способ оценки провоспалительной активности синовиальной жидкости при заболеваниях крупных суставов
Классы МПК: | G01N33/52 использование соединений или составов для колориметрического, спектрофотометрического или флуорометрического анализа, например реактивной бумаги G01N33/48 биологических материалов, например крови, мочи; приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры) |
Автор(ы): | Давыдов С.О. (RU), Цырендоржиев Д.Д. (RU) |
Патентообладатель(и): | Давыдов Сергей Олегович (RU), Цырендоржиев Дондок Дамдинович (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2002-10-21 публикация патента:
27.05.2004 |
Изобретение относится к области медицины, в частности к ревматологии, ортопедии и травматологии. Способ обеспечивает повышение точности оценки активности воспалительного процесса при заболеваниях крупных суставов и прост в исполнении. Проводят хемилюминесцентное исследование синовиальной жидкости, при этом определяют в ней содержание белка, затем в кювету для хемилюминесцентного исследования вносят интактные нейтрофилы здоровых доноров, полученных из лейкоконцентрата, подсчитывают их количество и параллельно в другую кювету для хемилюминесцентного исследования вносят интактные нейтрофилы доноров (Нф) и синовиальную жидкость больного, регистрируют хемилюминесцентный ответ клеток тест-системы, рассчитывают индекс хемилюминесцентного ответа (Ихл, имп/Нф/г белка) по формуле
, где Iсж - количество импульсов хемилюминесцентного ответа нейтрофилов при добавлении тестируемой синовиальной жидкости, Iбезсж - количество импульсов хемилюминесцентного ответа нейтрофилов без добавления тестируемой синовиальной жидкости, N - число нейтрофилов доноров, Р - содержание белка (г/л) в синовиальной жидкости, и при значении Ихл, равном 0,7-1,5 имп/Нф/г белка, диагностируют умеренную степень провоспалительной активности синовиальной жидкости, а при значении Ихл выше 1,5 имп/Нф/г белка - тяжелую степень воспалительного процесса в суставе. 1 ил.
Рисунок 1
![способ оценки провоспалительной активности синовиальной жидкости при заболеваниях крупных суставов, патент № 2229717](/images/patents/239/2229717/2229717-1t.gif)
Формула изобретения
Способ оценки активности воспалительного процесса при заболеваниях крупных суставов путем хемилюминесцентного исследования синовиальной жидкости, отличающийся тем, что определяют в синовиальной жидкости содержание белка, затем в кювету для хемилюминесцентного исследования вносят интактные нейтрофилы здоровых доноров, полученных из лейкоконцентрата, подсчитывают их количество и параллельно в другую кювету для хемилюминесцентного исследования вносят интактные нейтрофилы доноров (Нф) и синовиальную жидкость больного, регистрируют хемилюминесцентный ответ клеток тест-системы, рассчитывают индекс хемилюминесцентного ответа (Ихл, имп/Нф/г белка) по формуле![способ оценки провоспалительной активности синовиальной жидкости при заболеваниях крупных суставов, патент № 2229717](/images/patents/239/2229717/2229717-4t.gif)
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к медицине, а именно к ревматологии, ортопедии и травматологии, и может быть использовано при определении активности воспалительного процесса для оценки эффективности проводимой терапии.Для диагностики воспалительных заболеваний суставов используют многочисленные лабораторные методы, в том числе исследование синовиальной жидкости. В синовиальной жидкости определяют величину рН, физико-химические свойства (вязкость), клеточный состав, содержание лизосомальных ферментов и их ингибиторов, количество общего белка, альбумина, гаптоглобина и т.д. [1, 2, 3, 4].Наиболее близкими к предлагаемому способу по сущности оценки провоспалительной активности синовиальной жидкости при заболеваниях крупных суставов, взятым в качестве прототипа, является способ электрохемилюминесцентного (ЭХЛ) определения содержания провоспалительных цитокинов, в котором в качестве метки используется N-гидроксисукцинимидэфир (NHS) рутения (II) трис-бипиридина хелат (TAG-метка) [5]. Измерения ЭХЛ проводят с помощью электрохемилюминометра ORIGEN Analyzer, разработанного фирмой “IGEN Inc.” (USA). Ход определения цитокинов с помошью ЭХЛ метода заключается в следующем. Исследуемую пробу инкубируют с TAG мечеными антителами. После инкубации в раствор добавляют биотинилированные антитела (биотин). К образовавшимся в растворе структурам антиген-антитело (сэндвич) добавляют парамагнитные микробусы, покрытые ковалентно связанным с поверхностью бус стрептавидином. Реакция стрептавидина с биотином приводит к образованию конъюгата бусы/сэндвич. В таком виде конъюгант поступает в камеру люминометра Analyzer. Подвижный магнит притягивает конъюгант к электроду, на поверхности которого протекает реакция электрохемилюминесценции, в результате которой освобождается фотон длиной волны 620 Нм, регистрируемый люминометром. Калибровочная кривая строится по нескольким стандартным разведениям рекомбинантного цитокина. Полученные данные обрабатываются на компьютере.Подбор соотношения антител для определения цитокинов проводится по схеме: соотношение ТАG:Биотин 1:1, 1:2, 2:1, 2:2 мкг/мл при диапазоне стандартных разведений рекомбинантного цитокина от 0,1 до 100 пг/мл. Для работы используют соотношение антител, при котором получена максимальная чувствительность метода.Подбор оптимального времени инкубации антител с пробой производят путем варьирования между 30, 90, 120, 180 минутами инкубации. Обычно достаточно 120 минут на первую инкубацию антител с пробами и 30 минут на вторую инкубацию иммунных комплексов со стрептавидиновыми бусами. Подобный протокол подходит в случае работы с пробами синовиальной жидкости доноров, но, производя измерения в кондиционной среде, процедуру необходимо корректировать. В этом случае лучше произвести биотинстрептавидиновую реакцию до инкубации стрептавидиновых бус с пробами, предотвращая таким образом связывание свободного биотина кондиционной среды. ЭХЛ протокол для кондиционной среды: 20-30 минут инкубация смеси антител и стрептавидиновых бус и 90-120 минут инкубация с пробами.ORIGEN технология предусматривает использование в среднем 30 мкг бус на пробу, что обеспечивает эффективную кинетику образования иммунных комплексов. 1 мг DYNABEADS М-280 связывает, как минимум, 300 ПМОЛ свободного биотина или 5-10 мкг биотинилированных антител. Подбор оптимального количества бус для максимально эффективной кинетики образования иммунных комплексов можно осуществить, использовав несколько их разведений в 20, 30, 40 и 60 мкг на пробу [5].По росту содержания отдельных цитокинов (например, интерлейкина-1, интерлейкина-6, фактора некроза опухоли-альфа) судят об активности воспалительного процесса в суставах. Однако при этом практически нет возможности говорить об их эффекторных функциях. Для того чтобы выяснить степень реализации эффекторных функций цитокинов необходимо проведение дополнительных не менее дорогостоящих исследований [6]. Характеристика провоспалительного потенциала синовиальной жидкости при использовании данного способа является неполной, односторонней. Кроме того, способ требует наличия электрохемилюминометра ORIGEN Analyzer, разработанного фирмой “IGEN Inc.” (USA), и приобретения дорогостоящих наборов антител, рекомбинантных цитокинов по каждому отдельному цитокину.Для проведения полной всесторонней оценки провоспалительной активности синовиальной жидкости и упрощения способа исследуют потенциальную способность синовиальной жидкости больных с воспалительными заболеваниями крупных суставов модулировать кислородзависимый окислительный метаболизм интактных нейтрофилов здоровых доноров с помощью хемилюминесценции и по величине хемилюминесцентного ответа рассчитывают индекс провоспалительной активности.Способ осуществляют следующим образом.Синовиальную жидкость, полученную пункцией сустава больных с воспалительными заболеваниями крупных суставов, в количестве 3-5 мл фильтруют через 2 слоя стерильной марли. Общий объем фильтрата доводят до 5 мл средой 199. Жидкость центрифугируют при 2-4![способ оценки провоспалительной активности синовиальной жидкости при заболеваниях крупных суставов, патент № 2229717](/images/patents/239/2229433/176.gif)
![способ оценки провоспалительной активности синовиальной жидкости при заболеваниях крупных суставов, патент № 2229717](/images/patents/239/2229475/215.gif)
![способ оценки провоспалительной активности синовиальной жидкости при заболеваниях крупных суставов, патент № 2229717](/images/patents/239/2229475/215.gif)
![способ оценки провоспалительной активности синовиальной жидкости при заболеваниях крупных суставов, патент № 2229717](/images/patents/239/2229475/215.gif)
![способ оценки провоспалительной активности синовиальной жидкости при заболеваниях крупных суставов, патент № 2229717](/images/patents/239/2229717/2229717-3t.gif)
Класс G01N33/52 использование соединений или составов для колориметрического, спектрофотометрического или флуорометрического анализа, например реактивной бумаги
Класс G01N33/48 биологических материалов, например крови, мочи; приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры)