композиция для стимуляции синтеза меланинового пигмента и способ ее получения

Формула изобретения

1. Способ получения композиции для стимуляции синтеза меланинового пигмента, включающий следующие стадии: 1 кг замороженных котиледонов плаценты измельчают и подвергают мацерации этанолом 90-96 и при равных частях масса/объем, этот мацерированный продукт фильтруют и оставляют ее на 24 ч, к 200 мл экстракта, содержащего пигментирующий фактор, добавляют насыщенный раствор бензойной кислоты в этаноле от 90 до 96, смесь перемешивают от 10 до 50 мин и фильтруют; полученный преципитат промывают насыщенным раствором бензойной кислоты в дистиллированной воде, этот преципитат удаляют и добавляют к нему 30% ацетон, экстракт центрифугируют до 1500 об/мин в течение от 10 до 30 мин, а супернатант отбрасывают, преципитат снова промывают ацетоном, сушат в вакууме и при комнатной температуре, продукт снова растворяют в спирте от 90 до 96, содержащем от 0,2 до 4,0 мг/мл хлорида кальция, полученный продукт фильтруют через колонку с сефадексом с использованием натрий-фосфатного буфера при рН 4-8, собирают фракции, соответствующие второму протеиновому пику от 20 до 150 г/мл, проводят лиофилизацию и продукт снова растворяют в 50% спиртовом растворе, содержащем СаСl₂ в концентрации от 0,2 до 4,0 мг/мл.

2. Композиция для стимуляции синтеза меланинового пигмента, содержащая смесь 50% спиртового экстракта плаценты человека, которая содержит липопротеин с молекулярной массой в диапазоне 1500-4000 Да в качестве активного ингредиента, и хлорид кальция в концентрации от 0,2 до 4,0 мг/мл.

3. Способ лечения витилиго, включающий местное нанесение композиции по п.2 на пораженные участки тела путем ее втирания пальцами один раз в сутки без облучения инфракрасным светом в течение от 6 месяцев до одного года, в зависимости от тяжести заболевания.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к дерматологии, а более конкретно к композиции, разработанной для стимуляции синтеза меланинового пигмента кожи, а поэтому предназначенной для лечения витилиго, а также к способу получения этой композиции.

Предшествующий уровень техники.

Витилиго или лейкодерма представляет собой заболевание, которое известно человечеству с давних времен и которое характеризуется потерей клеток, продуцирующих меланиновый пигмент кожи. Данным заболеванием страдает приблизительно 1% населения Земного шара независимо от возраста, пола или расы. Это заболевание, имеющее неясную этиологию и до сих пор не поддающееся радикальному лечению, характеризуется постепенной депигментацией кожи у пациентов, перенесших состояния крайнего нервного напряжения, и неблагоприятно отражается на их психике и социальном поведении при появлении у них внешних симптомов в виде обесцвеченных участков кожи, окруженных гиперпигментированным гало и появляющихся, в основном, на лице, туловище или в области суставов. Специалистам известно, что для лечения витилиго могут быть использованы некоторые растительные или полусинтетические химические вещества, называемые псораленами. Эти вещества при их пероральном или местном применении концентрируются на меланоцитах или клетках, продуцирующих кожный пигмент, что приводит к поглощению энергии ультрафиолетового излучения и стимуляции продуцирования этого пигмента, то есть, меланина (Arnold M.J. Jr. “Psoralens & Suntan”. Hawaii Med. J. 1957-16391). Becker S.W. Jr. “Methods of increasing skin pigmentation”. J.Sec. Cosmetic Ehem. 1958-9-80. Fitzpatrick Т.В. Pigmentary Diseases Current Therapy. 1958-314. Becker S.W. Jr. "Effects of 8-Methoxy Psoralen and ultraviolet light in human skin". Science. 1958-127-878. Sidi E., Planat P. Practical considerations on current treatment of vitiligo Revue of Medicins. 1968-23, dec).

Однако при местном применении псоралены могут оказывать вторичное токсическое действие с возникновением дерматита и некроза кожи. Кроме того, они обладают медленным действием и в большинстве случаев при прерывании лечения возможны рецидивы.

С другой стороны, использование этих веществ связано с определенными трудностями, поскольку оно требует постепенного увеличения времени ежедневного облучения пациента ультрафиолетовыми лучами, что приводит к возникновению тяжелых токсических реакций, таких, как ожоги, вызываемые наружным применением этих средств, или к возникновению печеночной недостаточности, желудочно-кишечных, почечных или нервных расстройств, вызываемых пероральным введением этих средств.

Известным наиболее близким техническим решением, относящимся к предмету настоящего изобретения, является лосьон Мелагенин (пат. Франции N 8220746).

Лосьон Мелагенин представляет собой спиртовой экстракт 50% человеческой плаценты, которую получают от здоровых беременных женщин в асептических условиях после нормальных родов. Этот экстракт содержит липопротеин с молекулярной массой 1500-4000 Да, который составляет его активное начало. Это вещество стимулирует репродуцирование меланоцитов и синтез меланинового пигмента, а также ускоряет окисление аминокислоты L-допа под действием солнечного света, который благоприятствует ее превращению в меланин после внутренних химических процессов.

До настоящего времени для лечения витилиго успешно использовался лосьон Мелагенин. В соответствии с проведенными клиническими испытаниями, его применение давало заметный эффект у всех пациентов, подвергаемых лечению этим препаратом (Miyares Сао С., Taboas M. у Lopez H, "Informe preliminar sobre el empleo de extracto placentario humane en la terapeutica del Vitiligo. Revista Cubana de Farmacia 10(1), 1976. Miayres Сао С. у colaboradores. "Estudio experimental у clinico del efecto pigmentante epidermico del extracto placentario humano. Revista Cubana de Farmacia. Volumen 20, №6, Noviembre-Diciembre 1981. Sharma S.K., Jain R.K & Sharma A.K. Topical human placental extract for the treatment of Vitiligo. A preliminary study. Miyares C. Y colaboradores: Estudio experimental у clinico del efecto pigmentante epidermico del extracto placentario humane. Annais Brasileiros de Dermatologia. 1986: 61: 3 (suplemento). Miyares Сао С. Melagenina Producto Cubano. Nuevo у Eficaz medicamento para el tratamiento del Vitiligo. Serie de Resenas Nacionales. Ed. Palacio de las Convenciones. La Habana. Pag. 15, 1986).

Хотя лосьон Мелагенин не имеет вредных побочных эффектов, однако этот продукт должен использоваться три раза в день с интервалом в 8 ч, и одно из его применений должно сопровождаться облучением солнечным или инфракрасным светом. Все это создает неудобства при лечении большинства пациентов. Специалистам известно, что кальций активно участвует в процессе пигментации кожи посредством стимуляции секреторной активности меланоцитов, ассоциированной с концентрацией этого иона (Меуеr А. 1986. Influence of calcium on the melanocytes in the inner ear. Abst. 13th International Pigment Cell Conference. Oct. 5-6. Tucson, Arizona, USES. Negishi S. 1986. The role of calcium in light response of onyzias melonophores. Abst. 13th International Pigment Cell Conference Oct. 5-6, Tuczon, Arizona, USES).

Описание изобретения.

Новизна настоящего изобретения определяется новой композицией, содержащей то же самое активное начало, что и лосьон Мелагенин, а в данном случае альфалипопротеин, полученный из котилидонов человеческой плаценты путем их обработки органическими растворителями с последующим повторным растворением в растворе этанола с хлоридом кальция, в результате чего образуется продукт, в котором оба компонента обладают пигментообразующим синергическим действием, что позволяет снизить число применений этого продукта пациентом от 1 раза в каждые 8 ч до 1 раза в каждые 24 ч, а также избежать необходимости облучения пациента солнечными или инфракрасными лучами после какого-либо применения этого продукта.

Новый продукт, названный соответственно Мелагенином Плюс, может применяться один раз в день, что соответствует современному направлению в мировой медицинской практике.

Этот продукт стимулирует синтез меланинового пигмента кожи и репродуцирование меланоцитов, как это было продемонстрировано при проведении фармакологических исследований, и не дает каких-либо серьезных побочных эффектов, как было показано в токсикологических, тератологических и клинических испытаниях, проводимых с использованием этого продукта.

Этот продукт легок в получении и удобен в применении, способствует быстрому восстановлению пигментации после начала лечения, которое не дает рецидивов после прекращения лечения. Цвет, приобретаемый кожей при его применении, идентичен цвету нормальных участков кожи пациента, интенсивность окраски которых, в свою очередь, не усиливается после использования этого продукта.

Поскольку активное начало этого продукта экстрагируют из материала человеческого происхождения, то этот продукт не вызывает каких-либо опасных иммунологических реакций и не имеет противопоказаний в отношении возраста, пола или расы.

Получение активного начала композиции Мелагенин Плюс.

Для получения активного начала настоящего изобретения осуществляли следующую процедуру

Один килограмм котиледонов плаценты использовали после их хранения в замороженном виде в течение 7-10 дней, а затем их измельчали и подвергали мацерации этанолом 90-96 при равных частях масса/объем. Затем этот мацерированный продукт фильтровали через плотную марлю и оставляли на 24 ч. Определяли пигментообразующую активность супернатанта, который давал положительный результат через 20-50 дней после его наружного нанесения на уши мышей BALB/C 57 BL6.

К 200 мл этого экстракта с пигментирующим фактором с помощью иглы для подкожных инъекций добавляли 10 мл насыщенного раствора бензойной кислоты в этаноле 90-96, полученного путем растворения 2-8 г бензойной кислоты в 5-12 мл этанола 90-96.

Эту смесь перемешивали в течение 10-50 мин и фильтровали через фильтровальную бумагу Nhatman №2-5. Затем полученный преципитат промывали с использованием 200-500 мл насыщенного раствора бензойной кислоты в дистиллированной воде, полученного путем растворения 2-10 г бензойной кислоты в 300-1000 мл дистиллированной воды.

Затем преципитат удаляли с фильтровальной бумаги и добавляли 100-500 мл 30% ацетона. После центрифугирования до 1500 об/мин в течение 10-30 мин, супернатант отбрасывали.

Этот преципитат снова промывали 2-10 раз еще 100-500 мл ацетона, сушили в вакууме и при комнатной температуре. Этот продукт повторно растворяли в спирте от 90 до 96, содержащем 0,2-4,0 мг/мл хлорида кальция.

Пять миллилитров вышеуказанного продукта, обладающего биологической активностью, фильтровали через Сефадекс G-30 или 100, который был упакован в колонку шириной 1-3 см и высотой 18-40 см с использованием буферного раствора фосфата натрия от 510^-1 до 510^-6 моль, рН 4-8. Скорость потока составляла 10 - 30 капель в минуту и каждая собранная фракция составляла 5-10 мл. Были получены два протеиновых пика, первый с 100-300 мкг/мл, а второй с 20-150 мкг/мл. Второй пик оказался положительным на пигментообразующую активность, проявляющуюся через 10-20 дней после наружного нанесения лиофилизованной смеси морским свинкам.

Лиофилизованные смеси протеиновых пиков подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле и агарозе, где гель был окрашен красителем для белков (амидо черным), а агароза была окрашена красителем для обнаружения липидов (суданом). При электрофорезе белков наблюдалась окрашенная небольшая полоса с последующим появлением другой неокрашенной полосы, обе с небольшой миграцией. Кроме того, также наблюдалась очень заметная полоса в области альбумина. При электрофорезе липидов наблюдалась полоса в области миграции альфалипопротеинов.

Синергический пигментообразующий эффект мелагенина и кальция

Меланоцитопоэтическую активность полученного продукта оценивали путем наружного нанесения Мелагенина Плюс на ушной эпидермис черных мышей линии В6 D2 один раз в день в течение 5 дней подряд. Для проведения этого испытания было использовано 60 черных мышей, которых распределяли по 4 группам, обозначенным А, В, С и D, по 5 мышей в каждой, и которых подвергали нижеследующим обработкам.

Группа: суточная локальная обработка

А: 70%-ный спирт, используемый в качестве носителя для

Мелагенина (контроль);

В: 70%-ный спиртовой раствор с добавлением хлорида кальция в концентрации 1 мг/мл;

С: лосьон Мелагенин;

D: лосьон Мелагенин с добавлением хлорида кальция в концентрации 1 мг/мл (Мелагенин Плюс);

70%-ный спирт, 70%-ный спиртовой раствор с добавлением хлорида кальция в концентрации 1 мг/мл, а также лосьон Мелагенин и Мелагенин Плюс наносили на уши животных путем втирания продукта пальцами.

Суммарное время обработки составляло 48 часов, после чего животных умерщвляли для выделения у них ушного эпидермиса, который подвергали гистохимическому анализу на L-допа-оксидазу, что позволяло путем исследования под микроскопом определить число меланоцитов на 1 мм² данной гистологической структуры.

Для определения числа меланоцитов, приходящихся на 1 мм², выбирали 5 различных участков из зоны с высокой плотностью каждого уха и с использованием программы, специально разработанной для этой цели (а в данном случае, специальной подпрограммы для подсчета клеток), определяли число клеток на 1 мм² так, чтобы в каждом из этих 5 участков получить значения 150 меланоцитов на 1 мм² для каждой группы (15 животных на группу и 10 подсчетов для каждого животного).

Величины, полученные при подсчете меланоцитов на 1 мм², подвергали дисперсионному анализу простой классификации и апостериорно в соответствии с критерием Крускала-Уоллиса и критерием Ньюмена-Кейлса (уточненным критерием Стъодента)(ЗМК) для определения значимых различий, существующих для этих групп. Результаты, полученные в этом эксперименте, представлены в таблице I и графически проиллюстрированы на фиг.1.

Было установлено, что для р<0,001 в ушном эпидермисе черных мышей, обработанных лосьоном Мелагенин и Мелагенином Плюс, наблюдалось значимое увеличение числа меланоцитов/мм² по сравнению с группами, обработанными спиртом, или необработанными группами.

Увеличение числа меланоцитов было больше у животных, обработанных Мелагенином Плюс.

Были обнаружены и другие различия: значимое различие результатов, полученных с использованием Мелагенина Плюс и с использованием лишь лосьона Мелагенин; значимое различие результатов, полученных с использованием Мелагенина Плюс и с использованием лишь спирта + кальция; значимое различие результатов, полученных с использованием Мелагенина Плюс и с использованием лишь спирта; значимое различие результатов, полученных с использованием лосьона Мелагенин и с использованием спирта + кальция; значимое различие результатов, полученных с использованием лосьона Мелагенин и контрольной группы, обработанной лишь спиртом; не имеется каких-либо значимого различия между контрольной группой и группой, обработанной спиртом + кальцием.

Кроме того, было установлено, что при использовании лосьона Мелагенин и Мелагенин Плюс во всех биологических испытаниях в случае использования Мелагенина Плюс пигментообразующее действие в сосках самцов морских свинок было заметно через 13 дней, тогда как действие лосьона Мелагенин проявлялось только на 18 день. Аналогичным образом, в случае черных мышей большая концентрация меланина наблюдалась с использованием Мелагенина Плюс на срезах, обработанных для гистохимического анализа, где наблюдалась большее увеличение меланоцитов в базальной области эпидермиса.

Тест на раздражение кожи животных

Продукт Мелагенин Плюс наносили на кожу группы животных на участки размером 42 см² с использованием дозы 20 мг/см² и то же самое животное обрабатывали растворителем. В течение двухнедельного эксперимента не наблюдалось какого-либо раздражения или поражения кожи. Гистопатологические исследования не обнаружили каких-либо повреждений. В результате этого можно сделать вывод, что продукт Мелагенин Плюс не вызывает раздражения кожи.

Клинические испытания с участием человека

Для проведения этих испытаний были произвольно отобраны 30 пациентов с витилиго. Эти пациенты были альтернативно разделены на две группы, обозначенные I и II по 15 пациентов в каждой. Пациенты, принадлежащие к группе I, использовали лосьон Мелагенин (спиртовой экстракт человеческой плаценты, 50%) для наружного нанесения путем втирания пальцами в участки кожи, депигментированные в результате заболевания, три раза в день с интервалами в 8 ч (6.00 утра, 2.00 дня и 10.00 вечера). В одном из этих случаев обработанные участки должны были в течение 15 мин облучаться инфракрасными лампами с интенсивностью 250 Вт, помещенными на расстоянии 40 см. Нанесение лекарственного средства необходимо повторять через каждые 5 мин в течение этого интервала времени.

В свою очередь, члены группы II использовали Мелагенин Плюс (спиртовой экстракт человеческой плаценты, 50%, содержащий хлорид кальция) аналогичным способом, но один раз в день с интервалами в 24 ч и без облучения инфракрасным светом. Участники этого испытания не должны были подвергаться какому-либо лечению перед началом испытания. Пациенты, участвующие в эксперименте, ежемесячно проходили обследование в течение 6 месяцев и обе группы пациентов сравнивали в отношении степени репигментации, достигаемой с использованием каждого продукта, а также в отношении возникновения вторичных реакций. У 5 пациентов, произвольно отобранных из каждой группы, брали ткань на биопсию из депигментированных участков кожи в начале и в конце эксперимента.

Для идентификации меланоцитов у тех же самых индивидуумов применяли гистологический метод с применением L-допа-оксидазы (Negishi S. 1986. The role calcium in light response of onyzias melanophores. Abst. 13th International Pigment cell Conference. Oct. 5-6, Tucson, Arizona, USES). Одновременно определяли различия в количестве израсходованных флаконов лекарственного средства в каждой группе. Для осуществления статистических анализов на процент снижения депигментированных участков тела в каждой группе, а также для определения этих участков у пациента использовали программу, разработанную для этих целей (Coyula, R. Automatizacion de la Creacion de Historia Clinica de los enfermos de Vitiligo. Ira Conferencia Latinoamericana de Aplicaciones de la Matematica у la Computacion a la biologia. CENIC, 31 Oct. - 30 Nov., 1991, La Habana, Cuba).

Результаты, полученные в этом клиническом испытании, систематизированы в таблицах II, III, IV и V, в которых указаны данные пациентов, номер их истории болезни для их идентификации, возраст, пол, раса и продолжительность (годы) заболевания. Оцениваемые параметры выражали как % депигментации в начале и конце лечения, % достигнутой пигментации и число флаконов с лекарственным средством, использованным во время лечения. Аналогичным образом в таблице представлены данные для проанализированных участков, соответствующих каждому из этих пациентов, прошедших курс лечения (лицо, шея, туловище, конечности или гениталии), для каждого типа лечения.

Анализируя вышепривиденные таблицы, можно видеть, что после 6-месячного лечения у группы, прошедшей лечение лосьоном Мелагенин, средняя величина снижения депигментации поверхности тела, вызванной заболеванием, составляла 59,11%, а у группы, прошедшей лечение Мелагенином Плюс, эта величина составляла 50,79%, при этом какого-либо значимого различия обоих результатов для величины р<0,05 не наблюдалось.

При этом у пациентов из групп, прошедших испытание, каких-либо локальных или системных вторичных реакций не наблюдалось.

Биопсии, взятые у 5 пациентов каждой группы, обнаруживали появление меланоцитов на участках с витилиго, выбранных для гистологического исследования до и после лечения. Наконец, большее число израсходованных флаконов с лекарственным средством наблюдалось у группы, подвергаемой лечению лосьоном Мелагенин, всего 264, а в среднем 17,6 флаконов на пациента за 6 месяцев проведения эксперимента. Что касается группы, прошедшей лечение Мелагенином Плюс, то ею было использовано лишь 56 флаконов, а в среднем 3,7 флаконов на пациента за то же самое время. Проведенное гистологическое исследование показало, что репигментирующее действие обоих продуктов на участках с витилиго обусловлено тем, что эти продукты вызывают репродуцирование меланоцитов на указанных участках. Отсутствие вторичных системных и локальных побочных эффектов еще раз подтверждает безопасность обоих продуктов.

Синергическое действие кальция и мелагенина облегчает проведение лечения участков тела пациентов, пораженных витилиго, что позволяет снизить число ежедневных приемов данного продукта и, следовательно, уменьшить число потребляемых флаконов для каждого курса лечения. Эта новая композиция также позволяет избежать необходимости облучения пациента солнечным или инфракрасным излучением после ее применения.

Краткое описание чертежей

На чертеже проиллюстрировано меланоцитопоэтическое действие, выявленное в анализе, проводимом на ушах черных мышей в 4 группах, обозначенных А, В, С и D, которые были подвергнуты нижеследующим обработкам.

Группа: суточная локальная обработка

А: 70%-ный спирт, используемый в качестве носителя для Мелагенина (контроль);

В: 70%-ный спиртовой раствор с добавлением хлорида кальция в концентрации 1 мг/мл;

С: Лосьон Мелагенин;

D: Лосьон Мелагенин с добавлением хлорида кальция с концентрацией 1 мг/мл (Мелагенин Плюс).