мембрана для использования при направленной регенерации тканей
Классы МПК: | A61L27/24 коллаген A61L27/40 композиционные материалы, те слоистые или содержащие один материал, диспергированный в матрице того же самого или другого материала |
Автор(ы): | ЭКМЕЙЕР Зденек (DE), ШЛОССЕР Лотар (DE), ГЙЕШТЛИХ Петер (CH) |
Патентообладатель(и): | ЭД ГЕЙШТЛИХ ЗЁНЕ АГ ФЮР ХЕМИШЕ ИНДУСТРИЕ (CH) |
Приоритеты: |
подача заявки:
1998-10-05 публикация патента:
27.11.2003 |
Изобретение относится к многослойной мембране, содержащей матриксный слой, состоящий преимущественно из коллагена II и имеющий рыхлую губчатую структуру, и, по меньшей мере, один барьерный слой, имеющий плотную, относительно непроницаемую структуру. Такая мембрана особенно подходит для использования in vivo при направленной регенерации тканей, в частности для использования при реконструкции костной или хрящевой ткани. Преимуществом использования мембраны является то, что нативные клетки не способны проникнуть в слой или расти в слое, имеющем плотную относительно непроницаемую структуру. 4 с. и 16 з. п. ф-лы.
Формула изобретения
1. Многослойная мембрана, пригодная для использования in vivo при реконструкции костной или хрящевой ткани, причем вышеуказанная мембрана содержит матриксный слой, состоящий главным образом из коллагена II и имеющий рыхлую губчатую структуру, и, по меньшей мере, один барьерный слой, имеющий плотную, относительно непроницаемую структуру.2. Мембрана по п.1, отличающаяся тем, что она содержит один барьерный слой.3. Мембрана по п.1, отличающаяся тем, что матриксный слой в ней расположен между двумя барьерными слоями.4. Мембрана по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что матриксный слой изготовлен из коллагена II, полученного из натурального хряща.5. Мембрана по п.4, отличающаяся тем, что коллаген II получен из гиалинового хряща свиней.6. Мембрана по п.4 или 5, отличающаяся тем, что коллаген II имеет поперечные связи.7. Мембрана по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что барьерный слой или барьерные слои изготовлены преимущественно из коллагена I и III.8. Мембрана по п.7, отличающаяся тем, что барьерный слой или барьерные слои получены из перитонеальной мембраны телят или свиней.9. Мембрана по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что барьерный слой или барьерные слои включают синтетическую растворимую полимерную сеть, которая может быть покрыта коллагеновым материалом.10. Мембрана по п.9, отличающаяся тем, что вышеуказанный коллагеновый материал состоит из коллагена I типа и/или III типа.11. Мембрана по п.9 или 10, отличающаяся тем, что синтетическая полимерная сеть содержит полимер, выбранный из группы, состоящей из полиэфиров, гомополимеров и сополимеров полигликолевой и полимолочной кислоты, сополимеров гликолида и лактида, полиортоэфиров и поликапролактонов.12. Мембрана по п.11, отличающаяся тем, что полимер является поли(D, L-молочной кислотой), в которой соотношение D-лактида к L-лактиду равно примерно 70:30.13. Мембрана по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что матриксный слой импрегнирован хондроцитами, выделенными из суставного хряща, надкостницы, перикарда, или мезенхимными стволовыми клетками из костного мозга.14. Мембрана по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что матриксный слой и/или барьерные слои импрегнированы гликозаминогликаном.15. Мембрана по п.14, отличающаяся тем, что гликозаминогликан является гиалуроновой кислотой, хондроитин-6-сульфатом, кератинсульфатом, дерматансульфатом.16. Мембрана по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что матриксный слой и барьерные слои практически не содержат протеогликанов.17. Мембрана по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что матриксный слой и/или барьерные слои дополнительно содержат хондронектин, ламинин, фибронектин, альгинат кальция, анкорин II, факторы роста или морфогенетические факторы костей.18. Способ изготовления мембраны по п.1, в котором пасту из коллагена II наносят на поверхность барьерной мембраны, обладающей плотной, относительно непроницаемой структурой, с последующей сублимационной сушкой, в результате чего образуется матриксный слой, имеющий рыхлую губчатую структуру.19. Имплантат для использования при направленной регенерации тканей, отличающийся тем, что он включает мембрану, как она определена в любом из пп.1-17.20. Способ лечения дефектов костей или хрящей в теле человека и животных, причем вышеуказанный способ включает наложение мембраны по любому из пп.1-17 на дефект, а вышеуказанная мембрана ориентирована так, что барьерный слой или слои предотвращают врастание нежелательных типов тканей в зону регенерации кости или хряща.Описание изобретения к патенту
Область техникиНастоящее изобретение относится к имплантату в виде коллагеновой мембраны для использования при направленной регенерации тканей, в частности для использования in vivo при реконструкции костной или хрящевой ткани. Уровень техники
Давно известно, что при регенерации тканей трудно реконструировать хрящевую ткань, например при повреждениях хрящей. Повреждения хрящей могут происходить в любых суставах, хотя крупные суставы, такие как коленный и локтевой, подвергаются наибольшему риску. Такие повреждения могут быть результатом травмы, дегенеративных состояний или вскрытий при остеохондрите. Повреждения суставов являются главным патомеханическим фактором при развитии артроза. Выделение ферментов приводит к воспалительному процессу в синовиальной оболочке, который в свою очередь приводит к стиранию хряща и деструкции поверхности сустава. Недавние попытки регенерировать in vivo суставной хрящ при дефектах хряща включают имплантацию культивированных аутогенных суставных хондроцитов (КСХ). Однако эта методика имела ограниченный успех. В настоящее время общепринято, что реконструкция ткани требует обеспечения матрикса, служащего проводником для клеток, которые растут вдоль волокон и между волокнами матрикса. Недавно было предложено использовать КСХ, высаживаемые на синтетические и природные рассасывающиеся матриксы. Однако попытки реконструкции хрящевой ткани с использованием матриксов на основе полимолочной кислоты, полигликолевой кислоты и коллагена 1 (оссеина, главного компонента сухожилий, связок и хрящей) или коллагена III (упрочняющего компонента стенок полых органов, в том числе кровеносных сосудов, кишечника) требовали, чтобы матриксы заселялись хондроцитами in vitro перед имплантацией. Это дает увеличение числа осложнений, то есть иммунологических воспалительных реакций при участии гигантских клеток и фибробластических клеток на поверхности между имплантатами и тканью, по сравнению со стерильной культурой хондроцитов. Международная заявка, опубликованная под номером WO-A-96/25961, предлагает матриксный имплантат на основе коллагена II (хондрина, главного компонента хрящевой ткани), который может быть имплантирован на участок in vivo и который обеспечивает рост нативных (природных) хондроцитов на поверхности матрикса, результатом которого является регенерация хряща. Однако способность такого матрикса обеспечивать полную регенерацию хрящевой ткани ограничена. Поэтому существует потребность в матриксном имплантате, который обеспечивал бы успешное врастание в него нативных хондроцитов и таким образом - регенерацию хрящевой ткани после имплантации in vivo. В настоящее время авторы изобретения обнаружили, что хрящ и, в конечном счете, новую костную ткань можно реконструировать посредством использования матрикса из коллагена II, который in vivo отграничен не только от окружающей соединительной ткани, но и от подлежащего дефекта кости или хряща. Предполагается, что этого можно достичь за счет использования имплантата в виде многослойной мембраны, которая сама по себе способна предотвращать нежелательное врастание в матрикс окружающих тканей, и который можно хирургически имплантировать на место дефекта, чтобы получить такой эффект. Сущность изобретения
В одном из аспектов изобретение обеспечивает многослойную мембрану, содержащую матриксный слой, состоящий преимущественно из коллагена II и имеющий рыхлую губчатую структуру, и по меньшей мере один барьерный слой, имеющий плотную, относительно непроницаемую структуру. Особым преимуществом использования мембраны согласно настоящему изобретению является то, что нативные клетки не способны проникнуть в слой или расти в слое, имеющем плотную, относительно непроницаемую структуру. Хотя авторам и не хотелось бы быть связанными теорией, в настоящее время считается, что успешная регенерация хряща требует предотвращения быстрого врастания в область дефекта не только нативных клеток тканей, например соединительных тканей, кровеносных сосудов и т.п., но и новой костной ткани. Этого можно достичь при использовании двухслойной мембраны согласно настоящему изобретению, которая служит защитой коллагенового матрикса от врастания нативных клеток ткани с одной стороны. Во время хирургической имплантации эта мембрана может быть использована в сочетании с тканевым трансплантатом, например трансплантатом надкостницы, эффективно предотвращающим врастание нативных клеток ткани с противоположной стороны. Поэтому, например, трансплантат надкостницы может быть первоначально подшит на место так, чтобы он обеспечивал закрытие дефекта кости или хряща. Затем на место дефекта может быть имплантирована двухслойная мембрана согласно настоящему изобретению так, чтобы она находилась в контакте с трансплантатом и могла быть прикреплена таким образом, чтобы матриксный слой был обращен к дефекту кости. Более предпочтительно, двухслойную мембрану согласно настоящему изобретению первоначально имплантируют на место дефекта так, чтобы барьерный слой был обращен к дефекту кости или хряща. Затем укрепляют трансплантат надкостницы так, чтобы он находился в контакте с матриксным слоем. Трансплантат можно приклеить биосовместимым клеем, таким как фибриновый клей, или прикрепить рассасывающимися скобками из полимолочной кислоты, или, если это необходимо или возможно, подшить таким образом, чтобы он впоследствии служил непроницаемым барьером для врастания прилежащей соединительной ткани. В альтернативном способе осуществления изобретения мембрана сама может эффективно предотвращать врастание нативных клеток ткани. Поэтому, с другой стороны, изобретение обеспечивает мембрану, содержащую, по меньшей мере, три слоя, в которой матриксный слой, состоящий, главным образом, из коллагена II и имеющий явно выраженную губчатую структуру, расположен между двумя барьерными слоями, имеющими плотную, относительно непроницаемую структуру. Матриксный слой способен служить средой для врастания нативных хондроцитов, обеспечивая таким образом регенерацию хрящевой ткани. Однако, чтобы еще больше способствовать регенерации хрящевой ткани, матриксный слой может быть импрегнирован хондроцитами, либо перед, либо после имплантации in vivo. Хотя матриксный слой может быть импрегнирован хондроцитами непосредственно перед имплантацией, например, путем инъекции, ожидается, что обычно хондроциты будут вводиться в матриксный слой посредством прямой инъекции суспензии хондроцитов после имплантации. При этом хондроциты, присутствующие в основном слое мембраны, способны осуществлять регенерацию хряща и, в конечном итоге, новой кости, хотя мембрана одновременно предотвращает врастание других типов клеток из окружающих тканей. Хондроциты для использования в настоящем изобретении могут быть получены из таких источников клеток, которые включают аллогенные или аутогенные клетки, выделенные из суставного хряща, надкостницы и надхрящницы, и мезенхимные стволовые клетки костного мозга (клетки стромы). Так как аллогенные клетки обладают потенциалом для иммунного ответа и инфекционных осложнений, предпочтительно выделять хондроциты из аутогенных клеток, в особенности из аутогенного суставного хряща. Методики накопления клеток известны и включают ферментативное расщепление или рост в культуре. Выделенные клетки затем размножают в культуре клеток перед обратным введением в организм. Обычно, по меньшей мере, 106, предпочтительно, по меньшей мере, 107 клеток следует импрегнировать в матриксный слой, чтобы обеспечить оптимальную регенерацию хрящевой ткани. Обычно желательно, чтобы матриксный слой мембраны согласно настоящему изобретению содержал гликозаминогликаны (ГАГ), такие как гиалуроновую кислоту, хондроитин-6-сульфат, кератинсульфат, дерматансульфат и т.п., которые служат для создания природной среды, в которую хондроциты могут внедряться и размножаться. Хотя можно внедрить в коллагеновую основу гликозаминогликаны из разных источников, которые не обязательно имеют такие же состав, молекулярный вес и физиологические свойства, как гликозаминогликаны хряща, предпочтительными гликозаминогликанами являются гликозаминогликаны, экстрагированные из самого хряща. Обычно матриксный слой предпочтительно содержит от 1 до 10 весовых процентов гликозаминогликанов, например 2-6 весовых процента. Хотя некоторые гликозаминогликаны могут присутствовать в непроницаемом слое, большая их часть будет присутствовать в матриксном слое. В нативных коллагенсодержащих тканях ГАГ существуют, по меньшей мере частично, в качестве компонента протеогликанов (ПГ). Использование ГАГ в форме ПГ нежелательно в связи с потенциальными иммунологическими проблемами, которые могут быть вызваны содержанием белков в ПГ. Поэтому предпочтительно матриксный слой практически не должен содержать протеогликанов. Этого можно достичь, изготавливая матриксный слой из смеси очищенного, не содержащего телопептидов коллагена II и гликозаминогликанов. Другие добавки, которые также могут присутствовать в основном слое, включают, например, хондронектин, ламинин, фибронектин, альгинат кальция или анкорин II, помогающие прикреплению хондроцитов к волокнам коллагена II, и факторы роста, такие как фактор индукции хряща (ФИХ), инсулиноподобный фактор роста (ИФР), трансформирующий фактор роста
![мембрана для использования при направленной регенерации тканей, патент № 2217171](/images/patents/251/2217065/946.gif)
![мембрана для использования при направленной регенерации тканей, патент № 2217171](/images/patents/251/2217065/946.gif)
Нижеследующие примеры приведены только в качестве иллюстрации. В примерах все стадии процесса следует проводить при асептических условиях, например в "чистых производственных помещениях". Пример 1. (А) Перитонеальные мембраны от молодых телят полностью освобождали от мяса и жира механическими способами, промывали под проточной водой и обрабатывали 2% раствором NaOH в течение двенадцати часов. Затем мембраны промывали под проточной водой и подкисляли 0,5% HCl. После того как материал закислился по всей толщине (примерно через три часа), материал промывали до тех пор, пока не было получено значение рН 3,5. Затем материал усаживали 7% солевым раствором, нейтрализовали 1% раствором NaHCO3 и промывали под проточной водой. Затем материал дегидратировали ацетоном и обезжиривали n-гексаном. В результате был получен барьерный слой, представляющий собой натуральную животную мембрану, содержащую коллаген I и коллаген III. (Б) Замороженный хрящ от свежезабитых свиней погружали в холодную воду, тщательно промывали и механически очищали от остатков мяса, костей и твердых частиц. Затем материал в течение 30 минут промывали под проточной водой. Далее материал три раза измельчали в гомогенизаторе. Размер видимых частиц в конце измельчения составлял примерно 8 мм. Кусочки хряща обезвоживали посредством 4-кратного промывания ацетоном, каждый раз - в течение 8 часов. Затем хрящ обезжиривали посредством 4-кратной экстракции n-гексаном. Каждая обработка длилась минимум 8 часов. Соотношение гексана и хряща было равно 1:10. После обезжиривания хрящу давали набухнуть в питьевой воде. Соотношение вода : материал было равно 10:1. Время обработки было равно 24 часам. Затем материал обрабатывали NaOH (5 вес.%), причем соотношение хряща и жидкости было равно 1: 4, а время обработки было равно 32 часам. Во время обработки кусочки хряща хорошо перемешивали. Далее от хряща отмывали щелочь. Исходный рН, равный 14, при этом снижался до 9-11. Растворенные загрязнения отмывали и отделяли от хряща. Жидкость, образовавшуюся при обработке щелочью, собирали для выделения гликозаминогликана. Коллагеновый материал затем обрабатывали крепким раствором HCl (примерно 3 вес.%), сначала - при значении рН ниже 1,0. Время обработки было равно 4-6 часам. Далее материал промывали холодной водой достаточно долго для того, чтобы значение рН увеличилось до 3-3,5. Все загрязнения удаляли, и продукт представлял собой коллагеновую массу, не содержавшую солей, пригодную для изготовления губок или других коллагеновых материалов. С этой целью масса, полученная из хряща, может быть, в зависимости от желаемого результата, дегазирована, заморожена и подвергнута сублимационной сушке. Экстракт, образующийся при вышеописанной обработке щелочью, содержал гликозаминогликан, щелочи, денатурированные белки и соли. Вначале экстракт нейтрализовали при помощи НСl, значение рН после нейтрализации было равно 6. Затем экстракт обрабатывали фильтрующим устройством, а именно - кизельгуром, который удаляет денатурированные белки. К экстракту добавляли 0,5 весового процента кизельгура и удаляли его путем фильтрации вместе с денатурированным белком. Затем супернатант подвергали ультрафильтрации с использованием мембраны, отделявшей частицы с молекулярным весом примерно 10000 дальтон. Таким образом удаляли соли и оставляли очищенный гликозаминогликан. Раствор гликозаминогликана, полученный таким образом, примешивали к вышеописанному коллагеновому материалу, для получения матрикса из коллагена II, содержащего гликозаминогликан. Масса из коллагена II имела следующие свойства:
TG = 2,8 вес.%,
ГАГ = 3 вес.% (рассчитано в пересчете на коллаген),
Значение рН 3,5. (С) Свежеприготовленную перитонеальную мембрану, приготовленную так, как описано в пункте (А), равномерно вымачивали в воде и расстилали на стеклянной пластинке волокнистой стороной вверх. Далее мембрану тщательно смачивали массой из коллагена II, приготовленной так, как описано в пункте (Б) выше. Мембрану растягивали по плоскости во всех направлениях так, чтобы она оставалась прикрепленной к пластинке. Затем в мембрану втирали массу из коллагена II. На мембрану наносили очень толстый слой массы, и пластинку оставляли на ночь в холодильнике при температуре примерно 4oС. В этот период образовывалась паста. Пасту замораживали при следующих условиях:
Температура ванны: -12oС,
Время: 40 минут. Далее замороженную пасту подвергали сублимационной сушке и затем нагревали до 125oС. Время сублимационной сушки: 14 часов. Затем матриксный слой коллагена II срезали до толщины 1 мм. Пример 2. Свежеприготовленную перитонеальную мембрану из примера 1(А) накладывали на стеклянную пластинку, и в мембрану втирали густую массу коллагена II, имеющую такие же свойства, как в примере 1. 50 г массы коллагена II разводили 100 мл воды и тщательно перемешивали. Во время перемешивания медленно добавляли 100 мл раствора гликозаминогликана. Коллаген преципитировали в форме массы совместно с ГАГ. После преципитации массу гомогенизировали, а полученную таким образом дисперсию наносили на мембрану. В течение ночи образовывалась паста, и обработанную мембрану далее обрабатывали так, как описано в примере 1.
Класс A61L27/40 композиционные материалы, те слоистые или содержащие один материал, диспергированный в матрице того же самого или другого материала