способ выделения высокомолекулярного соматического сибиреязвенного антигена
Классы МПК: | A61K39/07 бациллы A61K35/74 бактерии |
Автор(ы): | Ермакова И.А. (RU), Липницкий А.В. (RU), Барков А.М. (RU), Евтеева Е.В. (RU) |
Патентообладатель(и): | Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2002-11-04 публикация патента:
20.06.2004 |
Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для изучения антигенной структуры сибиреязвенного микроба и идентификации различных генотипов В.anthracis. Согласно способу высокомолекулярный соматический антиген выделяют из культурального фильтрата бесплазмидного штамма В.anthracis 81/1 (tox-, сар-), который выращивают в R-среде с шуттелированием при 37
С в течение 22 ч. Дополнительную очистку соматического антигена производит при разделении КФ гель-хроматографией на сверхтонком сефакриле S 300. Соматический антиген (м.м. более 150 kDa) содержится во фракции 1, которая элюируется в свободном объеме (объеме выхода декстрана голубого) с регистрацией выхода фракции при
= 280 нм. Антиген не вызывает отека кожи при внутрикожном введении морским свинкам 0,1 мл с концентрацией белка 75 мкг/мл, а также не обуславливает защиту животных при внутримышечном введении через 2 недели 100 и 150 мкг антигена с неполным адъювантом Фрейнда и заражении животных через 21 день высоковирулентным штаммом В.anthracis 81/1. Полученный соматический антиген может быть использован для более полного изучения антигенных свойств различных генотипов В.anthracis. 1 табл., 2 ил.
Рисунок 1, Рисунок 2
![способ выделения высокомолекулярного соматического сибиреязвенного антигена, патент № 2230570](/images/patents/238/2230013/176.gif)
![способ выделения высокомолекулярного соматического сибиреязвенного антигена, патент № 2230570](/images/patents/238/2230270/955.gif)
Формула изобретения
Способ выделения высокомолекулярного соматического сибиреязвенного антигена, включающий культивирование клеток Bacillus anthracis, отделение клеток и выделение антигена, отличающийся тем, что бесплазмидный штамм Bacillus anthracis 81/1 TR (pX01-, рХ02-) выращивают в R-среде с шуттелированием при 37![способ выделения высокомолекулярного соматического сибиреязвенного антигена, патент № 2230570](/images/patents/238/2230013/176.gif)
![способ выделения высокомолекулярного соматического сибиреязвенного антигена, патент № 2230570](/images/patents/238/2230270/955.gif)
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для изучения антигенной структуры сибиреязвенного микроба и идентификации различных генотипов Bacillus anthracis.Известно, что соматические антигены B.anthracis являются перспективными для разработки видоспецифических диагностических препаратов. Эти антигены выделяют чаще всего из клеток и культуральных фильтратов (КФ) авирулентных токсинпродуцирующих штаммов В.anthracis (tox+ cap") (Безносов М.В., Петров Г.А. Способ получения сибиреязвенного эндоантигена. - Изобретение №1503102, 1987 г.; Ezzel J.W., Abshire J.G. Immunological analysis of cell-associated antigens B.anthracis // Inf.Immun. - 1988. - Vol. 56, №2. - P.349-356; Барков А.М., Липницкий А.В., Евтеева Е.В. Выделение и антигенная характеристика компонентов культурального фильтрата Bacillus anthracis // Биотехнология. - 2000.-№6. - С.27-33).Недостатками приведенных способов являлись сложность и много-этапность выделения, использование методов, вызывающих денатурацию белка, низкий выход антигенов. При этом не были получены достаточно очищенные антигены, что снижало специфичность диагностических препаратов.Наиболее близким аналогом предлагаемого способа является заявка на изобретение №2001118137/13 (019157) (Способ получения сыворотки для идентификации возбудителя сибирской язвы. Барков А.М., Липницкий А.В., Евтеева Е.В.), на которую получено решение о выдаче патента на изобретение.Цель изобретения - целенаправленное выделение высокомолекулярного соматического антигена B.anthracis, необходимого для более полного изучения антигенных свойств этого микроорганизма и идентификации различных генотипов B.anthracis.Поставленная цель достигается тем, что высокомолекулярный соматический антиген выделяют из КФ бесплазмидного штамма B. anthracis 81/ITR (tox-, cap-), что исключает наличие в нем антигенов, относящихся к сибиреязвенному токсину и капсуле, и способствует более высокому выходу соматического антигена.Дополнительная очистка антигена производится при разделении КФ гель-хроматографией на сверхтонком сефакриле S 300.Отбирают фракцию 1, которая элюируется в свободном объеме (объем декстрана голубого) и представлена белковым компонентом (м.м. > 150 кDа) КФ B.anthracis 81/ITR.При внутрикожном введении 0,1 мл этой фракции с концентрацией белка 72 мкг/мл тест на отекогенность был отрицательным, она не обладала протективными свойствами, в отличие от фракции 5 КФ токсинпродуцирующего штамма B.anthracis СТИ, которая при внутрикожном введении 80 мкг белка в 1 мл вызывала отек кожи, а при двукратном внутримышечном введении морским свинкам 100 и 150 мкг белка с неполным адъювантом Фрейнда обуславливала защиту животных при заражении высоковирулентным штаммом B.anthracis 81/1.Антисыворотки к антигенам фракции 1 в реакции иммунодиффузии (РИД) образовывали зону преципитата, не идентичную зонам, формируемым антисывороткой к фракции 5 токсинпродуцирующего штамма B.anthracis СТИ.Эритроцитарный диагностикум, полученный с использованием иммуноглобулинов антисыворотки к фракции 1, выявлял 25-3,1 мкг белка в 1 мл в КФ различных генотипов B.anthracis, в то время как эритроцитарный диагностикум, полученный на основе иммуноглобулинов антисыворотки к фракции 5 КФ B.anthracis СТИ, был активен только с КФ токсинпродуцирующего штамма с чувствительностью 0,75 мкг белка в 1 мл.Результаты изучения физических, биологических, антигенных свойств дали основание считать, что фракция I КФ B.anthracis 81/ITR представлена высокомолекулярным соматическим антигеном, а антисыворотка и эритроцитарный иммуноглобулиновый диагностикум пригодны для идентификации различных генотипов B.anthracis.Примеры конкретного выполнения, подтверждающие осуществление предлагаемого способа.Пример I. Получение бесклеточного культурального фильтрата B.anthracis 81/ITR.Суточные агаровые культуры B.anthracis 81/ITR и B.anthracis СТИ засевали раздельно в десять 500 мл колб с 200 мл R-среды (Ristrooh J.D., Ivins В. Elaboration of Bacillus anthracis antigens in a new, defined culture medium. Inf/ Immun. - 1983. - V.39, №1. - P. 483-486) до содержания 104-105 м.к./мл. Выращивали при 37![способ выделения высокомолекулярного соматического сибиреязвенного антигена, патент № 2230570](/images/patents/238/2230013/176.gif)
![способ выделения высокомолекулярного соматического сибиреязвенного антигена, патент № 2230570](/images/patents/238/2230013/176.gif)
![способ выделения высокомолекулярного соматического сибиреязвенного антигена, патент № 2230570](/images/patents/238/2230071/215.gif)
![способ выделения высокомолекулярного соматического сибиреязвенного антигена, патент № 2230570](/images/patents/238/2230570/2230570-2t.gif)