рекомбинантная плазмидная днк рвмс-qp120(a)m-1 для иммунизации против вируса иммунодефицита человека
Классы МПК: | C12N15/63 введение чужеродного генетического материала с использованием векторов; векторы; использование их хозяев; регулирование экспрессии C12N15/48 Retroviridae, например вирусы бычьей лейкемии, кошачьей лейкемии |
Автор(ы): | Козлов А.П., Климов Н.А., Машарский А.Э., Полякова М.С., Романович А.Э., Галачьянц Ю.П., Мурашев Б.В. |
Патентообладатель(и): | Автономная некоммерческая организация "Биомедицинский центр" |
Приоритеты: |
подача заявки:
2003-05-22 публикация патента:
20.04.2004 |
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности, к генетической инженерии и иммунологии и может быть использовано для иммунизации против вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) субтипа А. В рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей ген gp 120 вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А в последовательности нуклеотидов в кодонах с преобладанием аденина и/или тимина аденин и/или тимин частично заменены на гуанин и/или цитозин. Полученная рекомбинантная плазмидная ДНК обеспечивает экспрессию белка оболочки вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) типа 1 субтипа А в клетках высших эукариот. Изобретение позволяет проводить непосредственно иммунизацию организма человека. 1 табл., 3 ил.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5
Формула изобретения
Рекомбинантная плазмидная ДНК рВМС-gр120(А)m-1 для экспрессии белка вируса иммунодефицита человека gp120 в эукариотических клетках, характеризующаяся тем, что она содержит ген gp 120 вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А, представленный на фиг.2.Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности, к генетической инженерии и иммунологии, и может быть использовано для экспрессии белка gp120 вируса иммунодефицита человека 1 типа в эукариотических клетках.Известна рекомбинантная плазмидная ДНК, обеспечивающая высокий уровень продукции гибридного белка, обладающего антигенными свойствами поверхностного гликопротеида (gp) оболочки вируса Т-клеточного лейкоза человека 1 типа (HTLV-I), способная наследоваться в штаммах бактерий Е. coli. Рекомбинантная плазмидная ДНК pESG размером 5, 6 т.п.н. состоит из SalGl – BamH1 фрагмента (426 п.н.) последовательности области env HTLV-I и SalGl фрагмента плазмиды pUR291 размером 5,2 т.п.н. с геном бета-галактозидазы, областью ori и генетическим маркером в виде blа-гена (устойчивость к ампициллину), имеет уникальные сайты рестрикции ВаmHI, Pstl, HindIII, Stul, Clal, Tthlll-II; с помощью фермента рестрикции SalGl из промежуточной плазмиды pBEl вырезан фрагмент величиной 426 п.н. Этот фрагмент лигируют с линеанизированной гидролизом SalGl формой ДНК плазмидного вектора pUR291. После соответствующей инкубации трансформируют полученным препаратом компетентные (обработанные СаС1з) клетки Е.соli с последующим отбором трансформантом их способности расти на среде, содержащей ампициллин, RU 2081172 Al.Данное техническое решение позволяет осуществить продукцию белка оболочки вируса HTLV-1 в бактериальных клетках. Однако экспрессия белка оболочки вируса иммунодефицита человека в клетках высших эукариот не осуществляется.Известна рекомбинантная плазмидная ДНК pUE 41, кодирующая фрагменты белков оболочки gp120 и gp41 вируса иммунодефицита человека типа 1 размером 5700 н.п. и мол. м. 3, 7, содержащая Bam HI - Hind III - фрагмент плазмидной ДНК pUR292 размером 5180 н.п.; уникальный сайт рестрикции Hind III; гены и генетические маркеры; ген bla - обеспечивающий синтез -лактамазы; ген lacz, обеспечивающий синтез -галактозидазы; фрагмент гена env ВИЧ-1, обеспечивающий синтез полипептида, обладающего антигенным свойством белков оболочки вируса иммунодефицита человека типа 1, RU 1766070.Данная ДНК позволяет осуществить продуцирование фрагментов белков оболочки вируса иммунодефицита человека типа 1 в клетках бактерий, но не в клетках высших эукариот, что не позволяет осуществить ДНК-иммунизацию организма человека.Как следует из приведенного выше анализа уровня техники, близких аналогов, которые могли бы быть приняты за прототип настоящего изобретения, не выявлено.В основу настоящего изобретения положено решение задачи создания рекомбинантной плазмидной ДНК, которая обеспечивает экспрессию белка gp120, кодируемого геном env вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) субтипа А российского изолята в эукариотических клетках млекопитающих.Согласно изобретению эта задача решается за счет того, что в рекомбинантной плазмидной ДНК pBMC-gpl20(A)m-l для экспрессии белка вируса иммунодефицита человека gpl20 в эукариотических клетках новым является то, что она содержит ген gp 120 вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А, представленный на фиг.2. На фиг. 1 приведена природная нуклеотидная последовательность гена gpl20 ВИЧ-1 субтипа А российского изолята 98UA0116 и природная аминокислотная последовательность кодируемого данным геном белка gpl20;на фиг.2 приведено сравнение нуклеотидных последовательностей исходного (120А) и модифицированного в соответствии с настоящим изобретением гена gp120 ВИЧ-1 российского варианта субтипа А (120А MOD), замены нуклеотидов подчеркнуты;на фиг.3 приведена структура плазмидной ДНК pBMC-gp120(A)m-l.Обозначения на фиг.3: gp120(A)m-l - фрагмент ДНК, содержащий ген gp120(A), измененный соответственно настоящему изобретению; bla - ген бета-лактамазы; Ori - репликатор плазмиды pBR322; Р - промотор предранних белков цитомегаловируса (pCMVIE); pA BGH - участок терминации транскрипции и полиаденилирования.Фрагмент ДНК, кодирующий ген gpl20 ВИЧ-1 субтипа А, выделяли при помощи полимеразной цепной реакции, матрицей в которой служила ДНК из лимфоцитов периферической крови пациента, инфицированного вирусом иммунодефицита человека первого типа субтипа А. Полученный фрагмент клонировали в плазмидный вектор рВМС, получив в результате плазмиду pBMCgp120(A), содержащую природный ген gpl20. Далее выделяли плазмиду pBMC-gpl20(A)-l и производили в гене gpl20 необходимые замены нуклеотидов известным способом с получением плазмиды pBMC-gp 120(A)m-1.В качестве теста культуру клеток 3Т3 мыши трансформировали ДНК плазмид pBMC-gp 120(А)-1 и рВМС-gpl20(A)m-l (по 1 микрограмму каждой плазмидной ДНК), после чего клетки инкубировали в течение 48-72 часов, лизировали и анализировали белки клеточных лизатов с помощью электрофореза в ПААГ с последующим иммуноблоттингом с сывороткой пациента, инфицированного ВИЧ-1 субтипа А. Интенсивность окраски полос, соответствующих белку gp120, анализировали с помощью компьютизированной видеосистемы. Установлено, что в культуре клеток, трансформированных плазмидной ДНК, синтез белка gpl20 в 5-10 раз выше, чем в клетках, трансформированных плазмидой, содержащей природный ген. Установлено, что в культуре клеток, трансформированных плазмидой pBMC-gp120(A)m-l, синтез белка gpl20 в 10-15 раз выше, чем в клетках, трансформированных плазмидой pBMC-gp 120(A)-1.Лабораторным мышам линии BALB/c вводили внутримышечно по 10 и 25 микрограмм плазмидных ДНК pBMC-gp 120(А)-1 и pBMC-gp 120(A)m-l согласно настоящему изобретению. Иммунизацию повторяли через четыре недели. Через две недели после второго введения плазмид собирали сыворотки крови иммунизированных животных и определяли в них титр антител к рекомбинантному белку gpl20 субтипа А известным способом.Результаты приведены в таблице.Класс C12N15/63 введение чужеродного генетического материала с использованием векторов; векторы; использование их хозяев; регулирование экспрессии
Класс C12N15/48 Retroviridae, например вирусы бычьей лейкемии, кошачьей лейкемии