способ получения препарата гиалуронидазы

Формула изобретения

1. Способ получения препарата гиалуронидазы, включающий измельчение семенников, экстракцию биомассы раствором уксусной кислоты, концентрирование, очистку концентрата и последующую доочистку сорбцией балластных примесей активированным углем, отличающийся тем, что очистку концентрата проводят смесью 2-5 об.% хлороформа в присутствии 0,5 - 1,0 моль/л хлористого натрия, а доочистку проводят активированным углем, предварительно обработанным 2-4% раствором хлористого натрия.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что предварительную обработку активированного угля выполняют замачиванием его в растворе хлористого натрия не менее 4 ч с последующим автоклавированием.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к производству лекарственных средств, применяемых в медицинской практике, и касается получения препаратов из животного сырья.

Известен способ получения гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота (пат. RU 2054943, МПК⁶ A 61 K 35/48, опубл. 1996 г.), включающий измельчение семенников, экстракцию биомассы раствором уксусной кислоты, центрифугирование, ультрафильтрацию надосадочной жидкости, концентрирование, охлаждение, очистку концентрата 4-6 об.% хлороформом в присутствии 1 моль/л хлористого натрия и центрифугирование.

Такой способ не позволяет получить достаточно высокой степени очистки, вследствие чего целевой продукт обладает низкой удельной активностью, содержит значительное количество балластных белков, а в препарате присутствуют остатки хлороформа. Кроме того, недостаток способа - сложности с масштабированием процесса, возникающие при центрифугировании больших объемов субстратов.

Известен другой способ получения гиалуронидазы (пат. RU 2159284, МПК⁷ C 12 N 9/26, опубл. 2000 г.), включающий измельчение семенников убойных животных, экстракцию биомассы раствором уксусной кислоты, очистку концентрата замораживанием при температуре минус 5-20^oС с оттаиванием, концентрирование методом ультрафильтрации и последующую доочистку сорбцией балластных примесей активированным углем.

Такой способ позволяет получить достаточно высокую степень очистки.

Однако такой способ нетехнологичен и непроизводителен, что объясняется необходимостью замораживания и последующего оттаивания концентрата. Для замораживания используется дорогостоящее энергоемкое оборудование, процесс очистки длителен и возникают сложности при масштабировании процесса, т.е. при обработке больших объемов (в условиях промышленного производства). Кроме того, в таком способе предусмотрено три стадии очистки: замораживание с последующим оттаиванием, удаление балластных примесей этакридина лактатом и доочистка активированным углем. На каждой стадии происходят потери очищаемого препарата. При замораживании теряется до 10% активности гиалуронидазы, а потери на последующих двух стадиях составляют до 20%.

Задачей предлагаемого изобретения является создание технологичного, производительного способа получения препарата гиалуронидазы, обеспечивающего высокую степень очистки и достаточно высокий выход целевого продукта.

Поставленная задача достигается за счет усовершенствования способа получения препарата гиалуронидазы, включающего измельчение семенников, экстракцию биомассы раствором уксусной кислоты, концентрирование, очистку концентрата и последующую доочистку сорбцией балластных примесей активированным углем.

Это усовершенствование заключается в том, что очистку концентрата проводят смесью 2-5 об. % хлороформа в присутствии 0,5-1,0 моль/л хлористого натрия, а доочистку проводят активированным углем, предварительно обработанным 2-4% раствором хлористого натрия.

Кроме того, предварительную обработку активированного угля можно выполнять замачиванием его в растворе хлористого натрия не менее 4 часов с последующим автоклавированием.

Проведение очистки концентрата смесью 2-5 об.% хлороформа в присутствии 0,5-1,0 моль/л хлористого натрия позволяет удалять высокомолекулярные примеси, в том числе - гемпигменты. При этом хлороформ переводит балластные белки в нерастворимое, взвешенное состояние, а добавление хлористого натрия способствует осаждению нерастворимых белков.

Концентрация хлороформа меньше 2 об.% не обеспечит требуемой степени очистки от высокомолекулярных примесей, включая гемпигменты.

Увеличение концентрация хлороформа выше 5 об.% нецелесообразно, так как приводит к повышению расхода хлороформа и загрязнению целевого продукта.

Содержание хлористого натрия в смеси меньше 0,5 моль/л не обеспечит требуемого эффекта, а больше 1,0 моль/л нецелесообразно, так как приводит к повышению расхода хлористого натрия и загрязнению целевого продукта.

Проведение доочистки активированным углем, предварительно обработанным 2-4% раствором хлористого натрия, обеспечивает удаление низкомолекулярных примесей. Предварительная обработка угля 2-4% раствором хлористого натрия повышает его способность адсорбировать низкомолекулярные примеси, что необходимо для увеличения удельной активности целевого продукта.

Выполнение предварительной обработки активированного угля замачиванием его в растворе хлористого натрия не менее 4 ч с последующим автоклавированием позволяет быстро и просто получить активированный уголь с требуемыми адсорбционными свойствами, лишенный пирогенных свойств.

Способ осуществляют следующим образом.

Семенники крупного рогатого скота очищают от оболочек и подвергают измельчению на электромясорубке. Для экстракции в полученную биомассу добавляют раствор уксусной кислоты. Экстракцию проводят в течение 62 ч при постоянном перемешивании. Гомогенат фильтруют через миткаль с целью отделения прозрачного раствора, содержащего гиалуронидазу, от ткани семенников. Полученный экстракт концентрируют ультрафильтрацией на полых волокнах (ВПУ 15) до конечного объема 1/4-1/5 от исходного. К полученному концентрату добавляют хлороформ (2-5%), смесь интенсивно перемешивают, прибавляют хлористый натрий (0,5-1,0 моль/л) и выдерживают в течение 1,0-1,5 ч, затем осадок отделяют фильтрацией через миткаль. В прозрачный фильтрат добавляют специально обработанный 2-4% раствором хлористого натрия активированный уголь марки ОУ-Б, тщательно перемешивают в течение 1 ч. Затем смесь фильтруют на нутч-фильтре через миткаль. Фильтрат собирают в мерник, определяют концентрацию натрия хлористого, при необходимости проводят диафильтрацию на полых волокнах (ВПУ-15) до конечной концентрации хлористого натрия не более 0,9%. Раствор фильтруют на трехрамном фильтре через пластины типа Zeta plus марки 60SP, затем 90SP. Полученный фильтрат подвергают стерилизующей фильтрации, разливают в ампулы по 0,5 мл из расчета 64-128 УЕ на ампулу, лиофилизируют.

Пример 1. 100 кг замороженных семенников крупного рогатого скота измельчают на электромясорубке, добавляют в фарш 150 л 0,1 н. раствора уксусной кислоты. Смесь экстрагируют в течение 4 ч. По окончании экстракции гомогенат фильтруют через миткаль. Полученный экстракт в объеме 180 л концентрируют методом ультрафильтрации до объема 45 л (1/4 от исходного). К полученному концентрату медленной струей приливают 900 мл хлороформа (2 об.%), интенсивно перемешивают. Затем к полученной смеси прибавляют хлористый натрий в количестве 1,300 кг (0,5 моль/л). Раствор выдерживают в течение 1 ч, затем фильтруют через миткаль. Осадок удаляют, а в прозрачный раствор в объеме 44,0 л добавляют предварительно подготовленный активированный уголь марки ОУ-Б в количестве 3,520 кг (из расчета 80 г/л).

Активированный уголь предварительно замачивают в 2% растворе хлорида натрия на 4 ч, затем автоклавируют при t 132^oC, р=2 атм в течение 1 ч, охлаждают до 30-40^oС, надосадочный слой декантируют.

Смесь раствора гиалуронидазы с углем фильтруют на нутч-фильтре через миткаль, затем на трехрамном фильтре, заправленном пластинами марки 60SP, 90SP, фильтрат собирают в мерник. В результате получают 42 л очищенной тестикулярной гиалуронидазы с активностью 170 УЕ/мл и содержанием белка 10 мг/мл, содержание хлористого натрия в растворе 0,8%. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации, разливают в ампулы по 0,5 мл. Гиалуронидазная активность лиофилизированного препарата 85 УЕ в ампуле, удельная активность 17 УЕ/мг белка.

Пример 2. 150 кг замороженных семенников крупного рогатого скота измельчают на электромясорубке, добавляют в фарш 250 л 0,1 н. раствора уксусной кислоты. Смесь экстрагируют в течение 4 ч. По окончании экстракции гомогенат фильтруют через миткаль. Полученный экстракт в объеме 350 л концентрируют методом ультрафильтрации до объема 70 л (1/5 от исходного). К полученному концентрату медленной струей приливают 3500 мл хлороформа (5 об.%), интенсивно перемешивают. Затем к полученной смеси прибавляют хлористый натрий в количестве 4,060 кг (1,0 моль/л). Раствор выдерживают в течение 1 ч, затем фильтруют через миткаль. Осадок удаляют, а в прозрачный раствор в объеме 68 л добавляют предварительно подготовленный активированный уголь марки ОУ-Б в количестве 6,8 кг (из расчета 100 г/л).

Активированный уголь предварительно замачивают в 5% растворе хлорида натрия на 4 ч, затем автоклавируют при t 132^oC, р=2 атм в течение 1 ч, охлаждают до 30-40^oС, надосадочный слой декантируют.

Смесь раствора гиалуронидазы с углем фильтруют на нутч-фильтре через миткаль, затем на трехрамном фильтре, заправленном пластинами марки 60SP, 90SP, фильтрат собирают в мерник. В результате получают 65 л очищенной тестикулярной гиалуронидазы с активностью 166 УЕ/мл и содержанием белка 9,2 мг/мл. Содержание хлористого натрия в растворе 1,6%, поэтому раствор подвергают диафильтрации на полых волокнах до конечной концентрации хлористого натрия не более 0,9%. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации, разливают в ампулы по 0,5 мл. Гиалуронидазная активность лиофилизированного препарата 83 УЕ в ампуле, удельная активность 18 УЕ/мг белка.

Таким образом, предлагаемое изобретение обеспечивает достаточно высокую степень очистки препарата гиалуронидазы при высоком выходе (на 10% выше, чем у прототипа) технологичным, производительным способом за счет исключения операции замораживания - оттаивания.