способ диагностики функционального состояния нейтрофилов человека
Классы МПК: | G01N33/52 использование соединений или составов для колориметрического, спектрофотометрического или флуорометрического анализа, например реактивной бумаги |
Автор(ы): | Годков М.А., Зинкин В.Ю. |
Патентообладатель(и): | Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В.Склифосовского, Годков Михаил Андреевич, Зинкин Владимир Юрьевич |
Приоритеты: |
подача заявки:
2001-12-05 публикация патента:
10.12.2003 |
Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторным методам исследований. Сущность способа: венозную кровь человека центрифугируют на двойном градиенте плотности фиколл-верографина 1,118 и 1,076 г/мл, осуществляют гипотонический лизис примеси эритроцитов, доводят гранулоциты до концентрации 5
106 кл/мл. Определяют уровень спонтанной и индуцированной активности, в качестве индукторов используют опсонизированный и неопсонизированный зимозан. При определении уровня спонтанной активности в лунку вносят 50 мкл 0,4%-ного раствора нитросинего тетразолия (НСТ), 50 мкл инкубационной среды и 100 мкл клеточной суспензии, а при определении уровня индуцированной активности в лунку вносят 50 мкл раствора НСТ, 50 мкл взвеси стимулятора и 100 мкл клеточной суспензии, планшет с пробами инкубируют при 37oС, центрифугируют отделяют надосадок, добавляют этанол и снова центрифугируют, повторно отделяют надосадок, добавляют 0,85%-ный раствор NaCl и снова центрифугируют, после чего в каждую пробу добавляют димексид и инкубируют при 58-63oC, добавляют раствор КОН, результаты реакции регистрируют на фотометре по разнице экстинкций при длине волны 630 и 490 нм. Способ обладает высокой чувствительностью. 1 табл.
Рисунок 1

Формула изобретения
Способ диагностики функционального состояния нейтрофилов человека, заключающийся в исследовании кислородзависимого метаболизма путем предварительного выделения пула нейтрофильных гранулоцитов, постановки реакции восстановления нитросинего тетразолия в 96 луночных плоскодонных планшетах для иммунологических исследований и последующей фиксации результатов реакции с помощью многоканального фотометра, отличающийся тем, что в процессе выделения нейтрофилов венозную кровь человека центрифугируют на двойном градиенте плотности фиколл-верографина 1,118 г/мл и 1,076 г/мл, осуществляют гипотонический лизис примеси эритроцитов, доводят гранулоциты до концентрации 5



Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики функционального состояния нейтрофилов человека путем исследования кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов. Кислородзависимый метаболизм нейтрофильных гранулоцитов (НГ) является уникальной системой немитохондриального дыхания, которое резко возрастает в процессе клеточной активации - так называемый "респираторный взрыв". Это событие сопровождается повышенным потреблением глюкозы и кислорода, а также увеличением продукции активных форм кислорода (супероксид анион, пероксид водорода, гидроксил радикал и синглетный кислород) [4]. Кислородные радикалы являются не только основой антимикробного потенциала нейтрофилов, но и активными регуляторами тканевого метаболизма человека [1]. Таким образом, исследование кислородзависимого метаболизма НГ позволит судить о функциональном состоянии ключевой клетки системы антимикробной резистентности организма, реагирующей на любые изменения гомеостаза. Показана высокая информационно-диагностическая значимость исследования функциональной активности нейтрофилов при бактериальных и вирусных инфекциях, коллагенозах, травмах, сердечно-сосудистых и стоматологических заболеваниях [11, 16, 18]. Одним из основных методов исследования кислородзависимого метаболизма НГ является тест с нитросиним тетразолием (НСТ), который основан на способности практически бесцветного НСТ восстанавливаться кислородными радикалами в темно-синий диформазан (ДФ). Наибольшее распространение получили варианты визуального учета НСТ-теста, основанные на микроскопическом подсчете НГ, содержащих в цитоплазме ДФ [2, 6, 14, 20, 22]. Основными недостатками такого подхода являются отсутствие количественной регистрации кислородных радикалов, генерированных пулом нейтрофилов, и субъективность учета результатов реакции. С целью устранения указанных недостатков предложены варианты фотометрического учета НСТ-указанных недостатков предложены варианты фотометрического учета НСТ-теста. Оптическое измерение экстрагированного ДФ позволяет количественно оценивать интенсивность реакции и, соответственно, объективней оценивать функциональную активность клеток. В свою очередь, эти методики подразделяются по способу экстрагирования восстановленного НСТ и регистрации оптической плотности полученного раствора. Большинство авторов для решения этих задач используют кипячение прореагировавших клеток на водяной бане в присутствии органических растворителей (диоксана, пиридина, диметилформамида) с последующей фотометрией надосадочной жидкости в кюветных спектрофотометрах [3, 9, 12, 13, 23]. Однако использование больших объемов реагентов, использование кипящих токсических растворителей и отсутствие автоматизированной регистрации результатов реакции существенно ограничивает производительность и повышает трудоемкость данных модификаций. Известен способ диагностики функционального состояния нейтрофилов человека путем автоматизированного учета НСТ-теста с использованием пластиковых планшетов и многоканального спектрофотометра [8]. Известный способ проводится с выделенными нейтрофилами крови, которые получают после центрифугирования на градиенте фиколла - верографина (d=1,077 г/см3) и лизиса примеси эритроцитов хлористым аммонием. Полученную клеточную суспензию доводят до концентрации 1

I. Анализ влияния количества нейтрофилов в лунке планшета на количество образовавшегося ДФ. Оптимальным следует считать количество НГ в пределах от 250 до 750 тысяч в лунке. В данном диапазоне оптическая плотность раствора в спонтанном тесте линейно нарастает с 0,18 до 0,35; в индуцированном - с 0,65 до 1,25. Из этой зоны оптимума нами выбрана концентрация в 500


- использование концентрации НГ в лунке планшета 500

- использование корпускулярных индукторов в концентрации 15

- применение тестовой (?=630 нм) и референтной (?=490 нм) длин волн. Соблюдение указанных принципов позволило достичь высокой воспроизводимости (коэффициент вариации 10-15%) и чувствительности (50 тыс. клеток) метода. Способ осуществляют следующим образом. Приводим описание методики проведения количественного метода исследования кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов человека. I. На первом этапе осуществляют выделение нейтрофильных лейкоцитов (продолжительность этапа 50-60 мин для 10 образцов). Для чего на двойной градиент плотности (1,118 г/мл и 1,076 г/мл) фиколл-верографина (объемом по 2 мл каждый) наслаивают 8 мл крови, приготовленной следующим образом: 3 мл исследуемой крови разводят в 5 мл 0,85%-ного раствора NaCl. Центрифугируют 15 мин при 250 g. Забор нейтрофилов производят с помощью капилляра на границе раздела плазма/эритроциты. К отобранным в пластиковую пробирку клеткам добавляют 10-кратный объем 0,85%-ного раствора NaCl и центрифугируют 10 мин при 250 g. Добавляют к клеточному осадку 10 мл дистиллированной воды и щадяще ресуспендируют 30-40 сек. Затем добавляют 1 мл 8,5%-ного раствора NaCl и центрифугируют 10 мин при 250 g. Выделенные НГ доводят до концентрации 5

1. Спонтанному уровню активности нейтрофилов (сНСТ), выраженному в mOD. 2. Индуцированному опсонизированным зимозаном уровню активности нейтрофилов (о/зНСТ), выраженному в mOD. 3. Индуцированному неопсонизированным зимозаном уровню активности нейтрофилов (н/зНСТ), выраженному в mOD. 4. Коэффициентам активации - расчетным величинам, определяемым по отношению: о/зНСТ к сНСТ - КАо; н/зНСТ к сНСТ - КАн. 5. Коэффициенту опсонизации, определяемому по отношению о/зНСТ к н/зНСТ-КО. С помощью оптимизированного фотометрического варианта НСТ-теста оценивают кислородзависимый метаболизм нейтрофилов у пациентов указанных групп. С целью объективизации исследования параллельно проводят спонтанный и активированный латексом НСТ-тест (спНСТ и латНСТ (соответственно)) в его микроскопической модификации [2]. Полученные данные после статистической обработки с помощью программы "Биостатистика" [5] представлены в таблице. Представленный в таблице материал наглядно демонстрирует схожий характер изменения спонтанной активности нейтрофилов на фоне обширного гнойно-воспалительного процесса - перитонит, ожоговая травма. Так, с помощью фотометрического варианта НСТ-теста выявлено достоверное увеличение продукции кислородных метаболитов на 80 и 65% соответственно. Аналогичная, но выраженная в меньшей степени (32 и 23%) тенденция отмечена по данным микроскопического варианта. Подавление уровня спонтанной клеточной активности зафиксировано у пациентов с медиальными переломами бедра и в особенности у больных с экзогенным отравлением ПСП. Продукция кислородных радикалов пулом нейтрофилов была достоверно снижена на 60%, а процент ДФ позитивных клеток - на 23%. Угнетение кислородзависимого метаболизма НГ в ответ на дополнительную стимуляцию опсЗМ, н/оЗМ и латексом у больных с отравлением ПСП было значимо снижено на 72, 80,5, и 22% соответственно. Достоверное подавление индуцированных тестов у пациентов с переломами ШБК отмечено только в фотометрическом варианте НСТ-теста при использовании не- и опсонизированного зимозана (36 и 40% соответственно). У ожоговых больных и пациентов с распространенным перитонитом имелась тенденция к снижению процента активированных латексом НГ. Напротив, лейкоциты пациентов данных групп в ответ на стимуляцию зимозаном отвечали достоверным повышением продукции активных форм кислорода. Значения о/зНСТ-теста у пациентов с термической травмой были повышены на 35%, н/оНСТ-теста - на 40%. У больных с перитонитом происходило "расщепление" функциональной активности клеток: увеличение лейкоцитарной активности в тесте с н/оЗМ наблюдалось на фоне практически неизменного ответа на опсЗМ. По всей видимости, такая клеточная реакция (в первую очередь) зависит от рецепторной перестройки НГ, возникающей в силу целого ряда причин:
Во-первых, выраженная воспалительная реакция сопровождается выбросом из костномозгового депо большого количества юных форм нейтрофилов, обладающих незрелым рецепторным аппаратом. Во-вторых, в связи с процессами интернализации и/или "шеддинга" рецепторов к Fc фрагментам иммуноглобулинов класса G (в частности, FcrRII, FcrRIII), происходящими при активации НГ [15, 19, 21]. В-третьих, имеются данные об опосредуемой через интегрины (осуществляют рецепцию н/оЗМ) негативной регуляции кислородзависимого метаболизма нейтрофилов в ответ на стимуляцию опсЗМ. В основе этого феномена, по-видимому, лежит вовлечение конкурентных путей клеточной активации, использующих общие вторичные мессенджеры (тирозин и фосфатидилинозитолкиназы) [24]. Таким образом, способ диагностики функционального состояния нейтрофилов человека за счет использование не- и опсонизированного зимозана позволяет выявлять случаи функциональной дискретности нейтрофилов в ответ на стимуляцию, опосредованную через различные рецепторные структуры и пути активации. Так, в группе больных с медиальными переломами бедра в 47% наблюдений отмечали подавление метаболической активности нейтрофилов в обоих индуцированных тестах, селективное подавление активации на опсЗМ в 23% случаев и лишь 29% пациентов имели нормальный ответ на оба стимула. С целью описания прикладной значимости метода приведем клинический пример:
Больная Б. , 83-х лет поступила в НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского через 2-е суток после травмы в быту. Клинический диагноз: субкапитальный перелом шейки левой бедренной кости со смещением. Гипертоническая болезнь II ст. Атеросклероз сосудов головного мозга, хроническая цереброваскулярная недостаточность. При осмотре: область левого тазобедренного сустава увеличена в объеме, левая нижняя конечность ротирована кнаружи и укорочена на 2 см, пальпаторно область сустава резко болезненна, активные движения в левом тазобедренном суставе резко ограничены. На рентгенограмме - субкапитальный перелом шейки левого бедра со смещением. Лабораторно: клинический анализ крови - Нb - 127 г/л, Эр - 4,0 млн., Лей - 5,5 тыс. , п/я - 2, с/я - 60, Э - 1, Лф - 31, М - 6; при исследовании кислородзависимого метаболизма НГ с помощью фотометрического и микроскопического вариантов НСТ-теста отмечено повышение показателей спонтанного уровня активности, подавление ответа на латекс и опсЗМ, сохранение ответа на н/оЗМ. Наличие субкапитального перелома шейки левого бедра явилось показанием к эндопротезированию левого тазобедренного сустава. На 6-е сутки с момента поступления больной под эндотрахеальным наркозом произведено субтотальное эндопротезирование левого тазобедренного сустава биполярным эндопротезом фирмы "Beznoska" с цементной фиксацией бедренного компонента. Рана дренирована однопросветным силиконовым дренажем с вакуумной аспирацией в сборник типа "гармошка". Лабораторные данные к моменту оперативного вмешательства: клинический анализ крови - Hb - 95 г/л, Эр - 3,2 млн., Лей - 9,0 тыс., п/я - 11, с/я - 76, Э - 0, Лф - 10, М - 3; значения микроскопического варианта НСТ-теста в пределах физиологической нормы, по данным фотометрического варианта - сохранение подавленного ответа на опсЗМ. Полученные данные послужили основанием для включения в комплекс лечебных мероприятий иммунокорригирующей терапии (полиоксидоний по 6 мг в/м 1 раз/сут в течение 5 дней). Лабораторный контроль эффективности комплексной терапии на 9-е сутки: клинический анализ крови - Hb - 95 г/л, Эр - 3,0 млн., Лей - 5,3 тыс., п/я - 4, с/я - 47, Э - 7, Лф - 36, М - 6; значения НСТ-тестов в пределах физиологической нормы. Раневой процесс протекал гладко, послеоперационная рана зажила первичным натяжением, швы сняты на 11-е сутки. В удовлетворительном состоянии больная выписана домой на 14-е сутки с момента операции. Ближайшие результаты лечения и функции сустава хорошие. Заявленный способ отвечает современным требованиям к методам лабораторной диагностики иммунодефицитных состояний, обладает высокой чувствительностью и информативностью при воспалительных заболеваниях брюшной полости, ожоговой болезни, экзогенных отравлениях и травмах опорно-двигательного аппарата. С помощью заявленного способа можно выявлять нарушения функциональной активности нейтрофилов человека с учетом дискретности механизмов их развития, проводить целенаправленную иммунокоррекцию и осуществлять контроль эффективности проводимой терапии. Список литературы
1. Бахов Н.И., Александрова Л.З., Титов В.Н.//Лаб. дело. - 1988. - 6. - С.3 - 12. 2. Бумагина Т.К., Шмелев Е.И. //Лаб. дело. - 1981. - 4. - С. 200-202. 3. Вагнер В. К., Насонкин О.С., Борискина Н.Д. // Лаб. дело. - 1989. - 12. - С. 31-33. 4. Воспаление: Руководство для врачей. / Под ред. В.В. Серова, B.C. Паукова. - М., 1995. 5. Гланц С. Медико-биологическая статистика. - М., 1999. 6. Дранник Г.Н., Ковалев О.В. //Лаб. дело. - 1985. - 10. - С. 617-19. 7. Земсков В.М., Барсуков А.А., Безносенко С.А. и др. // Метод, рекомендации. - М., 1988. 8. Киселева Е.П., Полевщиков А.В. // Клин. лаб. диагн. - 1994. - 4. - С. 27-29. 9. Кубась В.Г., Данилова О.П., Никифорова Н.А. //ЖМЭИ. - 1987. - 4. - С. 58-59. 10. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Под ред. В. В. Меньшикова. - М., 1987. 11. Маянский А.Н., Пикуза Щ.И. Клинические аспекты фагоцитоза. - Казань, 1993. 12. Невмятуллин А.Л., Зеленова Е.Г., Маянский А.Н. // Лаб. дело. - 1985. - 6. - С. 347-349. 13. Черешнева М. В., Шилов Ю.И., Баданина О.Н., Осотов С.В. // Иммунология. - 2000. - 1. - С. 26-29. 14. Щербаков В.И.//Лаб. дело. - 1989. - 1. - С. 31-32. 15. Alves Rosa M.F., Vulcano M., Minnucci F.S., Di Gianni P.D., Isturiz M.A. // Clin. Immunol. Immunopathol. - 1997. - Vol. 83 (2). - P. 147-55. 16. Chello M. // Eur. J. Cardiothorac. Surg. - 1997. - Vol. 11 (l). - P. 162-68. 17. Clark J.L.// Del. Med. J. - 1973. -Vol. 45 (7). - P. 197-200. 18. De Toni S. // Ann. NYAcad. Sci. - 1997. - Vol. l5 (832). - P. 363-367. 19. Leino L., Lilius E.M. // J. Leukoc. Biol. - 1992. - Vol. 51 (2). - P. 157-63. 20. Matula G., Paterson P.Y. // N. Engl. J. Med. - 1971. - Vol. 285.- P. 311-14. 21. Middelhoven P.J., Van Buul J.D., Hordijk P.L., Roos D. // Clin. Exp. Immunol. - 2001.- Vol. 125 (l). - P. 169-75. 22. Park B.H., Fikrig S.M., Smithwick E.M. // Lancet. - 1968. - Vol. 2 (7567). - P. 532-4. 23. Richardson M.P., Ayliffe M.J., Helbert M., Davies E.G. // J. Immunol. Methods. - 1998. - Vol. 219. - P. 187-93. 24. Van S.R., Novak M.J. // Cell. Immunol. - 1999. - Vol. l95 (2). - P. 119-26.
Класс G01N33/52 использование соединений или составов для колориметрического, спектрофотометрического или флуорометрического анализа, например реактивной бумаги