей известным образом: низкоскоростным центрифугированием, обработкой суспензии различными детергентами (фреон-113, хлороформ) или флокулянтом высокомолекулярным полигексаметиленгуанидингидрохлоридом (ВПГ) в сочетании с низкоскоростным центрифугированием или сепарированием.

8. Очищенный антигенный материал подвергают инактивации.

9. Из инактивантов используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ).

10. АЭЭИ используют в виде 1% водного раствора.

11. АЭЭИ вносят в антигенный материал в концентрации 0,05-0,08%.

12. Инактивацию ПВС ведут в течение 2022 часов при 3539^oС и рН 7,67,8.

13. Соединение очищенного и авирулентного антигенного материала с масляным адъювантом.

14. Из масляных адъювантов используют масляный адъювант "Монтанид ИЗА 70".

15. Антигенный материал из штамма "Вл-94" ПВС соединяют с масляным адъювантом "Монтанид ИЗА 70" в соотношении, по меньшей мере, 1:2.

16. Из масляных адъювантов используют масляный адъювант "Монтанид ИЗА 206".

17. Антигенный материал из штамма "Вл-94" ПВС соединяют с масляным адъювантом "Монтанид ИЗА 206" в соотношении, по меньшей мере, 1:1.

18. Контроль целевого продукта.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1. Способ изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против ПВИС.

2. Приготовление антигенного материала из штамма "Вл-94" ПВС, репродуцированного в чувствительной биологической системе.

3. Штамм "Вл-94" ПВС используют в эффективном количестве.

4. Очистка антигенного материала от балластных примесей.

5. Инактивация антигенного материала.

6. Соединение очищенного и авирулентного антигенного материала с масляным адъювантом.

7. Контроль целевого продукта.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Из чувствительных биологических систем используют перевиваемую культуру клеток почки поросенка ППК.

2. Штамм "Вл-94" ПВС используют с биологической активностью не меньше 7,5 Ig ТЦД₅₀/см³.

3. Штамм "Вл-94" ПВС используют с ГА-активностью не меньше 1:256 ГАЕ.

4. Из инактивантов используют АЭЭИ.

5. АЭЭИ используют в виде 1% водного раствора.

6. АЭЭИ вносят в антигенный материал в концентрации 0,05-0,08%.

7. Инактивацию ПВС ведут в течение 2022 часов при 3539^oС и рН 7,67,8.

8. Из масляных адъювантов используют масляный адъювант "Монтанид ИЗА 70".

9. Антигенный материал из штамма "Вл-94" ПВС соединяют с масляным адъювантом "Монтанидом ИЗА 70" в соотношении, по меньшей мере, 1:2.

10. Из масляных адъювантов используют масляный адъювант "Монтанид ИЗА 206".

11. Антигенный материал из штамма "Вл-94" ПВС соединяют с масляным адъювантом "Монтанидом ИЗА 206" в соотношении, по меньшей мере, 1:1.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый способ и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Способ изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против ПВИС.

2. Получение антигенного материала из штамма гомологичного вируса, репродуцированного в чувствительной биологической системе.

3. Очистка антигенного материала от балластных примесей.

4. Инактивация вируса.

5. Соединение антигенного материала с масляным адъювантом.

6. Контроль целевого продукта.

По сравнению со способом-прототипом существенными отличительными признаками изобретения являются:

1. Из штаммов возбудителя инфекции используют штамм "Вл-94" ПВС.

2. Штамм "Вл-94" используют в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Из чувствительных биологических систем используют перевиваемую культуру клеток почки поросенка ППК.

2. Штамм "Вл-94" ПВС используют с биологической активностью не меньше 7,5 Ig ТЦД₅₀/см³.

3. Штамм "Вл-94" ПВС используют с ГА-активностью не меньше 1:256 ГАЕ.

4. Из инактивантов используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ).

5. АЭЭИ используют в виде 1% водного раствора.

6. АЭЭИ вносят в антигенный материал в концентрации 0,05-0,08%.

7. Инактивацию ПВС ведут в течение 2022 часов при 3539^oС и рН 7,67,8.

8. Из масляных адъювантов используют масляный адъювант "Монтанид ИЗА 70".

9. Антигенный материал из штамма "Вл-94" ПВС соединяют с масляным адъювантом "Монтанид ИЗА 70" в соотношении, по меньшей мере, 1:3.

10. Из масляных адъювантов используют масляный адъювант "Монтанид ИЗА 206".

11. Антигенный материал из штамма "Вл-94" ПВС соединяют с масляным адъювантом "Монтанид ИЗА 206" в соотношении, по меньшей мере, 1:1.

Вакцина, полученная предлагаемым способом, позволяет расширить арсенал средств специфической профилактики ПВИС.

Достижение технического результата от использования предлагаемого изобретения объясняется тем, что при изготовлении инактивированной эмульсионной вакцины против ПВИС в ее состав вводят антигенный материал из нового штамма "Вл-94" гомологичного вируса, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью и обеспечивающего получение вакцины, создающей напряженный и длительный иммунитет у привитых свиней.

Дополнительный технический результат от использования предлагаемого способа достигается за счет того, что инактивацию антигенного материала осуществляют АЭЭИ, что позволяет значительно снизить трудо- и энергозатраты на изготовление вакцины и повысить качество антигенного материала.

Дополнительный технический результат от использования предлагаемого изобретения в части повышения антигенной и иммуногенной активности целевого продукта достигается также за счет использования в его составе масляных адъювантов "Монтанид ИЗА 70" и "Монтанид ИЗА 206".

Исходный вирус для получения штамма "Вл-94" выделен во ВНИИ защиты животных в 1994 году при вирусологическом исследовании внутренних органов абортированных (до 15 см длиной) плодов свиноматок, привезенных из свинокомплекса "Владимирский" Владимирской области. Производственный штамм "Вл-94" ПВС получен методом последовательного пассирования на перевиваемой культуре клеток почки поросенка ППК.

Сущность изобретения пояснена на графике, на котором изображен уровень антител у ремонтных свинок, привитых инактивированной эмульсионной вакциной против ПВИС из штамма "Вл-94".

Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов МСХ РФ (ВГНКИ) 1 июля 1996 года под регистрационным шифром "Вл-94-ДЕП".

Штамм "Вл-94" ПВС обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и отличается высокой продуктивностью в чувствительных биологических системах культивирования. Экспериментально подтверждена возможность его использования для приготовления вакцины эмульсионной инактивированной против ПВИС, создающей напряженный и длительный иммунитет у вакцинированных животных.

Штамм "Вл-94" ПВС характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства

Штамм "Вл-94" ПВС относится к семейству Parvoviridae, роду Parvovirus. Зрелый вирион имеет кубическую симметрию, включает 32 капсомера, 2 или 3 капсидных белка, диаметр вириона около 20 нм, не содержит оболочки и липиды, мол.м. составляет 5,310⁶ Д. Вирусный геном представлен 1-нитевой ДНК с мол. м. 1,4 кД, т.е. около 26,5% массы полного вириона, доля гуанин+цитозин составляет 41-53%. Плавучая плотность в CsCI полного инфекционного вируса, неполного ("пустого") вириона и экстрагированной вирионной ДНК составляет 1,38-1,395; 1,30-1,315 и 1,724 г/см³, соответственно. Коэффициент седиментации 110-122S.

Антигенные свойства

Вирус содержит три полипептида А, В и С с мол. м. 60-90 кД. Все сравнивавшиеся изоляты ПВС оказались в антигенном отношении похожими, если не полностью идентичными. Их идентичность установлена в РН и РТГА. Вирус обладает выраженной антигенной активностью и индуцирует синтез вируснейтрализующих, комплементсвязывающих и преципитирующих антител, а также антигемагглютинин. Изучение антигенных свойств изолированных индивидуальных вирионных полипептидов возбудителя показало, что антисыворотка к каждому структурному белку нейтрализует инфекционную активность полных вирионов и взаимодействует со всеми тремя структурными белками вируса. Каждый индивидуальный белок вируса взаимодействует с вируснейтрализующими антителами, полученными на введение полного вируса. Вирусспецифические антигенные детерминанты имеются, предположительно, на всех вирионных белках ПВС. Биологический полураспад антител к ПВС у поросят зависит от их массы, в среднем он составляет от 18 до 20 дней.

Биотехнологические характеристики

Штамм "Вл-94" ПВС хорошо реплицируется в перевиваемой культуре клеток почки поросенка ППК и накапливается в титре инфекционной активности 8,0 Ig ТЦД₅₀/см³. Перевиваемая культура клеток СПЭВ нечувствительна к вирусу. Особенностью культивирования и накопления вируса является его зависимость от клеточного деления. Кривая размножения вируса зависит от количества митозов. Он хорошо размножается в делящихся клетках почки плода свиньи при заражении через 48 часов после посадки культуры. Наивысшая концентрация вируса достигается на 2-3 сутки культивирования. ЦПД характеризуется вакуолизацией и округлением клеток, диффузной грануляцией. При изучении цикла размножения методом иммунофлюоресценции было установлено, что антиген обнаруживается в ядре клеток через 6 часов после заражения и накапливается в максимальных количествах к 18-24 часам. Штамм "Вл-94" ПВС предназначен для изготовления инактивированных вакцинных препаратов против ПВИС. Штамм "Вл-94" ПВС является генетически стабильным и сохраняет свои иммунобиологические свойства на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения).

Хемо-таксономическая характеристика

Геном ПВС штамма "Вл-94" представлен 1-спиральной линейной молекулой ДНК с мол.м. 1,4 кД. 1-спиральная геномная ДНК состоит примерно из 5 тысяч нуклеотидов и кодирует 4 белка - 3 структурных и 1 неструктурный. На обоих концах ДНК имеются неидентичные, самокомплементарные последовательности нуклеотидов (палиндромы), образующие 2-спиральные шпильки, резистентные к нуклеазе S1; 3"-концевая шпилька состоит из 115-116 нуклеотидов, а 5"-концевая - из 200-242 нуклеотидов. Шпилечные структуры играют важную роль в репликации ДНК. Гены, кодирующие структурные белки, расположены в 5"-концевой половины, а ген, кодирующий неструктурный белок - в 3"-концевой половине ДНК. В вирионах штамма "Вл-94" содержится минус-ДНК. Вирус штамма "Вл-94" является автономным (не дефектным).

Патогенные свойства

Штамм "Вл-94" ПВС патогенен для этого вида животных и апатогенен для хомяков и мышей. У всех зараженных поросят симптомы болезни и патоморфологические изменения обычно отсутствуют, однако обнаруживаются специфические антитела. Вирус выделяют из семенных пузырьков на 7-9 день после заражения. С 12 дня в сыворотке крови животных выявляют антигемагглютинин. У поросят, находившихся в контакте с зараженными животными, также обнаруживаются специфические антитела, что свидетельствует о контагиозности инфекции. После внутримозгового, орального и интраназального заражения поросят каких-либо определенных и воспроизводимых клинических симптомов не наблюдалось. Однако у таких животных удавалось выделить вирус из испражнений, крови и большинства тканей. К 7 дню выявили специфические антитела. При заражении свиней вирусом из штамма "Вл-94" на разных стадиях беременности наблюдали трансплацентарное инфицирование плодов.

Гемагглютинирующие свойства

Штамм "Вл-94" агглютинирует эритроциты морской свинки, цыпленка, кошки, крысы, мыши, обезьяны, человека и не агглютинирует эритроциты барана, лошади, свиньи, КРС, собаки, кролика, хомячка и утки.

Для определения его ГА-активности используют эритроциты морской свинки, реакцию проводят при 4^oС, а в качестве разбавителя применяют фосфатно-буферный раствор, рН 7,2. ГА-активность в РГА составляла 1:2048 ГАЕ. Вирус не освобождается с эритроцитов при 37-40^oС в течение одного часа, однако в щелочном буфере (рН 9,0) он полностью элюирует с них за 30 мин при комнатной температуре.

Физические свойства

Молекулярная масса вирионов составляет 5,5-6,2 МД, плавучая плотность в градиенте CsCI 1,39-1,42 г/см³, коэффициент седиментации 110-122S.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм "Вл-94" ПВС устойчив к действию различных физико-химических факторов. Сохраняет инфекционность при рН 3-9 и 37^oС в течение 1, 5 часов, однако полностью инактивируется при рН 2 в тех же условиях. Вирус стабилен при 56^oС в течение 2 суток, при 70^oС - 2 часа и при 80^oС инактивируется за 5 мин. Не теряет инфекционность в культуральной жидкости с 20% фетальной сыворотки КРС при 35-37^oС в течение 15 недель, устойчив при обработке хлороформом, эфиром и фреоном в 10-50% концентрации в течение 10-30 мин при комнатной температуре. Вирус резистентен к действию РНК- и ДНК-азы и протеаз (папаина, химотрипсина, трипсина, пепсина), устойчив к действию ультразвука, инактивируется УФ-лучами, формалином, этиленимином и его производными, -препиолактоном, глутаральдегидом. В помещениях вирус сохраняет активность более 4 мес., в свинарниках - до 4-6 мес.

Дополнительные признаки и свойства

Свободен от контаминации бактериями, грибной микрофлорой, микоплазмами и вирусами.

На основании полученных данных можно утверждать, что штамм "Вл-94" по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным изолятом ПВС. Для снижения его эпизоотической опасности необходима своевременная профилактика вновь возникающих очагов болезни, а для этого необходима высокоактивная и безвредная вакцина.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа как наиболее близкого по совокупности признаков аналога позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемого способа, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемое решение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияния предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемый способ соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают его объем.

Пример 1.

Для изготовления вакцины эмульсионной, инактивированной против ПВИС, используют штамм "Вл-94" гомологичного вируса, адаптированный к перевиваемой культуре клеток почек поросенка ППК, выращенной на питательной среде пристеночной (ПСП) и проявляющий инфекционную активность в культуре клеток ППК не меньше 7,5 Ig ТЦД₅₀/см³ и ГА-активность не меньше 1:1024 ГАЕ. Для получения вакцины используют выращенную в матрасах культуру клеток ППК с хорошим монослоем 2-суточного возраста. Для получения 20 литров вируссодержащей суспензии ПВС берут от 110 до 120 матрасов с культурой клеток емкостью 1,5 дм³. После слива ростовой среды в матрасы вносят по 5-7 см³ ПВС матровой расплодки. После 40-60 минут инкубирования при температуре (372)^oС в матрасы вносят по 150-200 см³ поддерживающей среды (без сыворотки КРС). Зараженные матрасы помещают в термостат для культивирования при температуре (37^o2)^oС. Срок культивирования от 48 до 72 час. Для контроля незараженными оставляют 3 матраса, в которых ростовую среду меняют на 200 см³ поддерживающей среды без сыворотки. Начиная с 24 часов инкубирования, инфицированные и контрольные матрасы ежесуточно микроскопируют. Матрасы, в которых наблюдаются цитопатические изменения с поражением до 60% клеточного монослоя (обычно через 48-72 часа), отбирают, трехкратно замораживают при температуре не выше -20^oС и оттаивают. Затем вируссодержащий материал очищают от клеточного детрита. Для этого содержимое матрасов сливают в одну емкость и охлажденную вируссодержащую суспензию, соблюдая стерильные условия, освобождают от клеточного детрита центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 минут. Очищенная от детрита суспензия должна иметь вид прозрачной жидкости розовато-вишневого цвета. В очищенную суспензию вносят гентамицин (100 ЕД) и перемешивают 20 мин. Затем из емкости отбирают пробу для лабораторно-производственного контроля на стерильность, инфекционную и ГА-активность вируса. Производственная серия парвовируса должна иметь ГА-активность не меньше 1:1024 ГАЕ и инфекционную активность не меньше 7,5 Ig ТЦД₅₀/см³. Очищенную вируссодержащую суспензию подвергают инактивации. Инактивацию наработанного вирусного сырья ведут с помощью 1% раствора аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ), вносимого до конечной концентрации 0,05-0,08%. Для этого в суспензию, нагретую до 26-28^oС, вносят при постоянном перемешивании раствор АЭЭИ и устанавливают значение рН 7,6-7,8 добавлением в нее 5% раствора янтарной кислоты. Инактивацию ведут в термостате при температуре (37^o2)^oС в течение 20-22 час с периодическим перемешиванием. По окончании инактивации суспензию охлаждают до 4-6^oС, устанавливают значение ее в пределах 7,6-7,8 и отбирают пробы антигена для проверки на стерильность, авирулентность и ГА-активность, используя для этого известные специалисту методы. Эмульсионную вакцину готовят путем диспергирования смеси антигенсодержащего материала и масляного адъюванта, содержащего минеральное масло с эмульгатором. В качестве масляного адъюванта используют препараты фирмы "Сеппик" (Франция): Монтанид ИЗА 70 и Монтанид ИЗА 206. Масляный адъювант и инактивированный антиген смешивают на гомогенизаторе согласно следующим режимам:

1) при использовании Монтанида ИЗА 70 - гомогенизация в течение 4-5 мин при скорости вращения винта 3000 об/мин и температуре 10^oС, при этом получают однородную эмульсию бело-розового цвета типа "вода-масло";

2) при использовании Монтанида ИЗА 206 - гомогенизация в течение 3-4 мин при скорости вращения винта 600 об/мин и температуре 30^oС. Тип получаемой эмульсии "вода-масло-вода". При изготовлении вакцин антиген соединяют с масляным адъювантом в следующем соотношении: с адъювантом Монтанид ИЗА 70, по меньшей мере, 1:2, а с адъювантом Монтанид ИЗА 206, по меньшей мере, 1:1 соответственно.

Готовую эмульсионную вакцину фасуют в стерильные стеклянные флаконы и контролируют в соответствии с техническими условиями.

Для оценки антигенной активности препарата используют количественный метод контроля, с помощью которого определяют количество антигена парвовируса в прививной дозе вакцины (1 см³). Метод заключается в следующем: готовую вакцину деэмульгируют хлороформом в соотношении 1:1, центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин. Надосадок исследуют в РГА. Вакцина считается иммуногенной, если ГА-титр выделенного из вакцинного препарата парвовирусного антигена не ниже 1:256 в прививной дозе 1 см³. В большинстве серий количество антигена равняется 512 ГАЕ, 1024 ГАЕ и 2048 ГАЕ.

Вакцина представляет собой эмульсию белого или белого с розовым оттенком цвета слегка вязкой консистенции. При хранении вакцины допускается незначительное отслоение минерального масла на поверхности эмульсии. При встряхивании вакцина приобретает однородную гомогенную структуру.

Полученная вакцина имеет оптимальный компонентный состав, мас.%:

Антигенный материал из штамма "Вл-94" ПВС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ППК с инфекционной активностью не меньше 7,5 Ig ТЦД₅₀/см³ - 40,0 - 60,0

АЭЭИ (1% водный раствор) - 0,05 - 0,08

Масляный адъювант - До 100,0

Содержание антигена в вакцине в указанных выше пределах является его эффективным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата.

Вакцину применяют для профилактической иммунизации свиней против ПВИС. Вакцина способствует образованию активного иммунитета после 2-кратного применения препарата длительностью не менее 6 месяцев. Свиноматок, ремонтных свинок и хряков-производителей прививают 2-кратно с интервалом 20-30 дней за три недели до осеменения. Поросят прививают в 2-2,5 -месячном возрасте 2-кратно с интервалом 20-30 дней. Вакцину вводят свиньям внутримышечно за ухом в дозе 1 см³ независимо от возраста животных. Вакцина пригодна для применения в течение 12 месяцев после изготовления при условии ее хранения в темном помещении при температуре от 1 до 8^oС.

Пример 2

Описанным в примере 1 способом изготовлена инактивированная эмульсионная вакцина против ПВИС на основе масляного адъюванта "Монтанид ИЗА 70". Проведены исследования по изучению ее иммуногенной активности в условиях ряда хозяйств Российской Федерации. Результаты исследований в РТГА сывороток крови кроликов и выборочно от свиноматок, привитых вышеуказанной вакциной, из некоторых хозяйств представлены в таблице 1.

Примечание: значение титра антител в сыворотке крови у привитых животных не меньше 1:512 свидетельствует о достаточной иммуногенной активности вакцины.

Согласно данным, представленным в таблице 1, у серонегативных животных через 1-1,5 месяца после применения вакцины в сыворотках крови образуется высокий уровень специфических антител к ПВС. В этих хозяйствах в течение срока наблюдения эпизоотическая ситуация по ПВИС остается благополучной.

Пример 3.

Проведены исследования по изучению динамики уровня антител у ремонтных свинок, привитых инактивированной эмульсионной вакциной против ПВИС из штамма "Вл-94", изготовленной так, как описано в примере 1. Результаты исследований представлены на графике. Как видно из графика, двукратная вакцинация репродуктивного поголовья свиней за 2 недели до осеменения (случки) обеспечивают напряженный поствакцинальный иммунитет в течение 3-3,5 мас., т.е. в период супоросности. Высокий титр специфических антител предохраняет животных от заражения ПВС и, как следствие, обеспечивает благополучие репродуктивного поголовья по ПВИС.

Пример 4.

Эффективность инактивированной эмульсионной вакцины против ПВИС, изготовленной так, как описано в примере 1, проверена в спецхозе АО "Тихий Дон" Острогожского района Воронежской области на ремонтных свинках в количестве 22 голов, привитых упомянутой вакциной двукратно с интервалом 20 дней в дозе 1 см³. Результаты исследования в РТГА сывороток крови от ремонтных свиноматок, иммунизированных этой вакциной, приведены в таблице 2. Опорос ремонтных свиноматок прошел в установленные физиологические сроки на 114-116 день супоросности. На одну свиноматку получено по 9-10 поросят. Поросята имели массу тела 0,9-1,1 кг, хорошо развиты и с хорошим сосательным рефлексом.

Среди опоросившихся свиноматок наблюдали: количество пометов с мертворожденными поросятами - нет, количество пометов с частично мертворожденными поросятами - нет, количество пометов с патологией различного характера - нет.

Пример 5.

Эффективность инактивированной эмульсионной вакцины против ПВИС, изготовленной так, как описано в примере 1, проверена в подсобном хозяйстве "Васьково" Починковского района Смоленской области на 83 головах свиней, привитых упомянутой вакциной двукратно с интервалом 20 дней в дозе 1 см³. Осложнений после вакцинации не наблюдалось. Эффективность вакцины составила 97%, т.е. только у 3% свиноматок наблюдалась патология опоросов: аборты, мертворожденные и нежизнеспособные поросята.

Пример 6.

Эффективность инактивированной эмульсионной вакцины против ПВИС, изготовленной так, как описано в примере 1, проверена в АО "Вишневское" Воронежской области на 10 свиноматках, привитых данной вакциной двукратно с интервалом 20 дней в дозе 1 см³. Результаты исследования в РТГА сывороток крови от свиноматок, иммунизированных этой вакциной, приведены в таблице 3. Осложнений после вакцинации не наблюдалось. Эффективность вакцины составила 98%.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:

- способ изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против ПВИС, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно, в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;

- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью приведенных в описании или известных до даты приоритета средств и методов;

- при использовании предлагаемого способа достигнут технический результат, предусмотренный задачей создания изобретения.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации

1. Орлянкин Б.Г., Сергеев В.А., Седов В.А. Парвовирусная болезнь свиней. //Ветеринария, 1987, 10, 72-76.

2. Сергеев В.А. Вирусные вакцины.//Киев, "Урожай", 1993, 301-305.

3. Заявка Франции 2781159, А 61 К 39/23, 21.03.2000 г.

4. Орлянкин Б.Г., Сергеев В.А. и др. Вакцина против ПВИС.//Ветеринария, 1989, 8, 28-30.

5. Драбек И. , Ержабек И. и др. Оценка антигенной активности вакцин против парвовирусной болезни свиней на лабораторных животных.//Ветеринария, 1988, 11, 32-34.

6. Сюрин В. Н. и др. Вирусные болезни животных.//М., ВНИТИБП, 1998, 573-584.

7. Орлянкин Б. Г. , Политов О.Ю., и др. Антигенная активность вакцины против парвовирусной болезни свиней с масляным адъювантом.//Труды ВИЭВ, т. 69 "Новые методы и средства диагностики, профилактики и терапии болезней животных" - М., ВИЭВ, 1991, 85-87 (прототип).