способ получения препарата для активной иммунизации против туляремии

Формула изобретения

1. Способ получения препарата для активной иммунизации против туляремии путем выращивания культуры Francisella tularensis с последующей ее инактивацией, отделением от низкомолекулярных примесей, очисткой и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что используют вирулентные и вакцинные штаммы, при этом инактивацию проводят фенолом в концентрации 0,5-2%, клетки разрушают гидродинамическим воздействием, очистку препарата проводят дифференциальным центрифугированием или ультрафильтрацией.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что гидродинамическую обработку суспензии клеток осуществляют с помощью гомогенизатора однократно в течение 5-10 мин или ультразвуком с частотой 200 кГц, мощностью 300 Вт, в течение 3 мин с минутной паузой после каждой минуты обработки при 0-4С.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что очистку препарата проводят дифференциальным центрифугированием в два этапа: 10000-12000 г не менее 30 мин, затем свыше 100000 г - не менее 60 мин.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что очистку проводят путем ультрафильтрации через мембраны, полые волокна с пропусканием частиц менее 1 млн дальтон.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что очистку проводят путем колоночной хроматографии на носителях с исключенным объемом более 2 млн дальтон.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что выделение и очистку препарата проводят осаждением в изоэлектрической точке в интервале рН 4,0-5,5.

7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что препарат, полученный предложенным способом, предназначен для перорального или парентерального введения.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологии и препаративной биохимии, в частности к способам получения протективных антигенов, и может быть использовано в медицинской и микробиологической промышленности для разработки и производства средств специфической профилактики и диагностики туляремии и других инфекционных заболеваний.

Известны способы получения профилактических противотуляремийных препаратов, в частности, на основе клеток высоковирулентных штаммов Francisella tularensis Shu и A-Cole неарктической разновидности, инактивированных с помощью прогревания, эфирной экстракции или формалина (1). Однако полученные такими способами препараты оказались непригодными в силу своей высокой реактогенности, громоздкой схемы иммунизации и низкой иммуногенности при использовании в хорошо переносимых дозах.

Наиболее близким аналогом заявляемого объекта является способ получения инактивированной противотуляремийной вакцины путем детоксикации - окисления клеток высоковирулентных штаммов неарктической разновидности азотистой кислотой, удалением солей и низкомолекулярных примесей рецентрифугированием в воде и изотоническом растворе хлорида натрия. Далее клетки ресуспендировали в изотоническом растворе NaCl с добавлением 0,5% фенола и хранили при +4^oС. Использовали препарат подкожно, в дозе 3610⁹ клеток (2).

Приготовленный в соответствии с известным способом препарат обладает сильным побочным действием, связанным с присутствием в нем содержимого клеток. Особенную опасность представляют нуклеиновые кислоты, запрещенные комитетом экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов, как компоненты химических вакцин.

Полученный по известному способу препарат содержит, кроме необходимых для развития защитного иммунного ответа еще и балластные вещества, с которыми связана аллергизация организма, приводящая к ухудшению здоровья. Кроме того, полученный в соответствии с известным способом препарат не защищает высоковосприимчивых и высокочувствительных к туляремии животных при заражении высоковирулентными штаммами неарктической разновидности.

При получении препарата по известному способу все операции выполняются с живыми высоковирулентными клетками, что создает значительный риск для здоровья персонала. Лекарственная форма препарата содержит фенол, являющийся высокоаллергогенным и высокотоксичным веществом.

Цель изобретения - увеличение иммуногенности, ликвидация побочных эффектов при применении in vivo, повышение безопасности и удешевление процесса получения профилактического препарата для активной иммунизации против туляремии.

Поставленная цель достигается тем, что, как и в известном способе, препарат для активной иммунизации против туляремии получают путем выращивания культур вирулентных штаммов с последующей их инактивацией (детоксикацией) и отделением низкомолекулярных примесей.

Согласно изобретению препарат для активной иммунизации против туляремии выделяют, фракционируя предварительно разрушенные ультразвуком клетки, в результате чего удаляется внутриклеточное содержимое, в том числе нуклеиновые кислоты. Удаление нуклеиновых кислот ликвидирует риск, связанный с введением в организм чужеродной генетической информации. Очистка препарата, получаемого в соответствии с заявляемым способом, от балластных белков, повышает его удельную иммуногенность, уменьшает общую антигенную нагрузку, влияние на иммунологическую реактивность, снижая тем самым риск возникновения аллергических реакций. Выделение в очищенном виде протективного компонента путем фракционирования разрушенных ультразвуком бактериальных клеток, в соответствии с заявляемым способом, практически ликвидирует местную выраженную реакцию, сопровождающуюся в некоторых случаях некрозом, присущую всем известным профилактическим противотуляремийным препаратам при повторном использовании.

Кроме того, используют клетки, вирулентных, например, А-Соlе, или вакцинных, например 15/3 штаммов Francisella tularensis, инактивированных фенолом в концентрации 0,5-2%, или мертиолятом натрия в концентрации 0,1-0,01%. Возможность использования при приготовления препарата для активной иммунизации против туляремии, наряду с вирулентными, вакцинных штаммов, позволяет повысить безопасность производственного процесса для персонала, уменьшить себестоимость производства. Фенол в концентрации 0,5-2% и мертиолят натрия в концентрации 0,1-0,01%, применяемые в качестве инактивирующих агентов, обладают минимальным повреждающим действием на антигенную структуру препарата для активной иммунизации против туляремии, способствуют мягкому лизису клеток, вследствие своего антипротеазного действия. На последующих стадиях процесса инактиврующие вещества полностью удаляются из препарата.

Кроме того, для разрушения клеток применяют ультразвук с частотой 20 кГц и мощностью 300 Вт в течение трех минут с интервалом в 1 мин после каждой минуты обработки при 4^oС. Данный режим обработки ультразвуком является оптимальным, так как вызывает максимальное разобщение клеточных структур, при сохранении нативной структуры протективного компонента, определяющего действие препарата для активной иммунизации против туляремии. Более мягкий режим оставляет неразрушенными большое количество клеток, в результате чего снижается выход целевого продукта; более жесткий приводит к разрушению нативных структур, снижая удельную активность препарата, затрудняя процесс выделения и очистки, концентрирования.

Кроме того, разрушенные клетки очищают дифференциальным центрифугированием в два этапа. На первом этапе центрифугированием при 10-12 тыс. g в течение 30 мин осаждают неразрушенные клетки и крупные обломки (детрит). На втором этапе путем осаждения при 100000 g и более, в течение не менее 60 мин, супернатанта, полученного после первого этапа, наряду с осаждением препарата для активной иммунизации избавляются от низкомолекулярных продуктов деградации биополимеров клетки, в частности белков, нуклеиновых кислот, остаточных компонентов питательной среды. При ресуспендировании очищенного препарата в деионизованной воде получают любую необходимую концентрацию для последующей фасовки во флаконы и лиофилизации.

Кроме того, после удаления крупных примесей путем центрифугирования в режиме 1 этапа очистку и концентрированно препарата для активной иммунизации против туляремии проводят путем ультрафильтрации через мембраны или полые волокна с диаметром пор, обеспечивающим фильтрацию молекул размером менее 1 млн дальтон.

Кроме того, очистку препарата проводят путем колоночной хроматографии на носителях с исключенным объемом более 2 млн дальтон с последующим концентрированном фракции, содержащей целевой продукт, например, на роторном испарителе.

Кроме того, выделение и очистку препарата для активной иммунизации против туляремии проводят осаждением в изоэлектрической точке в интервале рН 4-5,5; с последующим концентрированном путем ультрафильтрации.

Пример 1. Биомассу F.tularensis штамм А-Соlе получали путем культивирования при t=37^oC в жидкой среде состава:

1. Ферментативный гидролизат рыбокостной муки - 100 г/л.

2. "Черный альбумин" - 50 г/л.

3. NaCl - 3 г/л.

4. К₂НРО₄ - 3,8 г/л.

5. КН₂РО₄ - 1,2 г/л.

6. MgSО₄ - 0,5 г/л.

7. Аутолизат дрожжей - 5 г/л.

8. Глюкоза - 10 г/л.

9. Тиамин хлорид - 0,5 мг/л.

10. Никотиновая кислота - 2 мг/л.

11. 1-Цистин - 1 г/л.

12. рН=6,80,1.

13 Аминный азот - 210 мг %

Выращивание оканчивали при переходе культуры в стационарную фазу.

Биомассу сливали в предварительно приготовленные бутыли с фенолом из расчета конечной концентрации 2% и оставляли при температуре +4^oС.

После анализа биомассы на стерильность, клетки отделяли путем центрифугирования при 10000 g в течение 30 минут, затем ресуспендировали в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе (ФБР) рН 7,4 и оставляли при перемешивании на 16 часов при +4^oС.

Затем суспензию клеток подвергали гидродинамической обработке на гомогенизаторе "Vortis" или ультразвуковом дезинтеграторе "Labsonic" при 0^oС.

Дезинтеграт клеток центрифугировали при 12000 g в течение 30 минут, полученный супернатант - при 100000 g, +4^oC, 1 час. После удаления супернатанта осадок препарата для активной иммунизации ресуспендировали в деионизованной воде и трижды переосаждали путем центрифугирования при 100000 g с последующим ресуспендированием в деионизованной воде. Очищенный препарат лиофилизовали и хранили при +4^oС.

Препарат содержал 15% белка, 38% углеводов, был активен в РНАт с антигенным эритроцитарным туляремийным диагностикумом до титра 1/4098 при исходной концентрации 1 мг/мл.

ЕД₅₀ препарата для мышей СВА, определенная методом Кербера в модификации Ашмарина И.П. и Воробьева А.А. при подкожной иммунизации и подкожном заражении 80 DCL штамма 503 F.tularensis составила 235 мкг. Для нелинейных крыс при заражении 10¹⁰ клеток штамма А-Соlе - 20 мкг. Для мышей СВА при внутрибрюшинной иммунизации и подкожном заражении 10 Del штамма A-Cole - 990 мкг.

Пример 2. Биомассу F.tularensis штамма 15/3 выращивали, как описано в примере 1, до перехода культуры в стационарную фазу.

Биомассу сливали в предварительно приготовленные бутыли с фенолом из расчета конечной концентрации 0,5% и оставляли при +4^oС.

После анализа биомассы на стерильность проводили процедуру выделения и очистки препарата для активной иммунизации против туляремии, как описано в примере 1.

Полученный препарат содержал 15% белка, 38% углеводов, был активен в РНАт эритроцитарным антигенным туляремийным диагностикумом до титра 1/2048 при исходной концентрации 1 мг/мл.

ЕД₅₀ препарата для мышей СВА при подкожной иммунизации и подкожном заражении 80 DCl штамма 503 F.tularensis составила 261 мкг. Для морских свинок при заражении 870 DCl штамма 503-35,6 мкг.

Пример 3. Биомассу штамма 15/3 F.tularensis получали, как описано в примере 1. Полученную культуру сливали в предварительно приготовленные бутыли с мертиолятом натрия из расчета конечной концентрации 1/5000 (0,02%). Далее клетки подвергали гидродинамической обработке в течение 5 мин на приборе Vortis с охлаждением. Затем отделяли неразрушенные клетки и крупные обломки путем центрифугирования при 10000 g в течение 20 минут.

После этого супернатант подвергали осаждению в изоэлектрической точке при рН 4,0 или при рН 5,5. Полученный осадок отмывали и концентрировали путем ультрафильтрации через мембрану с порами, обеспечивающими пропускание молекул с размером менее 50000 дальтон на приборе СН-4 (Amicon, Франция).

Полученный концентрат доводили до объема 1 л деионизованной водой и вновь подвергали ультрафильтрации. После трехкратного повторения процедуры концентрат препарата для активной иммунизации против туляремии замораживали во флаконах и подвергали лиофильному высушиванию.

Очищенный препарат содержал 26% белка, 42% углеводов, был активен в РНАт с туляремийным антигенным эритроцитарным диагностикумом до титра 1/2048 при исходной концентрации 1 мг/мл.

ЕД₅₀ препарата для мышей СВА при подкожной иммунизации и подкожном заражении 150 Del штамма 503 составила 1720 мкг.

Пример 4. Биомассу штамма 15/3 получали, как описано в примере 1. После отделения неразрушенных клеток центрифугированием при 10000 g в течение 30 мин, полученный супернатант порциями наносили на колонку 26500 с пористым стеклом CPG-10 (700А, Serva) или Sepharosae 2В (LKB). Очищенный препарат для активной иммунизации против туляремии выходил со свободным объемом одним пиком. Детекцию осуществляли на приборе Uvicord S-2 (LKB) при 206 нм. Все порции элюата, содержащие препарат, объединяли и концентрировали на роторном испарителе, например "ROTOVAPOR-R-150" при температуре материала не выше +40^oС и вакууме 20 мм рт. ст. Далее препарат фасовали во флаконы, замораживали и лиофильно высушивали.

Полученный препарат содержал 9% белка, 17,6% углеводов, не содержал нуклеиновых кислот, был активен в РНАт с туляремийным антигенным эритроцитарным диагностикумом до титра 1/4096.

ЕД₅₀ для мышей СВА при подкожной иммунизации и подкожном заражении 150 DCL штамма 503 составила 920 мкг.

Пример 5. Препарат для активной иммунизации против туляремии получали, как описано в примерах 1 или 2. Далее определяли ЕД₅₀ для нелинейных белых мышей весом 18-20 г. Для этого с помощью автоматической дозирующей пипетки раствор препарата вводили мышам per os в объеме 0,3-0,5 мл. Через 21 день опытных и контрольных животных заражали подкожно 100 DCL штамма 503 F.tularensis.

ЕД₅₀ составила 9 мг при 100% гибели неиммунных мышей.

При получении препарата для активной иммунизации против туляремии по заявляемому способу вследствие мягкого разобщения клеточных структур с последующей очисткой от низко- и высокомолекулярных примесей повышается удельная иммуногенность целевого продукта.

Он обеспечивает защиту от гибели высокочувствительных животных при заражении до 870 DCL высоковирулентного штамма 503, а также 10-30 DCL штамма А-Соlе.

Благодаря очистке от балластных веществ препарат нетоксичен при внутривенном введении кроликам в дозе до 100 мг, при внутрибрюшинном введении мышам до 10-15 мг.

Повторное введение препарата кроликам подкожно не вызывает местных изменений, кроме папулы и легкой гиперемии.

Разнообразие методов, использованных для выделения и очистки препарата, позволяет разработать оптимальную технологию его производства в зависимости от требуемых количеств и лекарственной формы.

Впервые получен препарат для активной иммунизации против туляремии, обеспечивающий защиту лабораторных животных, не только при парентеральном, но и при пероральном введении.

Вследствие возможности использования для производства препарата биомассы вакцинного штамма 15 резко уменьшается опасность для здоровья персонала.

Относительно простая технология получения больших количеств лиофилизованного препарата в сочетании с низкой токсичностью позволит при необходимости использовать его для аэрозольной иммунизации значительных контингентов людей.

Литература.

1. Sandstrom G. Francisella tularensis and cell-mediated immunity in man. - Doctor dissertation, Umea, Sweden, 1988, p.92.

2. Foshay M.D., Hesselbrock W.H., Wittenberg M.D., Rodenberg A.H. Vaccine prophylaxis against tularemia in man. - American Journal of public health, 1942, vol. 32, p. 1131-1145.