вакцина культуральная инактивированная против хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота

Формула изобретения

Вакцина против хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота культуральная инактивированная, содержащая антиген хламидий, адъювант и инактиватор, отличающаяся тем, что в качестве антигена она содержит суспензию клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК), инфицированных хламидиями штамма Chlamydia psittaci (var.bovis) ВГНКИ “В-75” №18 с титром не ниже 10^-7 ТЦД_50/мл, инактиватор - фенол и адъювант - поливинилпирролидон при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:

Суспензия клеток ФЭК, инфицированных

хламидиями штамма Chlamydia psittaci

(var.bovis) ВГНКИ “В-75” №18, с титром

не ниже 10^-7 ТЦД_50/мл 99,0-99,5

Фенол 0,3-0,5

Поливинилпирролидон 0,4-0,6

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и вирусологии, в частности к производству вакцин, применяемых для специфической профилактики и терапии сельскохозяйственных животных от заболевания хламидиозом. Вакцина содержит в качестве антигена цитопатогенный штамм Chlamydia psittaci (var. bovis) ВГНКИ "В-75" №18, выращенный на монослое первичной культуры клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) с титром не ниже 10^-7 ТЦД_50/мл. Вакцина также содержит инактиватор - фенол и адъювант - поливинилпирролидон. Вакцина специфична, высокоиммуногенна и имеет низкую реактивность.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и вирусологии, в частности к производству вакцин, применяемых для специфической профилактики и терапии сельскохозяйственных животных от заболевания хламидиозом.

Известна вакцина против энзоотического аборта овец инактивированная, изготовленная из зараженных хламидиями куриных эмбрионов (Franc et al. Am. j. Vet. Pec., Vol. 29, p. 1441, 1968). Недостатком данной вакцины являются ее высокая стоимость, ее изготовление требует больших затрат времени, высокое содержание баластных белков, снижающее ее иммуногенность и повышающее реактогенность. Эта вакцина не содержит специфического антигена и поэтому неиммуногенна для птиц. Данная вакцина выбрана нами в качестве прототипа.

Наиболее близким по технической сущности является патент США №4386065, А 61 К 39/118, 1983. "Вакцина против энзоотического аборта овец", которая включает в себя смесь водной суспензии, инактивированных формалином хламидийных элементарных телец, полученных из организмов chlamydia SP в пределах от 2*10⁶ до 10⁹ ELD_50/мл, размноженных в клеточной культуре и равного количества маслянного адъюванта, представляющего собой смесь светлого минерального масла и ланолина.

Недостатком этой вакцины является то, что штамм хламидий как продуцент не обладает цитопатическим действием. Вследствие этого для контроля накопления хламидий необходимо ежедневно готовить мазки, производить их окраску и подсчет зараженных клеток, а при сборе сырья требуется инфицированный монослой отделить от ростовой поверхности с помощью трипсина с верстном. Для создания нужной концентрации хламидий в вакцине культуральную суспензию подвергают центрифугированию. К тому же один стационарный монослой используется как посевной материал только для пяти чистых монослоев или их эквивалентов. Все эти операции усложняют технологический процесс производства и снижают производительность при изготовлении вакцины, что делает ее дороже. К тому же вакцина профилактирует только энзоотические аборты хламидиозной природы у овец и не профилактирует хламидиоз у крупного и мелкого рогатого скота.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей данного изобретения является создание специфичной, высокоиммуногенной вакцины для профилактики хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота, имеющей низкую реактогенность и получаемой более простым (в сравнении с прототипом) технологическим способом.

Поставленная задача достигнута благодаря тому, что вакцина культуральная инактивированная против хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота в качестве антигена содержит цитопатогенный штамм Chlamydia psittaci (var. bovis) ВГНКИ "В-75" №18, выращенный на монослое первичной культуры клеток фибробластов эмбрионов кур с титром не ниже 10^-7 ТЦЦ_50/мл, в качестве адъюванта - поливинилпирролидон, а также фенол при следующих процентных соотношениях:

1. Суспензия клеток ФЭК (фибробластов эмбрионов кур), инфицированных хламидиями штамма Chlamydia psittaci (var. bovis) ВГНКИ "В-75" №18 с титром не ниже 10^-7,0 ТЦД_50/мл - 99-99,5.

2. Фенол - 0,3-0,5.

3. Поливинилпирролидон - 0,4-0,6.

Существенным отличием данной вакцины от ее прототипа является то, что в качестве антигена берут штамм Chlamydia psittaci (var. bovis) ВГНКИ "В-75" №18, депонированный в коллекцию ВГНКИ ветпрепаратов. Выращивание его ведется на монослое первичной культуры ФЭК.

Целью изобретения является получение штамма Chlamydia psittaci (var. bovis) ВГНКИ "В-75" №18, обладающего стабильными иммуногенными свойствами, незначительной реактогенностью и высоким цитопатическим действием. Вакцинация инактивированной вакциной, изготовленной из штамма Chlamydia psittaci (var. bovis) ВГНКИ "В-75" №18, стельных коров при внутримышечном двукратном введении в дозе 10 мл обеспечивает сохранность новорожденных телят на 93,3% против 43,6% у невакцинированных контрольных животных (2 табл.). Целью изобретения является получение штамма Chlamydia psittaci (var. bovis) ВГНКИ "В-75" №18, обладающего стабильными иммуногенными свойствами, незначительной реактогенностью и высоким цитопатическим действием.

Штамм Chlamydia psittaci (var. bovis) ВГНКИ "В-75" №18 депонирован в коллекции Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов под номером 14.

Штамм Chlamydia psittaci (var. bovis) ВГНКИ "В-75" №18 выделен в 1975 г. из абортированного плода коровы, адаптирован к монослою фибробластов эмбрионов кур (ФЭК). Штамм пассирован через организм теленка и прошел 319 пасскажей в монослое культуры ФЭК в условиях роллера, в результате чего изменились его первоначальные свойства: возросла способность накопления, выражающаяся в эмбриональных летальных дозах (ЭЛД_50/03 мл) в указанной культуре, ускорился цикл развития цитоплазматических включений, в связи с чем появилась способность штамма оказывать высокое цитопатическое действие на монослой культуры (ФЭК), наряду с этим устойчиво повысилась иммуногенная активность и снизилась реактогенность.

Штамм бактерий Chlamydia psittaci (var. bovis) ВГНКИ "В-75" №18 обладает следующими свойствами.

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ. Элементарные зрелые частицы округлой формы, диаметром 180-200 нм, инициальные промежуточные формы - до 500-600 нм окрашиваются по методу Стемпа в розово-красный цвет, по Романовскому-Гимза в темно-голубой цвет.

КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА. Культивируется в желточных оболочках 7-8-дневных куриных эмбрионов, в культуре фибробластов эмбрионов кур, в перевиваемой линии трахеи теленка при 37-37,5С; пассируется на белых мышах при внутрибрюшинном, назальном, интрацеребральном и подкожном заражении.

АДАПТАЦИОННЫЕ СВОЙСТВА. Штамм - возбудитель хламидиоза коров, адаптируется к куриным эмбрионам, сохраняя патогенность для коров, а адаптируясь на культуре куриных фибробластов, повышает вирулентность и иммуногенность, при этом титр при титрации на 6-7-дневных куриных эмбрионах составляет 10^6,5-10^7,5 ЭЛД_50/03 мл и сокращается время цикла развития.

ПАТОГЕННЫЕ СВОЙСТВА. Штамм патогенен для морских свинок, вызывает у них аборты, рождение мертвых детенышей и гибель части зараженных животных, патогенен для белых мышей, вызывает заболевание и 100% гибель на 4-6 сутки при интрацеребральном введении.

АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА. В постановке перекрестной реакции связывания комплемента с гомологичными и гетерологичными антигенами и гипериммунными сыворотками установлено высокое антигенное родство к гомологичному антигену в тигре 1:40-1:80 (в реакции связывания комплемента (РСК) по 100% гемолизу). Антигенная близость к другим видам антигенов хламидий на 3-4 разведения отстоит дальше.

ТАКСОНОМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. Согласно решению Юридической комиссии Международной Ассоциации Микробиологических обществ (МАМО) с 1 января 1980 г. определение рассматриваемых микроорганизмов, как Chlamydia, стало обязательным. В соответствии с "The Shorter Bergey"s manual of determinative" (1980), хламидии отнесены к царству Procaryotae, отделу 2 прокариотов, индифферентных к свету, т.е. "скотобактериям", классу 2 Ricketsia. В класс Ricketsia включены порядки 1 Ricketsialesn 2 Chamydiales. Семейство Chlamydiaceae, роду Chlamydia, в котором описаны 4 вида: Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pecorum, Chlamydia Pneumoniae. Все виды хламидий гетерогенны.

ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА. Пример 1. В опыте было завакцинировано 24 белые мыши инактивированной вакциной, изготовленной из штамма "SR". Вакцину вводят подкожно в дозе 0,2 мл.

Подтитрованным контрольным штаммам "Р" в дозе 0,3 мл с титром 10^6,0 ЛД_50/0,3 мл через 14 дней после первого введения вакцуины 12 опытных и 12 контрольных белых мышей заражают подкожно. Через 20 дней после введения вакцины также заражают 12 вакцинированных и 12 невакцинированных белых мышей. Результаты представлены в табл. 1.

В табл. 1 показано, что штамм Chlamydia psittaci (var. bovis) ВГНКИ "В-75" №18 обладает иммуногенными свойствами, что позволяет использовать его для изготовления инактивированной вакцины против хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота.

Пример 2. Приготовленную инактивированную вакцину против хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота из штамма Chlamydia psittaci (var. bovis) ВГНКИ "В-75" №18 испытывают в опытах на коровах.

Вакцину вводят внутримышечно, двукратно с интервалом в 6 дней, в дозе 10 мл шести стельным клинически здоровым коровам. В качестве контроля используют 6 стельных невакцинированных коров. Вакцинированные и контрольные животные через 24 дня заражаются внутрибрюшинно суспензией хламидий, изолированных из паренхиматозных органов мертворожденного теленка, в титре 10⁷ ЭЛД₅₀ и в объеме 20 мл. Результаты иммуногенности вакцины представлены в табл. 2

Таким образом, вакцина, изготовленная из штамма Chlamydia psittaci (var. bovis) ВГНКИ "В-75" №18, обеспечивает у вакцинированных коров сохранность поросят 93,3% против 43,6% у невакцинированных животных.

Вторым существенным отличием является то, что в качестве адъюванта в вакцину вводят поливинилпиролидон (ПВП). Поливинилпиролидон - белый порошок, хорошо растворимый в воде, применяется как пролонгатор лекарственных средств. Ему присуще дезинтоксическое и противовоспалительное действие. В нашем препарате ПВП существенно повышает иммуногенность вакцины за счет того, что связывает (адсорбирует) антигенные белки.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый состав вакцины отличается от известного введением новых компонентов, а именно нового штамма Chlamydia psittaci (var. bovis) ВГНКИ "В-75" №18 с титром не менее 10^-7,0 ТЦД_50/мл и поливинилпирролидона в качестве адъюванта, а также соотношением компонентов.

Таким образом, заявляемое техническое решение является новым. Введение в качестве адъюванта поливинилпирралидона существенно повышает иммуногенность вакцины по сравнению с вакциной, содержащей в качестве адъюванта вазелиновое масло. Для доказательства был проведен следующий опыт. Восьми морским свинкам вводилась культуральная инактивированная вакцина, изготовленная из штамма Chlamydia psittaci (var. bovis) ВГНКИ "В-75" №18, содержащая в качестве адъюванта вазелиновое масло, и восьми - вакцина, содержащая в качестве адъюванта поливинилпирролидон. Вакцина вводилась подкожно, трехкратно с интервалом 7 дней в дозе 0,2 мл. Иммуногенность вакцины оценивалась по результатам РСК (с сывороткой крови опытных морских свинок, взятой через 20 дней после последнего введения вакцины). Результаты представлены в табл. 3.

Из табл. 3 следует, что иммуногенность вакцины с поливинилпирролидоном, используемым в качестве адъюванта, значительно выше, чем вакцины с вазелиновым маслом, использованным в качестве адъюванта.

Таким образом, данный состав компонентов придает вакцине новые свойства, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию "изобретательский уровень".

Пример 1. (Оптимальный вариант).

Приготовление культуры клеток ФЭК, заражение ее хламидиями производили по общепринятой методике (Л.П.Дьяконов и др. Культивирование клеток и тканей животных. Часть 1, Ставрополь, 1986). Затем суспензию клеток ФЭК, инфицированных хламидиями штамма Chlamydia psittaci (var. bovis) ВГНКИ "В-75" №18, подвергали контрольным высевам на бактериальную и грибковую контаминацию. После этого чистую, не контаминированную, суспензию брали для определения титра ТЦД_50/мл. Титр определяли по общепринятой методике и подсчитывали по методу Рида и Менча. В данном примере он равен 10^-7,0 ТЦД_50/мл.

Затем смешивали компоненты в следующих соотношениях суспензии клеток ФЭК: инфицированных хламидиями 99,1%; фенол 0,35 мас.%; поливинилпирролидона 0,55 мас.%. Полученную смесь выдерживали в течение 96 часов при температуре +10С.

Далее проводили выборочный контроль на иммуногенность. Для этого брали восемь морских свинок и вводили им вакцину по следующей схеме:

1-е введение - подкожно 0,2 мл;

2-е введение - подкожно через 7 суток 0,2 мл;

3-е введение - подкожно через 14 суток 0,2 мл.

Контролем служили четыре морских свинки, которым вакцина не вводилась. Через три недели после последнего введения вакцины определяли уровень накопления антител в сыворотке крови морских свинок в реакции связывания комплемента (РСК). Результат: четыре креста в разведении 1:5, четыре - в разведении 1:10; два - в разведении 1:20.

Аналогично делали для титра 7,5; 7,75; 6,5; 6,0; 5,5 ТЦД_50/мл. Сведения приведены в табл. 3.

Таким оброзом, титр хламидийного штамма 7,0 обеспечивает высокое накопление антител в сыворотке крови морских свинок. Вакцина с качеством, приведенными в примерах 1, 4, 5, считается пригодной для применения на крупном и мелком рогатом скоте. В целях экономии штамного материала при получении титра выше 7,8 ТЦД_50/мл суспензия разводится питательной средой ГЛА до титра, приведенного в примерах 1, 4, 5. Титр штамма ниже 6,5 ТЦД_50/мл (пример 6) не обеспечивает необходимого накопления хламидий и не применяется для иммунизации морских свинок.

В данном опыте отчетливо видна зависимость титра антител в сыворотке крови морских свинок от титра штамма Chlamydia psittaci (var. bovis) ВГНКИ "В-75" №18. Этот тест взят нами в качестве контроля иммуногенности вакцины при ее изготовлении.

Пример 7. Приготовление культуры клеток ФЭК, заражение ее хламидиями, выращивание и накопление их производили по общепринятой методике. Затем суспензию клеток ФЭК, инфицированных хламидиями штамма Chlamydia psittaci (var. bovis) ВГНКИ В-75" №18, подвергали контрольным высевам для проверки на бактериальную и грибковую контаминацию и одновременно определяли усредненный титр ТЦД_50/мл, который в данном примере равен 10^-7,2 ТЦД_50/мл.

Чистую, неконтаминированную бактериальной и грибковой флорой клеточную хламидийную суспензию, объединяли в общую стерильную емкость и проводили инактивацию хламидий фенолом. Для этого в емкости смешивали компоненты в следующем соотношении: суспензии клеток ФЭК, инфицированных хламидиями, брали 99,2 мас.%, а инактиватора (фенола) добавляли 0,4 мас.%. Полученную смесь выдерживали в течение 98 часов при температуре +10С. Затем добавляли 0,4 мас.% адъюванта (поливинилпирролидона). Затем проводили выборочный контроль на полноту инактивации. Для этого 10 развивающимся куриным эмбрионам 7-ми суточной инкубации стерильно вводили в полость желточного мешка 0,3 мл вакцины и инкубировали их при 37,0-37,5 в течение 12 суток. В качестве контроля использовали 10 эмбрионов, которым вводили не инактивированную клеточную взвесь, содержащую штамм Chlamydia psittaci (var. bovis) ВГНКИ "В-75" №18. Условия инкубации такие же. Опытные эмбрионы оставались живыми в течение 12 суток. В мазках-отпечатках, изготовленных из оболочек желточного мешка, окрашенных по методу Романовского-Гимза, хламидий не обнаруживалось. Контрольные эмбрионы пали на 5-7 сутки. Этот результат соответствует установленному контролю вакцины на полноту инактивации.

Аналогично делали для следующих количеств фенола: 0,3; 0,2; 0,5; 0,6 мас.%. Результаты приведены в табл. 4. Исходя из данных приведенных в табл. 4, видно, что количество инактиватора в интервале от 0,3 до 0,5 мас.% обеспечивает полноту инактивации хламидий в суспензии. Выше 0,5 мас.% фенол не добавляют с целью его экономии, т.к. качества вакцины это не улучшает. Концентрацию инактиватора ниже 0,3 мас.% не допускают, т.к. это не обеспечивает полной инактивации хламидий.

Пример 12. Приготовление культуры ФЭК, заражение ее хламидиями, их выращивание и накопление производили по общепринятой методике. Затем суспензию клеток ФЭК, инфицированных хламидиями штамма Chlamydia psittaci (var. bovis) ВГНКИ "В-75" №18, подвергали контрольным высевам для проверки на бактериальную и грибковую контаминацию. Если тест оказывался отрицательным, то выборочно определяли титр ТЦД_50/мл, который в этом примере равен 7,3 ТЦД_50/мл. Затем смешивали компоненты в следующих соотношениях: суспензия клеток, инфицированных хламидиями, брали 99,3 мас.%, фенола - 0,3 мас.% (смесь выдерживали 10 часов при -6С), поливинилпирролидона вводили 0,4 мас.%. Процесс вели следующим образом: навеску адъюванта и инактивированную суспензию клеток, содержащую антиген штамма Chlamydia psittaci (var. bovis) ВГНКИ "В-75" №18, оставляли при комнатной температуре до его полного растворения - 24 часа. Затем проводили контроль на иммуногенность так же, как в примере 1. Результат следующий: в разведении 1:5 - ++++; в разведении 1:10 - ++++; в разведении 1:20 - ++. Аналогично делали для 0,3 мас.%. Результаты приведены в табл. 5.

Как указано в табл. 5, содержание адъюванта в интервале значений от 0,4 до 0,6 мас.% обеспечивает иммуногенность вакцины в соответствии с установленным контролем. Количество адъюванта, превышающее 0,6 мас.%, не применяется с целью его экономии.

Существенного улучшения качества вакцины при увеличении содержания в ней адъюванта свыше 0,6 мас.% не происходит. Содержание адъюванта ниже 0,4 мас.% не допускается, т.к. иммуногенность такой вакцины ниже установленного контроля вакцины и она не вызывает надежного иммунного ответа у коров и овец.

Пример 17. Приготовление культуры клеток ФЭК, заражение ее хламидиями, их выращивание и накопление проводили по общепринятой методике. Затем суспензию клеток ФЭК, инфицированных штаммом Chlamydia psittaci (var. bovis) ВГНКИ "В-75" №18, подвергали контрольным высевам для проверки на бактериальную и грибковую контаминацию. При отрицательном результате теста определяли средний титр ТЦД_50/мл, который в этом примере равен 7,4 ТЦД_50/мл. Затем смешивали компоненты в следующих соотношениях: суспензии клеток ФЭК, инфицированных хламидиями, брали 99,25 мас.%; фенола - 0,35 мас.%; поливинилпирролидона - 0,4 мас.%. Далее проводили контроль на иммуногенность, как в примере 1. Результаты РСК следующие: в разведении 1:5 - ++++; в разведении 1:10 - ++++; в разведении 1:20 - +++. Аналогично делали для 99, 98, 99,5 и 99,7 мас.% суспензии клеток ФЭК, инфицированных штаммом Chlamydia psittaci (var. bovis) ВГНКИ "В-75" №18. Результат представлен в табл. 6.

Как указано в табл. 6, содержание суспензии клеток ФЭК инфицированных хламидиями штамма Chlamydia (var. bovis) ВГНКИ "8-75" №18 в пределах от 99,0 до 99,5 мас.% обеспечивает иммуногенность вакцины в соответствии ее контролем. Количество культуральной клеточной суспензии выше 99,5 мас.% не применяется, т.к. это не улучшает качество вакцины, а увеличивает расход ее дорогостоящих компонентов. Использование культуральной клеточной суспензии в количестве ниже 99,0 мас.% также не допускается, т.к. вакцина при этом не обладает иммуногенностью, соответствующей установленному контролю вакцины, и не вызывает развития надежного иммунитета у крупного и мелкого рогатого скота.

Лечебные свойства вакцины выявлены в опыте по определению иммунологических показателей крови у стельных коров, больных хламидиозом, до и после применения вакцины. Результаты представлены в табл. 7. В табл. 8 - контроль. Исследования иммунологических показателей крови контрольной группа не вакцинированных животных - благополучных по хламидиозу, представлены в табл. 8.

Среди вакцинированных против хламидиоза коров через 1 месяц после обработки значительно снижается количество животных с иммунодефицитом. У не вакцинированных здоровых коров этот процесс выражен значительно слабее. У вакцинированных телят также улучшается иммунный статус, в отличие от невакцинированных (см. табл. 9 и 10).

Таким образом, нами было доказано, что вакцина культуральная, инактивированная против хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота, не только профилактирует заболевание, но и обладает лечебным действием и может применяться на больных хламидиозом животных.

ТЕХНИЧЕСКИЙ РЕЗУЛЬТАТ

Вакцина профилактирует и лечит хламидиоз у крупного и мелкого рогатого скота, проявляющийся у коров (овец) хроническим бесплодием (удлиненный сервис-период и аритмию полового цикла), выкидышами, абортами, рождением мертвого приплода, рождением клинически больного и латентно инфицированного молодняка, хроническими пневмониями.

У телят (ягнят): энтериты, бурситы, бронхопневмонии, задержка роста и развития на фоне иммунодифицита.

У быков (баранов) производителей: хронические пневмонии, артриты, бурситы, воспаления семенного канатика.

Кроме того, вакцина сокращает загрязнение окружающей среды хламидиями, являющимися антропозоонозами, а также снижает затраты неблагополучного хозяйства на проведение малоэффективных лечебно-профилактических мероприятий с применением антибиотиков и других лечебных средств. Вакцина безвредна. В целом эффективность вакцины составляет 90-93%.

Источники информации

1. Л.П.Дьяконов, В.Ф.Глухов и др. Культивирование клеток и тканей животных. Учебно-методическое пособие (ч. 1). - Ставрополь, 1986.

2. Описание к патенту США №4386065, МКИ А 61 К 39/1983.

3. А.с. №645369, з.№2528058, МКИ С 12 К 5/00.

4. А.с. №660390, з.№2528670, МКИ С 12 К 5/00.

5. А.с. №661017, з.№2528672, МКИ С 12 К 5/00.

6. А.с. №666203, з.№2528672, МКИ С 12 К 5/00.

7. А.с. №666202, з.№2528669, МКИ С 12 К 5/00.

8. А.с. №655160, з.№2528668, МКИ С 12 К 5/00.

9. Описание к патенту №2125465.