прямая экспрессия пептидов в культуральные среды
| Классы МПК: | C12N15/63 введение чужеродного генетического материала с использованием векторов; векторы; использование их хозяев; регулирование экспрессии C12P21/02 с известной последовательностью из двух или более аминокислотных остатков, например глутатиона C12P21/06 гидролизом пептидной связи, например белковых гидролизатов |
| Автор(ы): | МЕХТА Нозар М. (US), РЭЙ Марта В. Л. (US), МИНАН Кристофер П. (US), КОНСАЛВО Анджело П. (US) |
| Патентообладатель(и): | ЮНИДЖЕН ЛЭБОРАТОРИЗ ИНК. (US) |
| Приоритеты: |
подача заявки:
1998-04-15 публикация патента:
10.12.2003 |
Изобретение относится к генетической инженерии. Экспрессирующий плазмидный вектор содержит нуклеиновые кислоты (НК), кодирующие пептидный продукт. Указанные НК присоединены в рамке считывания справа (3") от нуклеиновых кислот, кодирующих сигнальный пептид. Регуляторный район оперативно соединен с кодирующим районом. Регуляторный район содержит множество промоторов и хотя бы один сайт связывания рибосом. По меньшей мере один из промоторов представляет собой tac. Вектор может содержать НК, кодирующие, по меньшей мере, один усиливающий секрецию пептид. Культивируют Е.соli, трансформированную или трансфецированную заявленным экспрессирующим плазмидным вектором. Пептид извлекают из среды. Культивирование проводят в присутствии в среде источника углерода и при регулировании роста клеток-хозяев при скорости роста 0,05 и 0,20 удвоений в час. Изобретение позволяет осуществлять прямую экспрессию пептида в культуральную среду за пределами клетки. 4 с. и 9 з.п.ф-лы, 17 ил., 5 табл.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48, Рисунок 49, Рисунок 50, Рисунок 51, Рисунок 52, Рисунок 53, Рисунок 54, Рисунок 55, Рисунок 56, Рисунок 57, Рисунок 58, Рисунок 59, Рисунок 60, Рисунок 61, Рисунок 62, Рисунок 63, Рисунок 64, Рисунок 65, Рисунок 66, Рисунок 67, Рисунок 68, Рисунок 69, Рисунок 70, Рисунок 71, Рисунок 72, Рисунок 73, Рисунок 74, Рисунок 75, Рисунок 76, Рисунок 77, Рисунок 78, Рисунок 79, Рисунок 80, Рисунок 81, Рисунок 82, Рисунок 83, Рисунок 84, Рисунок 85, Рисунок 86, Рисунок 87, Рисунок 88, Рисунок 89, Рисунок 90, Рисунок 91
Формула изобретения
1. Экспрессирующий плазмидный вектор, содержащий (a) кодирующий район с нуклеиновыми кислотами, кодирующими пептидный продукт и присоединенными в рамке считывания справа (3") от нуклеиновых кислот, кодирующих сигнальный пептид; (b) регуляторный район, оперативно соединенный с кодирующим районом, причем указанный регуляторный район содержит множество промоторов и по меньшей мере один сайт связывания рибосом, причем по меньшей мере один из упомянутых промоторов представляет собой tac.2. Вектор по п.1, отличающийся тем, что содержит множество транскрипционных кассет, причем каждая кассета имеет упомянутый регуляторный район и указанный кодирующий район.3. Вектор по п.1, отличающийся тем, что указанный регуляторный район имеет точно два промотора.4. Вектор по п.1, отличающийся тем, что указанный промотор tac находится слева (5") от другого промотора в указанном регуляторном районе.5. Вектор по п.1, отличающийся тем, что С-концевая аминокислота указанного пептидного продукта представляет собой глицин.6. Вектор по п.1, отличающийся тем, что дополнительно содержит нуклеиновые кислоты, кодирующие по меньшей мере один усиливающий секрецию пептид.7. Вектор по п.6, отличающийся тем, что усиливающий секрецию пептид выбран из группы, состоящей из secY и pr1A-4.8. Вектор по п.1, отличающийся тем, что является введенным в клетку-хозяина.9. Способ получения пептидного продукта, предусматривающий культивирование Е.соli, трансформированной или трансфецированной вектором по п.1, в культуральной среде и извлечение этого пептидного продукта из среды.10. Способ получения пептидного продукта, предусматривающий культивирование E.coli, трансформированной или трансфецированной вектором по п.6, в культуральной среде и извлечение этого пептидного продукта из среды.11. Способ получения пептидного продукта, предусматривающий стадии(a) культивирования E.coli, трансформированной или трансфецированной вектором по п.1, в культуральной среде в присутствии источника углерода и индукции экспрессии пептидного продукта при регулировании роста этих клеток-хозяев при скорости роста между 0,05 и 0,20 удвоений в час; (b) извлечения после этого упомянутого пептидного продукта из этой среды.12. Способ по п.11, отличающийся тем, что в среде присутствует увеличивающее проницаемость мембраны количество глицина во время по меньшей мере части периода упомянутого регулируемого роста.13. Способ по п.11, отличающийся тем, что извлечение упомянутого продукта предусматривает (a) отделение клеток-хозяев от культуральной среды; (b) проведение жидкостной хроматографии с обращенной фазой этой среды и извлечение фракций, содержащих пептидный продукт; (c) проведение катионообменной хроматографии фракций стадии (b) (d) извлечение после этого фракций, содержащих пептидный продукт.Описание изобретения к патенту
Текст описания в факсимильном виде (см. графическую часть).Класс C12N15/63 введение чужеродного генетического материала с использованием векторов; векторы; использование их хозяев; регулирование экспрессии
Класс C12P21/02 с известной последовательностью из двух или более аминокислотных остатков, например глутатиона
1
6 специфичный лектин - патент 2524425
Класс C12P21/06 гидролизом пептидной связи, например белковых гидролизатов
