способ количественного определения клеток монослойных культур и устройство для его осуществления

Формула изобретения

1. Способ количественного определения клеток монослойных культур, отличающийся тем, что исследуемую культуру, выращенную в лунках плоскодонного оптически прозрачного стрипа помещают в фиксирующее приспособление, обеспечивающее прохождение светового потока через исследуемые культуры и его направленное отражение, затем оценивают оптическую плотность полученного отражения с разрешением от 400600 до 600600 dpi и по ее величине определяют количество клеток в исследуемой культуре.

2. Устройство для количественного определения клеток монослойных культур, содержащее планшетный сканер, включающий оптический датчик, отличающееся тем, что оно снабжено фиксирующим приспособлением, состоящим из двух частей: нижней части, представляющей собой черный непрозрачный экран с прорезями для фиксирования плоскодонного стрипа с лунками, содержащими исследуемые клетки, и верхней части, представляющей собой крышку с цилиндрическими выступами, расположенными таким образом, что торцы их обращены ко дну лунок и окрашены в матовый белый цвет, причем размер выступов соответствует размеру лунок стрипа.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к иммунологии, в частности к оценке результатов иммунологических анализов.

Цель изобретения - обеспечение возможности количественной оценки клеточных колориметрических диагностических систем на основе окрашенных монослойных клеточных культур, выращенных на плоскодонных стрипах без использования специализированных приборов.

Предшествующий уровень техники

Известны многочисленные устройства для количественной детекции содержимого лунок плоскодонных плашек (патенты US 4710031, US 5671290, US 4810096, JP 10274624 A2) и метод колориметрического измерения пролиферации и жизнеспособности клеток (Mosman Т. //J.immunol. Meth.-1983.-Vol.65.-P.55-63; А. П. Шпакова, К.С. Павлова, Т.И. Булычева // Клиническая лабораторная диагностика - 2000. - 2.-С. 20-23; Matthews, N and Neale, M.L // Limphokines and Interferons, IRL Press, Washington, DC -1987.-P221).

Наиболее близкий аналог предлагаемого изобретения описан в патенте US 4710031 на "Microtiter plate reader". редлагается ридер для плоскодонных плашек, который позволяет проводить визуальную экспертизу содержимого массива лунок плашки. Ридер включает средства поддержки плашки с лунками и имеет светоизлучающую поверхность, расположенную сверху. Области светоизлучения расположены таким образом, что соответствуют измеряемым на плашке лункам. Устройства ввода светового сигнала расположены снизу под плашкой и таким образом, чтобы обеспечить выборочную юстировку лунок.

Однако все предлагаемые аппараты не являются универсальными и зачастую представляют собой закрытые или частично закрытые системы. Кроме того, при неравномерности роста монослоя клеток по поверхности лунки использование таких аппаратов, которые для измерения используют небольшую часть площади дна лунки, может привести к значительным погрешностям при измерении.

Сущность изобретения

Предлагаемые способ и устройство позволяют проводить количественную регистрацию оптического сигнала со дна плоскодонных стрипов, используемых в клеточном колориметрическом анализе с любым размером лунок.

Считывание оптической информации с плоскодонных стрипов осуществляли с помощью планшетного сканера, вводящего оптическую информацию в компьютер, программного светофильтра и программ, измеряющих оптическую плотность полученного изображения.

Мы использовали планшетный сканер с оптическим разрешением от 400600 до 600600 dpi. Выбор данного диапазона разрешения был обусловлен двумя факторами: при меньшем оптическом разрешении для точной регистрации оптической плотности разрешение недостаточно, а при большем существенно увеличиваются системные требования к компьютеру и возрастает время анализа изображения из-за многократно большего размера файла со сканированным изображением. Сканирование изображений производили в различных режимах, подбирая оптимальный. Для фиксации стрипа на планшете сканера и минимизации оптических искажений полученного изображения, что приводит к искажению результатов, мы использовали специальное фиксирующее приспособление. Фиксирующее приспособление состоит из двух частей. Нижняя часть представляет собой черный непрозрачный экран с прорезями, позволяющими фиксировать плоскодонный стрип вдоль оси перемещения оптического датчика сканера. Верхняя часть представляет собой крышку с 8 цилиндрическими выступами, расположенными перпендикулярно плоскости крышки и соответствующими по размеру и расположению лункам стрипа. Их торцы, обращенные ко дну лунки, окрашены в матовый белый цвет. Это приспособление позволяет минимизировать оптические искажения полученного изображения, что позволяет использовать для регистрации сигнала неспециализированный сканер.

Для измерения количества клеток в исследуемых образцах культуры с известным содержанием клеток после фиксации и окраски помещают в фиксирующее приспособление таким образом, что дно лунок стрипа входит в прорези нижней его части, а выступы верхней части входят в полость лунок до их дна. Фиксирующее приспособление помещают на планшет сканера таким образом, чтобы пучок света от осветителя сканера через прорези нижней части попадал на клетки, расположенные на дне лунок, отражался от них и регистрировался оптическим датчиком сканера. Сигнал, полученный с датчика, поступает в компьютер, где формирует изображение дна лунок стрипа с клетками, после чего обрабатывается с помощью программы "SigmaScan Pro 5", преобразующей суммарную оптическую плотность изображения дна каждой лунки в численное значение. Используя эти значения, полученные при измерении оптической плотности серийных разведений образцов с известным количеством клеток, строят калибровочные кривые. Нанося на эти кривые значения оптических плотностей исследуемых культур, получают значения количества клеток в них.

Изобретение поясняется чертежами, где:

на фиг. 1 показана нижняя часть с прорезями фиксирующего приспособления для плоскодонных стрипов, вид сверху; на фиг. 2 - обе части фиксирующего приспособления: нижняя часть с прорезями и верхняя часть с цилиндрическими выступами; вид сбоку в разрезе вдоль осевой линии; на фиг.3 - обе части фиксирующего приспособления, вид спереди в разрезе вдоль осевой линии; на фиг. 4 - верхняя часть фиксирующего приспособления, вид снизу.

На фиг.1 изображен один из конструктивных вариантов фиксирующего приспособления для плоскодонных стрипов. Нижняя часть приспособления состоит из черного непрозрачного экрана 1, в котором вырезан вдоль оси перемещения оптического датчика сканера фиксатор для плоскодонного стрипа с прорезями для дна лунок стрипа 3. Экран 1 имеет размер, равный размеру планшета сканера, что предотвращает попадание света от внешних источников на зеркало оптической системы сканера и, в дальнейшем, на оптический датчик.

На фиг.2 изображены обе части фиксирующего приспособления. Верхняя часть приспособления состоит из пластины 4, выполненной из того же материала, что и экран 1, с цилиндрическими выступами 5, торцы которых, обращенные ко дну лунки, окрашены в матовый белый цвет. После размещения стрипа в фиксаторе 2 и накрывания его верхней частью приспособления, цилиндрические выступы входят в лунки стрипа и, таким образом, предотвращается влияние внешних источников света и внутреннего отражения света осветителя сканера от стенок лунок, что минимизирует оптические искажения полученного изображения дна лунок стрипа.

Пример

В лунки стандартного 8-луночного плоскодонного стрипа помещали серийные разведения клеток линии EJ рака мочевого пузыря человека.

Клетки культивировали 24 ч в среде RPMI-1640 с добавлением глютамина и 10% эмбриональной сыворотки КРС в атмосфере 6% СO₂. После окончания культивирования клетки фиксировали метанолом и окрашивали 0,16% кристаллвиолетом в 1,6% растворе этанола в течение 10 мин. Затем краситель отмывали избытком проточной воды. Окрашенный монослой помещали в плашечный фотометр "Multiscan EX" и учитывали результат реакции при длине волны 620 нм. Затем стрип помещали в фиксирующее приспособление и сканировали изображение стрипа с разрешением 400600 и 600600 dpi. Полученное изображение анализировали при помощи программы "SigmaScan Pro 5"(Copyright 1987-1999 SPSS Inc.), используя для оценки всю поверхность изображения дна лунок стрипа с применением зеленого программного светофильтра. Как параметр для оценки использовали среднюю оптическую плотность. Полученные данные по светопропусканию преобразовали по формуле А=1/D, где А - оптическая плотность в относительных единицах, а D - среднее светопропускание в относительных единицах. Данные, полученные при разрешении 400600 и 600600 dpi, практически совпали. После сравнения полученных графиков выяснилось, что оба графика (и со сканера, и с "Multiscan EX") равномерно монотонны и позволяют использовать их в качестве калибровочной кривой в иммунологических опытах. Различие состояло в том, что кривая, полученная с "Multiscan EX", имела более логарифмический характер, что менее удобно для измерений, связанных с крайними областями этой кривой.

В три лунки другого стрипа по тому же методу были помещены три различных образца клеток: 150 000, 70 000, 20 000 в мл. Оптическая плотность этих лунок, обработанных так же, как и лунки кривой, была измерена с помощью сканера. Полученные оптические плотности были нанесены на ординату графика, на который предварительно были нанесены значения оптической плотности точек калибровочной кривой. Полученные точки образцов были спроецированы на калибровочную кривую и из точек пересечения этих проекций с кривой были опущены перпендикуляры к оси абсцисс, на которой предварительно были нанесены значения концентраций клеток в лунках калибровочной кривой. Таким образом, были получены точки пересечения этих перпендикуляров с осью абсцисс, численное значение которых является аппроксимированным значением концентрации клеток в исследуемых точках. В таблице представлены данные сравнения значения количества клеток в исследуемых лунках, полученные прямым подсчетом в камере Горяева и с помощью обработки сканированного изображения.

Из таблицы видно, что погрешность измерения количества клеток в исследованных образцах, полученная с помощью анализа сканированных изображений, не превышает 7%. При измерении образцов стандартным методом - прямым подсчетом в камере Горяева допускается погрешность до 10%. Таким образом, предложенный метод дает результаты, сравнимые со стандартным, но в отличие от него автоматизирован и позволяет количественно оценивать клетки монослойных культур.