штамм feline herpesvirus-1, используемый для контроля иммуногенной активности вакцин, изготовления специфических лечебно-профилактических и диагностических биопрепаратов

Формула изобретения

Штамм Feline herpesvirus-1 ВГНКИ "Гранд"-31, используемый для контроля иммуногенной активности вакцин, изготовления специфических лечебно-профилактических и диагностических биопрепаратов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к новому штамму Feline herpesvirus-1, используемому для контроля иммуногенной активности вакцин, изготовления инактивированных вакцин и получения специфических лечебно-профилактических и диагностических сывороток и глобулинов и в качестве антигена для обнаружения антител к герпесвирусу кошек.

По литературным данным за рубежом различными авторами в различное время выделялись штаммы Feline herpesvirus-1, но подробной характеристики и областей использования штаммов кошачьего герпесвируса ими не приводится (1, 2). В России не имеется сообщений о выделении от кошек штаммов Feline herpesvirus-1 или закупке импортных штаммов вируса.

Целью изобретения является получение культурального штамма герпесвируса кошек, обладающего стабильной инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью, который может быть использован для контроля иммуногенной активности вакцин, изготовления специфических лечебно-профилактических и диагностических биопрепаратов.

Штамм Feline herpesvirus-1 получен из выделенного в 1994 году изолята вируса Feline herpesvirus-1 от павшей кошки 4-месячного возраста с признаками острого респираторного заболевания путем последовательных пассажей на субкультуре клеток почки кошки.

В том же году штамм депонирован в коллекцию микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и имеет регистрационный номер - "Гранд"-31.

Штамм Feline herpesvirus-1 ВГНКИ "Гранд"-31 характеризуется следующими признаками и свойствами:

Морфологические свойства

Вирионы имеют кубическую симметрию, капсид содержит 162 полых капсомера, заключенных в липопротеидную оболочку. Диаметр вириона колеблется от 120 до 173 нм.

Культуральные свойства

Вирус репродуцируется с проявлением цитопатического эффекта во многих первичных и перевиваемых культурах клеток, но наиболее чувствительными к вирусу являются культуры: CrFk (почки кошки), Fs (селезенки кошки) и другие клетки кошачьего происхождения. В названных культурах клеток через 48-72 часа после заражения наступает выраженное цитопатическое действие (ЦПД). В культурах клеток кошачьего происхождения титр вируса достигает 6,7 lg ТЦД 50/см³. Первые признаки цитопатического действия вируса штамма "Гранд" в использованных культурах проявляется уже через 24 часа после заражения и проявляется образованием отдельных очагов больших округлых клеток с последующей дегенерацией всего клеточного монослоя и отделением его от стекла.

Антигенные свойства

Штамм "Гранд" герпесвируса кошек при парентеральном введении кроликам индуцирует образование вируснейтрализующих антител в титрах 5-8 log₂.

Вирулентность

При ороназальном и интратрахеальном заражении интактных кошек культуральной расплодкой штамма "Гранд" с активностью 10⁷ ТЦД 50/см³ в дозе 1 см³ клинические признаки герпесвирусной инфекции проявляются у всех животных на 4-7 сутки. У животных отмечают снижение аппетита, кашель, ринит, катаральный конъюнктивит, язвенный стоматит, лихорадку (температура тела повышается до 40,0^oС. На 8-9 день с момента появления клинических признаков болезни в 70% случаев происходит падеж, в 30% - клиническое выздоровление животных, причем около половины животных остаются вирусоносителями. У беременных кошек болезнь может сопровождаться абортами.

Стабильность основных свойств штамма

Штамм герпесвируса кошек "Гранд" сохраняет исходную инфекционную и антигенную активность на протяжении 10 пассажей.

Серологические свойства

Активен в реакции нейтрализации со специфической сывороткой.

Гемагглютинирующие свойства

Штамм герпесвируса кошек "Гранд" слабо агглютинирует эритроциты кошек.

Безвредность для лабораторных животных

Штамм герпесвируса кошек "Гранд" безвреден для белых мышей, морских свинок и кроликов при внутримышечном, подкожном и ороназальном введении.

Дополнительные сведения о штамме

Штамм герпесвируса кошек "Гранд" свободен от бактериальных, микоплазменных, грибковых и вирусных контаминантов.

Способность штамма к распространению в естественных условиях

Заражение герпесвирусом животных в окружающей среде происходит аэрогенно и через контакт здоровых животных с выделениями больных. Инкубационный период от 2 до 10 дней.

Основные условия хранения

Штамм герпесвируса кошек "Гранд" лиофилизированный со стабилизирующими добавками сохраняет активность при -20^oС не менее одного года.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Штамм герпесвируса кошек "Гранд" используют для изучения его вирулентных свойств для кошек. Вирус с активностью 6 lg ТЦД 50/см³ вводят 2 группам котят 2-6-месячного возраста ороназально в дозе 1 см³. До заражения сыворотки крови животных исследуют на наличие специфических антител в РН в культуре клеток почек котенка с герпесвирусным антигеном активностью 100 ТЦД 50/см³. Интактные котята заболевают на 3-5 день после заражения с характерной для вирусных респираторных болезней клинической картиной: лихорадкой, ринитом, конъюнктивитом, пневмонией. Котята, в сыворотке крови которых титр гуморальных антител составляет 3 log₂ и выше, не заболевают при данных условиях заражения.

Пример 2

Проводят исследования по изучению безвредности штамма герпесвируса кошек "Гранд" для белых мышей, морских свинок и кроликов. Вирус с активностью 6 lg ТЦД 50/см³ вводят ороназально 3 группам (по 4 серонегативных животных в каждой из групп): белым мышам, морским свинкам и кроликам в объемах: 0,3, 0,5 и 1,0 см³ соответственно. Наблюдают за зараженными животными 14 суток. На протяжении периода наблюдения все животные остаются клинически здоровыми.

Пример 3

Проводят исследования по изучению стабильности вирулентных свойств штамма герпесвируса кошек "Гранд" после 12 пассажей на культурах клеток почки кошки, CrFk (почки кошки), Fs (селезенки кошки). Проводят по 10 пассажей вируса на указанных культурах клеток и получают вирусные сборы с активностью не ниже 6 lg ТЦД 50/см³. Серонегативным по герпесвирусу котятам 3-5-месячного возраста вирус вводят ороназально, по 1 см³, однократно. Котята заболевают на 4-7 день после заражения с характерной для вирусных респираторных заболеваний клинической картиной: лихорадкой, ринитом, конъюнктивитом, пневмонией.

Пример 4

Проводят исследования по изучению стабильности штамма герпесвируса кошек "Гранд" при хранении в лиофилизированном виде. Герпесвирус с активностью 6,0 lg ТЦД 50/см³ смешивают со средой высушивания ВГНКИ-3 в соотношении 1:1 и лиофилизируют. Определяют активность вируса титрованием в культуре клеток Fs до и после лиофилизации и при дальнейшем хранении при температуре минус 20^oС с интервалом полгода. Снижение титра герпесвируса при сушке на среде ВГНКИ составляет 0,5 lg ТЦД 50/см³. Снижение титра герпесвируса при хранении в течение полугода при температуре минус 20^oС составляет 0,1 lg ТЦД 50/см³, в течение года - 0,2 lg TЦД 50/см³, полутора лет - 0,50,1 lg ТЦД 50/см³, двух лет - 1,00,25 lg ТЦД 50/см³.

Пример 5

Определяют антигенные свойства инактивированного штамма герпесвируса кошек "Гранд" для кошек. Для этого получают культуральную расплодку вируса на перевиваемой линии клеток Fs. Вирусный сбор с титром 6,5 lg ТЦД 50/см³ инактивируют формалином, конечная концентрация которого составляет 0,2%. Пяти кошкам 4-месячного возраста инактивированный антиген в объеме 1 см³ вводят подкожно однократно. Максимальное накопление антител в сыворотках крови кошек регистрируют на 21 сутки после его введения. На протяжении этого периода происходит их постепенное нарастание. Титр после однократного введения антигена в РНГА составляет 5-6 log₂.

Пример 6

Специфические гипериммунные сыворотки на штамм герпесвируса кошек "Гранд" получают на кроликах и козах. Используют 2 способа иммунизации: еженедельное 3- кратное введение антигена в объеме 1 см³ кролику и 3 см³ козе и иммунизацию малыми дозами антигена, при которой антиген вводят внутримышечно в том же объеме при добавлении полного адъюванта Фрейнда (1:1), а затем через 2 месяца без адъюванта внутривенно в объеме 0,3 см³ и 0,5 см³ соответственно. Отбор крови для получения проб сывороток производят через 14, 21 и 28 дней после последнего введения антигена.

Активность полученных сывороток устанавливают в РН. Специфичность полученных сывороток проверяют в РН с данным вирусом и вирусом панлейкопении кошек. Активность сывороток крови кроликов, полученных при еженедельной иммунизации, составляет 5,0-6,0 log₂ (РН), коз - 4,0-6,0 1og₂. Более высокую активность в РН проявляют сыворотки крови, которые получают от кроликов и коз, иммунизированных малыми дозами антигена - 6,0-7,0 1og₂ и 7,0-8,0 1og₂ соответственно. Полученные сыворотки не проявляют активности в РН с вирусом панлейкопении кошек. У кроликов и коз контрольной группы они являются негативными.

Полученные гипериммунные сыворотки используют для серодиагностики инфекционного ринотрахеита и для специфического лечения больных животных. Сыворотки хранят в лиофилизированном или нативном виде при температуре минус 10-20^oС в течение 24 месяцев.

Пример 7

Получают глобулин из специфических гипериммунных сывороток крови коз с титром 6,0 log₂ в РН, а также сывороток кошек - с титром 8,0 log₂ в РН. Для этого используют общепринятый метод его высаливания насыщенным раствором натрия сульфата.

Осадок глобулина ресуспендируют фосфатным буферным раствором рН 7,2. Титр глобулина из сыворотки крови коз после ресуспендирования составляет 8,5 log₂ в РН, сыворотки крови кошек 9,25 log₂.

Полученные глобулины используют для диагностики инфекционного ринотрахеита в серологических реакциях и для специфического лечения больных животных. Глобулины хранят в лиофилизированном или нативном состоянии при температуре минус 10-18^oС в течение 24 месяцев.

Пример 8

Диагностическую сыворотку к герпесвирусу кошек, полученную, как описано в примере 6, используют для идентификации изолятов вирусов, выделенных от кошек с признаками респираторных заболеваний. Для этого содержимое ампулы с лиофилизированной сывороткой растворяют в 10 см³ ростовой культуральной среды, прогревают в течение получаса при 56^oС в водяной бане. Исследуемые образцы изолятов герпесвируса и контрольный образец герпесвируса кошек штамма "Гранд" (положительный контроль антигена) соединяют с разведенной сывороткой в соотношении 1:1. Полученную смесь инкубируют 1 час при комнатной температуре и вносят по 1 см³ в пробирки с культурой клеток почки кошки на сформированный монослой (по 4 пробирки на каждый образец). Параллельно в 4 другие пробирки с культурой клеток вносят по 1 см³ разведения изолятов 1:2 в поддерживающей культуральной среде без сыворотки. Контролем культуры клеток служат незараженные пробирки с монослоем клеток, куда вносят по 1 см³ поддерживающей культуральной среды без сыворотки и вируса. Все пробирки помещают в термостат на 7 дней и ежедневно микроскопируют. Диагностическая сыворотка нейтрализует ЦПД изолятов, содержащих герпесвирус кошек, что проявляется отсутствием ЦПД в пробирках, содержащих смесь вируса и позитивной сыворотки. В пробирках, содержащих тот же изолят герпесвируса без сыворотки, ЦПД проявляется в первые сутки характерным округлением клеток, а затем их отторжением от стекла с образованием пустот в виде "сетки". При исследовании проб изолятов, не содержащих герпесвирус, в пробирках с этим изолятом характерного ЦПД не проявляется, а в случае появления неспецифического ЦПД оно наблюдается также в пробирках, содержащих данный изолят и антигерпесвирусную сыворотку. В контрольных пробирках с незараженной культурой клеток не наблюдается дегенеративных изменений клеточного монослоя.

Пример 9

Проводят оценку антигенной активности герпесвируса в вакцине "Трикет" против калицивироза, инфекционного ринотрахеита и панлейкопении кошек производства фирмы Нобивак, Голландия, сер. 9515Е. Для этого кошек 2-4-месячного возраста вакцинируют указанной вакциной в дозе 1 см³ согласно наставлению по применению. Перед вакцинацией и через 21 день у всех привитых щенков берут пробы крови и получают сыворотки крови.

Для определения титра вируснейтрализующих антител к герпесвирусу кошек полученные сыворотки исследуют в РН с 100 ТЦД 50/см³ штамма герпесвируса "Гранд" в перевиваемой культуре клеток Fs. В качестве положительной контрольной сыворотки в РН используют специфическую диагностическую сыворотку к герпесвирусу кошек, полученную, как описано в примере 6. Оценку реакции проводят через 7 суток по развитию ЦПД в культуре клеток. Титр вируснейтрализующих антител в сыворотках крови привитых кошек составляет 1:16-1:128. При сравнении результатов титрования сывороток, полученных от кошек перед вакцинацией и после, отмечают, что у всех подопытных животных титры специфических антител к возбудителю инфекционного ринотрахеита возрастают не менее, чем в 2 раза, а у серонегативных до вакцинации животных становятся не ниже чем 1:32.

Таким образом установлено, что герпесвирусный компонент в вакцине "Трикет" является активным и, следовательно, вакцина по данному компоненту пригодна для использования.

Пример 10

Вакцину против инфекционного ринотрахеита кошек получают путем культивирования герпесвируса в монослое клеток почек котенка.

Для заражения используют культуральный герпесвирус шт. "Гранд" 2 уровня пассажей с активностью в РН 9 lg ТЦД 50/см³ в объеме 1 см³ на 200 см³ поддерживающей среды. Время культивирования составляет 48-72 часа. По истечении этого срока проводят однократное замораживание и оттаивание вируссодержащей культуральной жидкости. До инактивации вирусных сборов проводят электронную микроскопию для исключения их контаминации и определяют инфекционную активность вирусного сбора в культуре клеток. Активность вируса в РН должна быть не менее 6 lg ТЦД 50/см³. Вирус инактивируют формалином, конечная концентрация которого составляет 0,2%. В качестве адъюванта добавляют 3%-ный раствор гидроксала в количестве 10% от объема.

Вакцина против инфекционного ринотрахеита кошек инактивированная представляет собой жидкость розового или сиреневато-розового цвета с рыхлым осадком, разбивающимся при встряхивании в гомогенную взвесь. Она пригодна к применению в течение 18 месяцев с даты ее изготовления при условии хранения при температуре 2-4^oС.

Приготовленная вакцина стерильна в микозном и бактериальном отношениях.

Пример 11

Полученную по примеру 10 вакцину против ринотрахеита кошек проверяют на антигенную активность.

Для этого 3-4-месячным серонегативным котятам и кроликам массой не менее 3 кг вакцину вводят подкожно однократно в дозе 1,0 см³. Сыворотки животных на 21 сутки после иммунизации исследуют в РН. Титр составляет 6-7 log₂. Вакцина антигенна.

Пример 12

Проводят проверку вакцины против инфекционного ринотрахеита кошек, полученную по примеру 10 на безвредность. Для этого ее вводят подкожно 3 группам белых мышей соответственно по 0,1; 0,25 и 0,5 см³. Двум группам морских свинок - по 1,5 и 2,5 см³. Двум группам кроликов - 2,5 и 5,0 см³. Котятам - 1,0 (1 доза); 2,0 (2 дозы) и 3,0 см³ (3 дозы). Контрольным животным вводят максимальное для данной группы количество культуральной жидкости без вируса и адъюванта. Наблюдают за всеми животными в течение 3 недель. Температура тела и общее клиническое состояние всех опытных животных в период наблюдения (21 сутки) остаются нормальными, местной реакции на введение вакцины не отмечают. Препарат безвреден.

Пример 13

Проводят проверку иммуногенных свойств вакцины против инфекционного ринотрахеита кошек, полученную по примеру 10. Для этого используют две группы по 4 серонегативных котенка 3-4-месячного возраста. Первой группе котят вакцину вводят подкожно, однократно в дозе 1,0 см³. Второй группе котят (контрольной) вводят в том же объеме культуральную среду без вируса. Через 21 сутки после начала опыта всех котят заражают ороназально герпесвирусом - штаммом "Гранд" с активностью не менее 7 lg ТЦД 50/см³, который вводят в дозе 1 см³. Интактные котята контрольной группы заболевают на 3-5 день после заражения с характерной для вирусных респираторных болезней клинической картиной: лихорадкой, ринитом, конъюнктивитом, пневмонией. Общее клиническое состояние вакцинированных котят в период наблюдения (21 сутки) остается нормальным, местной реакции на введение вакцины не отмечают. Вакцина иммуногенна.

Пример 14

Изучают эффективность применения вакцины, полученной по примеру 10, в клинических условиях. Данной вакциной иммунизируют 32 кошек и 24 кота из них 19 беспородных, 13 персидских, 10 скотиш-фолд, 9 британских, 3 сиамских, 2 девон-рекс. Возраст животных - от 2 мес до 5 лет, причем 75% привитых животных в возрасте до 1 года. Вакцину вводят подкожно в дозе 1 см³.

Ни в одном случае не наблюдают поствакцинальных реакций как местного, так и общего порядка. Ни у одного животного не отмечают угнетения, отказа от корма, аллергических реакций. Местных кожных реакций на введение вакцины не выявляют. Ни в одном случае не наблюдают поствакцинальных осложнений и заболеваний животных инфекционным ринотрахеитом в течение года наблюдения за ними.

Пример 15

Изучают лечебные свойства гипериммунных сывороток, полученных по примеру 6, и глобулинов, полученных по примеру 7. В опыте используют 45 кошек различных пород и возраста с диагнозом "инфекционный ринотрахеит", подтвержденным в РН. В 12 случаях для лечения используют только антибиотики, в 12 случаях наряду с применением тех же антибиотиков неспецифическое лечение дополняют использованием гипериммунной сыворотки (полученной по примеру 6) с титром 8,0 log₂, в 10 случаях - глобулина (полученного по примеру 7) из сыворотки коз, в 11 - глобулина из сыворотки кошек. Специфические препараты вводят кошкам подкожно по 1,0 см³ в сутки в течение 3 суток. Во всех случаях использования специфических препаратов устанавливают выздоровление кошек, которое наступает через 24-72 часа, что раньше, чем обычно, на 3-5 суток, и ни в одном случае не отмечают рецидивов или осложнений болезни. В группе кошек, которым назначают только антибиотики, отмечают не менее 2 летальных исходов болезни; в группе, где проводят серотерапию, летальных случаев не отмечают. У одного котенка породы девон-рекс регистририруют аллергическую реакцию на второе введение сыворотки козы, проявившуюся гиперемией участков кожи и зудом. Эту реакцию устраняют однократным введением раствора димедрола в общепринятых дозах. При введении глобулинов котятам того же помета аллергических реакций не отмечают. Проведенными исследованиями устанавливают терапевтическую эффективность использования специфических сывороток и глобулинов при лечении инфекционного ринотрахеита кошек.

Использование в ветеринарной практике штамма Feline herpesvirus-1, ВГНКИ "Гранд"-31 позволит с достаточной достоверностью судить о качестве изготавливаемых и используемых биопрепаратов против герпесвирусной инфекции кошек, изготавливать на его основе высокоиммуногенную вакцину против инфекционного ринотрахеита кошек, получать гипериммунные сыворотки на разных видах животных для лечения и профилактики инфекционного ринотрахеита кошек. Использовать антиген и полученную на него сыворотку в серологических реакциях для диагностики инфекционного ринотрахеита кошек.

Источники информации

1. Arentt B.D., Greene C.E. Feline respiratory disease/The book: Clinical Microbiology and infectious diseases of the dog and cat (ed. Greene C.E. ) Philadelphia. - 1984. - р.527.

2. Gillespie J. H. , Scott F.W. Feline Calicivirus (FCV) infection. // Adv. vet. sci. and comp. med. - 1973. - 17. - р.176-188.