рекомбинантный полиовирусный вектор (варианты), способ его получения (варианты), способ индукции иммунного ответа у индивидуума (варианты), способ получения белка (варианты), вакцинная композиция для терапии или профилактики инфекционных заболеваний (варианты)

Формула изобретения

1. Рекомбинантный полиовирусный вектор, предназначенный для стимулирования иммунного ответа против патогенного микроорганизма, или вируса, или клетки-мишени, имеющий формулу

С-В-А-В-С,

где А представляет собой экзогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую подлежащий экспрессии экзогенный полипептид, выбранный из группы, состоящей из субъединицы токсина холерного вибриона, корегулируемой токсином холерного вибриона фимбрии, ротавирусного капсидного белка VP4, гемагглютинина вируса гриппа, S-антигена вируса гепатита В, пре-S1-антигена вируса гепатита В, пре-S2-антигена вируса гепатита В, белка внешней мембраны В. pertussis массой 69 кДа, гликопротеина D вируса простого герпеса и антигена VP7 ротавируса;

В представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую искусственный сайт протеолитического расщепления для протеазы, которая протеолитически процессирует белковый предшественник, продуцируемый исходным полиовирусом, модифицированным с получением рекомбинантного полиовируса, такой, как полиовирусный сайт протеолитического расщепления 2А и/или 3С;

С представляет собой геном исходного полиовируса, как показан в последовательности pMOVl. 3, pMOV2.1, pMOV2.5 или pMOV3.1 на фиг.2В, модифицированного с получением рекомбинантного полиовируса,

где А и В встроены в С в месте соединения между Vpl и 2А, или между 2А и 2В, или между 2С и 3А генома исходного полиовируса.

2. Рекомбинантный полиовирусный вектор по п.1, отличающийся тем, что экзогенная нуклеотидная последовательность А и нуклеотидная последовательность, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления В, присутствуют в рекомбинантном геноме в следующем порядке: 5"-нетранслируемый участок исходного вируса - уникальный стартовый кодон (кодоны) исходного вируса - инициирующий кодон (кодоны) транслируемого участка исходного вируса - нуклеотидная последовательность, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления - экзогенная нуклеотидная последовательность - нуклеотидная последовательность, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления - остальная часть исходного вирусного генома.

3. Рекомбинантный полиовирусный вектор по п.2, отличающийся тем, что геном исходного полиовируса является геномом полиовируса Mahoney или его производным.

4. Рекомбинантный полиовирусный вектор по п.1, отличающийся тем, что является полиовирусом, где экзогенная нуклеотидная последовательность А и нуклеотидные последовательности, кодирующие искусственные сайты протеолитического расщепления для полиовирусной 3С-протеазы или полиовирусной 2А-протеазы В, присутствуют в рекомбинантном полиовирусном геноме в следующем порядке: 5"-нетранслируемый участок полиовирусного генома - полиовирусный уникальный стартовый кодон - кодирующий полиовирусный белок участок (участки) - искусственный сайт распознавания 3С- или 2А-протеазы - экзогенная нуклеотидная последовательность - искусственный сайт распознавания 3С- или 2А-протеазы - остальная часть полиовируса.

5. Рекомбинантный полиовирусный вектор по п.4, отличающийся тем, что геном исходного полиовируса является геномом полиовируса Sabin или его производным.

6. Рекомбинантный полиовирусный вектор по п.5, отличающийся тем, что полиовирус Sabin выбирают из группы, состоящей из полиовируса Sabin типа 1, полиовируса Sabin типа 2 и полиовируса Sabin типа 3.

7. Рекомбинантный полиовирусный вектор, предназначенный для стимулирования иммунного ответа против патогенного микроорганизма, или вируса, или клетки-мишени, имеющий формулу

С-А-В-С,

где А представляет собой экзогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую подлежащий экспрессии экзогенный полипептид, выбранный из группы, состоящей из субъединицы токсина холерного вибриона, корегулируемой токсином холерного вибриона фимбрии, ротавирусного капсидного белка VP4, гемагглютинина вируса гриппа, S-антигена вируса гепатита В, пре-S1-антигена вируса гепатита В, пре-S2-антигена вируса гепатита В, белка внешней мембраны В. pertussis массой 69 кДа, гликопротеина D вируса простого герпеса и антигена VP7 ротавируса;

В представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую искусственный сайт протеолитического расщепления для протезы, которая протеолитически процессирует белковый предшественник, продуцируемый исходным полиовирусом, модифицированным с получением рекомбинантного полиовируса, такой, как полиовирусный сайт протеолитического расщепления 2А и/или 3С;

С представляет собой геном исходного полиовируса, модифицированного с получением рекомбинантного полиовируса, где А и В встраивают в С в таком месте генома исходного полиовируса, чтобы они не нарушали вирусную последовательность, необходимую для репликации полиовируса,

где рекомбинантный полиовирусный вектор имеет последовательность, показанную на фиг.1А.

8. Рекомбинантный полиовирусный вектор по п.7, отличающийся тем, что экзогенная нуклеотидная последовательность А и нуклеотидная последовательность, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления для полиовирусной 3С-протеазы или полиовирусной 2А-протеазы В, присутствуют в рекомбинантном полиовирусном геноме в следующем порядке: 5"-нетранслируемый участок полиовирусного генома - уникальный полиовирусный стартовый кодон - экзогенная последовательность А - последовательность, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления В - второй кодон исходного полиовирусного генома - остальная часть исходного полиовирусного генома.

9. Рекомбинантный полиовирусный вектор по п.8, отличающийся тем, что геном исходного полиовируса является геномом полиовируса Sabin или его производным.

10. Рекомбинантный полиовирусный вектор по п.9, отличающийся тем, что полиовирус Sabin выбирают из группы, состоящей из полиовируса Sabin типа 1, полиовируса Sabin типа 2 и полиовируса Sabin типа 3.

11. Рекомбинантный полиовирусный вектор по п.8, отличающийся тем, что геном исходного полиовируса является геномом полиовируса Mahoney или его производным.

12. Способ получения рекомбинантного полиовирусного вектора по п.1, способного стимулировать иммунный ответ против патогенного микроорганизма, или вируса, или клетки-мишени, отличающийся тем, что осуществляют а) получение полиовируса, который в своем природном жизненном цикле продуцирует полипротеиновый предшественник, который протеолитически процессируется; b) встраивание в геном полиовируса а) (1) экзогенной нуклеотидной последовательности, кодирующей подлежащий экспрессии полипептид, и (2) нуклеотидной последовательности, кодирующей искусственный протеолитический сайт расщепления для протеазы, которая протеолитически процессирует белковый предшественник, продуцируемый полиовирусом, полученным на стадии а), где b(1) и b(2) встраивают в геном полиовируса а) в таком месте, чтобы они не нарушали вирусную последовательность, необходимую для репликации полиовируса.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность b(1) кодирует полипептидный антиген, выбранный из группы, состоящей из субъединицы токсина холерного вибриона, корегулируемой токсином холерного вибриона фимбрии, ротавирусного капсидного белка VP4, гемагглютинина вируса гриппа, S-антигена вируса гепатита В, пре-S1-антигена вируса гепатита В, пре-S2-антигена вируса гепатита В, белка внешней мембраны В. pertussis массой 69 кДа, гликопротеина D вируса простого герпеса и антигена VP7 ротавируса.

14. Способ по п.12, отличающийся тем, что экзогенная нуклеотидная последовательность b(1) и нуклеотидная последовательность, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления для полиовирусной 3С-протеазы или полиовирусной 2А-протеазы b(2), присутствуют в рекомбинантном полиовирусном геноме в следующем порядке: 5"-нетранслируемый участок исходного полиовирусного генома - уникальный полиовирусный стартовый кодон - экзогенная нуклеотидная последовательность b(1) - нуклеотидная последовательность, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления b(2) - второй кодон исходного полиовирусного генома - остальная часть исходного полиовирусного генома.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность b(1) кодирует полипептидный антиген, выбранный из группы, состоящей из субъединицы токсина холерного вибриона, корегулируемой токсином холерного вибриона фимбрии, ротавирусного капсидного белка VP4, гемагглютинина вируса гриппа, S-антигена вируса гепатита В, пре-S1-антигена вируса гепатита В, пре-S2-антигена вируса гепатита В, белка внешней мембраны В. pertussis массой 69 кДа, гликопротеина D вируса простого герпеса и антигена VP7 ротавируса.

16. Способ по п.12, отличающийся тем, что экзогенная нуклеотидная последовательность b(1) и нуклеотидная последовательность, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления b(2), расположены в участке полиовирусного генома, выбранном из группы, состоящей из 1) соединения между Vpl и 2А; 2) соединения между 2А и 2В и 3) соединения между 2С и 3А.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность b(1) кодирует полипептидный антиген, выбранный из группы, состоящей из субъединицы токсина холерного вибриона, корегулируемой токсином холерного вибриона фимбрии, ротавирусного капсидного белка VP4, гемагглютинина вируса гриппа, S-антигена вируса гепатита В, пре-S1-антигена вируса гепатита В, пре-S2-антигена вируса гепатита В, белка внешней мембраны В. pertussis массой 69 кДа, гликопротеина D вируса простого герпеса и антигена VP7 ротавируса.

18. Способ по п.16, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность b(2), которая кодирует искусственный сайт протеолитического расщепления, кодирует сайт протеолитического расщепления для полиовирусной 3С-протеазы или сайт протеолитического расщепления для полиовирусной 2А-протеазы.

19. Способ получения рекомбинантного полиовирусного вектора по п.7, отличающийся тем, что экзогенная нуклеотидная последовательность и нуклеотидная последовательность, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления, присутствуют в рекомбинантном геноме в следующем порядке: 5"-нетранслируемый участок полиовирусного генома - уникальный стартовый кодон полиовируса - экзогенная нуклеотидная последовательность - нуклеотидная последовательность, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления - второй кодон полиовируса - остальная часть полиовирусного генома.

20. Способ по п.19, отличающийся тем, что экзогенная нуклеотидная последовательность кодирует полипептидный антиген, выбранный из группы, состоящей из субъединицы токсина холерного вибриона, корегулируемой токсином холерного вибриона фимбрии, ротавирусного капсидного белка VP4, гемагглютинина вируса гриппа, S-антигена вируса гепатита В, пре-S1-антигена вируса гепатита В, пре-S2-антигена вируса гепатита В, белка внешней мембраны В. pertussis массой 69 кДа, гликопротеина D вируса простого герпеса и антигена VP7 ротавируса.

21. Способ по п.19, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления, кодирует искусственный сайт протеолитического расщепления для полиовирусной 3С-протеазы или искусственный сайт протеолитического расщепления для полиовирусной 2А-протеазы.

22. Способ по п.21, отличающийся тем, что полиовирус является полиовирусом Sabin или полиовирусом Mahoney.

23 Способ по п.19, отличающийся тем, что экзогенная нуклеотидная последовательность и нуклеотидная последовательность, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления для полиовирусной 3С-протеазы или полиовирусной 2А-протеазы, присутствуют в рекомбинантном полиовирусном геноме в следующем порядке: 5"-нетранслируемый участок исходного полиовирусного генома - уникальный полиовирусный стартовый кодон - экзогенная нуклеотидная последовательность - нуклеотидная последовательность, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления - второй кодон исходного полиовирусного генома - остальная часть исходного полиовирусного генома.

24. Способ по п.23, отличающийся тем, что экзогенная нуклеотидная последовательность кодирует полипептидный антиген, выбранный из группы, состоящей из субъединицы токсина холерного вибриона, корегулируемой токсином холерного вибриона фимбрии, ротавирусного капсидного белка VP4, гемагглютинина вируса гриппа, S-антигена вируса гепатита В, пре-S1-антигена вируса гепатита В, пре-S2-антигена вируса гепатита В, белка внешней мембраны В. pertussis массой 69 кДа, гликопротеина D вируса простого герпеса и антигена VP7 ротавируса.

25. Способ по п.19, отличающийся тем, что экзогенная нуклеотидная последовательность и нуклеотидная последовательность, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления, расположены в участке полиовирусного генома, выбранном из группы, состоящей из 1) соединения между Vpl и 2А; 2) соединения между 2А и 2В и 3) соединения между 2С и 3А.

26. Способ по п.25, отличающийся тем, что экзогенная нуклеотидная последовательность кодирует полипептидный антиген, выбранный из группы, состоящей из субъединицы токсина холерного вибриона, корегулируемой токсином холерного вибриона фимбрии, ротавирусного капсидного белка VP4, гемагглютинина вируса гриппа, S-антигена вируса гепатита В, пре-S1-антигена вируса гепатита В, пре-S2-антигена вируса гепатита В, белка внешней мембраны В. pertussis массой 69 кДа, гликопротеина D вируса простого герпеса и антигена VP7 ротавируса.

27. Способ по п.25, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, которая кодирует искусственный сайт протеолитического расщепления, кодирует сайт протеолитического расщепления для полиовирусной 3С-протеазы или сайт протеолитического расщепления для полиовирусной 2А-протеазы.

28. Способ индукции иммунного ответа у индивидуума против патогена, отличающийся тем, что указанный способ предусматривает введение индивидууму рекомбинантного полиовируса, продуцированного с помощью рекомбинантного полиовирусного вектора по п.1, где экзогенная нуклеотидная последовательность А кодирует антиген патогена, в количестве, достаточном для индукции иммунного ответа у индивидуума.

29. Способ индукции иммунного ответа у индивидуума против патогена, отличающийся тем, что указанный способ предусматривает введение индивидууму рекомбинантного полиовируса, продуцированного с помощью рекомбинантного полиовирусного вектора по п.7, где экзогенная нуклеотидная последовательность А кодирует антиген патогена, в количестве, достаточном для индукции иммунного ответа у индивидуума.

30. Способ по п.29, отличающийся тем, что указанный способ предусматривает введение индивидууму рекомбинантного полиовируса, продуцированного с помощью рекомбинантного полиовирусного вектора по п.8, где экзогенная нуклеотидная последовательность А кодирует антиген патогена, в количестве, достаточном для индукции иммунного ответа у индивидуума.

31. Способ получения белка, отличающийся тем, что осуществляют a) включение рекомбинантного полиовируса, продуцированного с помощью рекомбинантного полиовирусного вектора по п.1, в подходящую клетку-хозяина; b) поддержание продукта в условиях, которые обеспечивают репликацию вируса по п.1, и c) выделение белка из клетки-хозяина.

32. Способ по п.31, отличающийся тем, что клетками-хозяевами являются человеческие клетки.

33. Способ получения белка, отличающийся тем, что осуществляют a) включение рекомбинантного полиовируса, продуцированного с помощью рекомбинантного полиовирусного вектора по п.7, в подходящую клетку-хозяина; b) поддержание продукта в условиях, которые обеспечивают репликацию вируса по п.7, и c) выделение белка из клетки-хозяина.

34. Вакцинная композиция для терапии или профилактики инфекционных заболеваний, таких, как холера, гастроэнтерит, грипп, гепатит В, коклюш и простой герпес, отличающаяся тем, что содержит рекомбинантный полиовирус, продуцированный с помощью рекомбинантного полиовирусного вектора по п.1, и физиологически приемлемый носитель.

35. Вакцинная композиция для терапии или профилактики инфекционных заболеваний, таких, как холера, гастроэнтерит, грипп, гепатит В, коклюш и простой герпес, отличающаяся тем, что содержит рекомбинантный полиовирус, продуцированный с помощью рекомбинантного полиовирусного вектора по п.7, и физиологически приемлемый носитель.

36. Рекомбинантный полиовирусный вектор, охарактеризованный в п.1 или 7, для получения рекомбинантного полиовируса, применимого в терапии инфекционных заболеваний, таких, как холера, гастроэнтерит, грипп, гепатит В, коклюш и простой герпес.

37. Рекомбинантный полиовирусный вектор, охарактеризованный в п.1 или 7, для получения рекомбинантного полиовируса, применимого в индукции иммунного ответа у индивидуума против патогена, такого, как холерный вибрион, ротавирус, вирус гриппа, вирус гепатита В, Bordetella pertussis, вирус простого герпеса, причем экзогенная нуклеотидная последовательность A кодирует антиген указанного патогена.

Описание изобретения к патенту

Предпосылки изобретения

В настоящее время существует множество типов вакцин, используемых для иммунизации индивидуумов против заболеваний. Хотя те из них, которые доступны, обычно безопасны и, по крайней мере, до некоторой степени эффективны в создании иммунной реакции, все они имеют ограничения. Кроме того, против некоторых заболеваний не существует эффективных вакцин. Разработка альтернатив существующим в настоящее время вакцинам и создание новых вакцин для защиты от заболеваний, вакцины против которых в настоящее время не существует, были бы важным шагом в снижении заболеваемости и смертности многими заболеваниями.

Краткое содержание изобретения

Настоящее изобретение относится к репликационно-компетентным рекомбинантным вирусам, которые содержат экзогенные последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют экзогенный полипептид или протеин, который экспрессируется как компонент рекомбинантного полипротеинового предшественника, который затем протеолитически расщепляется вирусными и/или клеточными энзимами. В результате, происходит высвобождение закодированного экзогенного полипептида. Репликационно-компетентными вирусами могут быть вирусы животных (не человека) (например, вирусы позвоночных и млекопитающих), вирусы человека или вирусы растений. Изобретение относится к репликационно-компетентным рекомбинантным вирусам, особенно, к полиовирусам, в которых рекомбинантный геном включает экзогенную последовательность нуклеиновых кислот (или последовательности), кодирующую экзогенный полипептид или полипептиды, которые подлежат экспрессии, и одну или более из последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих соответственное число искусственных сайтов протеолитического расщепления, и которая экспрессирует закодированный полипептид (полипептиды) и индуцирует продуцирование антител, специфичных для этого полипептида (полипептидов) у млекопитающего, которому они введены. Соответствующим образом выбранные репликационно-компетентные вирусы подходят для поставки экзогенного протеина индивидууму, например, позвоночному, особенно млекопитающему, и еще более конкретно, человеку, которому они вводятся. В случае растительных вирусов, например, репликационно-компетентный растительный вирус можно включить в семена или в растение на другой стадии развития, таким образом, что закодированный экзогенный полипептид экспрессируется и процессируется. Такой экзогенный полипептид можно использовать, например, для защиты растений от заболеваний или от нападения насекомых. Растения можно использовать для введения вакцины за счет орального приема.

Репликационно-компетентные рекомбинантные вирусы настоящего изобретения включают широкий круг типов вирусов, таких как пикорнавирусы (например, энтеровирусы, полиовирусы, вирус ящера (FM DV), риновирусы, эковирусы, вирусы гепатита А), Тогавирусы (например, вирусы Синобис и краснухи) и Флавивирусы (например, вирус желтой лихорадки). Тип используемого вируса определяется частично целевым экзогенным антигеном (антигенами), подлежащим экспрессии, способом введения полученных рекомбинантных вирусов и характером желательной иммунной реакции.

В частности, настоящее изобретение относится к репликационно-компетентным рекомбинантным полиовирусам, которые отличаются от родительских полиовирусов тем, что они были модифицированы таким образом, чтобы они не были патогенными и содержали бы экзогенные последовательности нуклеиновых кислот и один или более из искусственных сайтов протеолитического расщепления, с тем, чтобы во время вирусной инфекции они стабильно экспрессировали закодированный продукт как компонент рекомбинантного полипротеинового предшественника. Предшественник протеолитически расщепляют, высвобождая нормальные полиовирусные протеины и закодированный экзогенный протеин. Кроме того, репликационно-компетентные рекомбинантные вирусы могут содержать полилинкерную последовательность (EcoR1, Not1, BssH2 и Xho1) для облегчения встраивания целевых чужеродных нуклеотидных последовательностей. Они также включают поли-аминокислотный участок, например, поли-глициновый участок, который обычно соседствует со встроенной последовательностью, так, что повышается структурная гибкость участка и потенциально повышается эффективность протеолитического расщепления.

Настоящее изобретение относится к новому способу получения рекомбинантных вирусов, в котором экзогенные последовательности нуклеиновых кислот встраивают в вирусный геном. В способе настоящего изобретения используют основные аспекты жизненного цикла вируса, в результате чего рекомбинантный вирус продуцирует свои нормальные компоненты, и реплицируется, причем аминокислотная последовательность, закодированная экзогенной последовательностью (последовательностями) нуклеиновых кислот (экзогенный протеин), продуцируется в значительных количествах в инфицированных клетках. В рассматриваемом способе исходный вирус, геном которого кодирует полипротеиновый предшественник, который протеолитически расщепляется вирусными или клеточными энзимами с образованием одного или более из зрелых протеинов, модифицируют следующим образом: Экзогенную последовательность нуклеиновых кислот, которая кодирует подлежащий продуцированию полипептид, и последовательность или последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют (кодирует) искусственный сайт или сайты протеолитического расщепления для вирусной или клеточной протеазы, которая протеолитически расщепляет предшественник полипротеина, продуцируемый во время жизненного цикла исходным вирусом, вводят в вирусный геном, продуцирующий рекомбинантный вирус. Последовательности можно встраивать в вирусный геном в любом месте, при условии, что их наличие не нарушает вирусную последовательность, необходимую для вирусной репликации. Так, например, две последовательности можно строить по нативному сайту, по которому полипротеин расщепляется, для получения двух нативных протеинов (то есть, по любому сайту, по которому обычно протеолитически расщепляется нативный полипротеин). В тех случаях, когда экзогенные последовательности нуклеиновых кислот встраивают по концу вирусной последовательности, кодирующей протеин, необходима только одна протеолитически расщепляемая последовательность. Если в вирусный геном встраивают более чем одну экзогенную последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую нужный полипептид, могут понадобиться дополнительные последовательности нуклеотидов, кодирующие протеолитический сайт расщепления. Так, например, если две или более полипептид-кодирующие последовательности нуклеиновых кислот встраивают в вирусный геном (внутрь генома) и нужно, чтобы закодированные протеины были расщеплены с образованием двух или более отдельных протеинов, тогда следует также встроить достаточное количество последовательностей нуклеотидов, кодирующих сайты расщепления. Так, например, если в вирусный геном встраивают две экзогенные нуклеотидные последовательности, каждая из которых кодирует протеин, который нужно получить, и два отдельных (индивидуальных) протеина необходимо получить, необходимы три или четыре последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие сайты протеолитического расщепления (то есть, три, если два протеина кодируются двумя последовательностями нуклеиновых кислот, присутствующими в вирусном геноме, без прерывания последовательностей аминокислот, и четыре - если две последовательности нуклеиновых кислот разделены прерывающей последовательностью нуклеиновых кислот, причем продукт, который она кодирует, должен быть удален для "разделения" двух закодированных протеинов). В таких случаях, когда последовательности встроены внутрь (а не по концам) вирусного генома, необходимы две последовательности протеолитического расщепления для того, чтобы дать возможность освободить оба конца экзогенной последовательности нуклеиновых кислот; причем эти последовательности могут быть одинаковыми или различными.

В одном из вариантов настоящего изобретения две последовательности вводят в геном родительского вируса между первым или уникальным стартовым кодоном и вторым кодоном у 5" конца вирусной последовательности, кодирующей вирусный протеин таким образом, что порядок рекомбинантного генома становится: 5" нетранслируемый участок исходного вируса - уникальный стартовый кодон исходного вируса - экзогенная последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая подлежащий экспрессии продукт - последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления - второй кодон исходного вируса - остальная часть последовательности нуклеиновых кислот исходного вируса. В другом варианте, в котором экзогенная последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая экзогенный полипептид, встроена в вирусный геном, порядок последовательностей в получаемом рекомбинантном вирусном геноме будет следующим: 5" нетранслируемый участок исходного вируса - уникальный стартовый кодон исходного вируса - начальный кодон (кодоны) транслируемого участка исходного вируса - последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления - экзогенная последовательность нуклеиновых кислот - последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления - остальная часть генома исходного вируса. Кодируемые сайты протеолитического расщепления могут быть одинаковы или различны.

В одном варианте настоящего изобретения, в котором получают рекомбинантный полиовирус (который экспрессирует экзогенную нуклеотидную последовательность или последовательности), последовательность нуклеотидов, кодирующую протеин (например, антиген), который необходимо экспрессировать, и нуклеотидная последовательность (последовательности), кодирующую искусственную распознающую последовательность (или последовательности) для полиовирусной 3С протеазы, встраивают в геном исходного полиовируса. В другом варианте последовательность (или последовательности) нуклеотидов, кодирующую искусственную распознающую последовательность (последовательности) для полиовирусной 2А протеазы, встраивают в вирусный геном наряду с одной или более из последовательностей нуклеотидов, кодирующих подлежащий экспрессии протеин (протеины). В случае ДНК - вирусов с геномом манипулируют в его ДНК форме. В случае РНК вирусов, с геномом манипулируют в его кДНК форме. Обе они обозначаются как геном исходного вируса. В том варианте, когда экзогенная последовательность нуклеотидов, кодирующая экзогенный полипептид, встраивается в конец полиовирусного генома, получают рекомбинантный полиовирусный геном следующей структуры: 5" нетранслируемый участок исходного полиовируса - полиовирусный уникальный стартовый кодон - экзогенная нуклеотидная последовательность - искусственный полиовирусный сайт распознавания 3С или 2А протеазы - второй кодон полиовирусного генома - остальная часть полиовирусного генома. В том варианте, когда экзогенная последовательность нуклеотидов, кодирующая экзогенный полипептид, встроена по сайту внутри исходного полиовирусного генома (то есть, по внутреннему сайту), получающийся рекомбинантный полиовирусный геном имеет вид: 5 нетранслируемый участок исходных полиовирусов - полиовирусный уникальный стартовый кодон - полиопротеиновый кодирующий участок (участки) - последовательность нуклеотидов, кодирующая искусственный сайт распознавания 3С протеазы или 2А протеазы - экзогенная нуклеотидная последовательность (последовательности) - последовательность нуклеотидов, кодирующая искусственный сайт распознавания 3С протеазы или 2А протеазы - остальная часть полиовируса. В тех случаях, когда более чем один протеин или полипептид подлежат экспрессированию, более чем одна экзогенная последовательность нуклеиновых кислот встроена в рекомбинантный репликационно-компетентный полиовирус (то есть, последовательность нуклеотидов, кодирующая каждый из протеинов или полипептидов, подлежащих экспрессии), вместе с соответствующим количеством искусственных сайтов протеолитического расщепления, как было указано ранее.

Если транслируется модифицированный полиовирусный геном, получается более крупная структура, но она соответствующим образом расщепляется на обычные участки, составляющие полиовирусные протеины за счет 3С и/или 2А протеазы (протеаз), присутствующие в исходном полиовирусе. 3С и/или 2А протеаза (протеазы) также точно распознает (распознают) и расщепляет (расщепляют) искусственный сайт распознавания (протеолитического расщепления), освобождая экзогенный полипептид, закодированный экозогенной последовательностью нуклеотидов. Как было указано, рекомбинантные полиовирусы настоящего изобретения экспрессируют закодированный экзогенный протеин (протеины) в детектируемых количествах. Исходные вирусы продолжают реплицироваться и нативные протеины образуются точно также.

Репликационно-компетентные рекомбинантные вирусы настоящего изобретения, которые представлены рекомбинантными полиовирусами, можно использовать в качестве вакцин против бактериальных, вирусных, грибковых (например, дрожжевых) инфекций, паразитарных заболеваний, рака или аллергий. Их можно также использовать для введения контрацептивов (например, антигена спермы). Вакцинные и контрацептивные композиции, которые являются или включают репликационно-компетентные рекомбинантные вирусы, как здесь указано, также составляют объект настоящего изобретения.

Рекомбинантные полиовирусные вакцины настоящего изобретения особенно выгодны, если для предотвращения инфекции необходимо создать иммунитет слизистой оболочки. Так, например, эффективное создание иммунитета слизистой оболочки было бы выгодно для предотвращения или уменьшения инфекции HIV, ротавирусами, респираторным синцитиальным вирусом (RSV), вирусом гепатита А, полиовирусом, вирусом папиломы, вирусом кори и вирусами гриппа. Рекомбинантные вирусы также пригодны для создания иммунитета против бактериальных заболеваний, таких, которые вызываются Vibrio Cholerae и энеротоксигенными Е. Coli. Кроме того, рекомбинатные полиовирусы можно использовать для создания защиты от инфицирования более чем одним организмом за счет введения более чем одной экзогенной нуклеотидной последовательности (например, двух или более из последовательностей нуклеотидов, каждая из которых кодирует различные антигены) в геном исходного полиовируса. В другом варианте, смесь или коктейль из двух или более рекомбинантных вирусов, каждый из которых экспрессирует отличный антиген, можно использовать для иммунизации индивидуума против более чем одного организма или инфицирующего агента. За счет использования появившихся подходов молекулярной биологии для разработки усовершенствованных или новых вакцин, определение "идеальная вакцина", приведенное Task Force on Child Survivae (организация по детскому выживанию), как вакцина, при которой "однократное введение при рождении обеспечивает защиту от множества болезней", может быть многообещающе реализовано.

Рекомбинантные вирусы можно также использовать для получения экзогенных полипептидов в тканевой культуре, которые можно выделить или отделить из клеток и вирусов, в которых они вырабатываются. Их можно использовать для получения экзогенного полипептида в клетках позвоночных, в клетках млекопитающих, включая человеческие клетки, и в растительных клетках.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 схематически представлен рекомбинантный полиовирус настоящего изобретения, в котором полиовирусный геном (SEQ ID 24 и 25) модифицирован, и эти модификации позволяют встраивать экзогенные последовательности нуклеиновых кислот в конце полиовирусного генома, и показана экспрессия экзогенных полипептидов. Представлен также ход протеолитического процессинга вирусной 3C протеазы, когда она расщепляет как нативный полиовирусный полипротеиновый (РО) предшественник, так и экзогенную протеиновую вставку.

На фиг.2 схематически представлены рекомбинантные полиовирусы настоящего изобретения, со вставкой экзогенных последовательностей нуклеотидов на конце и внутри полиовирусного генома, что приводит к экспрессии экзогенных полипептидов. Представлен также поли-глициновый участок, соседний со встроенной последовательностью, который повышает структурную гибкость этого участка.

Фиг. 3 представляет собой фотографию результатов анализа бляшкообразования, который представляет фенотип исходного полиовируса и рекомбинантного полиовируса. В представленном анализе бляшкообразования HeLa клетки были инфицированы исходным полиовирусом (А) или рекомбинантными полиовирусами, содержащими: антигенные эпитопы, полученные из ротавирусного VP4 протеина (В, С и Д), или полную кодирующую последовательность субфрагмента В (СТВ) зрелого токсина холеры (Е).

Фиг. 4 представляет результаты анализов, которые показывают экспрессию и процессинг рекомбинантных полиовирусов, содержащих субъединицу токсина последовательности Vibrio cholerae В или последовательности ротавируса VP4.

На фиг. 4А представлена фотография Вестерн - блота, полученного с использованием экстрактов клеток HeLa, инфицированных либо исходным полиовирусом (линия 1), либо рекомбинантным вирусом полиовируса и токсина В холеры, описанным в примере 2 (полоса 2). Полученные результаты показывают, что В субъединица экспрессируется и соответствующим образом процессируется в контексте рекомбинантного полиовируса (указано стрелкой).

Фиг. 4В представляет фотографию экстрактов из тех же клеток HeLa, инфицированных либо исходным полиовирусом (линия 1), либо рекомбинантным полиовирусом токсин В холеры (СТВ) (линия 5) (пример 2) и зондированных кроличьими антителами, распознающими структурные протеины полиовируса. Полученные результаты показывают, что получается больше, чем нормальный РI полипротеиновый предшественник в полиовирусном рекомбинанте, но происходит соответствующее протеолитическое расщепление, в результате чего образуется нормальный комплемент полиовирусных протеиновых продуктов, а также высвобождается экзогенный СТВ протеин, получаемый из СТВ нуклеотидных последовательностей. Линии 2-4 содержат рекомбинантные полиовирусы, содержащие антигенные эпитопы (21-104 аминокислоты в длину), полученные из ротавирусного VP4 протеина.

На фиг.5 представлены результаты SDS-PAGE анализа, проведенного для определения структуры и состава рекомбинантных вариантов. Характер миграции двух вирусов (исходного и рекомбинантного) совершенно неразличим, что дает возможность предположить, что рекомбинантные вирусы имеют нормальную структуру и композицию протеинов. Показана идентичность полиовирусных капсидных протеинов.

На фиг.6 представлены результаты Вестерн-блот анализа, проведенного для определения способности рекомбинантных полиовирусов вызывать иммунную реакцию у вакцинированного хозяина, в сравнении с контрольными значениями и ложными инъекциями.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным репликационно-компетентным вирусам, которые включают экзогенную последовательность нуклеотидов, которая кодирует экзогенный полипротеин, который получают во время жизненного цикла вируса, и нуклеотидную последовательность, которая кодирует искусственный сайт протеолитического расщепления для вирусной или клеточной протеаз, которые расщепляют полипротеин предшественника, продуцируемый исходным вирусом. Два типа последовательностей могут присутствовать в любом месте исходного вирусного генома, при условии, что их присутствие не нарушает вирусную последовательность, необходимую для вирусной репликации.

Настоящее изобретение основано на демонстрации заявителями того факта, что экзогенную последовательность нуклеотидов, кодирующую экзогенный полипептид, можно строить в геном вируса в конце вирусного генома, или по месту внутри вирусного генома (то есть, по внутреннему сайту) и она может быть получена во время жизненного цикла вируса как полипротеиновый предшественник, который расщепляется вирусной или клеточной протеазами, которые расщепляют протеиновый предшественник, обычно продуцируемый исходным вирусом (то есть, вирусом, в который встраивают экзогенную последовательность нуклеиновых кислот). В одном варианте, в котором экзогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую экзогенный полипептид, встраивают в конце вирусного генома, порядок последовательности в получаемом рекомбинантном вирусном геноме следующий: 5" нетранслируемый участок исходного вируса - уникальный стартовый кодон исходного вируса - экзогенная последовательность нуклеотидов - последовательность нуклеотидов, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления - второй кодон исходного вируса - остальная часть вирусного генома. Участок рекомбинантного генома, который является 5" нетранслируемым участком вирусного генома, может представлять весь, или часть 5" нетранслируемого участка в том виде, как он встречается в исходном вирусе. В другом варианте, где экзогенная нуклеотидная последовательность, кодирующая экзогенный полипептид, встроена в вирусный геном, порядок последовательности в получаемом рекомбинантном вирусном геноме следующий: 5" нетранслируемый участок исходного вируса - уникальный стартовый кодон (кодоны) исходного вируса - исходный кодон (кодоны) транслируемого участка исходного вируса - последовательность нуклеотидов, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления - экзогенная нуклеотидная последовательность - последовательность нуклеотидов, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления - остальная часть исходного вирусного генома.

Кодируемый экзогенный полипептид экспрессируется в контексте трансляции нормального вирусного протеина, как компонент рекомбинантного или слитого полипептида предшественника (который включает экзогенный полипептид, искусственный сайт или сайты протеолитического расщепления и вирусный полипротеин). Рекомбинантный полипептидный предшественник протеолитически расщепляется под действием вирусной или клеточной протеазы (протеаз), которая расщепляет исходный вирусный полипротеин предшественника, что приводит к высвобождению свободного экзогенного протеина из вирусных протеинов. Вирус, модифицируемый таким образом, чтобы он включал экзогенные последовательности, вызывают исходным вирусом, который может быть нативным вирусом (либо патогенным, либо, предпочтительно, непатогенным), ослабленным вирусом, штаммом вакцины или рекомбинантным вирусом. В том смысле, как здесь использован, термин полипептид включает протеины или их части (пептиды), слияния двух или более из протеинов или пептидов и слияния протеина и пептида.

В конкретном варианте заявители получили репликационно-компетентный рекомбинантный полиовирус, который включает экзогенную последовательность нуклеотидов, кодирующую экзогенный протеин, подлежащий экспрессии, и нуклеотидную последовательность, кодирующую искусственный сайт протеолитического расщепления для протеазы полиовируса 3С и/или протеазы 2А, встроенные в конце полиовирусного генома, или по сайту внутри полиовирусного генома. Они продемонстрировали, что экзогенный протеин экспрессируется и высвобождается из полиовирусных протеинов за счет протеолитического расщепления. Получаемые репликационно-компетентные рекомбинантные полиовирусы отличаются от исходных вирусов тем, что они включают экзогенную нуклеотидную последовательность (последовательности), кодирующую экзогенный полипептид или полипептиды, и один или более из искусственных сайтов протеолитического расщепления, и экспрессируют эндогенный продукт во время вирусной инфекции. Исходные полиовирусы могут быть нативными или дикого типа полиовирусами, или рекомбинантными или генетически сконструированными полиовирусами (в этом случае измененные или мутированные последовательности не кодируют экзогенный протеин, пригодный для описанных здесь целей для полиовирусов, которые составляют настоящее изобретение).

В одном из вариантов настоящего изобретения, экзогенная последовательность нуклеотидов, кодирующая экзогенный полипептид, и нуклеотидная последовательность, кодирующая искусственные сайты протеолитического расщепления, расположены в конце полиовирусного генома, между уникальным стартовым кодоном и вторым кодоном полиовирусного генома, так что порядок последовательностей в рекомбинантном геноме следующий: 5" нетранслируемый участок полиовирусного генома - полиовирусный уникальный стартовый (первый) кодон - экзогенная последовательность нуклеиновых кислот - искусственный протеазный сайт распознавания - второй кодон полиовирусного генома - остальная часть полиовирусного генома. В результате экспрессии рекомибнантного полиовирусного генома продуцируется рекомбинантный полипротеиновый предшественник или полипротеин слияния, который включает экзогенный протеин, искусственный сайт протеолитического расщепления и полиовирусный полипротеин. Заявители показали, что протеолитическое расщепление рекомбинантного полипротеинового предшественника протеазой, для которой встроен искусственный сайт расщепления, приводит к продуцированию компонентов нормального полиовирусного протеина и высвобождению экзогенного протеина. Существует также вирусная репликация, но экзогенный протеин не включен в полиовирусный вирион.

Два рекомбинантных полиовируса настоящего изобретения, в которых экзогенная нуклеотидная последовательность и последовательность нуклеотидов, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления, встроены в конце полиовирусного генома, представлены на фиг.1 и 2 (рМОV 1.3). Рекомбинантный полиовирусный геном включает последовательности нуклеиновых кислот (сразу после 3" уникального стартового кодона), которые кодируют пять аминокислотных остатков, присутствующих на аминоконце полипротеина штамма полиовируса Mohoney, типа 1. Наличие этих последовательностей не является необходимым, но их присутствие может повлиять на эффективность экспрессии. Как видно на фиг. 2, рекомбинантный полиовирусный геном может также включать полиглициновый участок рядом со встроенными (экзогенными) последовательностями.

Экзогенные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие подлежащий экспрессии протеин или полипептид, можно встраивать в вирусный геном: например, в поливирусный геном. Как видно на фиг.2, существует ряд дополнительных участков внутри полиовирусного генома, по которым экзогенную последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую экзогенный полипептид, и последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие искусственные сайты протеолитического расщепления, можно расположить для продуцирования репликационно-компетентных рекомбинантных полиовирусов, которые экспрессируют закодированный продукт. Эти сайты внутри генома полиовируса включают соединения между Vp1 кодирующим участком и 2А кодирующим участком, соединение между 2А кодирующим участком и 2В кодирующим участком и соединение между 2С кодирующим участком и 3А кодирующим участком. Полилинкерные/протеолитические фрагменты были встроены по этим сайтам, и полученные рекомбинантные полиовирусы, как было показано, оказались репликационно-компетентны. Используя описанные здесь способы и известные способы, по этим сайтам можно встроить экзогенную последовательность или последовательности нуклеиновых кислот. Встраивание полилинкерных/протеолитических фрагментов по соединению Vpg кодирующего участка и 3С кодирующего участка прекращает вирусную репликацию.

Для облегчения процессинга экзогенных последовательностей внутри вирусного полипротеина необходимо включить соответствующие сигналы протеолитического расщепления по обоим концам вставки. Поэтому порядок последовательностей в полиовирусном геноме, в котором экзогенная последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая экзогенный полипептид, и последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая искусственные сайты протеолитического расщепления, встроены, например, между Vp1 кодирующим участком и 2А кодирующим участком, следующая: 5" нетранслируемый участок полиовирусного генома - полиовирусный уникальный стартовый кодон - Vp0 кодирующий участок - Vp3 кодирующий участок - Vp1 кодирующий участок - последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая искусственный сайт распознавания 3С протеазы или сайт распознавания 2А протеазы - экзогенная последовательность нуклеиновых кислот - последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая искусственный сайт распознавания 3С протеазы или сайт распознавания 2А протеазы - остальная часть полиовирусного генома.

Определение, что существует множество сайтов полиовирусного генома, по которым можно осуществить встраивание последовательностей экзогенных нуклеиновых кислот для продуцирования репликационно-компетентных рекомбинантных полиовирусов, означает, в широком смысле, что существует значительная гибкость и возможность вариаций при конструировании и продуцировании рекомбинантных вирусов, пригодных, например, в качестве вакцин и получения протеинов. Один или более из экзогенных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих экзогенный протеин или полипептид, подлежащие экспрессии и протеолитическому расщеплению, можно строить по одному или более из сайтов (на конце или внутри) описанного здесь вирусного генома. Помимо этого, другие сайты, по которым могут быть осуществлены вставки без нарушения репликационной способности вируса, можно идентифицировать. Возможно, что некоторые экзогенные последовательности нуклеиновых кислот будут более устойчивы, или будут более эффективно экспрессироваться и/или протеолитически расщепляться, если они будут встроены в определенный сайт вирусного генома. Насколько это верно (если вообще справедливо) можно оценить, используя описанные здесь способы и, соответственно, полученные рекомбинантные вирусы, например, как это проделано на примере полиовирусов.

В конструкцию репликационно-компетентных рекомбинантных вирусов могут быть включены дополнительные характеристики, такие, как полилинкерные последовательности (например, EcoR1, Not1, BssH2 и Xho1) для облегчения встраивания целевой чужеродной последовательности в рекомбинантный вектор. Далее, такие варианты, как полиглициновый фрагмент, можно встроить рядом со встроенной последовательностью таким образом, чтобы повысить структурную гибкость участка и потенциально повысить эффективность протеолитического расщепления.

Более одной последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих экзогенный протеин или полипептид, подлежащие продуцированию, можно встроить в рекомбинантные репликационно-компетентные вирусы, которые в результате продуцируют соответствующее число протеинов или полипептидов. Две или более из аминокислотных последовательностей, каждая из которых может кодировать другой продукт, или может кодировать тот же самый продукт (например, если желательно повышенное продуцирование протеина или полипептида). Далее, для полиовируса сайт (сайты) протеолитического расщепления может быть сайтом 3С расщепления, сайтом 2А расщепления, или ими обоими.

Хотя настоящее изобретение проиллюстрировано на примере получения рекомбинантного полиовируса, любой вирус, в котором происходит протеолитическое расщепление протеина вирусного предшественника, может быть модифицирован с тем, чтобы он продуцировал рекомбинантный вирус, который экспрессирует экзогенный протеин и процессирует его соответствующим образом. Так, например, рекомбинантные пикорнавирусы (например, энтеровирусы, полиовирусы, FMDV, риновирусы, эковирусы, вирус гепатита А) и рекомбинантные флавивирусы (например, вирус желтой лихорадки) могут быть получены и использованы таким же способом, который описан для рекомбинантных полиовирусов.

Рассматриваемый способ получения репликационно-компетентного рекомбинантного вируса, который экспрессирует и протеолитически расщепляет экзогенный протеин, представляет собой следующее: Вирус, который в своем природном жизненном цикле (именуемый исходным вирусом) продуцирует протеиновый предшественник, который протеолитически расщепляется вирусной или клеточной протеазой (протеазами), модифицируют, используя известные методы генной инженерии (Sambrook. J. et. al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual /2d, ed/, Cold Spring Harbor Laboratory Precc (1989)) для встраивания, по крайней мере, двух типов последовательностей нуклеиновых кислот в вирусный геном: экзогенной последовательности нуклеиновых кислот (последовательности нуклеиновых кислот, полученной из источника, отличного от типа вируса, в который ее встраивают), кодирующей экзогенный протеин или полипептид, подлежащий экспрессии и процессингу рекомбинантным вирусом, и последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую искусственный сайт распознавания для вирусной и/или клеточной протеазы (протеаз), которая процессирует экспрессированный рекомбинантный протеин с выделением вирусных и экзогенных протеинов. Дополнительный тип последовательности нуклеиновых кислот, например, поли-глициновый фрагмент, может быть встроен рядом с экзогенной последовательностью нуклеиновых кислот для повышения структурной гибкости участка и потенциального повышения эффективности.

Конструирование клона кДНК полиовирусного вектора, иллюстрирующее настоящее изобретение, описано в примере 1. Один или более из "фрагментов", каждый из которых включает экзогенные последовательности нуклеиновых кислот или последовательности, кодирующие экзогенный продукт (продукты), один или более из искусственных протеолитических сайтов распознавания и, необязательно, дополнительные последовательности нуклеиновых кислот, такие, как поли-глициновый фрагмент, могут быть встроены таким образом. Так, например, один "фрагмент", который включает последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую экзогенный протеиновый антиген, против которого нужно выработать иммунную реакцию, и искусственный сайт распознавания для протеолитического расщепления, можно встроить по 5" концу вирусного генома. В другом варианте, два или более таких "фрагмента" или один "фрагмент", которые включают последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие более одного протеина или полипептида, и соответствующее количество сайтов протеолитического расщепления (например, для достижения экспрессии и высвобождения двух или более различных протеиновых антигенов или двух копий одного протеинового агента), можно встроить в вирусный геном. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие протеины или полипептиды, которые необходимо экспрессировать, могут быть в тандеме "фрагментов" (то есть, без прерывающей последовательности) или могут быть разделены нуклеиновыми кислотами, которые не кодируют подлежащий экспрессии протеин или пептид. Один или более из "фрагментов" можно встраивать в некоторые или во все сайты вирусного генома. Полученный рекомбинантный полипротеиновый предшественник включает один или более из экзогенных протеинов или пептидов и один или более из сайтов протеолитического расщепления. Процессинг рекомбинантного полипротеинового предшественника приводит к высвобождению экзогенного продукта или продуктов.

Рекомбинантный вирус, такой, как описанный здесь рекомбинантный полиовирус, можно использовать для индуцирования иммунной реакции против антигена и индивидуума и, тем самым, обеспечить защиту против заражения или инфицирования экзогенным патогеном (бактериальным, вирусным, грибковым, паразитарным), где встречается антиген. Поэтому они полезны в качестве вакцин для создания защиты против таких патогенов. Как описано в примере 2, сконструирован рекомбинантный полиовирус, который включает нуклеотидные последовательности, кодирующие антигенные эпитопы белка Vp4 ротавируса. Как также указано в примере 2, был сконструирован рекомбинантный полиовирус, которых включает целиком кодирующий участок из субъединицы В токсина холеры. Рекомбинантные полиовирусы, которые включают последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие антигены вируса гриппа А или токсин coregulated pilus (tcp A) Vibrio choleral, также были получены. Фенотип этих рекомбинантов и исходного полиовируса представлен на фиг.3. Рекомбинантный полиовирус, содержащий полный кодирующий участок из субъединицы В токсина холеры, экспрессируют в HeLa клетках и определяют его экспрессию и процессинг. Полученные результаты показывают, что В субъединица экспрессируется и соответствующим образом процессируется в контексте рекомбинантного вируса (фиг.4А). Полученные результаты показывают также, что в рекомбинантных полиовирусах образуется более длинный, чем нормальный VP1, полипротеин, но происходит соответствующее протеолитическое расщепление, что приводит к образованию нормального комплемента полиовирусного протеина и свободной последовательности субъединицы В токсина холеры (фиг. 4В). Рекомбинантный полиовирус, содержащий антигенные эпитопы (21-104 аминокислоты), полученные из ротавирусного VP4 протеина, также были экспрессированы в HeLa клетках. Полосы 2-4 на фиг.4В содержат рекомбинантные полиовирусы, содержащие эти эпитопы.

В примере 3 описывается оценка иммуногенности рекомбинантных полиовирусов, полученных как здесь описано. Трансгенных мышей, которые экспрессируют рецептор полиовируса человека, инфицируют внутримышечно рекомбинантным полиовирусом, который экспрессирует полную субъединицу токсина В холеры (СТВ) и сконструирован на основе векторов Mahoney или Sabin. Контрольным мышам либо вводили мнимую инъекцию, либо их инфицировали рекомбинантным вирусом, который экспрессирует пилин Vibrio cholerae. Результаты Вестерн-блот анализа показывает (фиг.6), что мыши, иммунизованные СТВ рекомбинантным полиовирусом на основе Mohoney, отчетливо содержат IgG антитела, реакционно-способные с СТВ мономером и пентамером. У контрольных мышей, как и ожидалось, такие специфические антитела отсутствовали. Кроме того мыши, иммунизованные СТВ рекомбинантным полиовирусом на основе Sabin, не вырабатывают, в этом единственном случае, реакционно-способных СТВ-специфических антител. Причина этого не ясна, но это может быть связано с репликативными характеристиками рекомбинантных полиовирусов и может быть устранено за счет повышения дозы вакцины рекомбинантного вируса.

Рекомбинантный полиовирус, содержащий последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую другие антигены, против которых желательно выработать иммунную реакцию, можно получить способом, аналогичным описанному для протеинов субъединиц токсина В холеры и ротавируса VP4. Рекомбинантные полиовирусы особенно полезны без предотвращения заболеваний (или снижения серьезности, в которой они проявляются), что может потребовать создания иммунитета слизистой оболочки для предотвращения инфицирования. Так, например, рекомбинантные полиовирусы могут быть особенно полезны при создании защиты против инфицирования HIV, ротавирусами, RSV, вирусом гепатита А и вирусом гриппа, или для снижения серьезности заболевания.

Поверхность слизистой оболочки в человеческом организме составляет более 400 м² и представляет огромную поверхность контакта иммунной системы с окружающей средой. Полное число лимфоидных клеток, связанных с поверхностями слизистой оболочки, превышает все остальные лимфоидные клетки, взятые вместе, и эти клетки ответственны за синтез, по крайней мере, 60% от всего количества вырабатываемого в течение дня иммуноглобулина (Childers, N.K. et al., Annu, Rev. Microbiol 43:503-536 (1989)). Наличие специфических IgA антител в таких секретах, как слезы, слюна и молоко, в отсутствие локального экспонирования антигену, привело к созданию концепции общей иммунной системы слизистой оболочки. Потомство иммунных клеток, сенсибилизированных в лимфоретикулярных тканях, связанных с кишечником (GAL T), по-видимому, мигрирует к слизистой поверхности, расположенной на расстоянии, и защищает ее. Несмотря на степень и важность иммунной системы слизистой оболочки, относительно мало известно о детерминантах клеточного и гуморального иммунитета на поверхности слизистой оболочки. Экспериментальная оценка этих сведений ограничена в результате относительно малодоступности соответствующих лимфоцитов, а также трудностями поставки хорошо охарактеризованных антигенов в репродуцируемые мишеневые сайты. Рекомбинантные полиовирусы должны помочь поставлять хорошо охарактеризованные антигены репродуцируемым образом и могут снять некоторые из этих экспериментальных препятствий. Ряд вирусных и бактериальных заболеваний значительной важности нельзя предотвратить вакцинацией в настоящее время. Они включают диарреальные заболевания, вызванные ротавирусами, респираторные заболевания, возникающие за счет RSV инфекции, и бактериальные гастроэнтериты, вызванные V. cholerae или энтеротоксигенными Е. coli. Иммунитет слизистой оболочки создается после природной инфекции этими патогенами, что придает значительную или полную сопротивляемость и устойчивость к повторной инфекции. Рекомбинантные полиовирусы настоящего изобретения можно использовать для того, чтобы поставлять соответствующие защитные антигены в иммунную систему слизистой оболочки и, тем самым, обеспечить новую стратегию в области иммунизации.

Полиовирусные вакцины испoльзовались интенсивно и оказались очень безопасными и эффективными. Биологически активные, молекулярные клоны используемых полиовирусов включают полиовирус типа I (Mohoney штамм) (Racainello, V. et al. , Proc. Natl. Acad. Sсi. U.S.A. 78: 4887-4891(1981)) и вакцинные штаммы полиовирусов Sabin типов 1, 2 и 3 (Omata, T. et al. Gene 33:1-10 (1984); Toyoda. H. et al. J. Mol. Bio. 174:561-585(1984)). Производные полиовирусов также можно получить, которые, по-видимому, менее склонны превращаться в вирулентную форму, или их можно сделать авирулентными из вирулентной формы за счет сайт-направленного мутагенеза за счет вставок, делеций и/или модификаций нуклеотидных последовательностей.

Рекомбинантные полиовирусные вакцины могут с успехом заменять существующие в настоящее время полиовирусные вакцины для орального приема, что требует приготовления смеси трех различных ослабленных штаммов (PV1, PV2 и PV3), каждый из которых имеет изменяющиеся уровни антигенной потенциальной способности, и существует некоторый риск реверсии в дикого типа патогенную форму. PV1 считают и самой безопасной и наиболее антигенной компонентой, тогда как PV3, как известно, страдает достаточно высокой частотой реверсии в патогенный тип. Энтеровирусы: полиовирусы, вирусы Коксаки, эковирусы и новейшие энтеровирусы Мельника, в Virology (2d ed), D.N. Fields, D.M. Knipe et al. (ed) Raven Press Ltd. NY 1990, рр. 549-604: Nkowane, B.M. et al., Vaccine-Associated-Paralytic Poliomyelitis Unаted States: 1973-1984 J. AMA 257: 1335-1340 (1987); Мельник, Популяционная генетика в применении к полиовирусным вакцинам, Am. J. Pub. Health 52:472-483 (1962). Рекомбинантные полиовирусы на основе PV1, в которые встроены компоненты PV2 и PV3, могут оказаться более безопасными вакцинами, нежели существующие в настоящее время. Кроме того, с рекомбинантными полиовирусами на основе PV1 может оказаться возможным достичь эффективного иммунитета против всех полиовирусных штаммов за счет достижения максимального ослабления, антигенно потенциальных рекомбинантных вирусов, содержащих антигенные детерминанты из всех трех полиовирусных серотипов.

Особенные преимущества в использовании рекомбинантных полиовирусов в качестве вакцин состоят в том, что они генетически стабильны и репродуцируемо несут встроенную информацию по мере того, как полиовирусный геном распространяется от клетки к клетке при репликации. В результате, иммунизация должна быть эффективной при ограниченном количестве доз рекомбинантного полиовируса. Кроме того, так как вводимые антигены экспрессируются внутри инфицированных клеток, стимулируется как клеточный, так и гуморальный иммунитет. Хотя экзогенные последовательности нуклеиновых кислот несут рекомбинантные полиовирусы и экспрессируются во время цикла репликации, экзогенные протеины не включены в частицы зрелого вируса. Таким образом, структура и вириона и хозяев рекомбинантных полиовирусов не изменяется под действием экзогенных протеинов. Целый ряд важных переменных ограничивает эффективность доступных вакцин, особенно если их используют в развивающихся странах. Хотя некоторые из этих причин носят практический или экономический характер, другие имеют биологическую основу. Иммунизация противокоревыми вакцинами является хорошим примером биологического барьера, который настоящее изобретение может помочь преодолеть. Корь является причиной гибели 2 миллионов детей ежегодно в развивающихся странах. Bloom., B.R., Nature 342:115-120 (1989). Хотя существуют эффективные вакцины для предотвращения коревой вирусной инфекции, наличие антител, полученных от матери, которые нейтрализуют вакцину, существенно снижает ее эффективность у маленьких детей. Murphy, B.R. and R.M. Chanоck, in: Virology (2d ed.), B.N. Fields et al. (ed), Raven Press, NY pp. 469-502 (1990); Preblud, S.R. and S.L. Katz, Vaccine, S.A, Plotkin and E.A. Mortimer, W.B. Saunders Publishing, Philadelphia (1988).

В развивающихся странах эпидемиология коревой инфекции такова, что множество детей уже заболели, прежде чем они были эффективно вакцинированы. Рекомбинантные полиовирусы, несущие антигены, полученные из вируса кори, могут помочь преодолеть этот барьер. Полиовирусные вакцины вводят вскоре после рождения, и их эффективность заметно не зависит от присутствия полученных от матери антител. Полио-коревой рекомбинантный вирус будет экспрессировать коревые антигены в инфицированных клетках, обеспечивая создание иммунной реакции. Однако, из-за того, что антигены кори не входят в частицы рекомбинантного вируса, рекомбинация вакционного вектора не должна происходить.

Существуют дополнительные области, в которых вакцины настоящего изобретения должны быть полезны. Так, например, как установлено, диарретические заболевания вызывают от 5 до 10 миллионов смертей ежегодно. Институт медицины, Разработки новых вакцин: Establishing Properties, National Academy Press, Washington, D.D. (1985). Ротавирусы являются одним из наиболее важных этиологических агентов тяжелых случаев диарреи у меленьких детей, и считают, что они вызывают приблизительно миллион смертей ежегодно в этой части населения. Kapikian, A. Z. and R.M. Chanock, Jn: Virology (3d ed.), B.N. Field et al. (Ed), Raven Press, NY, pp. 1352-1404 (1990). Хотя был достигнут существенный прогресс в определении иммунной реакции у хозяев на ротавирусную инфекцию, попытки вакцинации были ограничены генетической сложностью вируса и ограниченной эффективностью доступных ослабленных вакцин. Аналогично, было описано, что антигены V, cholerae являются, по-видимому, мишенями защитной иммунной реакции. Однако возможные вакцины против холеры были ограничены либо нежелательными побочными эффектами, либо неадекватной иммуногенностью. Рекомбинантные полиовирусы, несущие иммуногенные, но непатогенные, защитные детерминанты из ротавирусов и V. cholerae, могут рассматриваться как возможные вакцины.

Респираторные заболевания, вызываемые инфекционными антигенами, приводят оценочно к 10 миллионам смертей ежегодно, причем RSV является основным вирусным патогеном. Mclntosh, K. and R.M. Chanock: In: Virology (2d ed), B.N. Field et al. (Ed), Raven Press, N.Y. pp. 1045-1074 (1990). Попытки cоздать RSV вакцину оказались безуспешными до настоящего времени, но был достигнут значительный прогресс в идентификации защитных антигенов. Для того чтобы RSV вакцины были эффективны, они должны создавать иммунитет в слизистой оболочке и их нужно вводить вскоре после рождения, и при этом они должны нейтрализовать действие полученных от матери антител. Рекомбинантные RSV - полиовирусы могут потенциально удовлетворять всем этим требованиям.

Предотвращение заболеваний, вызванных вирусом гепатита В, также является целью создания вакцин настоящего изобретения.

Вирус гепатита В принадлежит к семейству вирусов, называемых Hepadnaviridae. Этот вирус содержит небольшой циклический фрагмент ДНК, который является частично однонитевым. Инфекционный вирион содержит также ДНК полимеразу, которая делает ДНК геном полностью двунитевым. Цикл репликации вируса гепатита В (НВV) включает образование промежуточной РНК.

Вирус гепатита В широко распространен по всему миру. Именно люди, по-видимому, являются основными хранителями вируса, хотя поверхностный антиген вируса был обнаружен у некоторых видов приматов. По существующим оценкам в США встречаются 22 случая гепатита на 100000 населения, но считают, что эта оценка должна быть увеличена раз в 10. Из этих случаев примерно 45% относится к гепатиту В. Таким образом, можно считать, что около 1-1,25 миллионов человека в США являются хронически инфицированными гепатитом В.

Наиболее эффективным способом передачи вируса гепатита В является парентеральная передача. Вирус был обнаружен и в других выделениях организма инфицированных, но остальные типы передачи вируса до сих пор точно не установлены.

НВV также принимает участие в развитии первичной гепатоклеточной карциномы у хронически инфицированных вирусом. Это заболевание наиболее часто встречается в Африке, Китае, Южной Азии, на Аляске и на побережье Гренландии. Гепатоклеточная карцинома часто соответствует общему географическому распространению НВV инфекции.

Предотвращение заболевания, вызванного Bordetella pertussis, является следующей целью изобретения. Эта бактерия является причиной коклюша или непрекращающегося кашля, тяжелого и потенциально смертельного инфекционного заболевания респираторного тракта. Коклюшевые вакцины, используемые в настоящее время, содержат химически инактивированные целые клетки В. pertussis. Неклеточные коклюшевые вакцины были разработаны, и они основаны на материале, полученном химическим путем и физическими методами, выделенном из В. pertussis культур.

Кроме того, были описаны вакцины, которые получены за счет очистки отдельных специфических коклюшевых антигенов, которые затем комбинируют для получения вакцин (опубликованная Европейская патентная заявка 484621). Один из антигенов, включаемых в такую вакцину, является внешним мембранным протеином длиной в 69 кД (Shahin, R.D. et al., Abstracts of the 89^th Annual Meeting of the American for Microbiology, р.51 (1989). Этот антиген можно получить в соответствии со способом настоящего изобретения.

Предотвращение и лечение заболеваний, вызванных вирусами Неrреs (Herрet cviridae), является еще одной целью настоящего изобретения. Вирусы Герпес являются крупными ДНК вирусами, которые создают латентную инфекцию, которая может существовать в течение всей жизни хозяина. После скрытого периода вирус может реактивироваться под действием таких стимулов, как иммуносупрессия или иррадиация.

Вирус Неrреs Simplex типа 1 является причиной таких поражений в области рта, как пузырьковый лишай. Неrреs Simplex типа 2 является причиной герпеса гениталий, который может в дальнейшем осложниться карциномой шейки матки. Эти вирусы Неrреs широко распространены среди населения, и в настоящее время не существует зарегистрированной вакцины против этих вирусов.

Разрабатываемые в настоящее время вакцины против вирусов Неrреs используют такие гликопротеины, которые являются вирусными протеинами, существенными для проникновения вируса в клетки. Особый интерес представляют гликопротеины, обозначаемые gD Herреs Simplex типов 1 и 2. ДНК последовательности генов, кодирующих gD-1 и gD-2, представлены в патентах США 4818694 и 4891315. Любой из этих гликопротеинов можно получить в соответствии с настоящим изобретением. Представляют также интерес гликопротеины, обозначаемые gB Herpes Simplex типов 1 и 2. ДНК последовательности генов, кодирующих gB-1 и gB-2, представлены Stuve L.L. et al. J. Virology 61:326-335 (1987) и Вzik, D.J. et al., Virology 155:322-333 (1986). Любой из этих гликопротеинов можно получить в соответствии с настоящим изобретением.

Заболевания, вызываемые ротавирусом, являются следующей целью настоящего изобретения. В настоящее время ротавирусы рассматриваются WHO как основная причина детских гастроэнтеритов, и борьбе с этим заболеванием отдается высокий приоритет за счет получения подходящих вакцин (Bull W.H.O., 61:251-254(1983)).

Ротавирусный геном состоит из 11 сегментов двунитевой РНК. Эти гены кодируют продуцирование, по крайней мере, 6 структурных протеинов вируса, которые находятся внутри двойной оболочки полных вирусных частиц. Три из этих протеинов являются гликопротеинами внешней оболочки.

Необходимым приближением в разработке такой вакцины является создание с помощью рекомбинантной ДНК технологии нескольких из этих гликопроетинов внешней оболочки ротавирусов. Один из этих гликопротеинов обозначен VP7. ДНК последовательность гена, кодирующего VP7, представлена Both G.W. et al., Proc. , Natl. Acad. Sci U.S.A. 80:3091-3096 (1983). Этот гликопротеин можно получить по способу настоящего изобретения.

Любая ДНК последовательность, которая кодирует пептид или протеин экзогенного организма, которая при экспрессии продуцирует защитный иммунитет против такого организма, или против состояний или недомоганий, вызванных этим антигеном, может рассматриваться как экзогенные нуклеиновые кислоты для целей настоящего изобретения. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие один или более из экзогенных полипептидов (например, антигены или эпитопы), можно включить в вакцины настоящего изобретения. Если более чем один экзогенный антиген или эпитоп кодируется экзогенными последовательностями нуклеиновых кислот, они могут быть антигенами или эпитопами отдельного патогена или антигенов, или эпитопов из более чем одного (различных) патогенов. В предпочтительном варианте такой организм является патогенным микроорганизмом. Так, например, такой экзогенный эпитоп может быть найден на бактериях, паразитах, вирусах или грибках, которые являются агентами, вызывающими заболевания или недомогания. Кроме того, можно использовать эпитопы аллергенов, клетки спермы и раковые клетки. Такие бактерии, паразиты, вирусы или грибки включают, но не ограничиваются теми, которые перечислены далее.

Репликационные-компетентные рекомбинантные вирусы пригодны в качестве вакцин против широкого круга патогенов. Так, например, можно получить ДНК или РНК из любого из перечисленных далее организмов и использовать для получения рекомбинантных вирусов (см. табл. 1а).

Потенциально пригодные антигены для композиций вакцин можно определить с помощью различных критериев, например, по участию антигенов в нейтрализации инфекционной способности патогенов (Norrby, E., 1985, Summary In: Vaccines 85, Larnet R.A,, R.M. Chanock and F. Brown /ed/), Cold spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor NY, pp.388-389), по типу или группе специфичности, по распознаванию антисыворотки или иммунных клеток пациента, и/или при демонстрации защитных свойств антисыворотки или иммунных клеток, специфичных для антигена. Кроме того, закодированные эпитопы должны, предпочтительно, демонстрировать очень мало (или вовсе не демонстрировать) антигенных вариаций во время или среди различных изоляторов одного и того же патогена.

Пептиды или протеины, которые, как известно, содержат антигенные детерминанты, можно включать в рекомбинантные вирусы. Если известны специфические антигены, следует провести идентификацию и охарактеризовать их иммунореакционноспособные последовательности. Одним из способов осуществления этой задачи является использование моноклональных антител, вырабатываемых на поверхности других молекул патогена. Пептидные последовательности, которые могут распознаваться антителами, являются определенными эпитопами. В другом варианте, небольшие конъюгаты небольших синтетических пептидов с молекулами носителя можно тестировать на создание моноклональных антител, которые связываются с сайтами, соответствующими пептиду, на инактной молекуле (см., например, Wilson et al. , Cell 37:767(1984)). Другие способы, известные специалистам, которые можно использовать для идентификации и характеризации антигенных детерминант, также входят в объем изобретения.

Экзогенные протеины в композициях вакцин настоящего изобретения также могут содержать эпитоп экзогенного организма. Если экзогенный полипептид экспрессируют в организм позвоночного хозяина, он вызывает иммунную реакцию, которая защищает против состояний или недомоганий, вызываемых антигеном, содержащим этот эпитоп. Так, например, в этом варианте изобретения, могут быть использованы экзогенные протеины, которые кодируют эпитоп (эпитопы) или протеин (протеины) яда змеи, яда пчелы, гормон, сперму (для контрацепции), вызывающий аллергию антиген или любой другой антиген, против которого желательно вызвать иммунную реакцию. В другом варианте опухолево-специфический антиген можно экспрессировать как рекомбинантный экзогенный протеин, для индуцирования защитной иммунной реакции против рака.

Генную последовательность, кодирующую экзогенный протеин, который нужно экспрессировать за счет рекомбинантного вируса по способу настоящего изобретения, можно выделить способами, известными специалистам (но ими не ограниченными), для очистки от геномной ДНК микроорганизма, за счет кДНК синтеза из РНК микроорганизма, за счет способов рекомбинантной ДНК (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1982, Cold, Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. NY.) или химическим синтезом.

Если рекомбинантные вирусы настоящего изобретения используют в качестве вакцин, их вводят пациентам известными способами. Обычно их вводят так же, как (доступные в настоящее время) вакцины и/или способами, которые имитируют способы инфицирования патогенами, представляющими интерес. Так, например, вакцины рекомбинантного полиовируса можно вводить орально, а другие, например, рекомбинантные вакцины кори или флавивируса можно вводить подкожно. Их можно вводить в композициях вакцин, содержащих в дополнение к репликационно-компетентному рекомбинантному вирусу, физиологически приемлемый носитель. Композиция может также включать иммуностимулирующий агент или адъювант, вкусовой агент или стабилизатор.

Рекомбинантные вирусы настоящего изобретения, особенно рекомбинантные полиовирусы, можно также использовать как систему для получения экзогенного полипротеина в клетках хозяина, например, млекопитающего, особенно человека, или в клетках других типов (например, клетках млекопитающих, модифицированных так, чтобы они содержали рецептор полиовируса). Экзогенный протеин выделяют затем из клеток, в которых он продуцируется, используя известные способы.

В любом из применений (например, при иммунизации или получении тканевой культуры) экзогенная последовательность нуклеиновых кислот, которую встраивают в вирус, может быть получена из природного источника, из источника, полученного с помощью методов генной инженерии, или синтезирована химически. Экзогенная последовательность нуклеиновых кислот, вводимая в вирус, может кодировать полный антиген, против которого желательно выработать иммунную реакцию, или эпитопы антигена или его части.

Размеры последовательности нуклеиновых кислот, которую можно встроить в вирусный геном, по-видимому, не ограничены. Максимальный размер экзогенных последовательностей нуклеиновых кислот можно определить, например, оценив их влияние на репликацию вируса, как здесь указано. Экзогенные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие, по крайней мере, 150 дополнительных аминокислот (то есть, 450 нуклеотидов), были встроены в полиовирусный геном без заметного изменения эффективности репликации вируса. Ожидается, что встроенные последовательности представляют в иммунной системе хозяина антигенные структуры, определяемые как первичной последовательностью, так и конформацией структуры.

В качестве исходного вируса можно также использовать растительный вирус, в который описанным способом встраивают экзогенные последовательности нуклеиновых кислот. Так, например, растительный вирус с ДНК геномом (например, вирусом мозаики цветной капусты) или растительный вирус с РНК геномом (например, вирусом табачной мозаики, вирусом желтой мозаики турнепса) могут быть использованы. Их можно модифицировать, встраивая экзогенную последовательность (или последовательности) нуклеиновых кислот, которая кодирует экзогенный полипептид (например, токсин против насекомых или заболеваний), который нужно встроить в растение. Полученный репликационно-компетентный рекомбинантный растительный вирус вводят в растения (например, в семена или в растения на другой стадии развития), где экзогенный полипептид продуцируется. Так, например, экзогенную последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую токсин, например, токсин скорпиона или паука, можно встроить таким образом, чтобы они экспрессировались в растениях, которые оказываются защищены от насекомых, которые ими питаются. Кроме того, растения, в которых экспрессируются экзогенные последовательности нуклеиновых кислот, можно вводить орально как источник закодированного протеина или полипептида.

Аналогично, исходный вирус может быть вирусом животных, который модифицирован так, что включает экзогенную последовательность нуклеиновых кислот, которая должна экспрессироваться в животном (например, для защиты или иммунизации животного против патогена или для обеспечения фактора ускорения роста).

Далее настоящее изобретение будет проиллюстрировано следующими примерами, которые не следует рассматривать как ограничивающие.

Примеры

Пример 1

Конструирование полиовирусного векторного кДНК клона

Все манипуляции с молекулярными клонами проводят в соответствии со стандартными методиками рекомбинантных ДНК (Ausubel F.M. et al. Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing - Willey Interscience, New York, 1987). Использованные биологически активные молекулярные клоны полиовируса включают полиовирус типа 1 (штамм Mahoney) (Racaniello, V. et al. Proc. Natl. Aсаd. Sci U.S.A. 78:4887-4891 (1981) и вакцинные штаммы Sabin полиовирусов типов 1, 2 и 3 (Омата, Т. et al. Gene 32:1-10(1984); Toyоda, H. et al. J. Mol. Bio. 174:561-585 (1984)). Эти молекулярные клоны были модифицированы за счет встраивания Т7 РНК полимеразного промотора по 5" концу вирусного генома для облегчения ин витро транскрипции за счет Т7 РНК полимеразы инфекционной полиовирусной РНК. Au subel, FM. et al. Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing-Wiley Interscience, N.Y. (1987). Полиовирусные геномы были далее модифицированы таким образом, чтобы включать в рамке синтетический полилинкер, содержащий разнообразные сайты распознавания рестрикционного энзима (например, EсоR1 и Xho1). Встроенные внутрь полиовирусного генома последовательности включают с 3 стороны эти последовательности, кодирующие сайты распознавания и расщепления для полиовирусной 3С протеазы (AXXQG) (Palmenberg, A.C., Ann. Rev. Microbio 44:603-623(1990)). Эти модификации осуществляют в соответствии с вариантом полимеразной цепной реакции (PCR), известной как удлинение с перекрыванием (Ноrtоn, Р.М. еt al. Biotechniques 8: 528-535 (1990)). Она проиллюстрирована на примере полиовируса типа 1.

Короче, две независимые PCR реакции проводят, используя олигонуклеотиды 1 и 2 и 4 (см. таблицу 1б) для амплификации части полиовирусного генома из положений 1-740 и 740-1540, соответственно.

РСR продукты, содержащие фрагмент, который нужно встроить, очищают с помощью электрофореза в агарозном геле, а вторую PCR амплификацию осуществляют с олигонуклеотидными праймерами 1 и 4. Фрагмент ДНК из 1582 пар оснований (вp) из этой амплификации представляет вставку из 42 нуклеотидов (содержащих новые сайты рестрикционных энзимов и последовательности, кодирующие сигналы протеолитического расщепления) и последовательности 1-740 и 740-1540. (Вставку из 42 нуклеотидов встраивают между основаниями 740 и 741). Этот фрагмент переваривают Sal 1 и Aat 2, очищают с помощью гель-электрофореза и лигируют с Sal 1 - Aat 2, переваренным полиовирусным клоном pSR - ХрА (ранее описанная плазмида, содержащая полной длины полиовирусный кДНК клон (Andino, R. et al. Cell. 63:369-380 (1990)). Полученную плазмиду (названную рМ V 2.2) линеаризируют, переваривая с Сla1, и проводят ин витро синтез вирусной РНК за счет Т7 полимеразы в соответствии с обычной схемой (Ausubel, F.М. et al. Current Procols in Мolecular Biology - см. ранее).

Репликационно-компетентный полиовирус выделяют за счет трансфекции ин витро синтезированной полиовирусной РНК в HeLa клетках, по способу Luthman H. et al. Nucl. Acid. Res. II: 1295-1308 (1983). Выделенный вирус характеризуют в соответствии со стандартной методикой в соответствии со способностью к репликации, по структурному составу и нуклеотидной последовательности (Ansubel FM et al. - см. ранее).

Экзогенные генетические последовательности, полученные из различных вирусных и бактериальных патогенов, были экcпресcированы в этих рекомбинантных полиовирусах. Общая стратегия, использованная в этом случае, иллюстрируется на примере полной субъединицы токсина В холеры. Олигонуклеотиды, имеющие следующие последовательности (выбранные так, чтобы обеспечить встраивание в рамку в полиовирусный вектор), используют для амплификации полной субъединицы токсина В холеры, кодирующей участок, содержащийся в плазмиде рjМ17 (Rearson, D.N. et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 79:2978-2980 (1982)):

5"-ТСА GGА АТТ САС АСС ТСА ААА ТАТ Т-3"(посл. 1Д 5),

5"-ТСА GСТ CGА GGG АТТ ТGС CAT ACT ААТ-3" (посл. 1Д 6).

Это праймеры 5 и 6, представленные в табл. 2.

Полученную 312 bр ДНК переваривают EcoR1 и Xho1 (сайты, введенные за счет РСR праймеров) и лигируют с EcoR1 и Xho1 расщепленной рМ V 2,2. Полученную плазмиду обозначают рСН-52, и вирус, полученный после РНК транcфекции, pСН-52. Аналогичное приближение можно использовать для встраивания последовательностей, полученных из плазмидных клонов токсин-двойного регулирования фимбрий Vibrio choleraе (tcpA) (Sun, D. et al. Jnfect. Jmmunol 59: 114-118 (1991)), ротавирусного VР4 гена (Gorziglla, М. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7155-7159 (1990)) и гена гемагглютинина вируса гриппа А (Wiley D. С. et al. Ann. Rev. Biochem. 56:365-394 (1987)). Для тсрА, встроенная последовательность нуклеиновых кислот соответствует карбоксиконцу аминокислот (157-199) протеина. Для гриппа А встроенная последовательность нуклеиновых кислот соответствует аминокислотам 134-284.

Иммунологические характеристики рекомбинантных полиовирусов для подтверждения соответствующей экспрессии и процессинга полиовирусных составляющих, так же как и встроенных последовательностей, получили с помощью Вестерн блот-анализа (Ausubel F.М. et al., см. ранее). Сохранение композиции и структуры нативного вириона проверяют обычным центрифугированием с градиентом сахарозы (15-30%) метаболически меченых (³⁵S) лизатов инфицированных клеток. Градиентные фракции затем анализируют в стандартном SDS-РАGЕ анализе (Ausubel F.М. et al., см. ранее).

Пример 2

Конструирование и оценка рекомбинантного полиовируса, содержащего субъединицу В токсина Vibrio cholerae.

Были сконструированы рекомбинантные полиовирусы, содержащие либо полный кодирующий участок субъединицы В токсина холеры (103 аминокислоты), либо несколько участков капсидного протеина ротавируса VР4 (длиной в 21-104 аминокислоты).

ДНК фрагменты, кодирующие пептиды субъединицы В или VР4, были амплифицированы, и их концы модифицированы за счет включения соответствующих рестрикционных сайтов для целей клонирования. Экспрессированная в отсутствие субъединицы А токсина субъединица В токсина холеры не является токсичной, но может обеспечить антигенные стимулы для усиления защитной иммунной реакции. ДНК фрагменты были встроены в полиовирусный векторный кДВК клон, и РНК была транскрибирована из полученной плазмиды. Рекомбинантные кДНК клоны субъединицы В токсина холеры и ротавируса VP4 были отдельно трансфецированы в клетки НеLa. Рекомбинантные полиовирусные бляшки были получены после инкубирования при 37^oС в течение 3 дней (фиг.2). Фиг.2 демонстрирует морфологию исходных и рекомбинантных полиовирусных бляшек. Экстракты, полученные из клеток НеLа, инфицированных либо дикого типа полиовирусом (полоса 1), либо рекомбинантным вирусом полиовируса токсина В холеры (полоса 2), были обработаны электрофоретически на SDS-PAGE гелях и проанализированы с помощью Вестерн блота (фиг.3А). Вестерн блот был проявлен антиcывороткой кролика, специфической для интактного токсина холеры (А и В субъединицы). Как видно, В субъединица экспрессируетоя и соответствующим образом процеcсируется в контексте рекомбинантных полиовирусов (указано стрелкой).

Экстракты из тех же клеток НеLа, инфицированных либо исходным полиовируоом (фиг. 3В, полоса 1), либо токсин В холеры-полио рекомбинантным вирусом (фиг. 3В, полоса 5), были зондированы антителами кролика, распознающими полиовируcные структурные протеины. Как видно, более чем нормальный РI полипротеин получен в полиовируcных рекомбинантах, из-за присутствия экзогенного полипептида.

Соответствующий протеолитический процессинг обеспечивает создание нормального комплемента полиовирусных протеиновых продуктов, а также высвобождение экзогенных последовательностей токсина холеры. Иммунологическая характеристика рекомбинантных вирусов осуществлялась с помощью Вестерн блот-анализа (Ausubel, F.М. et al., см. ранее). Сохранение структуры нативного вириона подтверждается обычным центрифугированием в градиенте плотности и Вестерн блот-анализом (Ausubel, F.М. et al., cм. ранее).

Пример 3

Оценка иммуногенности рекомбинантных полиовирусов

В экспериментальной модели для исследований исходной иммуногенности используют трансгенных мышей, которые экспрессируют рецептор полиовируса человека (Ren. et al., Cell 63:353-362 (1990), любезно представленных Vincent Racaniello). Трансгенных мышей инфицируют внутримышечными инъекциями рекомбинантных полиовирусов (50 мкл 210⁸ pfu /мл), которые экспрессируют полную субъединицу В токсина холеры (СТВ) в контексте векторов на основе Mahoney или Sabin/MоSB и MsSB, соответственно. Контрольных мышей либо инфицировали рекомбинантным вирусом, который экопрессирует Vibrio cholerae фимбрии (ТсрА) (МоРi), либо имитировали инъекцию. Мышей инфицировали дважды с интервалом 30 дней. Спустя 43 дня вакцинированным мышам внутрибрюшинно вводили 10 мкг очищенного СТВ (Calbiochem) в неполном адъюванте Фрейнда. Спустя 5 дней у мышей брали кровь, и их сыворотку тестировали на наличие JgG антител реактивных с очищенными СТВ. Антитела, реактивные с СТВ, детектировали Вестерн блот-анализом следующим образом. 5 нг СТВ подвергают SDS-PAGE разделению в одной широкой полосе 10% полиакриламидного геля и переносят на нитроцеллюлозу. Сыворотку (разбавление 1:100) от иммунизованных животных вводят в независимые полосы много-щелевого аппарата (Mini - Protean 11, multi - Serecn BioRad). Связанные антитела детектируют, используя афинно очищенный кроличий анти-мышиный JgG, конъюгированный с пероксидазой, в соответствии со стандартными cпособами (ECL, Amercham).

Результаты этого анализа представлены на фиг. 6. Сыворотка от 5 из 5 мышей, иммунизованных СТВ-рекомбинантным полиовирусом, МоSB (полосы 3-7), отчетливо содержит JgG антитела, реактивные с СТВ мономером и пентамером. Сыворотка тех мышей, которым имитировали инъекцию (полосы 1 и 2), или не относящегося к делу контроля (MoRi, полосы 12-14), как и ожидалось, не содержит таких специфических антител. Кроме того, мыши, иммунизованные рекомбинантными СТВ на основе Sabin - экспрессирующие полиовирус, не демонстрируют СТВ-специфическую реактивность антител (MsSB, полосы 8-11). На основании этих предварительных результатов можно сделать ряд выводов. Во-первых, иммунизация рекомбинантными полиовирусами может либо непосредственно создать, либо специфически примировать соответствующую реакцию антител у иммунизованных животных. Отсутствие СТВ-специфических антител в сыворотке контрольных мышей, которых аналогично иммунизовали очищенными СТВ; и JgG изотип СТВ-реактивных антител указывают, что анамнестическая реакция была вызвана вакцинацией. Причина этого неясна, но это может быть связано с родственными репликативными характеристиками рекомбинантных полиовирусов, и может быть устранена за счет повышения дозы рекомбинантной вирусной вакцины. Как дикого типа, так и рекомбинантные Sabin полиовирусы реплицируются хуже, чем их дикого типа Mahoney двойники. Далее, трансгенные мыши, использованные в этих экспериментах, не поддерживают эффективную репликацию полиовирусов вакцинного штамма Sabin. Таким образом, ограниченная репликация ин виво может предотвратить создание эффективной иммунизации рекомбинантами на основе Sabin.

Пример 4

Оценка безопасности рекомбинантных вирусов

Параллельно исследованиям иммуногенности рекомбинантных полиовирусов, были проведены предварительные оценки безопасности этих вирусов. Для этой цели трансгенным мышам ввели в позвоночник равные титры (510⁶ БОЕ) либо исходного Mahoney (патогенного) либо Sabin (ослабленного) штаммов, либо их рекомбинантные производные, которые экспрессируют СТВ. Хотя все мыши, которым инокулировали штамм Mahoney, оказались парализованными, ни одна из мышей, которым ввели рекомбинанты, не испытывала паралича. Этот результат дает возможность предположить, что встраивание СТВ последовательностей внутрь полиовирусного генома скорее ослабляет, нежели усиливает патогенность полученного рекомбинантного вируса. Более подробное исследование этого явления проводится в настоящее время.

Пример 5

Конструирование дополнительных репликационно-компетентных полиовирусов

Рекомбинантные полиовирусы, схематически представленные на фиг.2, были сконструированы аналогичным образом, с использованием способов и материалов, здесь описанных (см. примеры 1 и 2) и известных специалистам. Для использования потенциала для экспрессии экзогенных кодирующих последовательностей по сайтам, отличным от 5" рекомбинантного полиовирусного протеина, полилинкерные/протеолитически расщепляющие фрагменты были встроены в ряд дополнительных мест внутри вирусного генома. Эти сайты включают соединение между V р1 и 2А (pMoV2.I и рМоV2.2), соединение между 2А и 2В (рМоV 2.5), соединение между 2С и 3А (рМоV 3.1) и соединение Vpg и 3C (рМоV 3.5). Для облегчения процессинга экзогенных последовательностей внутри вирусного полипротеина, соответствующие сигналы протеолитического расщепления были встроены по обоим концам вставки. При таком способе встраивания, три из новых сайтов для вставок позволяют создавать репликационно-компетентные рекомбинантные вирусы, которые стабильно содержат нужную вставку. Полученные вирусы, представленные на фиг. 2, обозначенные рМоV 2.1, рмоV 2.2, рМоV 2.5 и рМоV 3.1, все репликационно-компетентны и в действительности демонстрируют почти дикого типа морфологию бляшек и кинетику репликации. Единственной рекомбинантной модификацией, которая приводит к прекращению репликации вируса, является положение встраиваемой последовательности между Vpg и 3С. Возможность встраивать экзогенные антигенные последовательности по, крайней мере, четырем возможным положениям в полиовирусном геноме обеспечивает гибкость в получении рекомбинантных полиовирусных вакцин.

Как представлено на фиг.2, векторы, которые включают 3С сайт расщепления, и векторы, которые содержат 2А сайт расщепления, были сконструированы. Векторы, которые используют полиовирусную 3С протеазу для высвобождения экзогенных последовательностей из полипептидного предшественника, содержат Q-G сайт процессинга. Аналогичные рекомбинантные вирусы, которые используют полиовирусную 2А протеазу для осуществления соответствующего процессинга рекомбинантного полипротеинового предшественника, содержат специфический 2А сайт процессинга, обеспечиваемый У - G парой и окружающими аминокислотами. Вирусы рМоV 2.1 и pMoV 2.2 на фиг. 2 представляют такие векторы на основе 2А и, как было указано ранее, демонстрируют рост, близкий к вирусам дикого типа. Полиовирусные векторы (фиг.2) были сконструированы так, что они содержат более экстенсивную полилинкерную последовательность (EcoR1, Not1, BssH2 и Xho1), нежели присутствующая в рекомбинантном полиовирусе, представленном на фиг. 1, для облегчения встраивания нужных экзогенных последовательностей нуклеиновых кислот в рекомбинантный вектор. Кроме того, были также с успехом получены варианты, которые включают поли-глициновый участок рядом со встраиваемой последовательностью, с тем, чтобы обеспечить структурную гибкость участка и потенциально повысить эффективность протеолитического расщепления. Вообще, эти векторы увеличивают возможности основной стратегии и обеспечивают разнообразие альтернативных подходов для создания векторов вакцин.

Экзогенная последовательность нуклеиновых кислот (или последовательности), каждая из которых кодирует протеин или полипептид, который нужно экспрессировать, и последовательность нуклеиновых кислот, или последовательности, каждая из которых кодирует сайт протеолитического расщепления (например, 3С протеолитический сайт или 2А протеолитический сайт), могут быть введены в исходный полиовирусный геном по любому из сайтов, с использованием известных способов и способов, описанных в настоящем изобретении. Способность получаемых рекомбинантных полиовирусов продуцировать закодированный протеин (протеины) или полипептид (полипептиды), можно оценить описанным ранее способом. Иммуногенность рекомбинантных полиовирусов и их безопасность также можно оценить описанными ранее способами (см. примеры 3 и 4).

Пример 6

Стратегия конструирования рекомбинантных полиовирусов

Примеры 1-5 использовали встраивание в полиовирусный геном в рамке синтетические полилинкеры, содержащие сайты распознавания рестрикционных энзимов. В примере 6 описывается стратегия конструирования рекомбинантных полиовирусов, которые не требуют встраивания экзогенных рестрикционных сайтов или изменения окружения полиовирусного генома вокруг сайта встраивания для экзогенного гена. Далее, в примере 6 описывается стратегия встраивания экзогенных последовательностей нуклеиновых кислот в рамке с полипротеиновой открытой считывающей рамкой. Далее, примеры 7-9 описывают встраивание специфических экзогенных последовательностей нуклеиновых кислот в этот рекомбинантный полиовирус таким образом, чтобы получить вектор для экспрессии экзогенных полипептидов.

В этом примере 6 используется система Racaniello и Baltimore, которая позволяет осуществлять генетические манипуляции с полиовирусом (Racaniellо, V.R. and Baltimore, D. Science 214:916-919 (1981)). Плазмиды, содержащие полной длины кДНК копии полиогеномной РНК, как было обнаружено, продуцируют инфекционные вирусы с последующей трансфекцией в соответствующие клетки хозяина в культуре. Эту систему использовали для исследования многих аспектов репликации полиовирусов, генетической стабильности и ослабления штаммов вакцин.

Более конкретно, используемый полиовирусный вектор получают из плазмиды pLED 3.2. Плазмида pLED 3.2 состоит из плазмиды рBR 322, в которую встроена полной длины кДНК копия полиовирусного генома Sabin типа 3. Вирус Sabin типа 3 представляет собой ослабленный штамм, используемый в настоящее время для оральных полиовакцин. Полиовирусную кДНК клонируют после РНК палимеразного промотора бактериофага Т7. Наличие этого промотора позволяет осуществлять ин витро транскрипцию с использованием Т7 РНК полимеразы для получения полной длины РНК транскриптов, которые продуцируют полиовирус с последующей трансфекцией в клетки культуры тканей. Образцы плазмиды pLED 3.2 были депонированы в Американской коллекции типовых культур под регистрационным номером АТСС 75062 (12301 Parklawn Drive, Pockwille, Maryland 20852, США). 20 августа 1991 г.

Стратегия встраивания экзогенных последовательностей нуклеиновых кислот в рамке с открытой считывающей рамкой полиовирусного полипротеина включает использование полимеразной цепной реакции (РСР) удлинения с перекрыванием (Horton, R. М. et al., Gene 77:61-68 (1989)). Этот способ позволяет осуществлять слияние генных последовательностей без необходимости встраивания рестрикционных сайтов. Экзогенные гены соединяют в рамку с открытой считывающей рамкой полипротеина без изменения фланкирующей полиовирусной последовательности.

Эта стратегия включает два цикла PCR: в первом вводят перекрывающиеся фланкирующие последовательности в подлежащий клонированию ген; во втором используют два PCR фрагмента как матричную ДНК; что приводит к точному слиянию за счет перекрывающихся последовательностей.

Клоны экспрессии конструируют, используя PCR удлинения с перекрыванием для слияния экзогенного гена в начале участка, кодирующего полиовирусный полипротеин (основание 743). В дополнение, последовательность, кодирующую сайт распознавания 3С протеазы полиовируса, встраивают в направлении 3" к экзогенному гену. Специфические праймеры, используемые в этих примерах, представлены далее в табл. 2.

В первом цикле РСR реакционная смесь содержит приблизительно 2 нГ матричной ДНК, 100 пмолей каждого праймера, 200 мкмолей каждой dNТР, 10 мМ КСl, 10 мМ Трис-HCl, рН 8,3, 3,75 мМ MaCl₂ и 5 ед. AmpliTаg ДНК полимеразы, фрагмент Stoffel/Perkm/Elmer/Cetus, Norfalk, CT/. Реакционную смесь размещают в 100 мкл объемы и покрывают сверху 40 мкл светлого минерального масла. Условия РCR цикла следующие: 95^oС 2 минуты, лед 2 минуты, затем 95^oС 1 минута, 50^oС 1 минута, 72^oС 2 минуты в течение 30 циклов. Полученные РСR фрагменты очищают, используя набор Promega Magic РСR (Promega, Madison, WY) или электрофорез на агарозном геле (Sambrook. J. et al., Molecular Cloning: А Laboratory Manual 12 nd. Ed. Cold. Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)).

Участки pLED 3.2, которые расположены по краям основания 743, также амплифицируются в первом раунде РСR реакций с тем, чтобы обеспечить вторую матричную ДНК для достижения слияния. Дополнительные перекрывающиеся последовательности не добавляют на эти фрагменты; это позволяет использовать эти фрагменты для конструирования ряда различных слияний, каждое из которых содержит различные экзогенные гены. Праймеры, использованные для участка в обратном направлении (5") от основания 743, представляют собой праймеры С и D (см. табл. 2). Праймеры, которые используют для участка в прямом направлении (3") от основания 743, представляют собой праймеры Е и F (см. табл. 2). Матрицей для этих реакций является pLED 3.2, линеаризированная Xba1. PCR реакции ведут в соответствии с описанным ранее. В результате этих реакций получают фрагменты из 472 и 524 пар оснований для 5" и 3" участков pLED 3.2, соответственно. Полученные РСR фрагменты очищают на 0,8% агарозе с низкой температурой плавления (Seaplaque FMC (Rockland, ME)), а затем используют в качестве матриц для последующих реакций.

Второй раунд РСR реакций включает смешивание двух РСR фрагментов (только что описанных) и осуществление амплификации в присутствии внешних праймеров до получения продукта слияния. В конструкциях, которые будут описаны в примерах 7-11, экзогенный ген сливают с 5" или 3" фрагментом в отдельных РСR реакциях. Затем продукты слияния клонируют в pLED 3.2, используя уникальные рестрикционные сайты, представленные в этой плазмиде.

РСR реакционная смесь второго раунда содержит I мкл каждой матрицы, 100 пмолей каждого праймера, 200 мкмолей каждой dN ТР 10 мм KCl, 10 мМ Трис-HCl, рН 8,3, 3,75 MgCl₂ и 5 ед. AmpliTag ДНК полимеразы, фрагмент Staffel (Perkin - Elmer/Cetus). Реакционную смесь распределяют в 100 мкл объемы и заливают 40 мкл светлого минерального масла. Условия РСR цикла следующие для второго раунда: 94^oС 5 минут, 72^oС 10 минут, затем 94^oС 1 минута, 50^oС 1 минута, 72^oС 2 минуты в течение 30 циклов. Фрагменты слияния выделяют на 0,8% агарозе с низкой температурой плавления, переваривают соответствующими рестрикционными энзимами и субклонируют в pLED 3.2.

Пример 7

Конструирование рекомбинантного полиовируса, содержащего поверхностный антиген вируса гепатита В

Полиовирусный вектор, полученный из плазмиды pLED 3.2 по способу примера 6, используют для конструирования вирусного вектора для экспрессии S гена, кодирующего поверхностный (S) антиген вируса гепатита В. Было обнаружено, что антиген является защитным для вируса гепатита В. S антиген представляет собой протеин из 226 аминокислот длиной. В этом примере S ген гепатита В получают из субтипа ayw вируса человека, специфически из клонированной геномной ДНК. S ген вируса гепатита В из субтипа ayw имеет длину 675 пар оснований (Galiber F. et al., Nature, 281:646-650 (1979)).

Праймеры А и В (см. табл. 2) используют в первом раунде PCR для амплификации гена и встраивания перекрывающихся pLED 3.2 последовательностей в РСR продукт. Подчеркнутые последовательности в этих двух праймерах соответствуют последовательности в pLED 3.2, причем остальная часть последовательности соответствует S гену. В праймере A S генная последовательность соответствует кодону инициирования для S антигена у 157 пары оснований в геноме вируса гепатита В. Антисмысловой праймер В кодирует карбоксильный конец S антигена плюс cайт распознавания для полио 3С протеазы. Эти праймеры используют с клонированной ДНК гепатита В в качестве матрицы для создания РСR, фрагмента из 717 пар оснований. Первый раунд PCR, цикла проводят в следующих условиях: 94^oС 2 минуты, лед 2 минуты, затем 94^oС 1 минута, 26^oС 1 минута, 70^oС 2 минуты в течение 10 циклов, 94^oС 1 минута, 45^oС 1 минута, 70^oС 2 минуты в течение 20 циклов (как видно, они отличаются от условий примера 6).

Во второй РСR реакции используют описанные ранее фрагменты для создания слияний между pLED 3.2. фланкирующими участками и S геном. Осуществляют две РСR реакции с либо 5" pLED 3.2 фланкирующим участком, либо 3" pLED 3.2 фланкирующим участком плюс S генный РСR фрагмент в качестве матрицы. Смысловой праймер для 5" слияния является праймером С, причем он примирует по 5" концу pLED 3.2 фланкирующего участка. Антисмысловой праймер В примирует по 3" концу S гена. Для 3" слияния смысловым праймером является S генный смысловой праймер (А) с 3" LED 3.2 антисмысловым праймером (F). Полученные РСR фрагменты представляют собой 1175 и 1222 пар оснований для 5" и 3" слияний соответственно. Затем фрагменты слияния очищают с помощью электрофореза в агарозном гене.

Фрагменты слияния, полученные на втором раунде РСR реакций, переваривают затем рестрикционными энзимами для окончательного конструирования полиовирусного вектора, содержащего S ген. 5" LED 3.2 - S генное слияние переваривают m1u1 и BsтХ1 (уникальный сайт внутри S гена). 3" LED 3.2 - S генное слияние переваривают Avr 11 и BsтХ1. плазмиду pLED 3.2 переваривают по паре оснований 278 М1u1 и по паре оснований 1249 с помощью Avr1 для удаления фрагмента из 971 пары оснований. После очистки с помощью электрофореза на агарозном геле, полученные перевары смешивают и лигируют вместе, используя стандартные методики (Sambrook et al, см. ранее) до получения pLED 3.2/НBV. ДНК последовательность этой полной длины полио-слитой конструкции определяется с использованием Applied Biosystems (Foster City, СА), 370А ДНК секвенатором.

Затем проводят реакции транскрипции и трансфекции. РНК транскрипты, полученные из Т7 промотора, трансфецируют в V ero клетки для создания инфекционных полиовирусов. Для этих экспериментов приблизительно 5 мкг pLED 3.2/ НВV приготавливают для создания РНК транскриптов за счет переваривания плазмиды Pvu1. Pvu1 переваривание приводит к получению двух фрагментов, причем более крупный фрагмент содержит Т7 промотор, после которого следует полной длины полиогеном, содержащий S генное слияние. Продукт реакции переваривания экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Осажденную ДНК повторно суспендируют в 20 мкл воды. Полной длины РНК транскрипты синтезируют ин витро из Pvu1 -переваренной ДНК, используя Т7 РНК полимеразу (Moss, Е.G., et al., j. Virol, 63:1884-1890 (1989)).

Продукт транскрипции анализируют с помощью электрофореза на агарозном геле.

Конфлюэнтные 25 см² монослои V его клеток трансфецируют транскриптами, используя схему трансфекции ДЕАЕ (Van der Werf Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2330-2334 (1986)). Приблизительно 25 мкг РНК смешивают с ДЕАЕ-декстраном (0,5 мг/мл) и затем наливают сверху на V eгo клетки. Спустя 30 минут инкубирования при комнатной температуре, инокулят удаляют, а клетки промывают. Свежую модифицированную поддерживающую среду Эрла добавляют, и клетки инкубируют при 33,5^oС. После 5 дней инкубирования наблюдают полный цитопатический эффект (лизис клеток в монослое), и рекомбинантный полиовирус собирают из культуральной среды.

Вирусные порции, содержащие рекомбинантный полиовирус, полученный из конструкции pLED 3.2/HBV, титруют в анализе бляшек на V его клетках. Кроме того, РНК экстрагируют из рекомбинантного вируса и анализируют с помощью транскрипции и РСR, используя набор РСR Gene Amp термостабильной rTrh обратной транскриптазы РНК (Perkin - E1mer - Cetus). Полученные результаты демонстрируют, что S ген стабильно сохраняется в рекомбинантном pLED 3.2/НBV вирусе при ведении в культуре.

Для анализа экспрессии S антигена из полиовирусного вектора используют различные способы. Эти способы, которые являются стандартными процедурами, включают иммуно-пероксидазное окрашивание инфицированных клеток, иммуноосаждение вирусных и чужеродных протеинов, Вестерн-блот и Дот-блот (Coligan, j.Е. et al. Current Protocolsin Jmmunology, Johu Wiley and Sons (1992)).

Анализ иммунопероксидазного окрашивания используют для определения протеинов в инфицированных вирусом V его клетках. V его клетки инфицируют вирусом и фиксируют этанолом или метанолом через различные промежутки времени после инфицирования. Фиксированный клеточный монослой инкубируют с антисывороткой против либо полиовирусных протеинов, либо S антигена. Пластины промывают, а затем инкубируют со вторичным антителом (например, козьим анти-кроличьим IgG), конъюгированным с перокоидазой хрена (НRР). Пластины снова промывают, а затем добавляют НRP субстрат, 3,3"-диаминобензидинтетрагидрохлорид (Сигма, Сан-Луис, МО). Клетки, которые экспрессируют протеины, которые перекрестно реагируют с антителами, оказываются окрашенными.

Монослой V его клеток инфицируют рекомбинантным вирусом. Клеточные лизаты можно исследовать иммуноосаждением или Вестерн блоттингом на наличие вирусных закодированных протеинов. Для иммуноосаждения клеточные лизаты инкубируют с антисывороткой против полиовируса или экзогенного протеина. Протеин А Сефарозу (Сигма, Сан-Луис. МО) добавляют затем к смеси, и продолжают инкубирование. Сефарозные шарики центрифугируют, промывают и элюируют SDS диссоциационным буфером. Осажденные протеины можно проанализировать с помощью электрофореза на SDS-долиакриламидном геле. Для Вестернблоттинга клеточные листы разделяют на SDS-PAGE, переносят на нитроцеллюлозу и инкубируют с антисывороткой до представляющих интерес протеинов. Блоты промывают, инкубируют со вторичным антителом (например, козьим-анти-кроличьим IgG), конъюгированным с НRР. Блоты снова промывают, а затем НРР субстрат, 4-хлор-1-нафтол (Bio Rad Richmond CA) плюс перекись водорода, добавляют для идентификации перекрестно реагирующих протеинов.

В этом примере 7 и последующих примерах можно использовать способ, описанный в примере 3 ранее, используя трансгенных мышей для оценки иммуногенности рекомбинантных полиовирусов и экзогенных полипептидов.

Пример 8

Конструирование рекомбинантного полиовируса, содержащего гены пре-S участка вируса гепатита В

Оболочка вируса гепатита В содержит три протеина, причем все они закодированы внутри участка S гена генома вируса гепатита В. Каждый антиген кодируется различными стартовыми сайтами внутри открытой считывающей рамки S генного участка. Основным протеином является S антиген, который содержит 226 аминокислот. Два других протеина представляют собой средний и крупный протеин, которые закодированы пре-S1 и пре-S2 генами, соответственно (Tiollais, Р. et al, Nature, 317: 489-495 (1985)). Считают, включение пре-S1 и/или пре-S2 антигенов в вакцину, которая может содержать еще и S антиген, может повысить эффективность вакцин против вируса гепатита В.

Стратегия конструирования полиовирусных векторов, содержащих пре-S1 и пре-S2 гены, аналогична стратегии описанной в примере 7 для S гена. Праймеры конструируют для амплификации каждого гена и для встраивания полиовирусных фланкирующих последовательностей по обе стороны гена. Праймеры представлены в табл. 2, PCR реакционнее среды и условия циклинга представлены ранее.

Праймеры G и Н используют для амплификации пре-S1 участка из ДНК вируса гепатита В. Праймер G встраивает полиовирусную последовательность (подчеркнуто в табл. 2) по 5" концу пре-S1 гена, причем пре-S1 последовательность начинается у основания 2580 в геноме вируса гепатита В. Антисмысловой праймер Н расположен в пре-S участке генома (общего как для пре-S1, так и для пре-S2) от основания 3152-6 и включает есоR1 сайт у основания I. РCR амплификация клонированной геномной ДНК гепатита В с праймерами G и Н приводит к фрагменту из 338 пар оснований. Этот фрагмент используют как матричную ДНК, наряду с 5" LED 3.2 фрагментом (из праймеров С и Д, описанных в примере 6) во второй РСR реакции. Амплификация с праймерами С и Н приводит к слитому 5" LED 3.2 - пре-S1 фрагменту из 770 пар оснований. Для конструирования 3" конца пре-S1 гена, РСR фрагмент 3" LED 3.2- пре-S2 используют (см. следующий параграф), так как этот участок одинаков в обеих преконструкциях. 5" LED 3.2. - пре-S1 фрагмент переваривают M1u1 и EcoR1. 3"LED 3.2 -пре-S2 фрагмент переваривают есоR1 и Avr11. Полученные фрагменты очищают с помощью электрофореза на агарозном геле и лигируют в pLED 3.2, которая была переварена М1u11 и Avr11. Полученную конструкцию обозначают pLED 3.2/пре-S1.

По способу примера 7 ДНК последовательность этой полной длины полио-слитой конструкции определяют, используя Applied Biosistem 370А ДНК секвенатор.

Затем проводят реакции транскрипции и трансфекции. РНК транскрипты, создаваемые из Т7 промотора, трансфецируют в V его клетки для создания полиовируса. Для этих экспериментов приготавливают приблизительно 5 мкг pLED 3.2 /пре-1 для создания РНК транскриптов за счет переваривания плазмиды Pvu1. Pvu1 переваривание приводит к получению двух фрагментов, причем более крупный фрагмент содержит Т7 промотор, после которого следует полной длины полиогеном, содержащий пре-1 генное слияние. Полученный после переваривания продукт экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Осажденную ДНК повторно суспендируют в 20 мкл воды. Полной длины РНК транскрипты синтезируют ин витро из Pvu1 - переваренной ДНК, используя Т7 РНК полимеразу. Продукты транскрипции анализируют с помощью электрофореза на агарозном геле.

Конфлюэнтные 25 см² Vего клеточные монослои трансфецируют с транскриптами, используя схему ДЕАЕ-трансфекции. Приблизительно 25 мкг РНК смешивают с ДЕАЕ-декстраном (0,5 мг/мл), и затем выливают поверх Vего клеток. Спустя 30 минут инкубирования при комнатной температуре, инокулят удаляют, и клетки промывают. Свежую модифицированную поддерживающую среду Эрла добавляют, и клетки инкубируют при 33,5^oС. Культуры инкубируют до тех пор, пока не наблюдается полный цитопатический эффект, и рекомбинантные полиовирусы собирают из культуральной среды.

Вирусный продукт, содержащий рекомбинантные полиовирусы, полученные из конструкции pLED 3.2/пре-S1, титруют с помощью анализа бляшкообразования на V его клетках. Кроме того, РНК экстрагируют из рекомбинантного вируса и анализируют за счет обратной транскрипции и PCR, используя Gene Amp Термостабильную rTтh обратную транскриптазную РНК, РCR набор (Perkin-E1mer/Cetus). Полученные результаты показывают, что npe-S1 ген стабильно сохраняется в рекомбинантном pLED 2.3/пре-S1 вирусе при введении в культуре.

Для анализа экспрессии пре-S1 антигена из полиовирусного вектора используют различные способы. Эти способы включают иммуноосаждение вирусных или чужеродных протеинов, Вестерн-блоттинг и дот-блоттинг.

Экспрессионный клон для пре-S2 использует праймер Y в качестве смыслового праймера, и праймер В в качестве антисмыслового праймера (см. табл. 2). Эти праймеры приводят к амплификации полного пре-S2 гена и встраивают LED 3.2 последовательности по 5" и 3" концам. В результате РСR реакции создается фрагмент 867 пар оснований. После очистки этот фрагмент используют в качестве матрицы для второго раунда РСR реакций либо с 5" LED 3.2 либо 3" LED 3.2 фрагментами, что приводит к образованию продуктов слияния, обозначаемых 5" LED 3.2/пре-2 и 3" LED 3.2/пре-2. Во втором раунде РСR в качестве праймеров используют С и В для 5" слияния и Y и F для 3" слияния, фрагмент 5" LED 3.2/-пре-S2 переваривают Xba1 и Xba1. 3" LED 3.2/пре-2 фрагмент переваривают Хba1 и Avr11. Полученные фрагменты очищают о помощью электрофореза на агарозном геле и лигируют в pLED 3.2, которая была переварена М1u1 и Avr11. Полученную конструкцию обозначают pLED 3.2/ пре-S2.

По способу примера 7 ДНК последовательность этой полной длины конструкции полио-слияния определяют, используя ДНК секвенатор Applied Biosistems. РНК транскрипты, полученные из Т7 промотора, трансфецируют в V его клетки для создания инфекционного полиовируса. Для этих экспериментов приготавливают приблизительно 5 мкг pLED 3.2/пре-S2 для создания транскриптов за счет переваривания плазмиды Pvu 1. Pvu1 переваривание приводит к получению двух фрагментов, причем более крупный фрагмент содержит Т7 промотор, за которым следует полной длины полиогеном, содержащий npe-S2 генное слияние. Продукт реакции переваривания экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Осажденную ДНК повторно суспендируют в 20 мкл воды. Ин витро синтезируют полной длины РНК транскрипты из ДНК, переваренной Pvu1, с использованием Т7 РНК полимеразы. Продукты транскрипции анализируют с помощью электрофореза на агарозном геле.

Конфлюэнтные 25 см² монослои V его клеток трансфецируют транскриптами, используя схему ДЕАЕ-трансфекции. Приблизительно 25 мкг РНК смешивают с ДЕАЕ-декстраном (0,5 мг/мл) и затем выливают поверх V его клеток. Спустя 30 минут инкубирования при комнатной температуре, инокулят удаляют, а клетки промывают. Добавляют свежую модифицированную среду Эрла, и клетки инкубируют при 33,5^oС. Культуры инкубируют до наблюдения полного цитопатического эффекта, и рекомбинантные полиовирусы собирают из культуральной среды.

Полученные вирусы, содержащие рекомбинантные полиовирусы, полученные из конструкции pLED 3.2/пре-S2, титруют в анализе бляшкообразования на V его клетках. Кроме того, РНК экстрагируют из рекомбинантного вируса и анализируют с помощью обратной транскрипции и РСR, используя РСR набор Gene Amp термостабильных rTтh обратных транскриптазных РНК (Perkin - Elmer/Cetus), полученные результаты показывают, что пре-S2 ген стабильно сохраняется в рекомбинантном pLED 3.2/пре-S2 вирусе при введении его в культуре.

Для анализа экспрессии пре-S2 антигена из полиовирусного вектора используют различные способы. Эти способы включают окрашивание иммунопероксидазой инфицированных клеток, иммуноосаждение вирусных и чужеродных протеинов, Вестерн-блоттинг и дот-блоттинт.

Для определения протеинов в инфицированных вирусом V его клетках используют анализ окрашивания иммунопероксидазой как для пре-S1, так и для пре-S2. V ero клетки инфицируют вирусом и фиксируют этанолом или метанолом в различные моменты времени после инфицирования. Фиксированные клеточные монослои инкубируют с антисывороткой против либо полиовирусных протеинов, либо против пре-S1 или пре-S2 антигенов, в зависимости от случая. Пластины промывают, а затем инкубируют со вторичным антителом (например, козьим анти-кроличьим IgG), конъюгированным с НRР. Пластины снова промывают, а затем добавляют НRР субстрат, 3,3"-диаминобензидинтетрахлорид (Сигма). Клетки, которые экспрессируют протеины, которые перекрестно реагируют с антителами, оказываются окрашенными.

Монослои V его клеток инфицируют рекомбинантным вирусом. Клеточные лизаты можно исследовать иммуноосаждением или Вестерн-блоттингом на наличие кодируемых вирусом протеинов. Для иммуноосаждения клеточные лизаты инкубируют с антисывороткой против полиовируса или экзогенного протеина. Затем добавляют протеин А сефарозу (Сигма) к смеси, и продолжают инкубирование. Сефарозные шарики центрифугируют, промывают и элюируют SDS диссоциационным буфером. Осажденные протеины можно проанализировать с помощью электрофореза на SDS-полиакриламидном геле. Для вестернблоттинга клеточные лизаты разделяют с помощью SDS-РАGЕ, переносят на нитроцеллюлозу и инкубируют с антисывороткой. Блоты промывают, инкубируют со вторичным антителом (например, козьим анти-кроличьим JgG), конъюгированным с НRP. Блоты снова промывают, а затем для идентификации перекрестно-реагирующих протеинов добавляют НRР субстрат, 4-хлор-1-нафтол (Bio Rad, Richmond, СА) плюс перекись водорода.

Пример 9

Конструирование рекомбинантного полиовируса, содержащего ротавирусный VР7 ген.

Клон экспрессии, обозначенный pLED 3.2/VР7, конструируют, причем ген, кодирующий ротавируоный VР7 антиген, встраивают в полиовирусный геном. Клон содержит полной длины ген для VР7, длина которого составляет приблизительно 1 Kb. Этот клон конструируют, используя РСR удлинения с перекрыванием, и ген встраивают в начале полиовирусной открытой считывающей рамки (основание 743). Для первого раунда РСR используют праймеры Р и Q (табл. 2). Матричная ДНК представляет собой плазмидный клон, содержащий полной длины ротавирусный VР7 ген. РСR продукт из этой амплификации имеет длину 1012 пар оснований. Условия РСR цикла для первого раунда реакций отличаются от стандартных условий, указанных в примере 6, и представляют собой: 94^oС 2 минуты, лед 2 минуты, затем 94^oС 1 минуту, 26^oС 1 минуту, 70^oС 2 минуты в течение 10 циклов; 94^oС 1 минута, 45^oС 1 минута, 70^oС 2 минуты в течение 20 циклов.

Второй раунд PСR реакций проводят как описано ранее. Фрагмент первого раунда РСR смешивают либо с 5" LED 3.2, либо 3" LED 3.2 и амплифицируют с праймерами С и Q для 5" слияния, или с праймерами Р и F для 3" слияния. Полученные продукты слияния переваривают с М1u1 и Bge11 для 5" слияния или Bge11 и Avr11 для 3" слияния. Эти перевары затем субклонируют в pLED 3.2 до получения pLED 3.2/ Р7.

ДНК последовательность этой полной длины конструкции полиослияния определяют, используя ДНК секвенатор Applied Biosystems (Foster City, СА) 370А.

Затем проводят реакции транскрипции и трансфекции. РНК транскрипты, полученные из Т7 промотора, трансфецируют в V его клетки для создания инфекционного полиовируса. Для этих экспериментов приготавливают приблизительно 5 мкг рLED 3.2/V Р7 для создания РНК транскриптов за счет переваривания плазмидой Pvu1. Pvu1 переваривание приводит к получению двух фрагментов, причем после более крупного фрагмента, содержащего Т7 промотор, следует полной длины полиогеном, содержащий V Р7 генное слияние. Продукт реакции переваривания экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Осажденную ДНК повторно cуспендируют в 20 мкл воды. Полной длины РНК транскрипты синтезируют ин витро из Pvu1 - переваренной ДНК с помощью Т7 РНК полимеразы (Moss, Е. G., et al. , J. Virol., 63:1884-1890 (1989)). Продукты транскрипции анализируют с помощью электрофореза на агарозном геле.

Конфлюэнтные 25 см² монослои V его клеток трансфецируют с транскриптами, используя ДЕАЕ-трансфекционную схему (Vander Werf. S. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 83: 2330-2334 (1986)). Приблизительно 25 мкг РНК смешивают с ДЕАЕ-декстраном (0,5 мг/мл), а затем выливают поверх V его клеток. После 30 минут инкубирования при комнатной температуре, инокулюм удаляют и клетки промывают, добавляют свежую модифицированную поддерживающую среду Эрла, и клетки инкубируют при 33,5^oС. Культуры инкубируют до наблюдения полного цитопатического эффекта, и рекомбинантные полиовирусы собирают с культуральной среды.

Вирусы, содержащие рекомбинантный полиовирус, полученный из конструкции pLED 3.2/VР7, титруют в анализе бляшкообразования на V его клетках. Кроме того, РНК экстрагируют из рекомбинантного вируса и анализируют с помощью обратной транскрипции и РСR, используя РСR набор Gene Amp. термостабильных rTтh обратных транскриптазных РНК (Аperkin/Еlmer/Cetus). Полученные результаты показывают, что VР7 ген стабильно сохраняется в рекомбинантном pLED 3.2/VР7 вирусе при культивировании.

Для анализа экспрессии VР7 из полиовирусного вектора используют различные способы. Эти способы, которые представляют собой стандартные процедуры, включают иммуноперокcидазное окрашивание инфицированных клеток, иммуноосаждение вирусных и чужеродных протеинов, Вестерн-блоттинг и дот-блоттинт (Coligan J. Е., et al. Current Protocols in Jmmunology, johu Wiley and Sons (1992)).

Анализ окрашивания иммунопероксидазой используют для определения протеинов в инфицированных вирусом V его клетках. V его клетки инфицируют вирусом и фиксируют этанолом или метанолом в различные моменты после инфицирования. Фиксированные клеточные монослои инкубируют с антисывороткой против либо полиовирусных протеинов, либо против VР7. Пластины промывают, а затем инкубируют со вторичным антителом (например, козьим, анти-кроличьим IgG), конъюгированным с пероксидазой хрена (НRР). Пластины снова промывают, а затем добавляют НRР субcтрат, 3.3"-диаминобензидинтетрагидрохлорид (Сигма, Сан-Луис, МО). Клетки, которые экспрессируют протеины, которые перекрестно реагируют с антителами, оказываются окрашены.

Монослои V его клеток инфицируют рекомбинантным вируcом. Клеточные лизаты можно исследовать иммуноосаждением или вестернблоттингом на предмет присутствия кодируемых вирусом протеинов. Для иммуноосаждения клеточные лизаты инкубируют с антисывороткой против полиовирусов или экзогенного протеина, затем добавляют Протеин А Сефарозу (Сигма) к смеси и продолжают инкубирование. Сефарозные шарики центрифугируют, промывают и элюируют SDS-диссоциационным буфером. Осажденные протеины можно проанализировать с помощью электрофореза на SDS-полиакриламидном геле. Для вестернблоттинга клеточные лизаты разделяют с помощью SDS-РАGЕ, переносят на нитроцеллюлозу и инкубируют с антисывороткой до получения представляющих интерес протеинов. Блоты промывают, инкубируют со вторичным антителом (например, козьим анти-кроличьим JgG) конъюгированным c НRР. Блоты снова промывают, и для идентификации перекрестно-реагирующих протеинов добавляют НRР субстрат, 4-хлор-1-нафтол (Bio Rad, Richmond, СА).

Пример 10

Конструирование полиовирусных полилинкерных кассетных векторов

Экзогенные гены можно также встраивать в полиовирусный геном за счет конструирования двух полиовирусных клонирующих векторов, близких тем, которые описаны в примерах 1-5, в том, что эти векторы встраивают уникальные сайты клонирования рестрикционных энзимов, каждый в другом месте, внутри полиовирусного генома. Такая полилинкерная кассетная векторная методика обеспечивает более простую процедуру клонирования, нежели способ примера 6, хотя последний лимитирует добавление дополнительных аминокислот, которые не находятся в исходном экзогенном полипептиде.

Первый вектор (вектор 2) содержит полилинкерную кассету в рамке с полиовирусным протеином, непосредственно после которой следует инициирующий кодон AUG у основания 743. Затем вводят следующие рестрикционные сайты: Noт1, Hpa1 и Рас1. Они следуют сразу после последовательности, кодирующей сайт распознавания полио 3С протеазы. Затем эту последовательность приспосабливают за счет добавления или делеции 1-2 дополнительных оснований к тому, чтобы поддерживать правильную открытую считывающую рамку в этом участке.

РСR удлинения с перекрыванием используют для встраивания реcтрикционных сайтов во время конструирования векторов. Для конструирования вектора 1 синтезируют праймеры J и К (табл. 2) для введения полилинкерной кассеты у основания 743. В первом раунде РСR реакций используют pLED 3.2 как матричную ДНК, праймеры С и J для 5" участка, и праймеры К и F для 3" участка. Ожидаемые размеры для амплифицированных фрагментов составляют 512 и 551 пару оснований для 5" и 3" участков, соответственно. Эти фрагменты используют непосредственно из РСR реакции, и они служат в качестве матрицы для второго раунда РСR с праймерами С и F. Получают фрагмент из 1016 пар оснований, который содержит полилинкерную последовательность и сайт распознавания 3С протеазы в середине фрагмента. Этот фрагмент очищают, переваривают М1u1 и Avr11 и субклонируют в pLED 3.2, которая была переварена теми же самыми рестрикционными энзимами.

Протеолитический процессинг полиовирусного полипротеина происходит на множестве стадий во время репликации вируса. Первоначальное протеолитическое расщепление осуществляют за счет 2А протеазы, что приводит к образованию протеинов, обозначаемых Р1 и Р2-Р3. Каждый из них далее расщепляется 3С протеазой до получения индивидуальных вирусных протеинов. Во время протеолитического процессинга полипротеина продукты частичного расщепления, как было показано, имеют функции, отличающиеся от функций продуктов окончательного расщепления (Harris, К.S. et al., Semin. Virol., 1:323-333 (1990)). Встраивание экзогенного гена в полипротеин на участках, кодирующих функциональные предшественники, не создает жизнеспособных вирусов. Второй кассетный вектор конструируют для встраивания рестрикционных сайтов по связи между Р1 и Р2 (основание 3377).

Встраивают рестрикционные сайты Noт1, Hpa1 и Рac1. Для этих рестрикционных сайтов существует 2А протеазный сайт распознавания 5": сайт распознавания 3С протеазы встраивают в направлении 3" к этим сайтам. Первый раунд РСR реакций использует pLЕD 3.2 в качестве матричной ДНК, праймеры L и М для 5" участка, и праймеры N и О для 3" участка (табл. 2).

Ожидаемые размеры для амплифицированных фрагментов составляют 563 и 692 bp для 5" и 3", соответственно. Эти фрагменты используют непосредственно из РСR реакции, и они служат в качестве матрицы для второго раунда РСR с праймерами L и O. Полученный фрагмент имеет 1096 bр в длину и содержит сайт распознавания 2А протеазы, полилинкерную последовательность и сайт распознавания 3С протеазы в середине. Затем этот фрагмент переваривают BstE11 и субклонируют в рLЕD3.2, переваренную тем же энзимом.

Кассетные векторы используют в качестве векторов экспрессии для экзогенных генов. Экзогенные гены клонируют в кассетные векторы, либо используя существующие совместимые рестрикционные сайты, либо за счет добавления таких реотрикционных сайтов к концам гена с помощью РСR. В последнем случае экзогенный ген амплифицируется за счет РСR с использованием праймеров, соответствующих 5" и 3" концам гена. Если эти праймеры синтезированы, рестрикционаый сайт добавляют к 5" концу смыслового праймера, а второй рестрикционный сайт добавляют к 5" концу антисмыслового праймера. После амплификации гена в стандартной реакции PCR, полученный PСR фрагмент будет содержать ген, фланкированный двумя рестрикционными сайтами. Как вектор, так и РСR фрагмент, оба переваривают двумя рестрикционными энзимами, а затем лигируют вместе, в результате чего получают представляющий интерес экспрессионный клон.

Следует отметить, что праймеры можно сконструировать таким образом, чтобы они соответствовали любому участку представляющего интерес экзогенного гена, так чтобы в вектор можно было включать неполные гены. Более того, переваривание вектора Нра1 приводит к получению тупых концов фрагментов. Поэтому, любой фрагмент с тупыми концами экзогенного гена может быть клонирован в вектор.

Пример 11

Конструирование рекомбинантного полиовируса, содержащего В. pertussis 69 kD внешний мембранный протеиновый ген.

Полиовирусные кассетные векторы примера 10 используют для экспрессии 69 kD внешнего мембранного протеина В. pertussis. Зрелый протеин закодирован внутри участка гена приблизительно в 1,8 kD. Этот участок, или более короткие участки открытой считывающей рамки можно амплифицировать с помощью РСR c праймерами специфических последовательностей. Эти праймеры конструируют таким образом, чтобы они содержали Not1 сайт с 5" конца антисмыслового праймера. Праймеры нужно подобрать таким образом, чтобы открытая считывающая рамка и сайт распознавания полиовирусной 3С протеазы были в рамке. После амплификации с помощью РСR, полученный фрагмент очищают электрофорезом на агарозном геле или с помощью Magic РСR набора (Promega), перериваривают Not1 и Prac1 и лигируют в вектор, рестриктированный теми же самыми энзимами. Полученную плазмиду обозначают pLED 3.2/69 kD. ДНК последовательность этой полной длины полио-слияния конструкции определяют, используя ДНК секвенатор 370A Applied Biosystem (Foster City, СА).

Далее, проводят реакции транскрипции и трансфекции. РНК транскрипты, полученные из Т7 промотора, трансфецируют в V его клетки для создания инфекционного полиовируса. Для этих экспериментов приготавливают приблизительно 5 мкг pLED 3.2/69 kD для создания РНК транскриптов за счет переваривания плазмидой Pvu1. Pvu1 переваривание приводит к получению двух фрагментов, причем более крупный фрагмент содержит Т7 промотор, после которого следует полной длины полиогеном, содержащий 69 kD генное слияние. Продукт реакций переваривания экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Осажденную ДНК повторно суcпендируют в 20 мкл воды. Полной длины РНК транскрипты синтезируют ин витро из Pvu1-переваренной ДНК, используя Т7 РНК полимеразу (Moss, Е. G. et al. j Virol 63:1884-1890 (1989)). Продукты транскрипции анализируют электрофоретически на агарозном геле.

Конфлюэнтные 25 см² монослои V его клеток трансфецируют транскриптами, используя схему ДЕАЕ-трансфекции (Van der Werf, S. Procе Natl. Acadе Sci., USA, 83: 2330-2334 (1986)). Приблизительно 25 мкг РНК смешивают с ДЕАЕ-декстраном (0,5 мкг/мл), и затем выливают поверх клеток V его. После 30 минут инкубирования при комнатной температуре инокулюм удаляют, и клетки промывают, добавляют свежую поддерживающую среду Эрла, и клетки инкубируют при 33,5^oС. Культуры инкубируют до наблюдения полного цитопатического эффекта, и рекомбинантные полиовирусы собирают с культуральной среды.

Исходные вирусы, содержащие рекомбинантные полиовирусы, полученные из конструкции pLED 3.2/69 kD, титруют в анализе на бляшкообразование на V его клетках. Кроме того, РНК экстрагируют из рекомбинантного вируса, и анализируют c помощью обратной транскрипции и РСR, используя РСR набор Gene Amp термостабильной rТтh обратной транскриптазной РНК (Perkin - Elmer/Cetus). Полученный результат показывает, что 69 kD ген стабильно сохраняется в рекомбинантном pLED 3.2/69 kD вирусе при культивировании.

Используют различные способы для анализа экспрессии 69 kD внешнего мембранного протеина из полиовирусного вектора. Эти способы, которые представляют собой стандартные процедуры, включают иммунопероксидазное окрашивание инфицированных клеток, иммуноосаждение вирусного и чужеродного протеинов, вестернблоттинг и дотблоттинг (Coligan, j. Е. et al., Current Protocols in Jmmunology, Jonn Wiley and Sons (1992)).

Анализ иммунопероксидазного окрашивания используют для определения протеинов в инфицированных вирусом V его клетках, V его клетки инфицируют вирусом и фиксируют этанолом или метанолом в различные моменты времени после инфицирования. Фиксированные клеточные монослои инкубируют с антисывороткой против либо полиовирусных протеинов, либо 69 kD внешнего мембранного протеина. Пластины промывают, а затем инкубируют со вторичным антителом (например, козьим анти-кроличьим JgG), конъюгированным с пероксидазой хрена (НRР). Пластины снова промывают, а затем добавляют HRP субстрат, 3,3"-диаминобензидинтетрагидрохлорид (Сигма, Сан Луис, МО). Клетки, которые экспрессируют протеины, которые перекрестно реагируют с антителами, оказываются окрашены.

V eгo клеточные монослои инфицируют рекомбинантным вирусом. Клеточные лизаты можно исследовать иммуноосаждением или вестернблоттингом на наличие вирусных закодированных протеинов. Для иммуноосаждения клеточные лизаты инкубируют с антисывороткой против полиовируса или экзогенного протеина. Протеин А сефарозу (Сигма) добавляют к смеси и продолжают инкубировать. Сефарозные шарики центрифугируют, промывают и элюируют SDS диссоциационным буфером. Выпавшие в осадок протеины анализируют с помощью электрофореза на SDS-полиакриламидном геле. Для вестернблоттинга клеточные лизаты выделяют с помощью SDS-РАGЕ, переносят на нитроцеллюлозу и инкубируют с антисывороткой к представляющим интерес протеинам. Блоты промывают, инкубируют со вторичным антителом (например, козьим анти-кроличьим JgG), конъюгированным с НRP. Блоты промывают снова, и затем НRР субстрат, 4-хлор-1-нафтол (Bio Rad, Richmond, CA) плюс перекись водорода, добавляют для идентификации перекрестно-реагирущих протеинов.

Пример 12

Конструирование рекомбинантного полиовируса, содержащего ген гликопротеина D Herpes Simplex.

Полиовирусные кассетные векторы примера 10 используют для экспрессии гликопротеина D вируса Herpes Simplex. Этот протеин кодируется геном приблизительно 1,2 kD. Этот участок или более короткие участки открытой считывающей рамки можно амплифицировать с помощью РСR с праймерами специфических последовательностей. Эти праймеры конструируют таким образом, чтобы они содержали Not1 сайт с 5" конца смыслового праймера, и Рас1 сайт с 5" конца антисмыслового праймера. Эти праймеры должны быть подобраны так, чтобы открытая считывающая рамка и сайт распознавания полиовирусной 3С протеазы были в рамке. После амплификации за счет РСR, полученный фрагмент очищают с помощью электрофореза на агарозном геле, или с помощью Magic PCR набора (Promega), переваривают Not1 или Рас1 и лигируют в вектор, рестриктированный теми же самыми энзимами.

Полученную плазмиду обозначают pLED 3.2/gD. ДНК последовательность этой полной длины полио-слитой конструкции определяют, используя секвенатор ДНК 370А Applied Bioystems (Foster City, СА).

Затем проводят реакции транскрипции и трансфекции. РНК транскрипты, полученные из Т7 промотора, трансфектируют в V его клетки для создания инфекционного полиовируса. Для этих экспериментов приготавливают приблизительно 5 мкг pLED 3.2/gD для создания РНК транскриптов за счет переваривания плазмидой Pvu1. Pvu1 переваривание приводит к получению двух фрагментов, причем после более крупного фрагмента, содержащего Т7 промотор, следует полной длины полиогеном, содержащий gD генное слияние. Продукт реакции переваривания экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Осажденную ДНК повторно суспендируют в 20 мкл воды. Полной длины РНК транскрипты синтезируют ин витро из Pvu1-переваренной ДНК, используя Т7 РНК полимеразу (Moss Е.G., et al. , j. Virol., 63:1884-1890 (1989)). Продукты транскрипции анализируют с помощью электрофореза на агарозном геле.

Конфлюэнтные 25 см² монослой V его клеток трансфецируют транскриптами, используя схему ДЕАЕ-трансфекции (Vander Werf 83:2330-2334 (1986)). Приблизительно 25 мкг РНК смешивают с ДЕАЕ-декстраном (0,5 мг/мл), и затем выливают поверх V его клеток. После 30-минутного инкубирования при комнатной температуре, инокулюм удаляют, и клетки промывают. Добавляют свежую модифицированную поддерживающую среду Эрла, и клетки инкубируют при 33,5^oС. Культуры инкубируют до тех пор, пока не наблюдают полный цитопатический эффект, и рекомбинантные полиовирус собирают с культуральной среды.

Вирусный материал, содержащий рекомбинантный полиовирус, полученный из конструкции pLED 3.2/gD, титруют в анализе на бляшкообразование на его клетках. Кроме того, РНК экстрагируют из рекомбинантного вируса и анализируют с помощью обратной транскрипции и РСR, используя РСR набор Gene Amp термостабильной rTтh обратной транскриптазой РНК (Perkin-Еlmer/Cetus). Полученные результаты показывают, что gD ген стабильно сохраняется в рекомбинантном pLED 3.2/gD вирусе при культивировании.

Для анализа экспрессии gD из полиовирусного вектора используют различные способы. Эти способы, которые являются стандартными процедурами, включают иммунопероксидазное окрашивание инфицированных клеток, иммуноосаждение вирусных и чужеродных протеинов, вестернблоттинг и дотблоттинг (Coligan, J.E., et al., eds. Current. Protocols in Jmmunology john Wiley and Sons (1992)).

Анализ иммунопероксидазного окрашивания используют для определения протеина в вирус-инфицированных V его клетках. V eго клетки инфицируют вирусами и фиксируют этанолом или метанолом в различные моменты времени после инориирования. Фиксированные клеточные монослои инкубируют с антисывороткой против либо полиовирусных протеинов, либо gD. Пластины промывают, а затем инкубируют со вторичным антителом (таким как козий или анти-кроличий IgG), конъюгированный с пероксидазой хрена (HRP). Пластины снова промывают, и добавляют HRP субстрат, 3,3"-диаминобензидинтетрагидрохлорид (Сигма). Клетки, которые экспрессируют протеины, которые перекрестно реагируют с антителами, оказываются окрашены.

Монослои V eгo клеток инфицируют рекомбинантным вирусом. Клеточные лизаты можно исследовать с помощью иммуноосаждения или вестернблоттингом на наличие вирусных закодированных протеинов, для иммуноосаждения клеточные лизаты инкубируют с антисывороткой против полиовируса или экзогенного протеина. Протеин А сефарозу (Сигма) добавляют затем к смеси, и продолжают инкубирование. Сефарозные шарики центрифугируют, промывают и элюируют SDS диссоциационным буфером. Осажденные протеины можно анализировать с помощью электрофореза на SDS-полиакриламидном геле. Для вестернблоттинга клеточные лизаты разделяют с помощью SDS-РАGЕ, переносят на нитроцеллюлозу и инкубируют с антисывороткой к представляющим интерес протеинам. Блоты промывают, инкубируют со вторичным антителом (таким, как козий анти-кроличий IgG), конъюгированный с НRР. Блоты снова промывают, а затем НRР субстрат, 4-хлор-1-нафтол (Bio Rad, Richmond, СА) плюс перекись водорода, добавляют для идентификации перекрестно-реагирующих протеинов.

Эквиваленты

Специалисты могут узнать, или с помощью рутинных экспериментов определить, эквиваленты специфических вариантов изобретения. Эти эквиваленты входят в объем, указанный формулой изобретения.