питательная среда для ускоренного определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза

Формула изобретения

Питательная среда для ускоренного определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза, содержащая солевой состав модифицированной питательной среды Сотона, отличающаяся тем, что она содержит дополнительно 0,35% питательного агара и 25% лошадиной сыворотки при следующем составе компонентов:

Полужидкая основа:

Калия двухосновного фосфорнокислого 0,5 г

Магнезии сернокислой 0,05 г

Железа лимоннокислого аммиачного 0,05 г

Натрия лимоннокислого 2,0 г

L-аспарагина 4,0 г

Глицерина 60 мл

Питательного агара 3,5 г

Дистиллированной воды До 1 л

Лошадиной сыворотки 100 мл/300 мл полужидкой основы

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к области фтизиобактериологии, и может быть использовано для определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза.

Разработка методов и сред для ускоренного определения лекарственной устойчивости является важной задачей современной фтизиобактериологии, особенно в условиях подъема лекарственной устойчивости, наблюдающегося в последние годы [1, 2]. Общеизвестно, что чем ранее начата адекватная химиотерапия, тем быстрее наступает излечение больного, поэтому клиницисты очень заинтересованы в быстром получении данных о лекарственной устойчивости МБТ, выделенных от пациента.

Учет результатов определения лекарственной устойчивости стандартным непрямым методом абсолютных концентраций на плотной яичной среде Левенштейна - Йенсена производится на 14-21-й день после посева культуры МБТ [3, 4]. Ускоренный метод определения лекарственной устойчивости на плотной яичной среде Попеску по нитратредуктазной активности применим только для Mycobacterium tuberculosis, но не для M.bovis, не имеющего данного фермента [5].

На жидких средах МБТ растут быстрее. Так, бульон Миддлбрука используется для определения лекарственной устойчивости в таких системах, как ВАСТЕС, МВ-ВАСТ, BBL-MGIT. Индикация роста МБТ в этих системах осуществляется радио-, коло- и флюорометрическими методами на 3-10-е сутки после посева культуры [6, 7, 8]. Перечисленные системы, использующие жидкую среду, очень дороги и доступны немногим хорошо оснащенным референс-лабораториям. Так, стоимость 1 флакона со средой МВ-ВАСТ превышает 100 руб., системы BBL-MGIT - около 1 у.е., система ВАСТЕС требует дорогого аппаратурного обслуживания и небезопасна радиологически.

Полужидкие среды используются в практике некоторых фтизиобактериологических лабораторий только для выделения измененных форм МБТ - L-форм [9].

В целях ускоренного определения лекарственной устойчивости штаммов МБТ перспективно использование полужидких сред с добавлением оптимальных количеств ростовых и питательных факторов и противотуберкулезных препаратов.

Прототипом предлагаемой среды является жидкая синтетическая среда Сотона [3], с помощью которой определяют лекарственную устойчивость. Но в практике фтизиобактериологии она, как и другие жидкие среды [3], используется в крайне редких случаях из-за неудобства применения или сложности и трудоемкости считывания результата: 1) визуально - по росту поверхностной пленки на 10-14-21-й день, при этом теряется преимущество среды в скорости роста; 2) по мазку из осадка - процедура, увеличивающая опасность внутрилабораторного заражения и требующая длительного времени.

Таким образом, преимущество предлагаемой среды в сравнении с наиболее близкими: 1) быстрота получения результатов - 3-7 суток; 2) дешевизна; 3) доступность любой фтизиобактериологической лаборатории, так как необходимые для нее ингредиенты постоянно используются в повседневной практике этих лабораторий; 4) безопасность - не требуются дополнительные манипуляции, такие, как высев, микроскопия для верификации роста; 5) простота считывания результата, которое осуществляется визуально.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка питательной среды для ускоренного определения лекарственной устойчивости штаммов МБТ к трем основным препаратам - стрептомицину, изониазаду, рифампицину.

Задача решается за счет того, что в жидкую модифицированную среду Сотона добавляют 0,35% питательного агара и 25% лошадиной сыворотки.

Приготовление питательной среды для определения лекарственной устойчивости МБТ.

Основу среды представляет модифицированная жидкая синтетическая среда Сотона [10], в которую добавляют питательный агар и после стерилизации - лошадиную сыворотку. Конечная концентрация агар-агара в предлагаемой среде около 0,08%, то есть среда близка по консистенции к жидкой, что наряду с оптимальной концентрацией вносимой лошадиной сыворотки обусловливает быстрый рост МБТ, а агар-агар не дает инокуляту опускаться на дно, повышая локальную концентрацию микроорганизмов. Это обеспечивает быструю визуализацию роста - начальные его признаки на 3-5-е сутки, отчетливые - на 5-7-е сутки в зависимости от особенностей штамма.

Состав питательной среды, г:

Калий двухосновный фосфорнокислый 0,5

Магнезия сернокислая 0,05

Железо лимоннокислое аммиачное 0,05

Натрий лимоннокислый 2,0

L-аспарагин 4,0

Глицерин, мл 60

Питательный агар 3,5

Дистиллированная вода До 1 л

Смесь подогревают до полного растворения солей, разливают в колбы по 300 мл и стерилизуют в автоклаве при 1 атм (120°С) 30 мин. В остывшую полужидкую основу асептически добавляют 100 мл лошадиной сыворотки (к 300 мл основы, что составляет 25%). Затем полужидкую среду разливают в 4 колбы по 100 мл: 1 - контроль, без противотуберкулезных препаратов; 2 - с 1 мл стрептомицина в концентрации 1000 мкг/мл; 3 - с 1 мл изониазида в концентрации 100 мкг/мл; 4 - с 1 мл рифампицина в концентрации 2000 мкг/мл. Разведения препаратов производят стандартно [3, 4]. Конечные концентрации химиопрепаратов равны: стрептомицина - 10 мкг/мл, изониазида - 1 мкг/мл, рифампицина - 20 мкг/мл, то есть данные концентрации идентичны тем, которые используются в стандартном непрямом методе абсолютных концентраций. Затем среду с противотуберкулезными препаратами и без них разливают асептически по 4 мл. Пробирки должны быть закрыты резиновыми пробками без лунок.

Определение лекарственной устойчивости МВТ.

Готовят суспензию исследуемого штамма МБТ в физиологическом растворе по стандарту мутности 5 ед., разводят ее в 10 раз и вносят в пробирки с полужидкой средой в объеме 0,2 мл. Инокулят засевают поверхностно по стенке пробирки без перемешивания и встряхивания. Посевы инкубируют при 37°С в течение 7 дней. Учет результатов производят визуально. МБТ растут в верхней части среды в виде взвеси или облачка очень мелких и более крупных крошковидных колоний. При чувствительности культуры МБТ к препарату роста нет, среда остается равномерно прозрачной. При резистентности штамма МБТ к противотуберкулезным препаратам результат можно учитывать при появлении первых признаков роста, то есть на 3-5-е сутки, при чувствительности - не ранее 7 суток (срок, при котором наблюдается наибольший процент совпадений результатов, полученных с помощью данной среды и стандартной среды Левенштейна - Йенсена).

Испытание предлагаемой среды проведено на 242 клинических штаммах МБТ, выделенных из патологического материала больных туберкулезом органов дыхания и его внелегочными формами. Лекарственную устойчивость исследовали параллельно на предлагаемой среде и стандартным методом на среде Левенштейна - Йенсена.

Результаты определения скорости роста МБТ на предлагаемой среде по сравнению со средой Левенштейна - Йенсена представлены в табл. 1.

Как видно из приведенных данных, срок начального и отчетливого роста, определяемого визуально, на полужидкой среде в 2,1 и 2,8 раза меньше такового на среде Левенштейна - Йенсена, что делает предлагаемую среду перспективной для ускоренного определения лекарственной устойчивости.

В табл. 2 представлены данные исследования лекарственной устойчивости с помощью предлагаемой среды и стандартным методом на среде Левенштейна - Йенсена. Статистически достоверных различий между ними нет.

Таким образом, проведенные исследования показали, что использование предлагаемой полужидкой среды в 2,1-2,8 раза сокращает сроки роста МВТ в сравнении со средой Левенштейна - Йенсена, используемой для определения лекарственной устойчивости стандартным методом, и дает высокий процент сходимости результатов. Поэтому для ускоренного определения устойчивости МБТ к основным противотуберкулезным препаратам - стрептомицину, изониазиду, рифампицину целесообразно использовать предлагаемую полужидкую среду.

Источники информации

1. Вишневский Б.И., Вишневская Е.Б., Платонова М.В. Лекарственная устойчивость микробактерий туберкулеза при различных локализациях заболевания// Мат. VII съезда Всерос. общ. эпидем., микробиол. и паразитол. - М., 1997, т.2, с.301 и 302.

2. Дорожкова И.Р., Попов С.А., Медведева И.Н. Мониторинг лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза в России за 1979-1998 гг.// Пробл. туб. - 2000, №5, с.19-22.

3. Ященко Т.Н., Мечева И.С. Руководство по лабораторным исследованиям при туберкулезе. - М.: Медицина, 1973.

4. Приказ №558 от 8.06.1978. Об унификации микробиологических методов исследования при туберкулезе. - М., 1978.

5. Патент RU 2099425. Способ определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза //Голышевская В.И., Корнеев А.А., Аникин В.А. и др.

6. Siddiqi S.H., Libonati J.P. Middlbrook G. Evaluation of a rapid radiometric method for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis //J.Clin. Med. - 1981, 13, №5, p.908-912.

7. Севастьянова Э.В., Голышевская В.И., Сафонова С.Г. и др. Определение лекарственной устойчивости М. tuberculosis традиционными и современными методами //Тез.докл. IV съезда НМА фтиз. - М. - Йошкар-Ола, 1999, с.218.

8. Иртуганова О.А., Смирнова Н.С., Слогоцкая С.В. и др. Бактериологические методы определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза // Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы. - М., 2000, с.73-75.

9. L-формы микобактерий туберкулеза/ Под ред. З.Н.Кочемасова. - М.: Медицина, 1980.

10. Щеголева Р.А. Модификация жидкой питательной среды Сотона для выращивания микобактерий туберкулеза. Лаб. дело. - 1989, №5, с.78 и 79.