реагент для диагностирования инфекции, вызванной вирусом puumala

Формула изобретения

1. Реагент для обнаружения инфицирования вирусом Puumala, содержащий сенсибилизированные нерастворимые в воде частицы носителя и антигены вируса Puumala, связанные с внешней поверхностью частиц носителя, в количестве от 0,005 до 2 мас %.

2. Реагент по п.1, отличающийся тем, что сенсибилизированные нерастворимые в воде частицы носителя суспендированы в физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS), содержащем 1% (по объему) инактивированной кроличьей сыворотки.

3. Реагент по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанные антигены вируса Puumala получены из клеток Vero E6 тканевой культуры или мозга хомяка.

4. Реагент по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанные частицы носителя представляют собой частицы неорганических соединений или эритроциты.

5. Реагент по п.4, отличающийся тем, что указанные частицы неорганических соединений выбраны из группы, состоящей из оксидов металлов III, IV или VI групп Периодической системы элементов, выбранных из группы, состоящей из диоксида кремния, оксида алюминия, диоксида титана, диоксида циркония, сесквиоксида железа (Fe₂O₃), оксида железа (Fe₃O₄), оксида кобальта и оксида никеля; гидроксидов, выбранных из группы, состоящей из гидроксида алюминия, гидроксида железа (Fе(ОН)₃) и гидроксида хрома; галогенидов, выбранных из группы хлорид серебра и бромид серебра; сульфидов; карбонатов, выбранных из группы, состоящей из карбоната кальция и карбоната магния; или сульфатов, выбранных из группы, состоящей из сульфата бария и сульфата стронция.

6. Реагент по п.4, отличающийся тем, что указанные частицы неорганических соединений выбраны из группы, состоящей из диоксида кремния и оксидов металлов, выбранных из группы, состоящей из металлов II, III и IV групп Периодической системы, причем указанные оксиды способны присоединяться к диоксиду кремния.

7. Реагент п.4, отличающийся тем, что указанные частицы неорганических соединений представляют собой частицы высокой плотности, полученные при покрытии частиц неорганических соединений слоем красителей или смесей красителей и неорганических соединений, и обработанные кремниевыми или титановыми связывающими реагентами для получения реакционноспособной поверхности, причем указанные частицы большой плотности имеют средний диаметр в интервале от 0,1 до 10,0 мк и удельный вес в интервале от 1,5 до 4,0.

8. Реагент по п.7, отличающийся тем, что указанные красители выбраны из группы, состоящей из катионных красителей, дисперсных красителей, прямых красителей, кислотных красителей, металлсодержащих красителей и флуоресцентных осветляющих красителей.

9. Реагент по п.1, отличающийся тем, что указанные антигены перед связыванием с частицами предварительно обрабатывают формалином при низкой температуре для повышения чувствительности.

Описание изобретения к патенту

Область, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к диагностическому реагенту для обнаружения вирусной инфекции. Более конкретно оно относится к диагностическому реагенту для серологического обнаружения инфекции, вызванной вирусом Puumala, обладающему повышенной специфичностью и чувствительностью, позволяющими точно диагностировать геморрагическую лихорадку с ренальным синдромом, вызванную вирусом Puumala.

Описание предшествующего уровня техники

Хантавирусы (Hantavirus) представляют собой серологически родственные члены семейства Bunyaviridae. Прототипом хантавируса является вирус Hantaan, который заражает азиатскую полосатую полевую мышь Apodemus agratius и был открыт в 1976 году (Lee et al., "Isolation of the Etiologic Agent of Korean Hemorrhagic Fever," J. Infect. Dis. 137:298-307 (1978)). Когда вирус переносится от мышек человеку, возникает острое заболевание, известное как геморрагическая лихорадка с ренальным (почечным) синдромом (HFRS, Корейская геморрагическая лихорадка). Вирус Seoul и вирус Puumala, обнаруженный позднее, также являются членами рода Hantavirus. Эпидемическая геморрагическая лихорадка, обнаруженная в азиатских странах, вызывается вирусами Hantaan или Seoul, тогда как HFRS, встречающаяся в европейских странах, вызывается вирусом Puumala. Вирус Puumala передается через автохтонных европейских носителей-грызунов, таких, например, как рыжая полевка (Clethrionomys glareolus). Недавно обнаружен хантавирусный легочный синдром (HPS) в США, который сопровождается высокой смертностью. HPS вызывается вирусом Sin Nombre того же самого фенотипа, что и вирус Hantaan, но антигенно отличный от него.

Основными клиническими особенностями эпидемической геморрагической лихорадки, обнаруженной в Азии и вызванной вирусом Hantaan или вирусом Seoul, являются лихорадка, кровоизлияние (в пищеварительный тракт и субконъюнктивиальное) и синдром почечной недостаточности. HFRS, обнаруженная в Европе, также характеризуется лихорадкой, менее тяжелыми кровоизлиянием и синдромом почечной недостаточности. HPS в США также сопровождается лихорадкой, острым респираторным дистресс-синдромом и отеком легких, приводящим к смерти, примерно, в течение недели после начала заболевания.

Существуют большие антигенное и генетическое различия между природными хантавирусами (hantavirus), поэтому соответствующая вакцина требуется почти для каждого отдельного вида. Кроме того, высокая перекрестная реактивность между отдельными видами рода hantavirus затрудняет возможность при диагностировании четко отличить одну хантавирусную инфекцию от других.

Инфекция, вызываемая вирусом Puumala, обнаружена в европейских странах и, в частности, ежегодно сообщается о нескольких тысячах случаев заболевания в странах Северной Европы. Так как его клинические симптомы являются менее тяжелыми, чем в случае других хантавирусных инфекций, то респираторный дистресс-синдром и синдром почечной недостаточности затрудняет отличие данной инфекции от других случаев дыхательной недостаточности или острого нефрита. Следовательно, необходим новый, точный, быстрый и простой способ серологической диагностики вируса Puumala.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следовательно, целью данного изобретения является обеспечить простой, быстрый и эффективный диагностический реагент для обнаружения инфекции, вызванной вирусом Puumala.

Данное изобретение предлагает диагностический реагент для обнаружения инфекции, вызванной вирусом Puumala, который представляет собой нерастворимые в воде частицы носителя и антиген вируса Puumala, находящийся на их внешней поверхности.

Далее настоящее изобретение предлагает реагент для обнаружения заражения вирусом Puumala; реагент приводят в контакт с сывороткой пациента, предположительно инфицированного вирусом Puumala, и наблюдают агглютинацию с целью определить, содержит ли сыворотка антитела против вируса Puumala, при этом указанный реагент представляет собой нерастворимые в воде сенсибилизированные частицы носителя, на внешней поверхности которых находятся антигены вируса Puumala в количестве от 0.005 до 2% вес.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для целей данного изобретения чистый антиген вируса Puumala, полученный из тканевой культуры или животного происхождения, связывается с нерастворимыми в воде частицами носителя, в результате получаются сенсибилизированные частицы носителя.

Чистый антиген вируса Puumala можно получить из различных источников, например из органов, в частности мозга животных, или из тканевой культуры, инфицированной вирусом. В одном типичном варианте воплощения изобретения клетки Vero E6 инокулируют с вирусом Puumala ATCC VR-984 и культивируют соответствующим образом, а инфицированные клетки лизируют. Антиген вируса выделяют и очищают от лизата для использования при получении диагностического реагента по данному изобретению. В другом варианте воплощения данного изобретения, в котором в качестве источника антигена вируса используют соответствующее животное, в мозг новорожденного хомячка (например, в возрасте менее одного дня) вводят с помощью инъекции вирус Puumala ATCC VR-984, затем размножают инфицированных хомяков, дезинтегрируя его мозг, и выделяя, и очищая вирусный антиген ультрацентрифугированием. Вирусный антиген используют для сенсибилизации нерастворимых в воде частиц носителя с целью приготовления дигностического реагента по данному изобретению.

Антиген вируса подвергают действию лучей и химически модифицируют для повышения его реактивности или чувствительности. Например, обработкой примерно 0.05% (объем/объем) раствором формалина при низкой температуре, например при 4^oС, в течение нескольких дней, например в течение 2 недель, с целью модифицировать белок антигена. Обработанный таким образом антиген связывают с внешней поверхностью нерастворимых частиц носителя, например HDP (частиц с высокой плотностью) или эритроцитов, получая сенсибилизированные частицы носителя. Диагностический реагент по данному изобретению представляет собой водную суспензию, содержащую сенсибилизированные частицы носителя.

Нерастворимые в воде частицы носителя могут включать частицы известных неорганических соединений или (красные кровяные клетки) эритроциты животных. Частицы неорганических соединений могут включать, но не ограничиваться ими оксиды металлов III, IV или VI групп Периодической системы элементов, например диоксид кремния, оксид алюминия, диоксид титана, диоксид циркония, сесквиоксид железа (F₂O₃), оксид железа (F₃O₄), оксид кобальта или оксид никеля; гидроксиды, например гидроксид алюминия, гидроксид железа (Fе(ОН)₃) или гидроксид хрома; галогениды, например хлорид серебра или бромид серебра; сульфиды, например сульфид кадмия; карбонаты, например карбонат кальция или карбонат магния, или сульфаты, например сульфат бария или сульфат стронция. Из них предпочтительно применяются диоксид кремния, оксид алюминия, диоксиды титана, циркония или их смешанные оксиды.

Неорганические соединения в виде макрочастиц могут также включать неорганические оксиды, диоксид кремния и оксиды металла, выбранного из группы, состоящей из металлов II, III и IV групп Периодической системы, в которых оксиды металла могут образовывать комплекс с диоксидом кремния. Типичными примерами неорганических оксидов являются оксид лития, оксид натрия, оксид калия, оксид магния, оксид кальция, оксид стронция, оксид бария, оксид алюминия, оксид титана, оксид циркония, оксид германия, оксид гафния, оксид олова, оксид цинка и тому подобное, но не ограничиваются только ими.

Для целей данного изобретения также могут применяться макрочастицы неорганических соединений, покрытые пигментами, если пигменты не оказывают вредного влияния на структуру неорганических соединений. Соединения могут быть покрыты одним или более слоев пигментов.

Частицы неорганических соединений могут иметь средний диаметр в интервале от 0.1 до 10 мк и предпочтительно от 0.8 до 5.0 мк и плотность в интервале от 1.5 до 4.0 и предпочтительно от 1.8 до 2.5.

Предпочтительно может применяться многослойное покрытие частиц неорганических комплексов. Комплексные неорганические частицы можно получать, покрывая частицы неорганических соединений, например частицы неорганических соединений на основе двуокиси кремния, слоем пигмента и, если необходимо, дополнительным слоем вышеупомянутых сложных оксидов. Затем образовавшиеся в результате частицы обрабатывают связующими, например связующими на основе кремния и титана, при этом образуется реактивная (реакционноспособная) поверхность. Полученные таким образом частицы обычно называют "частицы с высокой плотностью" (HDP), и их средний диаметр составляет от 0.1 мк до 10.0 мк и плотность (удельный вес) от 1.5 до 4.0.

Для целей данного изобретения частицы носителя имеют диспергируемость 80% или более и предпочтительно 90% и более. Термин "диспергируемость" в данном контексте указывает процент числа отдельных неаггломерированных частиц от общего числа частиц, суспендированных в водной среде. Диспергируемость можно измерять обычным счетчиком, например Coltercounter Model ZD-1.

Частицы носителя могут иметь различную форму в зависимости от кристаллической структуры неорганических соединений и способа их получения. Обычно они имеют форму полиэдральную, цилиндрическую, коническую и сферическую. Предпочтение отдается применению частиц сферической, особенно правильной сферической формы. Эти частицы могут быть получены известными методами, описанными, например, в JP 52-138094A или JP 61-149644A.

Возможно применять частицы носителей, пропитанные известными красителями. Красители могут включать, но не ограничиваться ими, катионные красители, такие как малахитовый зеленый, родамин В или метиленовый синий; дисперсные красители, такие как дианикс^тм (Mitsubishi Chemical Co., Ltd., Япония), дисбазол^тм (I. C.I., Великобритания, U.K.) микетонполиэфир^тм (Mitsui Toatsu К. К. Япония); прямые красители, например конго красный, прямой глубоко-черный Е W или хризофенин G; ализарин-сафрол В; кислотные красители, например ализариновый прямой синий А или ализарин-циариновый зеленый G; кислотные красители, например бриллиантовый черный F (diamond black F), chromfast navyblue В (хромовый флотский интенсивно-голубой В) или palatine fast blue BN (интенсивно-голубой); металлсодержащие красители, например asidol (азидол) (BASF, Германия), eisen opal (Horoya Kagakusa, Япония) или oreosol (Taoka Kagakusa, Япония); активные красители, например diamira, michishiron (Mitsubishi Chemical Co., Ltd., Япония) или sumifix (Sumitomo Chemical Co., Ltd. , Япония); флуоресцентные осветляющие красители, например mikiwhite (Mitsubishi Chemical Co., Ltd., Япония) или whitux (Sumitomo Chemical Co., Ltd., Япония). Предпочтительными являются металлсодержащие красители и катионные красители, а наиболее предпочтительными являются катионные красители.

Применяются красители, имеющие растворимость 1 весовую часть или более, более конкретно 5 весовых частей, наиболее предпочтительно 10 весовых частей в 100 частях метанола.

Количество красителей в частицах носителя может составлять от 0.5 мас.% до 8 мас.%, и предпочтительно от 1.0 мас.% до 5.0 мас.%, но не ограничивается этим. Взятые в вышеприведенном интервале красители облегчают наблюдение за агглютинацией антиген-антитело с целью обнаружения инфицирования вирусом Puumala, а также в этом случае предотвращается отток красителя из частиц неорганического носителя.

Гемоциты (клетки крови) можно использовать в качестве нерастворимых в воде частиц носителя для обнаружения антител вируса Puumala по данному изобретению. Источник или тип клеток крови не очень ограничен и может выбираться из таковых, применяемых для обнаружения агглютинации антиген-антитело. Хотя гемоциты проявляют относительно более низкую чувствительность, чем HDP, они все же могут преимущественно применяться в качестве нерастворимых в воде частиц носителя для целей данного изобретения.

Частицы носителя с повышенной благодаря антителу вируса Puumala чувствительностью можно получать, приводя в контакт антиген вируса, полученный, как описано выше, с частицами носителя так, чтобы связать антиген с внешней поверхностью частиц. Способ связывания антигена с частицей конкретно не ограничивается, но можно применять обычные методы. Например, частицы контактируют с антигеном в водной среде, например в физиологическом растворе или физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS), при смешивании антигена с взвешенными частицами в водной среде.

Отношение антигена к частицам носителя находится в интервале от 100 до 400 агглютинирующих единиц HDP и предпочтительно от 150 до 250 агглютинирующих единиц HDP на 1 г частиц. Контактирование осуществляют при рН 6.0-8.0 и при температуре от 4^oС до 20^oС. Применяемый здесь термин "агглютинирующая единица HDP" означает наименьшее количество антигена, требуемое для обнаружения агглютинации HDP-сыворотки.

После перемешивания несвязанные антигены удаляют отмыванием и раствор далее термостатируют с инертным сывороточным белком, например с альбумином бычьей сыворотки (BSA), для насыщения (заполнения) оставшихся активных участков внешней поверхности частиц.

Диагностический реагент по данному изобретению можно получать, суспендируя сенсибилизированные частицы в водном растворе до концентрации от 0.005 до 2 мас.% и предпочтительно от 0.05 до 1 мас.%.

Сенсибилизированные частицы носителя можно модифицировать с целью продлить срок хранения, хотя частицы сами по себе устойчивы, и можно использовать, просто суспендируя частицы модифицированного носителя в соответствующей водной среде, например в дистиллированной воде, непосредственно перед применением.

Диагностический реагент по данному изобретению является реактивным (реакционноспособным) по отношению к образцу сыворотки больного, предпочтительно зараженного или предрасположенного к заражению вирусом Puumala, что приводит к агглютинации с высокой степенью специфичности и чувствительности.

Примеры

Данное изобретение более подробно будет описано с помощью примеров, которые не ограничивают объем данного изобретения. В частности, нерастворимые в воде частицы носителя получают, покрывая ядро из диоксида кремния смесью красителя и диоксида кремния, а затем обрабатывают поверхность кремниевым связующим в одном варианте воплощения способа по данному изобретению, что не должно ограничить вид нерастворимых в воде частиц носителя.

Пример 1. Получение антигена вируса Puumala

Штамм Sotkamo вируса Puumala ATCC VR-984 получен из Американской коллекции культур клеток (MD, USA) и использован в качестве источника антигена вируса Puumala.

Вирус Puumala ATCC VR-984 пересевают в клетках Vero E6 (АТСС CRL 1586) до 10 пассажей и для применения в качестве заготовки вируса собирают клоны, образующие самые большие и самые прозрачные стерильные пятна. Получение вирусного антигена осуществляют, используя клетки Vero E6 или новорожденного хомяка в возрасте менее одного дня в качестве клеток-хозяев. Предпочтительно используют клетку Vero E6.

Получение вирусного антигена с применением клетки Vero E6 или новорожденного хомяка поясняется ниже.

Выращивание вируса в клетках Vero E6

Клетки Vero E6 тканевой культуры инокулируют с 0.1 мл вируса Puumala, полученного см. выше, и культивируют в термостате в атмосфере СO₂ при 37^oС в течение, примерно, 10 дней. Инфицированные клетки обрабатывают 0.1% Triton-X и собирают. Собранные клетки разрушают ультразвуком и центрифугируют при 4^oС, получая надосадочную жидкость, содержащую вирусные частицы. Надосадочную жидкость обрабатывают гамма-лучами (3000 рад) для полной инактивации вируса. Инактивированный вирус инокулируют в клетки Vero E6 и анализируют методом непрямого иммуно-флуоресцентного анализа антител (IFA) для подтверждения инактивации вируса. Ультрацентрифугирование со скоростью 70000 об/мин проводят при 4^oС в течение 4 часов, получая надосадочную жидкость, содержащую вирусный антиген, которую разводят PBS и фильтруют через сверхтонкий фильтр, получая очищенный антиген вируса Puumala.

Полученный таким образом раствор антигена вируса Puumala обрабатывают 0.05% (объем/объем) формалином при 4^oС в течение 2 недель для модификации поверхности белка антигена с целью повышения чувствительности. Антиген подвергают диализу против физиологического раствора и применяют как антигенный компонент диагностического реагента по данному изобретению.

Выращивание инфицированного вирусом новорожденного хомяка

Инъекцию вируса Puumala (0.01 мл) вводят в мозг новорожденного хомяка (в возрасте не более суток). Через 20 дней, когда парализовано более половины животных, мозг животных удаляют асептически и гомогенизируют. Для получения эмульсии (10-20% об.) к гомогенату добавляют физиологический раствор. Эмульсию, полученную таким образом из мозга, центрифугируют при 600 об/мин, 4^oС в течение 30 минут и к надосадочной жидкости добавляют 10-кратный объем этилового спирта, а затем осторожно встряхивают при низкой температуре и сушат в вакууме.

К высушенному веществу мозга добавляют физиологический раствор до первоначального его (мозга) объема и 20% (объемных) сульфата протамина. После осторожного всряхивания при низкой температуре центрифугируют при 10000 об/мин в течение 60 минут, получая надосадочную жидкость, содержащую вирусный антиген, свободный от основного белка миелина. Надосадочную жидкость разбавляют PBS и фильтруют через сверхтонкий (ультра) фильтр, получая очищенный антиген вируса Puumala.

Полученный таким образом раствор антигена вируса Puumala обрабатывают 0.05% (по объему) формалином при 4^oС в течение 2 недель с целью модифицировать белок поверхности антигена для повышения чувствительности. Антиген подвергают диализу против физиологического раствора и применяют как антигенный компонент для диагностического реагента по данному изобретению.

Титр полученного таким образом раствора антигена определяют методом ELISA так, чтобы диагностический реагент, содержащий антиген, мог иметь постоянный титр. Титр раствора антигена, полученного в (1) и (2) случае, составляет 5-10 агглютинирующих единиц HDP/мл и 120 агглютинирующих единиц HDP/мл соответственно.

Пример 2. Получение частиц с высокой плотностью

В стеклянную колбу с мешалкой наливают 2800 мл метанола, 616 мл водного раствора аммиака (25 мас.%) и 21 мл водного раствора гидроокиси натрия (5М). При 10^oС к раствору по каплям со скоростью 25.5 мл/час добавляют 256 мл раствора (22 мас.%) тетраэтилсиликата в метаноле, при этом образуются частицы двуокиси кремния с диаметром 0.91 мк. 625 мл раствора (44 мас.%) тетраэтилсиликата в метаноле и 625 мл раствора (1.25 мас.%) метиленового синего в метаноле одновременно добавляют по каплям со скоростью 25.5 мл/час, при этом получают окрашенные частицы двуокиси кремния. Частицы двуокиси кремния повторно суспендируют и декантируют, чтобы очистить и промыть.

Полученные таким образом двухслойные частицы двуокись кремния/краситель имеют средний диаметр около 1.57 мк. Частицы носителя суспендируют в метаноле до концентрации 0.5 мас.%, и к образовавшейся суспензии добавляют фенилтриэтоксисилан до концентрации 0.5 мас.%. Реакцию проводят в течение 16 часов при 10^oС и в результате получают частицы двуокиси кремния с модифицированной поверхностью.

Пример 3. Получение HDP, покрытых оболочкой, содержащей антиген вируса Puumala

К раствору антигена вируса Puumala, полученному в примере 1, добавляют М/60 и PBS (рН 7.2), чтобы разбавить раствор до 2 агглютинирующих единиц HDP/мл. Образующийся раствор антигена (5 мл) смешивают с 0.5% HDP/PBS (5 мл) и осуществляют сенсибилизацию при осторожном встряхивании в течение 60 минут. Затем смесь трижды отмывают PBS и суспендируют при разведении (5 мл) инактивированной кроличьей сывороткой в PBS при 56^oС в течение 30 минут до концентрации 1%, получая сенсибилизированный раствор HDP.

Пример 4. Определение титра антител с применением HDPA или IFA

Титр антител сыворотки больных HFRS определяют, применяя HDPA (агглютинирующие частицы высокой плотности), а также непрямой IFA (иммунофлуоресцентный анализ).

Каждые 0.025 мл разведения из примера 3 помещают в лунки V-образного микропланшета и в первую лунку добавляют 0.025 мл испытуемой сыворотки (разведение 1:10). Испытуемый образец разводят серийно (последовательно), и по каплям добавляют сенсибилизированный раствор HDP (0.025 мл) из примера 3, и хорошо перемешивают. Оставляют при комнатной температуре, через 40 минут наблюдают агглютинацию в каждом разведении и максимальное разведение, при котором существует агглютинация антиген-антитело, определяют как "титр антитела HDP". Этим способом титр антител HDP определяют для 43 испытуемых образцов сыворотки.

Помимо этого осуществляют соответствующий IFA (непрямой иммунофлуоресцентный анализ антител) в отношении 43 испытуемых образцов сыворотки, и максимальное разведение, при котором наблюдается флуоресцентный комплекс антиген-антитело, определяют как "титр антитела IFA".

Для сравнения определяют чувствительность и специфичность IFA и HDPA в отношении инфекции Hantavirus с помощью диагностического реагента, раскрываемого в KR 90-16761A, содержащего HDP, сенсибилизированные вирусом Hantaan.

Результаты показаны в таблице.

Как видно из таблицы, результаты анализов IFA и HDPA показывают, что больные в Корее, Японии и Китае поражены вирусом Hantaan, тогда как больные в России, Финляндии и Югославии инфицированы вирусом Puumala. IFA и HDPA не отличаются заметно по чувствительности и специфичности. Диагностический реагент по данному изобретению делает возможным простой тест для обнаружения отличия между инфицированием вирусом Puumala и вирусом Hantaan с самой высокой доступной соответствующему IFA степенью чувствительности. Следовательно, можно диагностировать раннюю стадию геморрагической лихорадки с почечным синдромом (HFRS), вызванной вирусом Puumala, и отличить ее от близких синдромов, таких как острый респираторный диспресс-синдром или синдрома почечной недостаточности, которые трудно отличить от HFRS клиническими исследованиями.

Пример 5. Получение эритроцитов, сенсибилизированных антигеном вируса Puumala

К PBS, содержащему 2.5% инактивированных эритроцитов овцы, добавляют эквивалентный объем раствора дубильная кислота/PBS 1:100000 и смесь оставляют для реакции при 20^oС на 20 минут. Реакционную смесь промывают PBS (смесь 1/60 М физиологического раствора с фосфатным буфером (рН 7.2) и физиологического раствора в объемном соотношении 1:3) один раз, а затем суспендируют в PBS, получают 0.5%-ную суспензию, содержащую комплекс танин-клетка крови (гемоцит).

Суспензию танин-гемоцит смешивают с 80-кратным разведением антигена вируса Puumala, полученного в примере 1 (1:1 по объему), и образующуюся смесь осторожно всряхивают при комнатной температуре в течение 60 минут для осуществления сенсибилизации. Затем смесь отмывают трижды PBS и суспендируют в инактивированной кроличьей сыворотке (1%) в PBS до достижения концентрации 0.5%, получают сенсибилизированный раствор эритроцитов.

Пример 6. Определение титра антител с применением сенсибилизированного раствора эритроцитов

В лунки V-образного микропланшета помещают по 0.025 мл разведения инактивированной кроличьей сыворотки (пример 3) и в первую лунку добавляют 0.025 мл сыворотки (разведение 1:10; сыворотка N 11 в таблице). Испытуемый образец разбавляют сериями, по каплям добавляют сенсибилизированный раствор эритроцитов (0.025 мл) в примере 3. Через 3 часа при комнатной температуре наблюдается агглютинация. В результате титр антител равен 40.

Хотя предпочтительные варианты осуществления способа по данному изобретению описаны выше, должно быть четко понято, что многие варианты и/или изменения основных концепций, предлагаемых в изобретении, которые будут очевидны специалистам, отвечают духу и входят в объем данного изобретения, как это отражено в предлагаемой формуле изобретения.