вектор для экспресии и секреции человеческого интерферона альфа(hifn), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn

Формула изобретения

1. Экспрессирующий вектор для секреторного продуцирования человеческого интерферона альфа (hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">) в бактериальных клетках, содержащий полинуклеотид, кодирующий модифицированную сигнальную последовательность термостабильного энтеротоксина II, полученную путем замены одной или нескольких из 4-й, 20-й и 22-й аминокислот сигнальной последовательности термостабильного энтеротоксина II E.coli, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID No:3, аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из треонина, глутамина и валина; и полинуклеотид, кодирующий hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, лигированный с его 3), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230116/697.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-концом.

2. Экспрессирующий вектор по п.1, отличающийся тем, что указанная модифицированная сигнальная последовательность термостабильного энтеротоксина II выбрана из группы, состоящей из полипептида, полученного путем замены 4-го аспарагина аминокислотной последовательности SEQ ID No:3 треонином; полипептида, полученного путем замены 4-го аспарагина и 22-го тирозина аминокислотной последовательности SEQ ID No:3 треонином и глутамином, соответственно; полипептида, полученного путем замены 4-го и 20-го аспарагинов аминокислотной последовательности SEQ ID No:3 треонином и глутамином, соответственно; и полипептида, полученного путем замены 4-го аспарагина, 20-го аспарагина и 22-го тирозина аминокислотной последовательности SEQ ID No:3 треонином, валином и глутамином, соответственно.

3. Экспрессирующий вектор по п.1, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид, кодирующий hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, кодирует IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a SEQ ID No:l или IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b SEQ ID No: 2.

4. Экспрессирующий вектор для секреторного продуцирования человеческого интерферона альфа (hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">) в бактериальных клетках, содержащий полинуклеотид, кодирующий модифицированную сигнальную последовательность термостабильного энтеротоксина II, полученную путем замены одной или нескольких из 4-й, 20-й и 22-й аминокислот сигнальной последовательности термостабильного энтеротоксина II E.coli, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID No:3, аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из треонина, глутамина и валина; полинуклеотид, кодирующий hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, лигированный с его 3), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230116/697.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-концом, и последовательность Шайна-Дальгарно термостабильного энтеротоксина II E.coli (последовательность SD, SEQ ID No: 8) или ее мутант, лигированные перед 5), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230116/697.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-концом полинуклеотида, кодирующего модифицированную сигнальную последовательность термостабильного энтеротоксина II.

5. Экспрессирующий вектор по п.4, отличающийся тем, что мутант последовательности SD имеет последовательность, полученную путем делеции 1 или 2 нуклеотидов из области, расположенной за GAGG, находящейся на 5), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230116/697.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-конце SEQ ID No:8.

6. Экспрессирующий вектор по п.4, отличающийся тем, что мутант последовательности SD имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No:9.

7. Экспрессирующий вектор по п.1, отличающийся тем, что его выбирают из группы, состоящей из плазмид pT14SSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T, pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T, pT14SSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T22Q, pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T22Q, pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T20V22Q, pT14NSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T22Q, pT14MSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T22Q, pT14SSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b-4T, pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b-4T, pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b-4T22Q, и pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b-4T20V22Q.

8. Штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4Т (НМ 10603, номер доступа КССМ-10175) для экспрессии человеческого интерферона альфа.

9. Штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T22Q (НМ 10611, номер доступа КССМ-10176) для экспрессии человеческого интерферона альфа.

10. Штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b-4T (НМ 10703; номер доступа КССМ-10177) для экспрессии человеческого интерферона альфа.

11. Штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b-4T22Q (НМ 10711; номер доступа КССМ-10178) для экспрессии человеческого интерферона альфа.

12. Способ секреторного продуцирования hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, не имеющего дополнительного метионинового остатка, присоединенного у его N-конца, где указанный способ включает стадии трансформации бактериальных клеток экспрессирующим вектором для секреторного продуцирования hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> по п.1 и культивирования указанных трансформированных бактериальных клеток.

13. Способ секреторного продуцирования hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, не имеющего дополнительного метионинового остатка, присоединенного у его N-конца, где указанный способ включает стадии трансформации бактериальных клеток экспрессирующим вектором для секреторного продуцирования hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> по п.4 и культивирования указанных трансформированных бактериальных клеток.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к экспрессирующему вектору для секреторного продуцирования человеческого интерферона альфа (hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">), содержащему полинуклеотид, кодирующий модифицированную сигнальную последовательность термостабильного энтеротоксина II E.coli, и hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> - кодирующий полинуклеотид, лигированный с его 3"-концом; к микроорганизму, трансформированному указанным экспрессирующим вектором; и к способу продуцирования hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, не содержащего дополнительного метионинового остатка на своем N-конце и секретирующегося в периплазму клетки E.coli.

Предшествующий уровень техники

В 1957 году Иссак и Линденман сообщали, что у кур, инфицированных вирусом гриппа А, продуцировался фактор ингибирования репликации вируса, названный интерфероном (Issacs, К. & Lindenmann, J.Proc.R.Soc.Lond., В 147:258-267, 1957).

Человеческие интерфероны представляют собой белки цитокины, ингибирующие иммунный ответ in vivo или репликацию вируса, и классифицируются как интерферон альфа (IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">), интерферон бета (IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230064/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">) и интерферон гамма (IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230082/947.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">) по типу продуцирующих их клеток (Kirchner, H. et al., Tex.Rep.Biol.Med., 41:89-93, 1981; Stanton, G. J. et al., Тех. Rep.Biol.Med. 41:84-88, 1981).

Хорошо известно, что указанные интерфероны, действуя вместе, обладают синергическим эффектом, который проявляется в антивирусной активности, противораковой активности, активации NK (клеток-киллеров) и в активности, направленной на ингибирование пролиферации клеток костного мозга (Klimpel, et al., J.Immunol. 129:76-78, 1982; Fleischmann, W.R. et al., J.Natl. Cancer. Inst. 65:863-966, 1980; Weigent, et al., Infect. Immun. 40:35-38, 1980). Кроме того, интерфероны действуют как факторы регуляции экспрессии, структуры и функции генов в данной клетке и обладают прямым антипролиферирующим действием.

IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> продуцируются в случае, когда лейкоцит стимулируется В-клеточным митогеном, вирусом или раковыми клетками. В настоящее время известны гены, кодирующие более 20 видов интерферонов, каждый из которых включает 165 или 166 аминокислот.

IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, используемый для ранних клинических тестов, получают из лейкоцитарной пленки, стимулированной вирусом Сендай, и его чистота составляет лишь менее 1% (Cantell, К & Hirvonen, Тех. Rep. Biol. Med. 35:138-144, 1997).

В 1980 г. с помощью техники рекомбинантных ДНК стало возможным продуцировать большое количество IFNa, обладающего биофизической активностью (Goedell, D.V. et al., Nature, 287:411-416, 1980). Клинические тесты с использованием рекомбинантного hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> показали, что он является эффективным для лечения различных твердых раковых опухолей, а в частности рака мочевого пузыря, рака почек, ВИЧ-ассоциированной саркомы Капоши и т.п.(Torti, F.M. J.Clin. Oncol. 6:476-483, 1988; Vugrin, D. et al., Cancer. Treat. Rep. 69:817-820, 1985; Rios, A. et al., J. Clin. Oncol. 3:506-512, 1985). Он также является эффективным для лечения вируса гепатита С (Davis, G.G. et al., N.Engl. J.Med., 321:1501-1506, 1989) и границы его применения в качестве терапевтического агента расширяются день ото дня.

Результаты клонирования гена IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> из лейкоцита показали, что IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> кодируется группой, по крайней мере, из 10 различных генов. Это указывает на то, что ДНК-последовательности этих генов продуцируют не один вид белка, и что IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> представляет собой смесь белков определенного подтипа, имеющих сходные структуры. Белки такого подтипа были названы IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-1, 2, 3 и т.п. (Nature, 290:20-26, 1981).

Среди нескольких типов интерферонов hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, выделенный из человеческих лейкоцитов, имеет молекулярную массу 17500-21000 и очень высокую природную активность, составляющую примерно 2 ), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230071/215.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 10⁸ ед/мг белка. Jn vivo, IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> представляет собой белок, состоящий из 165 аминокислот. В случае, если 23-й аминокислотой является лизин, то такой интерферон обозначается IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a (SEQ ID No:1), а в случае, если 23-й аминокислотой является аргинин, то он обозначается IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b (SEQ ID No:2). Сначала hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> был продуцирован методом с использованием клеточной культуры. Однако этот метод оказался неподходящим для промышленного продуцирования из-за его низкой продуктивности, которая составляет примерно 250 мкг/л.

Для решения этой проблемы были разработаны способы выделения большого количества интерферона из микроорганизмов с использованием техники рекомбинантных ДНК, и эти способы используются до настоящего времени.

Наиболее широкое применение имеет способ с использованием E.coli, которая в соответствии со свойствами клеток E.coli продуцирует IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, состоящий из 166 или 167 аминокислот. Эти продукты содержат дополнительный метиониновый остаток, добавленный у N-конца благодаря кодону ATG, присутствующему в сайте инициирующего кодона. Однако сообщалось, что в случае человеческого гормона роста этот дополнительный метиониновый остаток может стимулировать нежелательный иммунный ответ (публикация патента ЕР № 256843).

Кроме того, большинство экспрессированных IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> аккумулируется в цитоплазме в форме нерастворимых телец включения и должно быть превращено в активную форму в результате повторной укладки в процессе очистки. Поскольку этот способ повторной укладки является неэффективным, IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> присутствует частично в восстановленной форме или образует межмолекулярное дисульфид-связывающее тельце или дефектное дисульфид-связывающее тельце. Удаление побочных продуктов, которые приводят к заметно низкому выходу, представляет определенные трудности. В частности, чрезвычайно трудно удалить такие нежелательные побочные продукты интерферона, как интерфероны с неправильной укладкой.

Недавно для решения вышеупомянутых проблем, связанных с продуцированием чужеродного белка в микробной клетке, был предпринят ряд попыток разработать способ, основанный на эффективной секреции растворимой формы целевого белка, не имеющего у своего N-конца дополнительного метионина.

В этом способе нужный белок экспрессируется в форме гибридного белка, несущего сигнальный пептид, присоединенный к его N-концу. При прохождении указанного гибридного белка через клеточную мембрану сигнальный пептид удаляется ферментом в E.coli, и нужный белок секретируется в нативной форме.

Способ секреторного продуцирования является более предпочтительным, чем способ микробного продуцирования, поскольку аминокислотная последовательность и высшая структура продуцированного белка, обычно, идентичны указанным последовательности и структуре белка дикого типа. Однако выход, который дает способ секреторного продуцирования, в большинстве случаев является очень низким из-за недостаточной эффективности как мембранного транспорта, так и последующей очистки. Это соответствует хорошо известному факту, что выход белка млекопитающего, продуцированного секреторным способом в прокариотах, гораздо ниже, чем выход прокариотического белка, продуцированного тем же способом в прокариотах. Поэтому были предприняты попытки разработать более эффективный способ секреторного продуцирования. Так, например, в публикации патента Кореи № 93/1387 описаны попытки крупномасштабного продуцирования IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> с использованием сигнального пептида щелочной фосфатазы E.coli, однако его выход в культуральной среде при 10⁹ МЕ/л (10 мкг/л культуральной среды) был очень низким. Поэтому разработка способа продуцирования растворимого IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, не содержащего на своем N-конце дополнительного метионинового остатка, с использованием микроорганизма для крупномасштабного производства, представляет огромный интерес.

Ранее авторами настоящего изобретения был продуцирован новый сигнальный пептид термостабильного энтеротоксина II E.coli (заявки на патент Кореи № 98-38061 и 99-27418) и было обнаружено, что этот новый секреторный сигнальный пептид может быть использован для крупномасштабного продуцирования природной формы IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">. А именно авторами настоящего изобретения был сконструирован экспрессирующий вектор, содержащий ген, полученный путем лигирования IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-кодирующего гена, вместо гена, кодирующего энтеротоксин II, с модифицированным секреторным сигнальным пептидом E.coli, и был разработан способ секреторного продуцирования IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, обладающего природной биологической активностью, предусматривающий использование микробной секреторной системы путем культивирования микроорганизма, трансформированного указанным экспрессирующим вектором.

Краткое описание изобретения

В соответствии с этим целью настоящего изобретения является получение экспрессирующего вектора, который способен к секреторному продуцированию человеческого интерферона альфа (hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">).

Другой целью настоящего изобретения является получение микроорганизма, трансформированного указанным экспрессирующим вектором.

Еще одной целью настоящего изобретения является способ продуцирования растворимой формы hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> с использованием указанного микроорганизма, который не содержит дополнительного метионинового остатка, присоединенного к амино-концу.

Краткое описание графического материала

Вышеуказанные и другие цели и признаки настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующего описания настоящего изобретения и прилагаемого графического материала, на котором соответственно проиллюстрированы:

Фиг.1: процедура конструирования вектора pT-IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a;

Фиг.2: процедура конструирования вектора pT14SI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a;

Фиг.3: процедура конструирования вектора pT14SSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a;

Фиг.4: процедура конструирования вектора pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T22Q;

Фиг.5а и 5b: результаты электрофореза в ДСН-ПААГ, которые подтверждают экспрессию IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a и чистоту IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a, экспрессированного из рекомбинантных клеточных линий, и результат Вестерн-блот-анализа, который подтверждает молекулярную массу экспрессированного IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b соответственно.

Подробное описание настоящего изобретения

В соответствии с одним из своих аспектов настоящее изобретение относится к экспрессирующему вектору для секреторного продуцирования hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, содержащего полинуклеотид, кодирующий модифицированную сигнальную последовательность термостабильного энтеротоксина II (далее называемой “мутантом STII”) и полинуклеотид, кодирующий hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, лигированный с его 3"-концом.

Полинуклеотидом, кодирующим hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> и используемым для конструирования экспрессирующего вектора настоящего изобретения, может быть любой из полинуклеотидов, кодирующих произвольные подтипы hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, такие как природный hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a (SEQ ID No:1), IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b (SEQ ID No:2), IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-1 и IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-3, и им может также быть рекомбинантный полипептид, который имеет модифицированную последовательность оснований, кодирующую любой из вышеуказанных подтипов IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">.

Полинуклеотидом, кодирующим модифицированную сигнальную последовательность термостабильного энтеротоксина II E.coli настоящего изобретения, лигированную перед 5"-концом полинуклеотида, кодирующего hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> и используемого для секреторного продуцирования hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, может быть полинуклеотид, кодирующий мутант, полученный путем замены одной или нескольких аминокислот сигнальной последовательности термостабильного энтеротоксина II E.coli, описанной в SEQ ID No:3, а предпочтительно одной или более из ее 4-й, 20-й и 22-й аминокислот другой(ими) аминокислотой(ами). Примерами таких полинуклеотидов являются полинуклеотиды, кодирующие мутанты, полученные путем следующих замен: 4-й аминокислоты треонином ([Thr⁴]STII); 4-й аминокислоты треонином и 22-й аминокислоты глутамином соответственно ([Thr⁴, Gln²²]STII); 4-й аминокислоты треонином, 20-й аминокислоты валином и 22-й аминокислоты глутамином соответственно ([Thr⁴, Val²⁰, Gln²²]STII); и 4-й аминокислоты треонином и 20-й аминокислоты валином соответственно ([Thr⁴, Val²⁰]STII) в сигнальной последовательности термостабильного энтеротоксина II E.coli (STII), описанной в SEQ ID No:3, а предпочтительными полинуклеотидными последовательностями являются SEQ ID No: 4, 5, 6 и 7. Однако известно, что вследствие вырожденности кодона могут существовать и некоторые другие полинуклеотиды, кодирующие мутанты настоящего изобретения, а в частности полинуклеотид, модифицированный путем введения предпочтительных кодонов Е.coli без каких-либо замен в аминокислотной последовательности, может быть использован для стимуляции скорости экспрессии IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">.

Кроме того, экспрессирующий вектор настоящего изобретения может также включать последовательность Шайна-Дальгарно термостабильного энтеротоксина II E.coli (последовательность SD, SEQ ID No:8) или ее мутантную последовательность, лигированную перед 5"-концом полинуклеотида, кодирующего модифицированную сигнальную последовательность термостабильного энтеротоксина II. По сравнению с последовательностью дикого типа, которая имеет 7 оснований (TGATTTT), следующих за GAGG на 5"-конце последовательности SD термостабильного энтеротоксина II в E.coli, представленной в SEQ ID No:8, мутантная последовательность SD имеет укороченную последовательность из 6 или 5 оснований. Использование этого мутанта может приводить к увеличению скорости секреторной экспрессии IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">. Однако, если указанная последовательность оснований становится короче на 4 основания, то скорость экспрессии заметно снижается. Конкретным примером предпочтительного мутанта, который может быть использован в настоящем изобретении, является мутантная последовательность SD термостабильного энтеротоксина II E.coli, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID No:9.

Промотором, используемым для получения экспрессирующего вектора настоящего изобретения, может быть любой из промоторов, который способен экспрессировать гетерологичный белок в микроорганизме-хозяине. В частности, если гетерологичный белок экспрессируется в E.coli, то предпочтительным промотором является промотор lac, Tac и арабинозы.

Настоящее изобретение также относится к трансформированным микроорганизмам, которые могут быть получены путем трансформации таких штаммов E.coli, как BL21 (DЕ3) E.coli (Novagen, USA) или XL-1 blue E.coli (Novagen, USA) с использованием указанного экспрессируищего вектора. Примерами настоящего изобретения являются такие трансформированные микроорганизмы, как BL21(DE3)/pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2а-4Т (“НМ 10603”) E.coli, BL21(DE3)/ pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T22Q (“HM 10611”) E.coli, BL21 (DЕ3) /pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b-4T (“HM 10703”) E.coli, BL21(DЕ3)/pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b-4T22Q (“HM 10711”) E.coli.

Вышеуказанные трансформированные микроорганизмы были депонированы в Корейском центре культур микроорганизмов (КССМ) (Адрес: Yurium Bidg., 361-221, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul 120-091, Republic of Korea) 23 декабря 1999 г. под номерами доступа КССМ-10175, КССМ-10176, КССМ-10177 и КССМ-10178 соответственно, в рамках Будапештского договора, заключенного в соответствии с Международным соглашением о депонировании микроорганизмов для проведения патентной экспертизы.

В соответствии с другим своим аспектом настоящее изобретение также относится к способу продуцирования hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, не содержащего дополнительного метионинового остатка у своего N-конца, путем его секреции в периплазму E.coli, где указанный способ предусматривает культивирование трансформированного микроорганизма в подходящих условиях культивирования, которые могут быть аналогичными стандартным условиям культивирования, используемым для трансформированных микроорганизмов.

hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, продуцируемый секреторным способом настоящего изобретения, включает произвольные подтипы hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, такие как IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-1, IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-3 и т.п., а также природные подтипы hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a (SEQ ID No:1) и hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b (SEQ ID No:2), состоящие из 165 аминокислот. Кроме того, способ настоящего изобретения может быть также использован для продуцирования любого другого интерферона, такого как hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230064/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> и hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230082/947.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">.

В соответствии со способом настоящего изобретения 80% или более IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, продуцируемого трансформантом E.coli настоящего изобретения, секретируется в периплазму с высокой степенью продуктивности, составляющей более 1 г/л. Продуцированный IFNa имеет ту же аминокислотную последовательность, что и природный IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, у N-конца которого отсутствует дополнительная аминокислота, присоединенная к его N-концу, и который обнаруживает биологическую активность, аналогичную активности природного IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">.

Настоящее изобретение подробно проиллюстрировано нижеследующими примерами, которые не ограничивают его объема. Сравнительный пример: ген IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a и конструирование вектора, содержащего этот ген.

Ген, кодирующий hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a, получали путем проведения ПЦР с использованием геномной ДНК человека в качестве матрицы и SEQ ID No: 10 и 11 в качестве праймеров. Праймер SEQ ID No:10 был сконструирован для получения рестрикционного NdeI-сайта (5"-CATATG-3"), расположенного выше от кодона, кодирующего первую аминокислоту (цистеин) природного hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, а праймер SEQ ID No:11 был сконструирован для получения рестрикционного BamHI-сайта (5"-GGATCC-3"), расположенного ниже от кодона терминации природного hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">.

Амплифицированный ПЦР-продукт расщепляли ферментами NdeI и BamHI с получением ДНК-фрагмента, кодирующего hIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a. Этот ДНК-фрагмент встраивали в NdeI/BamHI-сайт вектора рЕТ-14b (Novagen, USA) с получением вектора pT-IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a.

На фиг.1 проиллюстрирована вышеописанная процедура конструирования вектора pT-IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a.

Сравнительный пример 1: Конструирование вектора, содержащего сигнальную последовательность энтеротоксина и гены IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a

Для получения гена сигнальной последовательности энтеротоксина II E.coli, пару комплементарных олигонуклеотидов SEQ ID No:12 и 13 конструировали на основе ранее известной нуклеотидной последовательности сигнального пептида энтеротоксина II E.coli, и синтезировали с использованием ДНК-синтезатора (Model 380B, Applied Biosystem, USA). Вышеуказанные олигонуклеотиды конструировали для встраивания рестрикционного BspHI-сайта (сайта, комплементарного рестрикционному NdeI-сайту) выше кодона инициации энтеротоксина II E.coli и рестрикционного MluI-сайта, введенного посредством молчащей замены в другой конец. Оба олигонуклеотида отжигали при 95°С с получением затупленного по концам ДНК-фрагмента, имеющего нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальную последовательность энтеротоксина II E.coli. Вышеуказанный ДНК-фрагмент встраивали в SmaI-сайт вектора pUC19 (BioLabs, USA) с получением вектора pUC19ST.

Кроме того, вектор pT-IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a, содержащий ген IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a, полученный в сравнительном примере, подвергали ПЦР с использованием праймеров SEQ ID No:14 и 15 для лигирования сигнального пептида энтеротоксина с геном IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a. Праймер SEQ ID No:14 конструировали так, чтобы он соответствовал 5"-концу гена IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a, а праймер SEQ ID No: 15 конструировали так, чтобы рестрикционный BamHI-сайт (5"-GGATCC-3") был введен ниже кодона терминации гена. ДНК-фрагмент, содержащий указанный полинуклеотид, кодирующий природный IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a, амплифицировали посредством ПЦР с использованием вышеуказанных полинуклеотидных праймеров. Амплифицированный ДНК-фрагмент расщепляли ферментами MluI и BamHI с получением ДНК-фрагмента IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a, имеющего MluI/BamHI-концы.

При этом вектор pUC19ST, содержащий сигнальный пептид энтеротоксина, расщепляли ферментом MluI, а затем гидролизовали BamHI с получением фрагмента вектора, имеющего MluI/BamHI-концы. Указанный фрагмент вектора лигировали с ДНК-фрагментом IFNa-2a, в результате чего получали вектор pUC19SIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a.

Вектор pUC19SIFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a расщепляли ферментами BspHI и BamHI с получением ДНК-фрагмента (564 п.н.). ДНК-фрагмент встраивали в NcoI/BamHI-участок вектора pET-14b (Novagen, USA) с получением вектора pT14SI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a.

На фиг.2 проиллюстрирована описанная выше процедура конструирования вектора pT14SI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a.

Затем штамм BL21(DE3) E.coli обрабатывали 70 мМ раствором хлорида кальция с получением компетентной E.coli, a затем в него добавляли вектор рТ14I), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2а в 10 мМ Трис-буфере (рН 7,5). Трансформант E.coli, экспрессирующий IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a, отбирали стандартным методом, основанным на чувствительности трансформированного вектора к антибиотикам, и обозначали НМ 10600 E.coli.

Кроме того, вектор pT14SI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a подвергали ПЦР с использованием праймеров SEQ ID No: 16 и 17 для амплификации ДНК-фрагмента, полученного посредством последовательного лигирования последовательности Шайна-Дальгарно энтеротоксина; сигнального пептида энтеротоксина; и гена IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a, а затем ДНК-фрагмент расщепляли ферментами XbaI и BamHI с получением вставки.

Полученную вставку лигировали в XbaI/BamHI-участок вектора pET-14b (Novagen, USA) для конструирования вектора pT14SSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a.

На фиг.3 проиллюстрирована вышеописанная процедура конструирования вектора pT13SSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a. Штамм BL21(DE3) E.coli (Stratagene, USA) трансформировали вектором pT14SSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a с получением трансформанта, обозначенного НМ 10601 E.coli.

Сравнительный пример 2: Конструирование вектора, содержащего сигнальную последовательность энтеротоксина и гены IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b

23-й лизиновый кодон гена IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a в векторе pT14SSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a заменяли кодоном аргинина посредством сайт-направленного мутагенеза (Papworth, С et al., Strategies, 9, 3, 1996) в целях конструирования экспрессирующего вектора, содержащего ген IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b. Вектор pT14SSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a подвергали гибридизации с синтетическими олигонуклеотидами SEQ ID No:19 и 20, содержащими замененный кодон, с образованием гибридной молекулы и осуществляли амплификацию ДНК с использованием pfu-ДНК-полимеразы (Stratagene, USA) и четырех нуклеотидтрифосфатов (АТР, GTP, ТТР, СТР), которые удлиняют указанные олигонуклеотиды в направлении 5"), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230067/8594.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">3".

Последовательность интерферона ), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b

), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230116/2230116-2t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">

Амлифицированный ДНК-фрагмент выделяли и к нему добавляли рестриктирующий фермент DpnI для полного удаления нетрансформированных плазмид.

XL-1 Blue E.coli (Novagen, USA) трансформировали указанной модифицированной плазмидой. Определяли последовательность оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, и таким образом получали плазмиду pT14SSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b, которая содержала ген, кодирующий аргинин вместо 23-й аминоксилоты IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a, то есть лизина.

Затем BL21(DE3) E.coli трансформировали модифицированным вектором pT14SSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b с получением трансформанта, обозначенного НМ 10701 E.coli, методом, описанным в сравнительном примере 1. Анализ N-концевой аминокислотной последовательности белка, продуцированного путем культивирования трансформанта, подтвердил, что этот трансформант экспрессировал IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b, имеющий нативную аминокислотную последовательность.

Пример 1: Конструирование вектора, содержащего мутант сигнального пептида энтеротоксина

(1) Конструирование вектора, содержащего [Thr⁴]STII

Для модификации конкретного аминокислотного остатка пептида сигнальной последовательности энтеротоксина получали вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий мутантную сигнальную последовательность энтеротоксина, с помощью сайт-направленного мутагенеза, описанного ниже.

Сначала вектор pT14SSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a, полученный, как описано в сравнительном примере 1, подвергали ПЦР с использованием олигонуклеотидов SEQ ID No:22 и 23, в результате чего, в соответствии с процедурой сайт-направленного мутагенеза, описанной в сравнительном примере 2, получали модифицированную плазмиду, где 4-я аминокислота сигнальной последовательности энтеротоксина заменена треонином (Thr).

), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230116/2230116-3t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">

XL-1 Blue E.coli (Novagen, USA) трансформировали указанной модифицированной плазмидой. Определяли последовательность оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, и таким образом получали плазмиду, которая содержала ген, кодирующий пептид сигнальной последовательности энтеротоксина, имеющий в 4-м аминокислотном положении Thr. Полученную таким образом плазмиду расщепляли ферментами XbaI и MluI, а затем встраивали в XbaI/MluI-участок вектора pT14SSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a с получением вектора pT14SSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T.

Затем BL21(DE3) E.coli (Stratagene, USA) трансформировали вектором pT14SSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T с получением трансформанта E.coli, обозначенного HМ 10602 E.coli.

Вектор pT14SSIa-2a-4T конструировали с использованием pT14SSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b, а затем в соответствии с методом, описанным выше, трансформировали в BL21(DE3) E.coli (Stratagene, USA) с получением трансформанта E.coli, обозначенного НМ 10702 E.coli.

(2) Конструирование вектора, содержащего [Thr⁴,Gln²²]STII

Вектор pT14SSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T, полученный в стадии (1), подвергали ПЦР с использованием олигонуклеотидов SEQ ID No: 25 и 26, которые были сконструированы так, что в нем 22-я аминокислота сигнального пептида энтеротоксина, имеющего Thr в 4-м положении, была заменена на кодон Gln в соответствии с процедурой сайт-направленного мутагенеза в стадии (1), в результате чего получали модифицированную плазмиду.

), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230116/2230116-4t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">

Затем XL-1 Blue E.coli (Novagen, USA) трансформировали указанной модифицированной плазмидой. Определяли последовательность оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, и таким образом получали плазмиду pT14SSIa-2), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-4T22Q, которая содержала ген, кодирующий сигнальный пептид энтеротоксина, имеющий Thr и Gln в 4-м и 22-м аминокислотных положениях сигнальной последовательности энтеротоксина соответственно. Затем BL21(DE3) E. Coli (Stratagene, USA) трансформировали вектором pT14SSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T22Q в соответствии с методом, описанным в стадии (1), в результате чего получали трансформант E.coli, обозначенный НМ 10604 E.coli.

Для модификации последовательности Шайна-Дальгарно модифицированной сигнальной последовательности энтеротоксина с образованием последовательности SEQ ID No:9 векторы pT14SSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T и pT14SSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T22Q подвергали процедуре сайт-направленного мутагенеза, описанной в стадии (2) с использованием олигонуклеотидов SEQ ID No:27 и 28 с получением нужной модифицированной плазмиды.

XL-1 Blue E.coli (Novagen, USA) трансформировали указанной модифицированной плазмидой. Определяли последовательность оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, и таким образом получали плазмиды pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T и pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T22Q, содержащие модифицированную последовательность Шайна-Дальгарно сигнальной последовательности энтеротоксина.

На фиг.4 проиллюстрирована вышеописанная процедура конструирования вектора pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T22Q.

BL21(DE3) E.coli трансформировали векторами pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2а-4Т и pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T22Q соответственно с получением трансформантов, обозначенных НМ 10603 и НМ 10611 E.coli, которые были депонированы в Корейской коллекции культур микроорганизмов (КССМ) 23 декабря 1999 г. под номерами доступа КССМ-10175 и КССМ-10176 соответственно.

Кроме того, векторы pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b-4T и pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b-4T22Q получали в соответствии с процедурой, описанной выше для вектора pT14SSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b, которые были использованы для трансформации BL21(DE3) E.coli с получением трансформантов, обозначенных НМ 10703 и НМ 10711 E.coli соответственно. Трансформанты НМ 10703 и НМ 10711 E.coli были депонированы в КССМ 23 декабря 1999 г. под номерами доступа КССМ-10177 и КССМ-10178 соответственно.

(3) Конструирование вектора, содержащего [Thr⁴,Val²⁰, Gln²²]STII

Для последующей замены 20-й аминокислоты пептида сигнальной последовательности энтеротоксина, имеющей Thr и Gln в 4-м и 22-м положениях, на кодон Val, векторы pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T22Q и pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b-4T22Q, полученные на стадии (2), подвергали ПЦР с использованием олигонуклеотидов SEQ ID No: 29 и 30 методом сайт-направленного мутагенеза, описанного в стадии (2), в результате чего получали нужные модифицированные плазмиды, обозначенные pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T20V22Q и pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b-4T20V22Q.

XL-1 Blue E.coli трансформировали указанными модифицированными плазмидами. Определяли последовательности оснований ДНК, выделенных из трансформированных колоний, и таким образом получали плазмиды pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T20V22Q и pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b-4T20V22Q, которые содержали ген, имеющий кодоны Thr, Val и Gln вместо кодонов Asp в 4-м положении. Asp в 20-м положении и Tyr в 22-м положении соответственно. BL21(DE3) Е.coli трансформировали указанными плазмидами с получением трансформантов, обозначенных НМ 10612 и НМ 10712 E.coli соответственно.

Пример 2. Получение мутантной последовательности Шайна-Дальгарно для термостабильного энтеротоксина II

Для снижения числа оснований между сайтом связывания с рибосомой и инициирующим колоном ATG модифицированной сигнальной последовательности термостабильного энтеротоксина II E.coli внутри последовательности Шайна-Дальгарно термостабильного энтеротоксина II в полученном, как описано выше, экспрессирующем векторе конструировали модифицированную плазмиду в соответствии с процедурой сайт-направленного мутагенеза, описанной в сравнительном примере 2.

А именно для снижения числа оснований между сайтом связывания с рибосомой GAGG и инициирующим кодоном ATG с 7 до 5 вектор pT14OSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T22Q, полученный, как описано в примере 1(2), подвергали сайт-направленному мутагенезу, описанному в сравнительном примере 2 с использованием олигонуклеотидов SEQ ID No: 31 и 32, в результате чего получали модифицированную плазмиду, обозначенную pT14NSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T22Q. Кроме того, для снижения числа оснований между сайтом связывания с рибосомой GAGG и инициирующим кодоном ATG до 4, вектор pT14NSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T22Q подвергали процедуре сайт-направленного мутагенеза, описанной в сравнительном примере 2 с использованием олигонуклеотидов SEQ ID No: 33 и 34, в результате чего получали модифицированную плазмиду, обозначенную pT14MSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T22Q.

XL-1 Blue E.coli трансформировали указанными модифицированными плазмидами. Определяли последовательности оснований ДНК, выделенных из трансформированных колоний, и таким образом получали IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-экспрессирующие плазмиды pT14NSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T22Q и pT14MSSI), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a-4T22Q, которые соответственно содержали 5 и 4 основания между сайтом связывания с рибосомой GAGG и инициирующим кодоном ATG. BL21(DЕ3) E.coli трансформировали указанными экспрессирующими плазмидами с получением трансформантов, обозначенных НМ 10613 и НМ 10614 E.coli соответственно.

Пример 3. Сравнение уровней экспрессии IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2

Трансформанты, полученные, как описано выше в Сравнительных примерах и в Примерах, культивировали в среде LB, а затем инкубировали в присутствии IPTG в течение 3 часов. Каждую из этих культур центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут для осаждения бактериальных клеток, и преципитат обрабатывали методом осмотического шока (Nossal, G.N., J.Biol.Chem., 241:3055, 1966), как описано ниже.

Преципитат суспендировали в 1/10 объема изотонического раствора (20% сахароза, 10 мМ буфер Трис-Cl, содержащий 1 мМ EDTA, рН 7,0). Полученную суспензию оставляли на 30 минут при комнатной температуре, а затем центрифугировали для сбора бактериальных клеток. Полученные клетки ресуспендировали в D.W. при 4), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230013/176.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">С для экстракции белков, присутствующих в периплазме клеток, и центрифугировали с получением супернатанта в виде периплазматического раствора. Уровень IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2 в периплазматическом растворе анализировали методом ELISA (Kato, К. et al., J. Immunol., 116, 1554, 1976) с использованием антитела против IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2 (R&D, USA), и этот уровень вычисляли как количество IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a, продуцируемого на 1 л культуры. Результаты представлены в таблице.

), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230116/2230116-5t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">

Пример 4. Последующая обработка и очистка

В соответствии с процедурой, описанной в примере 3, трансформант НМ 10611 E.coli, полученный, как описано в примере 1(2), культивировали в среде LB, и культуру центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут для сбора клеток. Из этих клеток получали периплазматический раствор методом осмотического шока.

Указанный периплазматический раствор доводили до рН 5,0-5,5, адсорбировали на колонке с S-сефарозой (Pharmacia Inc., Sweden), предварительно уравновешенной до рН 5,3, а затем колонку промывали 25 мМ NaCl. IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2 элюировали путем последовательного добавления растворов, забуферных уксусной кислотой и содержащих 50 мМ, 100 мМ, 200 мМ и 1 М NaCl соответственно, и фракции, содержащие IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2, собирали и объединяли.

Объединенные фракции подвергали хроматографии на колонке с сефарозой Blue (Pharmacia Inc., Sweden) и элюировали добавлением в колонку буферных растворов, содержащих более 2 М NaCl, с получением активной фракции.

Активную фракцию диализовали буфером, и, наконец, подвергали фракционированию на колонке с анионообменной смолой DEAE при рН 5,8 с получением IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a, имеющего чистоту более 99%. Кроме того, IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b выделяли из трансформанта НМ 10711 E.coli путем повторения вышеописанной процедуры.

Каждую из очищенных фракций IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a и IEN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ) для определения чистоты и приблизительной концентрации IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, а затем подвергали стандартному ELISA-методу, как описано в примере 3 для определения точной концентрации IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> в периплазматическом растворе. Кроме того, с помощью анализа N-концевой аминокислотной последовательности было подтверждено, что IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a и IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b представляют собой природные типы, не содержащие дополнительного метионина.

Пример 5: Определение молекулярной массы IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a, продуцированного из рекомбинантных клеточных линий

Уровень экспрессии и молекулярные массы IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a и IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b, продуцированных из рекомбинантных клеточных линий, определяли с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттинга.

Сначала периплазматическую фракцию трансформанта НМ 10611 E.coli, полученного, как описано в примере 4, и очищенный IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a, полученный из нее, подвергали электрофорезу в ДСН-ПААГ стандартным методом с использованием коммерчески доступного продукта IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a (3 ), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230071/215.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 10⁶ МЕ/мл) в качестве контроля.

На фиг.5а представлены результаты электрофореза в ПААГ с ДСН, где дорожка 1 соответствует IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2а-контролю; дорожка 2 соответствует периплазматической фракции трансформанта НМ 10611 E.coli; а дорожка 3 соответствует очищенному IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a. Как видно из фиг.5а, очищенный IFNa-2a имеет ту же молекулярную массу, что и природный IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2a, и присутствует в периплазматической фракции трансформанта НМ 10611 E.coli на высоком уровне.

Кроме того, периплазматическую фракцию трансформанта НМ 10711 E.coli, очищенную фракцию, полученную в результате хроматографии периплазматического раствора на колонке с S-Сефарозой, и наконец, очищенный IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b подвергали электрофорезу в ПААГ с ДСН стандартным методом.

Нитроцеллюлозный фильтр (Bio-Rad Lab, USA) смачивали в буферном растворе для блоттинга (170 мМ глицин, 25 мМ Трис ), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230116/8226.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> НСl [рН 8], 20% метанола) и разделенные на геле белки переносили на нитроцеллюлозный фильтр в течение 3 часов с использованием набора для блоттинга. Фильтр выдерживали в 1% казеине в течение 1 часа и три раза промывали PBS, содержащим 0,05% Твина 20. Затем фильтр помещали в раствор кроличьего антитела против IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> (Chemicon, # AB1434, USA), разведенного PBS, и оставляли на 2 часа при комнатной температуре для прохождения реакции. После проведения реакции фильтр 3 раза промывали раствором PBST для удаления непрореагировавшего антитела. Затем добавляли конъюгированное с пероксидазой хрена козье антитело против кроличьего IgG (Bio-Rad Lab, USA), разведенное в PBS, и подвергали реакции при комнатной температуре в течение 2 часов. Фильтр промывали PBST, и к нему добавляли раствор набора субстратов для пероксидазы (Bio-Rad Lab, USA) для развития цветной реакции. Результаты вышеописанного Вестерн-блоттинга приводятся на фиг.5b, где дорожка 1 соответствует периплазматической фракции трансформанта НМ 10711 E.coli; дорожка 2 соответствует фракции, очищенной хроматографией на колонке с S-сефарозой; а дорожка 3 соответствует конечному очищенному IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-2b.

Результаты этого примера подтверждают, что из рекомбинантных штаммов Е.coli настоящего изобретения экспрессируется большое количество растворимого IFN), штамм escherichia coli для экспрессии и секреции hifn(варианты) и способ продуцирования hifn, патент № 2230116" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">.