способ приготовления очищенного препарата ботулинического токсина типа а

Формула изобретения

Способ приготовления очищенного препарата ботулинического токсина типа А, включающий культивирование штамма-продуцента Clostridium botulinum в жидкой питательной среде, отделение токсинсодержащих компонентов из культуральной жидкости, кислотно-солевое осаждение белков из надосадочной жидкости, экстракцию токсина из осадка, фракционирование компонентов препарата методами гель-фильтрации и анионообменной хроматографии, отличающийся тем, что перед этапом хроматографии белки из экстракта токсина двукратно осаждают в присутствии сульфата аммония до степени насыщения 20% и 40% соответственно, гель-фильтрацию и анионообменную хроматографию выполняют в условиях, оптимальных для диссоциации компонентов токсического комплекса, - при рН 7,9 и концентрации соли фосфорно-кислого натрия 0,025 М, адсорбционную хроматографию выполняют перед этапом анионообменной хроматографии, а в качестве адсорбента на этапе адсорбционной хроматографии используют гидроксиапатит.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способам очистки препаратов ботулинического токсина физико-химическими методами и может быть использовано при производстве антитоксических сывороточных препаратов, в частности для конструирования иммуноферментной тест-системы для обнаружения и идентификации ботулинического токсина типа А.

Известно что ботулинические токсины представляют собой сложный белково-нуклеотидный комплекс, состоящий из нейротоксина, гемагглютинина, нетоксического белка, и, кроме того, получаемые путем, например, кислотного или солевого осаждения препараты ботулинического токсина содержат в качестве балластных примесей компоненты питательной среды и разрушенные клетки продуцента. Это делает необходимой дополнительную очистку препаратов ботулинического токсина для целей практического применения, в частности для получения типоспецифичных конкретному типу ботулинического токсина антитоксических сывороток.

Известны способы получения очищенного препарата ботулинического токсина в кристаллическом виде, основанные на многоэтапном кислотно-солевом и спиртовом переосаждении токсина из кльтуральной жидкости. Например, Lamanna С., McElroy О.Е., Eklund H.W. The purification and crystallisation of Clostridium botulinum type A toxin //Science. -1946. - Vol. 103. P. 613-621. По этому способу получают кислотно-солевой осадок, содержащий ботулинический токсин, обрабатывают его раствором уксусно-кислого натрия, фракционируют различными концентрациями метилового спирта и сульфатом аммония разной степени насыщения.

Общим с заявляемым способом является этап приготовления из культуральной жидкости штамма-продуцента кислотно-солевого осадка, содержащего ботулинический токсин.

К недостаткам данного способа следует отнести недостаточную степень очистки токсина. Полученный этим способом препарат негомогенен и представляет собой комплекс нейротоксина и гемагглютинина в соотношении 1:4 по весу (DasGupta B.R., Boroff P.A. Separation of toxin and hemagglutinin from cristalline toxin of Clostridium botulinum type A by anion exchange chromatography and determination of their dimension by gelfiltration// J.Biol. Chem. - 1968. - Vol. 243.- P.1065-1070).

Поскольку входящие в токсический комплекс включения гемагглютинина и нетоксического белка не обладают типоспецифичностью, антитоксические сыворотки, полученные на основе такого препарата токсина, дают перекрестные реакции с другими типами токсинов, то есть препарат антител не обладает абсолютной специфичностью по отношению к токсину типа А. Причиной, препятствующей получению гомогенного ботулинического нейротоксина типа А, обладающего четкой типоспецифичностью, является относительно высокая прочность связей отдельных белковых компонентов ботулинического токсинного комплекса.

Известен также способ получения гомогенного нейротоксина, основанный на использовании методов многостадийной хроматографической очистки первичных белковых препаратов (DasGupta B.R., Sathyamoorthy V. Purification and amino acid composition of type A botulinum neurotoxin. - Toxicon, 1984, V.22, №3, P. 415-424). Данная методика включает в себя получение кислотно-солевого преципитата токсина с помощью сульфата аммония, обработку растворенного осадка, последовательное осаждение сульфатом аммония, обработку преципитата тразилиолом и фенилметилсульфонилфлуоридом, многократный диализ препарата, две стадии хроматографии на колонке с ДЭАЭ-сефадексом А-50, хроматографию на колонке с сефадексом G-100, хроматографию на колонке SP-сефадекса С-50.

Общим с заявляемым способом является этап приготовления из культуральной жидкости штамма-продуцента кислотно-солевого осадка, содержащего ботулинический токсин, а также выполнение этапов фракционирования препарата методом гель-фильтрации и ионообменной хроматографии.

Недостатком данного метода является его трудоемкость, многостадийность получения препарата (метод включает девять стадий), малый выход конечного продукта (из 64 литров культуральной жидкости получено около 60 мг нейротоксина), обусловленный как физическими потерями на отдельных стадиях, так и частичной инактивацией нейротоксина, связанной с его денатурацией в ходе выделения и очистки.

Известен также способ получения очищенного препарата ботулинического нейротоксина, основанный на последовательном применении этапов ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-sephacel и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (Matsuda М., Orutsumi S. Rapid method for purification of Clostridium botulinum type С neurotoxin by high performance liquid chromatography // Eur. J. Epidemiol. - 1986. - Vol. 2. - P. 265-271).

Общим с заявленным способом является этап приготовления из культуральной жидкости штамма-продуцента кислотно-солевого осадка, содержащего ботулинический токсин, а также выполнение в качестве одного из этапов метода ионообменной хроматографии.

Недостатком данного способа является высокая стоимость используемых при ВЭЖХ материалов и оборудования, кроме того, данный метод выделения нейротоксина пригоден для получения препарата только в аналитических целях.

Наиболее близким к заявляемому решению является способ выделения нейротоксина типа А из культуральной жидкости, включающий ряд последовательных этапов гель-фильтрации и ионообменную хроматографию препарата токсина (Получение нейротоксина и гемагглютинина Cl. botulinum типа А и характеристика нейротоксина / И.Д. Виноградова, Р.Н. Уварова, Н.Н. Иванова и др.// Биохимия. - 1982. - Т. 48. - Вып.5. - С. 788-795).

Способ включает в себя следующие этапы:

- культивирование штамма-продуцента ботулинического токсина;

- получение из культуральной жидкости кислотно-солевого осадка, содержащего ботулинический токсин;

- гель-фильтрация растворенного преципитата на колонке с сефадексом G-l00;

- хроматография фракции первого пика, полученного после гель-фильтрации на целлюлозе ДЭАЭ-32;

- осаждение токсина из элюата добавлением насыщенного раствора сульфата аммония до конечной концентрации 60%;

- восходящая гель-фильтрация на колонке с сефадексом G-200;

- перевод полученных фракций в другую буферную систему гель-фильтрацией через сефадекс G-25;

- хроматография токсина на ДЭАЭ-сефадексе А-50.

При этом Cl. botulinum типа А штамм 501 выращивается в анаэробных условиях на среде, содержащей кислотный гидролизат китовой муки с кукурузным экстрактом. После окончания культивирования микробные клетки отделяются стерильной фильтрацией. Безмикробная культуральная жидкость охлаждается до 7-10С, подкисляется соляной кислотой до рН 5,6, добавляется сухой сульфат аммония до конечной степени насыщения 40% и инкубируется 36 часов при 7С для формирования осадка белка, который затем собирается центрифугированием.

Для экстракции токсина кислотно-солевой осадок растворяется в натрий-фосфатном буфере рН 6,8. Нерастворимые частицы удаляются центрифугированием. Экстракт наносится на колонку с сефадексом G-100, уравновешенным цитратфосфатным буфером, рН 5,6, и белок элюируется тем же буфером. Хроматография фракций первого пика, полученного после гель-фильтрации, проводится на целлюлозе ДЭАЭ-32 в цитратфостатном буфере, рН 5,6. Токсин, элюирующийся с колонки одним белковым пиком, осаждается добавлением насыщенного раствора сульфата аммония до конечной степени насыщения 60%. Смесь центрифугируется, осадок растворяется в натрий-фосфатном буфере рН 5,6. Раствор токсина вносится в колонку с сефадексом G-200, уравновешиваемым трис-НС1-буфером, рН 7,9 и элюцию проводят тем же буфером, применяя метод восходящей гель-фильтрации. Полученные фракции второго пика, включающие токсический белок, объединяют и проводят их гель-фильтрацию через сефадекс G-25 в натрий-фосфатном буфере рН 7,9. На последнем этапе очистки проводится хроматография препарата токсина на ДЭАЭ-сефадексе А-50, уравновешенном в натрий-фосфатном буфере рН 7,9 путем подачи раствора NaCl с линейным градиентом в концентрации 0-0,5 М.

Общим с заявляемым способом является этап приготовления из культуральной жидкости штамма-продуцента кислотно-солевого осадка, содержащего ботулинический токсин, а также применение комбинаций и методов гель-фильтрации и ионообменной хроматографии.

К недостаткам рассматриваемого способа следует отнести длительность процесса получения препарата, обусловленная многоэтапностью технологического процесса и несовершенством матриц, используемых для гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Так, в методике на этапах гель-фильтрации используются сефадексы G-100 и G-200, а на этапах ионообменной хроматографии - целлюлоза ДЭАЭ-32 и ДЭАЭ сефадекс А-50. Однако известно, что гранулы сефадексов относительно эластичны и легко сжимаются под влиянием гидродинамических воздействий, что накладывает существенные ограничения на допустимые значения скоростей хроматографической элюции фракций. Порошок целлюлозы ДЭАЭ-32 также достаточно легко спрессовывается при больших скоростях протекания элюирующих растворов и, кроме того, при незначительных случайных отклонениях рН и ионной силы элюента могут происходить необратимые деформации гранул, что приводит к резкому ухудшению условий течения элюента (Остерман А.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. - М.: Наука, 1985). Известно также, что целлюлоза ДЭАЭ-32 и сефадексы выпускаются в виде сухих порошков, и поэтому их необходимо подвергать длительной подготовке к работе: сефадексы замачивают для набухания в течение двух суток с последующей деаэрацией, преформированием слоя геля в колонке и промывке. Порошок целлюлозы также замачивают в течение одного часа с последующим отмучиванием мелких частиц и переводом ионообменника в нужную ионообменную форму.

Несовершенство носителей и многоэтапность методики значительно усложняют процесс хроматографической очистки ботулинического токсина и удлиняют время его проведения, это является причиной потерь серологической активности препарата как за счет физической потери части специфического белка, так и за счет его частичной денатурации в ходе многоэтапного хроматографического процесса.

Задачей изобретения является приготовление очищенного препарата ботулинического нейротоксина типа А, пригодного для получения высокоспецифичных антитоксических сывороток путем разрушения токсинного комплекса и полного удаления из препарата ботулинического токсина примесей гемагглютинина и других перекрестно реагирующих соединений с антителами антитоксических сывороток в короткие сроки, с наименьшим количеством этапов очистки и в условиях, максимально уменьшающих воздействия, неблагоприятно влияющие на антигенные свойства молекул очищенного нейротоксина.

Выполнение данной задачи является необходимым условием для приготовления серологически чистых анатоксинов, предназначенных для иммунизации животных и получения строго типоспецифических антител к ботулиническому токсину типа А.

Поставленная задача решается благодаря тому, что проводится предварительная очистки концентрата токсина переосаждением сульфатом аммония при степенях насыщения 20% (с целью удаления с осадком крупномолекулярного балласта) с последующим повторным осаждением белков при 40% насыщении той же солью для удаления остающихся в надосадочной жидкости низкомолекулярных соединений из культуральной среды. В результате получаемый препарат в меньшем объеме содержит большее количество специфического компонента, что обеспечивает более эффективную дальнейшую его хроматографическую очистку от балластных примесей.

Ведение хроматографического процесса при рН 7,9 обеспечивает разрушение токсинного комплекса уже на первом этапе, что позволяет сразу избавиться от основного количества примесей гемагглютинина и нетоксического белка при гель-фильтрации на сефакриле S-300, область фракционирования которого лежит в диапазоне от 10 до 1500 тысяч Дальтон.

Использование адсорбционной хроматографии на гидроксиапатите позволяет отказаться от дополнительной стадии ионообменной хроматографии и восходящей гель-фильтрации. На данной стадии происходит полная очистка нейротоксина от остаточных включений гемагглютинина за счет различия в их сорбционной способности.

Кроме того, порядок выполнения этапов выделения гомогенного нейротоксина подобран таким образом, что отпадает необходимость промежуточных операций концентрирования токсина и перевода собираемого белка в другую буферную систему методами диализа или гель-фильтрации.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что для повышения степени антигенной чистоты препарата ботулинического нейротоксина и сокращения времени и затрат на выделение используют стадии кислотно-солевой преципитации осажденных из культуральной жидкости белков, одноэтапную гель-фильтрацию на сефакриле S-300 в условиях, обеспечивающих разрушение токсинного комплекса, чем достигается удаление основного количества примесей перекрестно реагирующих антигенов. Удаление остаточных количеств гемагглютинина из преципитата достигается на стадии адсорбционной хроматографии на гидроксиапатите, а примесей нуклеиновых кислот - ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-Sephacel.

Способ выполняется следующим образом.

Штамм-продуцент Cl. botulinum типа А выращивают в анаэробных условиях на среде, содержащей кислотный гидролизат рыбокостной муки с добавлением кукурузного экстракта. После окончания культивирования микробные клетки отделяют центрифугированием. Фугат культуральной жидкости охлаждают, подкисляют соляной кислотой, добавляют сухой сульфат аммония до конечной степени насыщения 60% и инкубируют для формирования осадка белка, который собирают центрифугированием. Для экстракции токсина одну часть полученного кислотно-солевого осадка растворяют в десяти частях по весу 0,05 М фосфатного буферного раствора (ФБР) рН 7,9. К полученному экстракту приливают насыщенный раствор сульфата аммония до конечной степени насыщения 20% и осветляют центифугированием. К надосадочной жидкости приливают насыщенный раствор сульфата аммония до конечной степени насыщения 40%. Полученную смесь центрифугируют, надосадочную жидкость декантируют, осадок ресуспендируют в ФБР рН 7,9. Белки растворяют при постоянном перемешивании на магнитной мешалке и осветляют центрифугированием. Осветленный препарат токсина наносят на гель сефакрила S-300 уравновешенный 0,025 М ФБР с 0,3 М КС1 рН 7,9, заполняющий хроматографическую колонку. Гель-фильтрацию проводят при условиях подачи в качестве элюата 0,025 М ФБР с 0,3 М КС1 посредством перистальтического насоса. Элюат собирают фракциями. Полученные фракции второго и третьего пиков анализируют в реакции диффузной преципитации (РДП) по Оухтерлони с моно- и полиспецифическими гипериммунными сыворотками к токсину типа А. Фракции, обладающие активностью не ниже 4 ЕА/мл, объединяют. Объединенные фракции наносят на уравновешенный 0,025 М ФБР рН 7,9 гидроксиапатит (ГАП), заполняют хроматографическую колонку. Гель промывают 0,05 М ФБР до экстинкции 0,01 ед. Токсин элюируют с ГАП 0,2 М ФБР рН 7,9. Полученный раствор токсина разводят в четыре раза дистиллированной водой, наносят на уравновешенную 0,025 М ФБР, рН 7,9, целлюлозу ДЕАЕ-Sephacel, заполняющую хроматографическую колонку. Белок элюируют с ионообменника 0,11 М ФБР, рН 7,9. С момента начала элюирования выходящую из колонки жидкость собирают фракциями. Полученные фракции анализируются в РДП с моно- и полиспецифическими гипериммунными сыворотками к токсину типа А. Фракции, обладающие активностью не ниже 4 ЕА/мл, объединяют.

Для сравнения эффективности заявляемого способа и прототипа получали каждым из способов препараты очищенного нейротоксина и использованием одного и того же исходного концентрата ботулинического токсина типа А.

В ходе проведения процесса учитывалось время проведения очистки препарата, оценивался выход готового продукта по общему содержанию белка, его серологической активности, электрофоретической и серологической гомогенности, токсичности. Общее содержание белка в готовых препаратах определен методом Лоури, их серологическую активность и гомогенность исследовали в реакции диффузной преципитации по Оухтерлони титрованием препаратов с шагом два с использованием моно- и полиспецифических сывороток к ботулиническим токсинам типов А, В, Е. Электрофоретическую гомогенность определяли постановкой диск-электрофореза исследуемых препаратов в градиентном полиакриламидном геле (ПААГ) (градиент концентрации 10-15%) в денатурирующих условиях в присутствии натриевой соли додецилсульфата (DS-Na). Токсичность полученных препаратов определяли титрованием на белых мышах путем внутрибрюшинной инъекции животному раствора токсина и выражали количеством LD₅₀ в 1 мл. Сравнительные исследования показывают, что заявленный способ обеспечивает по сравнению с прототипом проведение процесса приготовления очищенного препарата ботулинического токсина в значительно более короткие сроки и позволяет получать готовый препарат с большей токсичностью и серологической активностью (Табл. 1).

Положительный эффект получен благодаря тому, что при использовании заявленного способа выделение гомогенного нейротоксина происходит с использованием всего трех этапов хроматографической очистки. Предлагаемый порядок операций позволил полностью отказаться от дополнительного этапа перевода частично очищенного ботулинического токсина в другую буферную систему. Условия проведения операций очистки и сокращение продолжительности выполнения методики позволило значительно сократить потери белка на этапе хроматографического процесса, а также и токсической и серологической активности конечного продукта (Табл. 1).

Возможность осуществления заявляемого способа подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Выделение очищенного препарата ботулинического токсина типа А из культур Cl. botulinum штамма 98А. Препарат выделяли из 14 литров 6-суточной культуры Cl. botulinum производственного штамма 98А, выращенной в анаэробных условиях в питательной среде на основе 1% соляно-кислотного гидролизата казеина с добавлением 2% кукурузного экстракта при температуре 34С. Культуру осветляли центрифугированием (8000 g, 20 мин, 4С). Токсин осаждали сульфатом аммония при степени насыщения 60%, отделяли от надосадочной жидкости центрифугированием при тех же условиях и гомогенизировали. Полученную пасту хранили при температуре 20С, отбирая по мере необходимости навески для очистки токсина.

Навеску концентрированной пасты массой 5 г экстрагировали в 0,05 М ФБР рН 7,9.

На каждом этапе очистки токсина определяли токсичность препарата титрованием на белых мышах, исследовали полученные препараты методом диск-электрофореза в градиентном полиакриламидном геле (ПЛАТ) (градиент концентрации 10-15%) в присутствии додецилсульфата натрия (DS-Na) в деионизирующих условиях. Проводили дробное осаждение белков токсина сульфатом аммония при конечной степени насыщения 20 и 40%. При исследовании полученного препарата методом диск-электрофореза было выявлено, что на данном этапе происходило удаление из экстракта крупномолекулярного балласта и низкомолекулярных соединений культуральной среды. При последующей гель-фильтрации осветленного препарата через сефакрил S-300 происходило полное освобождение токсина от низкомолекулярных компонентов культуральной среды. Частично очищенный токсин элюировался во фракциях второго и третьего пиков. При адсорбционной хроматографии на гидроксиапатите достигалось практически полное удаление гемагглютинина. Токсин элюировался с ГАП 0,2 М ФБР, рН 7,9, одним белковым пиком.

На последнем этапе очистки в результате ионообменной хроматографии на целлюлозе ДЕАЕ-Sephacel гомогенный препарат нейротоксина элюировался 0,11 М ФБР, рН 7,9. Удельная токсичность препарата на данном этапе составила l,810⁸ LD₅₀/мг, серологическая активность - 16 ЕА/мл.

В препарате помимо белков не зарегистрировано присутствия нуклеиновых кислот (отношение экстинкций ультрафиолетового спектра А₂₆₀/А₂₈₀=0,1). Очищенный токсин в РДП не давал линий преципитации с гипериммунными сыворотками против ботулинических токсинов других типов (В, С, Е). Из 14 литров культуральной жидкости получено 34 мг гомогенного препарата ботулинического нейротоксина типа А. При постановке РДП по Оухтерлони показано, что препарат является серологически гомогенным.

Пример 2. Выделение очищенного препарата ботулинического нейротоксина из культуры Cl. botulinum штамма 316. (Токсичность культуральной жидкости, полученной на среде Китта-Тароцци составляет 0,510⁵ LD₅₀/мл). Этапы выполнения способа очистки ботулинического токсина являются аналогичными приведенным в примере 1. При гель-фильтрации токсина на сефакриле S-300 токсин содержался во фракциях только второго пика. При адсорбционной хроматографии на ГАП токсин элюировался более пологим белковым пиком. На последнем этапе очистки препарат обладал удельной токсичностью 1,110⁷ LD₅₀/мг, серологическая активность 8 ЕА/мл. Из 14 литров культуральной жидкости было получено 19 мг гомогенного ботулинического нейротоксина. При постановке РДП показано, что полученный препарат дает одну четкую линию преципитации с гомологичными гипериммунными сыворотками и не дает линий преципитации с гипериммунными сыворотками против ботулинических токсинов других типов.

Пример 3. Выделение очищенного препарата ботулинического нейротоксина из культур Cl. botulinum штамм 333 (штамм не обладает гемагглютинирующей активностью, токсичность культуральной жидкости, полученной на среде Китта-Тароцци 1,010⁶ LD₅₀/мл).

Этапы выполнения способа очистки ботулинического токсина являются аналогичными приведенным в примере 1. При гель-фильтрации концентрата токсина на сефадексе S-300 токсин определялся во фракциях только второго пика, серологическая активность фракций в среднем составляла 4 ЕА/мл. Так как на электрофореграмме в градиентном ПААГ (градиент концентрации 10-15%) в денатурирующих условиях в присутствии DS-Na после этапа гель-фильтрации на сефакриле S-300 следов гемагглютинина выявлено не было, этап хроматографии на ГАП не проводили. Полученный после гель-фильтрации раствор токсина наносили на уравновешенную 0,05 М ФБР рН 7,9 целлюлозу ДЕAE-Sephacel. Белок элюировали с ионообменника 0,11 М ФБР рН 7,9. Токсин выходил с колонки одним белковым пиком. Фракции, обладающие активностью не ниже 8 ЕА/мл, объединяли. Полученный препарат токсина обладал удельной токсичностью l,310⁸ LD₅₀/мл, серологической активностью 16 ЕА/мл. При исследовании полученного препарата в градиентном ПААГ в тех же условиях показано, что полученный препарат является гомогенным. На электрофореграмме выявлялись две белковые полосы молекулярной массы примерно 50 и 100 кДт, что соответствует молекулярной массе легкой и тяжелой цепи ботулинического токсина.

При постановке РДП полученный препарат не давал линий преципитации с гипериммунными сыворотками против ботулинических токсинов других типов. Из 14 литров культуральной жидкости получено 27 мг гомогенного ботулинического нейротоксина.

Пример 4. Получение на основе препарата гомогенного нейротоксина, выделенного по заявляемому способу, гипериммунных сывороток.

Приготовление ботулинического анатоксина. Иммунизацию кроликов проводили по ранее отработанным методикам. Через 7-8 суток после окончания срока иммунизации и осуществляли пробный забор крови из краевой ушной вены. Полученные сыворотки крови анализировали в РДП по Оухтерлони. При наличии в сыворотке специфических антител в титре 1:32 и выше осуществляли забор крови из сердца для выделения иммуноглобулинов. Цилиндр с кровью помещали в термостат и выдерживали при температуре 36-38С в течение одного часа. Образовавшуюся сыворотку сливали в центрифужные стаканы и центрифугировали в течение 30 мин 3000 об/с и t 4С. К полученной сыворотке добавляли 2% раствор сульфата натрия до конечной концентрации 0,05%. В РДП показано, что полученная сыворотка не дает линий преципитации с ботулиническими токсинами других типов.

Полученные из приготовленной моносыворотки к токсину типа А препараты иммуноглобулинов не дают перекрестных реакций с токсинами гетерологичных типов при использовании их в твердофазном иммуноферментном анализе (ТИФА) (Табл. 2).