способ получения 1--d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина)

Формула изобретения

Способ получения рибавирина путем трансгликозилирования 1,2,4-триазол-3-карбоксамида в присутствии ферментного препарата с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве ферментного препарата используют рекомбинантную пуриннуклеозид-фосфорилазу, полученную из штамма суперпродуцента Е.соli ВL21 (DE3)/рERPUPHO1 и иммобилизованную на аминопропиллированном силохроме.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству противовирусных соединений, и может быть использовано при получении целевого противовирусного препарата нуклеозидной природы - рибавирина (синонимы: виразол, ребетол) путем синтеза гетероциклического основания с последующим его превращением в нуклеозид в результате ферментативной реакции трансгликозилирования.

Рибавирин представляет собой широко используемый в медицине противовирусный и противоопухолевый препарат, подавляющий репродукцию ряда ДНК-и РНК-содержащих вирусов, в том числе вирусов гепатита С, гриппа и др. (Евр. патент ЕР 0956861, МПК⁷ А 61 К 38/21, опублик. 17.11.1999). По химической структуре рибавирин представляет собой 1--d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230064/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид (фиг.1).

Известен способ химического синтеза рибавирина на основе метилового эфира 1,2,4-триазол-3-карбоновой кислоты На первой стадии синтеза получают силильное производное метилового эфира 1,2,4-триазол-3-карбоновой кислоты взаимодействием с гексаметилдисилазаном, которое алкилируют 1-ОАс-2,3,5-три-ОВz--d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230064/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-D-рибофуранозой в присутствии хлорного олова. Затем проводят удаление защитных групп с помощью насыщенного раствора аммиака в метаноле (Патент США 3798209, МПК С 07 С 95/04, опублик. 19.03.1974). К недостаткам этого метода относятся необходимость в последовательном введении защитных групп в структуру исходной рибозы и трудность в отделении примесей неприродного -d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-аномера рибавирина, высокая стоимость исходных компонентов синтеза.

Известен способ ферментативного трансгликозилирования исходного гетероциклического производного 1,2,4-триазол-3-карбоксамида l--d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-D-рибофуранозилфосфатом при температуре от 0 до 50-d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230013/176.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">С в присутствии ферментов - нуклеозидфосфорилаз, предварительно выделенных из бактериальных клеток (Патент США 3976545, МПК⁷ кл. С 12 D 013/06, опублик. 24.08.1976). К недостаткам этого метода можно отнести следующее: невозможность использовать в процессе получения рибавирина ферментные препараты более одного раза и высокая стоимость исходного 1 -d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-D-рибофуранозилфосфата.

Известен способ получения рибавирина по реакции трансгликозилирования в процессе ферментации клеток Brevibacterium acetylicum., в котором исходное основание 1,2,4-триазол-3-карбоксамид и донор рибозы (инозин, аденозин, гуанозин, цитидин и др.) добавляют в культуральную среду, содержащую пролиферирующие микроорганизмы при 20-40-d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230013/176.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">С (Патент США 4614719, МПК⁷ кл. С 12 Р 019/28, опублик. 30.09.1986). К недостаткам этого метода можно отнести следующее:

1) рибавирин продуцируется в культуральной среде в процессе роста микроорганизмов,

2) необходимо избегать заражения реакционного объема сторонними микроорганизмами,

3) ферменты клетки продуцируют не только рибавирин, но и весь спектр природных нуклеозидов, фосфатов рибавирина, его метаболитов, что усложняет процесс выделения целевого продукта,

4) протяженный (от 2 до 8 дней) производственный цикл.

Известен наиболее близкий к заявленному способ получения рибавирина, в котором сырую биомассу клеток штамма Е. coli БМТ-3Д/1А инкубируют с 1,2,4-триазол-3-карбоксамидом и гуанозином при 60-d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230013/176.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">С в течение 30 часов с последующим выделением целевого продукта (Авт. свид. СССР № 1661209 А1, МПК⁷ кл. С 12 N 1/20, опублик. 07.07.91). Выход составляет 67% от теоретически возможного. К недостаткам способа можно отнести то, что биомасса клеток применяется для синтеза рибавирина однократно. Кроме того, описанный способ получения рибавирина не свободен от всех недостатков, присущих указанным ранее способам.

Изобретение решает задачу упрощения технологии получения рибавирина.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе получения рибавирина путем трансгликозилирования 1,2,4-триазол-3-карбоксамида в присутствии ферментного препарата в качестве ферментного препарата используют рекомбинантную пуриннуклеозид-фосфорилазу, иммобилизованную на водонерастворимом полимерном сорбенте (ИФП-ПНФ).

Использование ИФП-ПНФ значительно упрощает технологию выделения рибавирина из реакционной смеси и позволяет использовать иммобилизованные ферментные препараты до 15 производственных циклов.

Изобретение осуществляют следующим образом. 1,2,4-триазол-3-карбоновую кислоту этерифицируют метанолом в присутствии хлористого водорода. Полученный 3-карбометокси-1,2,4-триазол амидируют водным раствором аммиака (см. фиг.2).

Образовавшийся 1,2,4-триазол-3-карбоксамид служит исходным гетероциклическим основанием для превращения в -d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230064/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-D-рибофуранозил1,2,4-триазол-3-карбоксамид (рибавирин) в реакции трансгликозилирования с помощью ИФП-ПНФ.

Одновременно, на основе рекомбинантной пуриннуклеозид-фосфорилазы получают иммобилизованный ферментный препарат (ИФП-ПНФ) (схема синтеза приведена на фиг.3).

Полученный ферментативный препарат используют в реакции трансгликозилирования 1,2,4-триазол-3-карбоксамида с гуанозином (схема химико-ферментативного синтеза приведена на фиг.4), образовавшийся в результате рибавирин подвергают очистке.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1.

Метиловый эфир 1,2,4-триазолкарбоновой кислоты получают взаимодействием 67.6 г (0.6 моль) 1,2,4-триазол-3-карбоновой кислоты с 0.5 л (395 г, 12.3 моль) метилового спирта в присутствии газообразного хлористого водорода, который пропускают в охлаждаемую льдом реакционную массу в течение 7 часов.

По окончании пропускания хлористого водорода реакционную смесь оставляют на двое суток при комнатной температуре для завершения кристаллизации метилового эфира 1,2,4-триазол-3-карбоновой кислоты. Выпавшую соль отфильтровывают, промывают охлажденным метанолом и высушивают на воздухе при 20-d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230013/176.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">С и затем - при 60-d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230013/176.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">С до постоянной массы.

Получают 86.1 г метилового эфира 1,2,4-триазол-З-карбоновой кислоты в виде кристаллического порошка белого цвета с выходом 88.0%, с содержанием основного вещества не ниже 98% (метод ВЭЖХ), температура плавления 198-199-d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230013/176.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">С.

1,2,4-Триазол-3-карбоксамид получают аммонолизом 30 г (0.182 моль) метилового эфира 1,2,4-триазол-3-карбоновой кислоты при обработке 160 мл (144.64 г) 25% водного аммиака при кипении реакционной смеси в течение 1 часа, при двухкратном добавлении водного аммиака. Затем реакционную смесь упаривают до 1/3 первоначального объема, из охлажденной суспензии отфильтровывают выпавший 1,2,4-триазол-3-карбоксамид и перекристаллизовывают его из воды.

После сушки при 65-d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230013/176.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">С получают 1,2,4-триазол-3-карбоксамид с содержанием основного вещества не ниже 96% (метод ВЭЖХ) и температурой плавления 224-228-d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230013/176.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">С. Выход 1,2,4-триазол-3-карбоксамида составляет 17.56 г (86%).

Параллельно проводят получение пуриннуклеозид-фосфорилазы (ПНФ) с использованием штамма суперпродуцента Е. coli BL21(DE3)/ pERPUPHO1.

Штамм суперпродуцента пуриннуклеозид-фосфорилазы Е. coli BL21(DE3)/ pERPUPHOl выращивают при 37-d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230013/176.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">С в 100 мл YT-бульона (рН 7.0) с 50 мкг/мл ампициллина в течение 2 ч на качалке со скоростью вращения 190 об/мин до мутности А₅₅₀ 0.7-0.8, прибавляют изопропилтио--d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230064/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-D-галактозид до концентрации 0.2 мМ и продолжают процесс еще 6 ч, и культуру центрифугируют 5 мин при 6000 об/мин. Осажденные влажные клетки (10 г) суспендируют в 20 мл буфера (30 мМ Na-фосфат, рН 7.0, 5% глицерин) и разрушают ультразвуком с помощью ультразвукового дезинтегратора Sonifier 240 (Branson) (3 импульса по 20 сек при 2.0 А и 0-d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230013/176.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">С). Гомогенат центрифугируют 10 мин при 10000 g и полученный осветленный лизат с содержанием фермента до 80% от суммарного белка подвергают очистке.

Содержащий ПНФ осветленный лизат очищают от балластных белков ступенчатым высаливанием при обработке мелкорастертым сульфатом аммония, который прибавляют в количестве 136 г на 1 л раствора при 4-d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230013/176.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">С в течение 1 часа, и центрифугируют при О-d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230013/176.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">С в течение 1 часа при 12000 об/мин. Для выделения фракции ПНФ к полученному раствору после отделения балластных белков прибавляют сухой сульфат аммония при 4-d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230013/176.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">С в количестве 392 г на 1 л раствора (80% насыщения). После перемешивания в течение 12 часов полученную суспензию центрифугируют при О-d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230013/176.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">С в течение 1 часа при 12000 об/мин, супернатант сливают. Полученный осадок, содержащий ПНФ, растворяют в 50-60 мл буферного раствора 20 мМ трис-НСl рН 7.5, 2 мМ ЭДТА, 0.05 М NaCl). Полученный раствор пропускают через колонку с Сефадексом G-100, элюируют тем же буферным раствором со скоростью 20 мл/час. Отбирают фракции, содержащие фермент, на основании данных анализа по количеству общего белка и ферментативной активности. В собранных фракциях определяют содержание общего белка. Отобранные фракции лиофилизируют. Лиофилизированный порошок, содержащий 400 мг ПНФ, хранят при -20-d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230013/176.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">С в течение 1 года.

Далее проводят получение иммобилизованного ферментного препарата пуриннуклеозид-фосфорилазы (ИФП-ПНФ).

Для иммобилизации ПНФ используют аминопропилированный силохром АР CPG 170. В присутствии боргидрида натрия образуется ковалентная связь между альдегидными группами сорбента и аминогруппами белков (см. фиг.3).

Сорбент АР CPG - 170 в количестве 10 г промывают последовательно 40 мл дистиллированной воды, дважды в 40 мл этилового спирта и отмывают 40 мл дистиллированной воды. Затем сорбент трижды промывают 40 мл 50 мМ буферного раствора фосфорнокислого калия. Отмытый сорбент отжимают от буфера на стеклянном фильтре, взвешивают. Масса влажного сорбента должна быть не менее 28 г. Влажный сорбент готовят непосредственно перед нанесением ферментных препаратов и используют в течение 1 суток.

Из лиофилизированного порошка ПНФ готовят 30 мл раствора в 50 мМ буферном растворе фосфорнокислого калия с концентрацией белка 5 мг/мл.

Раствор ПНФ вносят в сосуд с влажньм сорбентом и выдерживают в течение 18 ч при температуре 4-d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230013/176.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">С, при постоянном мягком перемешивании на качалке, не допуская вспенивания белка.

По завершении перемешивания отбирают 100 мкл супернатанта, содержащего несорбированный белок. Определяют концентрацию белка в супернатанте. Если концентрация белка выше 0.5 мг/мл, перемешивание продолжают еще в течение 3 ч.

Сорбент промывают трижды последовательно 60 мл 50 мМ буферного раствора фосфорнокислого калия и 20 мл 2 М раствора хлористого калия и затем обрабатывают 20 мл раствора 90 мг боргидрида натрия в дистиллированной воде в течение 1 ч при температуре 4-d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230013/176.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">С.

По завершении процесса иммобилизации сорбент промывают трижды последовательно 60 мл 50 мМ буферного раствора фосфорнокислого калия и 20 мл 2 М раствора хлористого калия.

Получают 30 г влажного сорбента, содержащего 90 мг ПНФ.

По результатам трех экспериментов готовый ИФП-ПНФ должен содержать не менее 3 мг белка на 1 г влажного сорбента.

Ферментативную активность иммобилизованной рекомбинантной пуриннуклеозид-фосфорилазы определяют по способности расщеплять инозин с образованием гипоксантина. За 1 единицу активности принимают количество фермента, которое превращает 1 мкМ инозина в течение 1 минуты при температуре 20-d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230013/176.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">С. Удельная активность ИФП-ПНФ в указанных условиях не менее 15 единиц на 1 мг иммобилизованного белка.

Препарат ИФП-ПНФ хранят при температуре 4-d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230013/176.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">С не более 4 недель.

Получение рибавирина с помощью ИФП-ПНФ проводят по схеме, приведенной на фиг.4.

1--d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230064/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид (рибавирин) получают по реакции трансгликозилирования при взаимодействии 17.0 г (0.06 моль) гуанозина с 4.48 г (0.04 моль) 1,2,4-триазол-3-карбоксамида в присутствии 30 г иммобилизованного ферментного препарата ПНФ (ИФП-ПНФ) в 1 л 10 мМ калий-фосфатного буфера при рН 7.0. Реакция протекает при термостатировании в течение 30 часов при 62-d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230013/176.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">С. Контроль полноты процесса осуществляется с помощью ВЭЖХ. Процесс считается законченным, если содержание рибавирина в реакционной смеси изменяется в пределах 80-92%.

Реакционную смесь отделяют от иммобилизованного ферментного препарата декантацией. ИФП-ПНФ промывают 60 мл 50 мМ калий-фосфатного буферного раствора и используют повторно в процессе получения рибавирина не менее 15 раз.

Реакционный раствор охлаждают до температуры +4-d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230013/176.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">С. Выпавший в осадок гуанин отфильтровывают. Фильтрат упаривают в вакууме до небольшого объема и пропускают через ионообменную смолу DOWEX (Н⁺-форма) для очистки от следов тяжелых металлов и неорганических катионов, технический рибавирин элюируют водой. Элюат упаривают в вакууме до небольшого объема, пропускают через слой ионообменной смолы DOWEX (ОН^--форма) для очистки от примесей исходных соединений (гуанозина и 1,2,4-триазол-3-карбоксамида), а также неорганического фосфата и гуанина. Рибавирин элюируют водой. Полученный водный раствор упаривают в вакууме досуха, затем высушивают в эксикаторе до постоянного веса.

Фармакопейный продукт получают кристаллизацией из этанола с добавлением воды. Препарат высушивают при температуре 100-d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230013/176.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">С в течение 5 часов.

Выход составляет 6.60 г (68%).

Продукт получают в виде белого кристаллического порошка, содержащего 99.9% основного вещества, угол вращения [-d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230018/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">]²⁰_D= -36.2 (с 1.0; Н₂O).

Т. пл. продукта - 175-178-d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230013/176.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">С.

Коэффициент молярной экстинкции при длине волны 205.6 нм -11300-11400.

Значение R_f=0.48 (TCX на пластинах Kieselgel 60 F₂₅₄ (Merck) в системе растворителей ацетонитрил-вода, (9:1)).

УФ-спектр: -d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230118/955.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, нм (А): 207.6 (1.253).

Масс-спектр, m/z: 245.5 [М+Н]⁺, 267.1 [M+Na]⁺, 282.9 [M+K]⁺_, 487.9 [2М]⁺_, 510.0 [M+Na]⁺, 526.0 [2M+K]⁺ (Finnigan 900 S (ESI)).

Спектр ¹Н-ЯМР (D₂O), (-d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксиамида (рибавирина), патент № 2230118" SRC="/images/patents/238/2230063/948.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">. м. д.): 8.80 (1H; уш. с, Н-5), 6.20 (1Н, д, Н-1’, J_1’,2’= 3.44 Гц), 4.71 (1H, дд, Н-2’, J_2’,1’ = 3.44 Гц, J_2’,3’ = 5.27 Гц), 4.55 (1H, дд, Н-3", J_3’2’= 5.27 Гц, J_3’,4’= 5.27 Гц), 4.28 (1H, тд, Н-4’, J_4’,3’= 5.27 Гц, J_4’,5a’= 3.21 Гц, J_4’,5b’= 5.27 Гц), 3.93 (1H, дд, Н-5а’, J_5а’,5b’= 12.6 Гц, J_5a",4’= 3.21 Гц), 3.82 (1H, дд, H-5b", J_5b’,5a’= 12.6 Гц, J_5b’,4’= 5.27 Гц) (Bruker DRX 500).

Пример 2.

Получение рибавирина проводят по примеру 1 с тем отличием, что на стадии трансгликозилирования с помощью ИФП-ПНФ применяют вместо гуанозина 42.9 г (0.16 моль) инозина. Выход рибавирина составляет 7.0 г (72%).