комбинированная вакцина для иммунопрофилактики вирусного гепатита в и д, столбняка и дифтерии

Формула изобретения

1. Комбинированная вакцина для иммунопрофилактики вирусного гепатита В и Д, столбняка и дифтерии, содержащая антигены вируса гепатита В (HBsAg), дифтерии и столбняка, мертиолят, гель алюминия гидроксида и растворитель, отличающаяся тем, что в качестве антигена вируса гепатита В вакцина содержит HBsAg/ayw, полученный культивированием штамма дрожжей Pichia angusta VKM Y-2924D и/или HBsAg/adw, полученный культивированием штамма дрожжей Hansenula Polymorpha VKPM Y-2412, а в качестве растворителя 0,9%-ный раствор натрия хлорида при следующих количествах компонентов:

Поверхностный антиген

вируса гепатита В

(HBsAg/ayw), полученный

культивированием

штамма дрожжей

Pichia angusta VKM Y-2924D,

и/или поверхностный

антиген вируса гепатита

В (HBsAg/adw), полученный

культивированием штамма

дрожжей H.Polymorpha

VKPMY-2412 5-10 мкг HbsAg

Дифтерийный анатоксин 5-10 Lf

Столбнячный анатоксин 5-7,5 ЕС

Гель алюминия гидроксида (Аl³⁺) 0,35-0,55 мг

Мертиолят 15-35 мкг

0,9%-ный Раствор натрия

хлорида До 0,5 мл

2. Комбинированная вакцина для иммунопрофилактики вирусного гепатита В и Д, столбняка и дифтерии по п.1, отличающаяся тем, что поверхностные антигены вируса гепатита В (HBsAg/ayw) и (HBsAg/adw) содержатся в соотношении 1:1.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к разработке новых ассоциированных вакцин, содержащих в одном препарате несколько антигенов, что обеспечивает возможность проведения одновременно иммунизации против возбудителей нескольких заболеваний.

Развитие вакцинологии и прививочного дела привело к существенному возрастанию количества прививок, получаемых каждым индивидуумом.

Одномоментная вакцинация, не сопровождающаяся угнетением иммунного ответа на какой-либо из антигенов, либо повышением реактогенности, позволяет не только более успешно реализовывать проведение прививок в декретированные сроки, но и снизить загруженность медицинских работников. Вместе с тем при одновременной вакцинации остаются нерешенными такие вопросы, как возможность использования трех и более препаратов, избыточная инокуляция сорбента и консерванта в случае их содержания в препарате и, наконец, неизбежность проведения двух инъекций. Все эти обстоятельства определяют необходимость разработки и внедрения новых комбинированных вакцин.

Известна комбинированная вакцина против дифтерии, столбняка и гепатита В.

В дозе 0,5 мл вакцина содержит в качестве активных компонентов:

D – токсоид 25 Lf(ед);

Т – токсоид 10 Lf(ед)

HbsAg 10 мкг протеина

Поверхностный антиген вируса гепатита В представляет собой любые известные антигены поверхностного антигена вируса гепатита В или их фрагменты, проявляющие антигенность поверхностного антигена гепатита В (даны ссылки в описании патента на известные антигены).

Все антигены, кроме поверхностного антигена гепатита В, адсорбируются на гидроокиси алюминия. Поверхностный антиген гепатита В адсорбируют на фосфате алюминия. При необходимости используют в вакцине антисептик, например мертиолят, от 1:20000 до 1:10000 или 2-феноксиэтанол от 3 до 6 мг/кл.

В состав вакцины входит изотонический соляной раствор. RU, Патент № 2160120, А 61 К 39/295, 39/29, опубл. 2000 г.

Известна также комбинированная вакцина для иммунопрофилактики вирусного гепатита В и Д, столбняка и дифтерии.

Вакцина имеет следующий состав:

Антиген вируса гепатита

В (HBsAg),полученный

культивированием трансформированных

клеток штамма

S. cerevisiae ВКПМ Y-2203 5-10 мкг HBsAg

Анатоксин дифтерийный

очищенный концентрированный 5-30 Lf

Анатоксин столбнячный

очищенный концентрированный 5-10 ЕС

Мертиолят 0,010,002%

Гель алюминия

гидроксида 0,6-1,2 мг

в пересчете на алюминий

Фосфатно-солевой буфер

50 mМ Na-фосфатный буфер,

рН 6.8-0.13 М NaCl) До 1 мл

RU, Патент № 2130779, 1998, А 61 К 39/29.

Задачей изобретения является расширение арсенала средств, предназначенных для иммунопрофилактики вирусного гепатита В и Д, столбняка и дифтерии.

Поставленная задача решена путем конструирования новой высокоиммуногенной комбинированной вакцины, в которой в качестве антигена вируса гепатита В (HBsAg) содержится новый антиген вируса гепатита В (HBsAg/adw), полученный культивированием штамма дрожжей Hansenula Polymorpha VKPM Y-2412, или антиген вируса гепатита В (HBsAg/ayw), полученный культивированием штамма дрожжей Pichia angusta (Hansenula Polymorpha) VKM Y-2924D, или смесь указанных антигенов в равных количествах (соотношение 1:1).

В связи с введением с 2003 года новой классификации Hansenula Polymorpha в настоящее время обозначается как Pichia angusta.

Количество антигена или смеси антигенов вируса гепатита В в составе комбинированной вакцины составляет 5-10 мкг HBsAg в 0,5 мл раствора, являющегося прививочной дозой препарата.

Кроме того вакцина содержит:

Дифтерийный анатоксин 5-10 Lf

Столбнячный анатоксин 5-7,5 ЕС

Гель алюминия гидроксида (Al³⁺) 0,35-0,55 мг

Мертиолят (консервант) 15-35 мкг

0,9% NaCl До 0,5 мл

В отличие от известной вакцины согласно изобретению в сконструированную вакцину введен новый антиген вируса гепатита В серотипов adw и/или ayw, изменено соотношение активных ингредиентов из-за выявленного потенцирующего эффекта и значительно уменьшено количество растворителя.

При разработке новой вакцины требовалось соединить несколько антигенов (один из них новый) в одном инъекционном препарате таким образом, чтобы новая комбинация компонентов, взятых в определенных количествах, не снижала безопасности и иммуногенности вновь созданного иммунобиологического препарата, а также его эпидемиологической эффективности.

Проведенные исследования показали, что созданный препарат обладает широкими возможностями использования при высокой иммуногенной активности, нетоксичности и отсутствии каких-либо побочных реакций.

Новый комбинированный препарат представляет собой ассоциированный на геле алюминия гидроксида поверхностный антиген вируса гепатита В и смесь очищенных от балластных белков дифтерийных и столбнячных анатоксинов, при этом обладает более широким спектром действия, чем известные ранее препараты.

При этом следует отметить, что новый комбинированный препарат является эффективным и при иммунопрофилактике вирусного гепатита Д, поскольку вирус гепатита Д не может участвовать в развитии гепатитной инфекции без одновременной репликации вируса гепатита В, и возможно предохранить от дельта-инфекции вакцинацией против вирусного гепатита В в результате образования антител к HBsAg (анти HBs).

Для выделения новых антигенов вируса гепатита В, содержащихся в вакцине, используют новые дрожжевые продуценты.

Дрожжи Pichia angusta (Hansenula Polymorpha) являются предпочтительными по сравнению с S. cerevisiae, поскольку позволяют добиваться более высоких уровней синтеза антигена при более простых способах получения культур высокой плотности.

Штаммы дрожжей Pichia angusta (Hansenula Polymorpha), являющиеся продуцентами поверхностного антигена вируса гепатита В серотипов adw и ayw, являются новыми и ни в патентной, ни в научной литературе не описаны.

Способ получения новых штаммов-продуцентов и выделение антигенов вируса гепатита В серотипов ayw и adw:

все рутинные генно-инженерные операции осуществляют согласно стандартным методикам и инструкциям компаний-производителей ферментов и наборов для манипуляций с ДНК in vitro. Для ПЦР во всех случаях использовали полимеразу Vent (NEB). Синтез олигонуклеотидов производился ЗАО “Синтол” г. Москва. В работе для получения антигена серотипа ayw использовали следующие олигонуклеотиды:

Пример 1. Получение фрагмента ДНК, кодирующего HBsAg/ayw (фрагмент А). Реакционную смесь, содержащую олигонуклеотиды 1u и 8L по 1 мкМ, олигонуклеотиды со 2u по 8u; с 1L по 7L по 10 пМ, ThermoPol буфер (10 mM KCl, 20 mМ tris-HCl рН 8.8, 10 mМ (NH₄)₂SO₄, 2 mМ MgSO₄, 0,1% Triton X-100, 250 uM dNTP) и 5 единиц активности Vent полимеразы инкубируют в течение 30 циклов изменения температуры. Каждый цикл включает инкубацию при 95С в течение 30 сек, при 50С 30 сек, при 72С 90 сек. После этого продукты реакции разделяют электрофоретически в 1% агарозном геле, и изолируют фрагмент размером 730 пар оснований. Соответствие выделенного фрагмента нужному размеру определяют также путем электрофореза в 1% агарозном геле, сравнивая его подвижность с подвижностью полос маркеров молекулярного веса.

Пример 2. Получение фрагмента геномной ДНК Pichia angusta, содержащего промотор гена МОХ (фрагмент Б).

Суспендируют 2-3 мкг клеток штамма Pichia angusta (Hansenula Polymorpha) BKM 4-2559, получен из почвы СС4 38-22-2 Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, в 0,1 мл 0,25% раствора додецилсульфата натрия и инкубируют на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Клетки осаждают центрифугированием при 10000 g 5 мин. 1 мкл полученного супернатанта добавляют к 25 мкл смеси, содержащей олигонуклеотиды moxU5 и moxL3 по 1 мкМ, ThermoPol буфер (10 mM KCl, 20 mM tris-HCl рН 8.8, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0,1% Triton X-100, 250 uM dNTP) и 5 единиц активности Vent полимеразы. Реакционную смесь инкубируют в течение 30 циклов изменения температуры. Каждый цикл включает инкубацию при 95С в течение 30 сек, при 50С 30 сек, при 72С 90 сек. После этого продукты реакции разделяют электрофоретически в 1% агарозном геле и изолируют фрагмент размером 850 пар оснований. Соответствие выделенного фрагмента нужному размеру определяют также путем электрофореза в 1% агарозном геле, сравнивая его подвижность с подвижностью полос маркеров молекулярного веса.

Пример 3. Получение фрагмента геномной ДНК Pichia angusta, содержащего часть гена TRP 3 (фрагмент В).

Суспендируют 2-3 мкг клеток штамма Pichia angusta (Hansenula Polymorpha) BKM 4-2559 в 0,1 мл 0,25% раствора додецилсульфата натрия и инкубируют на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Клетки осаждают центрифугированием при 10000 g 5 мин. 1 мкл полученного супернатанта добавляют к смеси, содержащей олигонуклеотиды trpU5 и trpL3 по 1 мкМ, ThermoPol буфер (10 mM KCl, 20 mM tris-HCl pH 8.8, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0,1% Triton Х-100, 250 uM dNTP) и 5 единиц активности Vent полимеразы. Реакционную смесь инкубируют в течение 30 циклов изменения температуры. Каждый цикл включает инкубацию при 95С в течение 30 сек, при 50С 30 сек, при 72С 120 сек, при 50С 30 сек, при 72С 120 сек. После этого продукты реакции разделяют электрофоретически в 1% агарозном геле и изолируют фрагмент размером 1360 пар оснований. Соответствие выделенного фрагмента нужному размеру определяют также путем электрофореза в 1% агарозном геле, сравнивая его подвижность с подвижностью полос маркеров молекулярного веса.

Пример 4. Получение фрагмента ДНК Pichia angusta, содержащего последовательность, кодирующую HBsAg/ayw, слитую с промотором МОХ и геном TRP 3 (фрагмент Г).

Реакционную смесь (0.05 мл), содержащую олигонуклеотиды moxU5 и trpL3 по 1 мкМ, фрагменты А, Б и В по 1 пг, ThermoPol буфер (10 mM KCl, 20 mM tris-HCl pH 8.8, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0,1% Triton X-100, 250 uM dNTP) и 5 единиц активности Vent полимеразы инкубируют в течение 30 циклов изменения температуры. Каждый цикл включает инкубацию при 95С в течение 30 сек, при 50С 30 сек, при 72С 3 мин. После этого продукты реакции разделяют электрофоретически в 1% агарозном геле и изолируют фрагмент размером 2,9 тысяч пар оснований. Соответствие выделенного фрагмента нужному размеру определяют также путем электрофореза в 1% агарозном геле, сравнивая его подвижность с подвижностью полос маркеров молекулярного веса.

Пример 5. Интеграция последовательности, кодирующей HBsAg/ayw, в геном Pichia angusta.

Штамм Pichia angusta (Hansenula Polymorpha) DLT (Agaphonov et al., 2002; коллекция штаммов лаборатории молекулярной генетики РКН ПК МЗ РФ) выращивают в течение 15-20 часов в среде YNB-D, содержащей триптофан 20 мг/л, при 37С в условиях интенсивной аэрации. 0,5 мл культуры добавляют к 30 мл такой же среды и инкубируют в тех же условиях в течение 4-х часов. Клетки собирают центрифугированием при 3000g 5 мин и суспендируют в 15 мл буфера Т (10 mМ tris-HCl pH 7.4; 100 mМ СН₃СООLi; 0.5 mМ EDTA). После инкубации в течение 30 мин при 30С клетки вновь осаждают и суспендируют в 200 мкл буфера Т. К 0,05 мл суспензии добавляют 1 мкг фрагмента Г, перемешивают, добавляют 120 мкл 70% раствора ПЭГ 4000, вновь перемешивают и инкубируют 1 час при 30С.

Трансформационную смесь инкубируют при 45С 15 мин, охлаждают до комнатной температуры и высевают на чашки Петри со средой, содержащей 50 мг/мл лейцина. Выросшие колонии трансформантов проверяют на способность расти на среде, содержащей метанол в качестве единственного источника углерода. Отбирают клоны, не способные расти на такой среде, и проверяют их на способность синтезировать HBsAg/ayw. Полученный штамм дрожжей Pichia angusta является продуцентом поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg/ayw). Штамм имеет регистрационный номер VKM Y-2924D, 25.02.2003 и депонирован в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Г.К. Скрябина.

Пример 6. Анализ способности штамма синтезировать HBsAg/ayw.

Тестируемый штамм засевают в среду YPD (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона и 2% глюкозы) и инкубируют при 37°С в течение 15-20 часов в условиях высокой аэрации. Полученную культуру разводят в пять раз средой YPM (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона и 2% метанола) и инкубируют в тех же условиях в течение 30-50 часов. Клетки из 0,5 мл культуры собирают центрифугированием, суспендируют в 0,2 мл дистиллированной воды, добавляют 0,2 мл 0,2 М NaOH и инкубируют на кипящей водяной бане 8 мин. Суспензию центрифугируют 10 мин при 10000g, после чего супернатант анализируют методом электрофореза и иммуноблоттинга с использованием антител к HBsAg/ayw. В качестве стандарта используют очищенный белок HBsAg/ayw. В дорожках соответствующих штаммам, которые синтезируют HBsAg/ayw, выявляется полоса на уровне 24-27 кДа такая же, как и в случае очищенного белка.

Пример 7. Определение последовательности гена HBsAg/ayw в геноме дрожжей.

Суспендируют 2-3 мкг клеток анализируемого штамма в 0,1 мл 0,25% раствора додецилсульфата натрия и инкубируют на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Клетки осаждают центрифугированием при 10000 g 5 мин. 1 мкл полученного супернатанта добавляют к смеси, содержащей олигонуклеотиды МОХ и TRP по 1 мкМ, ThermoPol буфер (10 mM KCl, 20 mМ tris-HCl рН 8.8, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0,1% Triton X-100, 250 uM dNTP) и 5 единиц активности Vent полимеразы. Реакционную смесь инкубируют в течение 30 циклов изменения температуры. Каждый цикл включает инкубацию при 95С в течение 30 сек, при 50С 30 сек, при 72С 2 мин. После этого продукты реакции разделяют электрофоретически в 1% агарозном геле и изолируют фрагмент размером 800 пар оснований. Фрагмент секвенируют с использованием праймеров МОХ и TRP. Совпадение результатов секвенирования с исходной последовательностью показывает отсутствие мутаций в интегрированном в геном дрожжей гене HBsAg/ayw.

Пример 8. Выделение HBsAg(ayw) из клеток Pichia angusta. После ферментации исходного штамма дрожжей Pichia angusta HBsAg выделяют согласно общепринятой методике по следующей схеме. Клетки из культуральной жидкости осаждают центрифугированием при 4000 g на центрифуге Beckman. Осажденную биомассу ресуспендируют до концентрации 250 г влажных клеток на 1 литр в буфере экстракции PBS рН 6.8 с добавлением EDTA, PMSF и Tween-20. Далее клетки разрушают в мельнице Dyno-Mill типа KDL, используя стеклянные шары диаметра 0.5-0.7 мм. Основную массу нецелевых белков из полученного гомогенизата осаждают добавлением полиэтиленгликоля (PEG) до концентрации 4.5%. Осажденные белки отделяют центрифугированием. Полученный супернатант фильтруют на ультрафильтрах (500 кДа) Pellicon. При этом отделяются белки с мол. массой меньше 500 килоДальтон, а также удаляется PEG и раствор HBs антигена переводится в буфер PBS рН 6.7. Одновременно происходит концентрирование раствора, что существенно для следующей стадии абсорбции на стекло. Посадку HBsAg на макропористое стекло (МПС) осуществляют в колонках системы StreamLine, разработанной фирмой Pharmacia (Sweden). Для удаления неспецифически связанных белков колонку промывают тем же буфером PBS. Антиген элюируют карбонатным буфером (КБ) рН 9.5. Элюат концентрируют ультрафильтрацией и разделяют при помощи ультрацентрифугирования на зональном роторе (Beckman) в градиенте глицерин/сахароза. Полученные фракции анализируют на содержание HBsAg, используя РОПГА набор и фракции, содержащие антиген, объединяют и очищают гель-фильтрацией на сорбенте Toyopearl HW-65 (ToyoSoda Corp., Japan). Чистоту полученного таким образом HBs антигена определяют методом SDS-PAGE. Если чистота продукта недостаточна (<95%), производят дополнительную очистку при помощи ионообменной хроматографии на сорбенте TSK-DEAE (ToyoSoda Corp., Japan). Выход антигена 25-30 мг с 1 л культуральной жидкости.

Полученный раствор HBsAg (ayw) анализируют рядом методов.

1. Антигенную активность измеряют наборами РОПГА (реакция обратной пассивной гемагглютинации эритроцитов) по методике производителя (НПО “Диагностические Системы”, Нижний Новгород) с использованием в качестве стандарта отраслевого стандартного образца активности HBsAg (ОСО 42-28-153-88), выпускаемого ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

2. Чистота рекомбинантного HBsAg определяется электрофорезом в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях (SDS-PAGE) с окрашиванием серебром и Coomassie Brilliant Blue R-250. Чистота выделенного антигена не <95%.

Получение штамма дрожжей Н. polymorpha VKPM Y - 2412 (депонирован в ГНИИ Генетики - продуцента поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg/adw) проводят аналогично примерам 1-5 с той лишь разницей, что в работе используют следующие олигонуклеотиды:

Выделение HBsAg/adw осуществляют аналогично примеру 8. Анализ выделенного HBsAg/adw проводят методами, описанными для антигена HBsAg/ayw.

Пример 9. Анализ способности штамма синтезировать HBsAg/adw.

Тестируемый штамм засевают в среду YPD (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона и 2% глюкозы) и инкубируют при 37С в течение 15-20 часов в условиях высокой аэрации. Полученную культуру разводят в пять раз средой YPM (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона и 2% метанола) и инкубируют в тех же условиях в течение 30-50 часов. Клетки из 0,5 мл культуры собирают центрифугированием, суспендируют в 0,2 мл дистиллированной воды, добавляют 0,2 мл 0,2 М NaOH и инкубируют 3-4 мин. Затем клетки осаждают, ресуспендируют в сэмплбуфере и инкубируют на кипящей водяной бане 8 мин. Суспензию центрифугируют 10 мин при 10000 g, после чего супернатант анализируют методом иммуноблоттинга с использованием антител к HBsAg/adw. В качестве стандарта используют очищенный белок HBsAg/adw.

Пример 10. Определение последовательности гена HBsAg/adw в геноме дрожжей.

Суспендируют 2-3 мкг клеток анализируемого штамма в 0,1 мл 0,25% раствора додецилсульфата натрия и инкубируют на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Клетки осаждают центрифугированием при 10000 g 5 мин. 1 мкл полученного супернатанта добавляют к смеси, содержащей олигонуклеотиды МОХ и TRP по 1 мкМ, ThermoPol буфер (10 mM KCl, 20 тМ tris-HCl рН 8.8, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0,1% Triton X-100, 250 uM dNTP) и 5 единиц активности Vent полимеразы. Реакционную смесь инкубируют в течение 30 циклов изменения температуры. Каждый цикл включает инкубацию при 95С в течение 30 сек, при 50С 30 сек, при 72С 2 мин. После этого продукты реакции разделяют электрофоретически в 1% агарозном геле и изолируют фрагмент размером 800 пар оснований. Фрагмент секвенируют с использованием праймеров МОХ и TRP и определяют отсутствие мутаций путем сравнения результатов с исходной последовательностью.

Полученные штаммы имеют видовые названия: Hansenula polymorpha и Pichia angusta. Наименование штаммов VKPM Y - 2412 (HBsAg/adw) и VKM Y-2924D (HBsAg/ayw).

Культурально-морфологические особенности штаммов: клетки округлой формы, небольшие по размеру; на агаризованной среде YPD образуют крупные круглые колонии с выраженной выпуклой серединой.

Активность штаммов - не менее 30 мг/л культуральной жидкости.

Хранение при -70С в виде суспензии клеток в стерильном 30-50%-ном растворе глицерина.

Генетические особенности: ауксотроф по лейцину, фаги у дрожжей не обнаружены.

Штаммы не являются зоопатогенными или фитопатогенными.

Способ определения активности: в осветленном гомогенизате клеток методом иммуноферментного анализа.

Способ, условия и состав сред для размножения штаммов: инкубирование прокачиванием при 30С в питательной среде состава: 2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы.

Условия и состав среды для ферментации: прокачивание при 291С и рН 5,0-5,5 в среде, содержащей до 10-15% глицерина и соли.

Выделенные антигены вируса гепатита В серотипов ayw и adw используют для создания комбинированных вакцин в качестве активных компонентов.

Полученные согласно изобретению вакцины могут быть представлены в нескольких вариантах:

1. В составе вакцины в качестве антигена вируса гепатита В содержится антиген серотипа ayw, полученный путем культивирования штамма дрожжей Pichia angusta VKM Y-2924D.

2. В составе вакцины в качестве антигена вируса гепатита В содержится антиген серотипа adw, полученный путем культивирования штамма дрожжей Hansenula Polymorpha VKPM Y-2412.

3. В составе вакцины в качестве антигена вируса гепатита В содержится смесь антигенов серотипов ayw и adw, взятых в равных количествах (соотношение 1:1).

Все активные компоненты комбинированной вакцины, кроме антигена вируса гепатита В, являются известными отечественными антигенами.

Способ получения комбинированной вакцины заключается в обычном смешении компонентов состава, при этом одинаково хорошие результаты могут быть получены при осуществлении способа в различных вариантах:

1. Сорбируют анатоксин дифтерийно-столбнячный (АДС) на геле гидроксида алюминия, взятом примерно в половинном его количестве, отдельно проводят сорбцию антигена вируса гепатита В (HBsAg) одного серотипа или смеси ayw и adw на другой части геля гидроксида алюминия, после чего сорбированные антигены смешивают и добавляют консервант и фармацевтически приемлемый растворитель.

2. АДС сорбируют на геле гидроксида алюминия, беря все его количество, указанное в формуле, после чего к сорбированному АДС добавляют антиген гепатита В одного серотипа или смесь антигенов 2-х серотипов и далее, как в 1 варианте.

3. Смешивают АДС с HBsAg одного серотипа или со смесью антигенов ayw и adw и затем сорбируют их на геле гидроксида алюминия, далее как в 1 варианте.

4. HBsAg одного серотипа или смесь антигенов 2-х серотипов сорбируют на геле гидроксида алюминия, затем добавляют АДС и остальные компоненты, как в первом варианте.

Проверку полноты сорбции осуществляют по реакции коагглютинации для дифтерийного и столбнячного компонентов, ИФА - для гепатитного компонента.

Конкретные примеры вакцин, полученных согласно изобретению.

1. Комбинированная вакцина для иммунопрофилактики вирусного гепатита В и Д, столбняка и дифтерии содержит:

Поверхностный антиген

вируса гепатита В

(HBsAg/ayw), полученный

культивированием

штамма дрожжей

Pichia angusta VKM Y-2924D 5 мкг

Дифтерийный анатоксин 7,5 Lf

Столбнячный анатоксин 5 ЕС

Гель алюминия гидроксида (А1³⁺) 0,5 мг

Мертиолят 25 мкг

0,9% NaCl До 0,5 мл

0,5 мл препарата является одной прививочной дозой.

2. Комбинированная вакцина для иммунопрофилактики вирусного гепатита В и Д, столбняка и дифтерии содержит:

Поверхностный антиген вируса

гепатита В (HBsAg/adw),

полученный культивированием

штамма дрожжей

Н. Polymorpha VKPM Y-2412 10 мкг

Дифтерийный анатоксин 10 Lf

Столбнячный анатоксин 7,5 ЕС

Гель алюминия гидроксида (Al³⁺) 0,35 мг

Мертиолят 15 мкг

0,9% NaCl До 0,5 мл

3. Комбинированная вакцина для иммунопрофилактики вирусного гепатита В и Д, столбняка и дифтерии содержит:

Поверхностный антиген

вируса гепатита В

(HBsAg/ayw), полученный

культивированием

штамма дрожжей

Pichia angusta VKM Y-2924D 4 мкг

Поверхностный антиген

вируса гепатита В

(HBsAg/adw), полученный

культивированием

штамма дрожжей H.PolymorphaVKPMY-2412 4 мкг

Дифтерийный анатоксин 10 Lf

Столбнячный анатоксин 5 ЕС

Гель алюминия гидроксида (А1³⁺) 0,5 мг

Мертиолят 35 мкг

0,9% NaCl До 0,5 мл

В соответствии с действующим порядком регистрации вакцин и программой исследования были проведены Государственные клинические испытания реактогенности и иммуногенности полученной вакцины у взрослых и детей.

В качестве референс-препаратов были использованы АДС-М анатоксин и вакцина против гепатита В рекомбинантная дрожжевая производства НПК “Комбиотех”.

Исследования проводились в условиях контролируемого опыта среди организованных взрослых контингентов в возрасте 16 лет и старше и организованных детей в возрасте 6 лет.

Группы наблюдения и сравнения были составлены из здоровых лиц, не болевших гепатитом В (ГВ) и дифтерией, не имевших противопоказаний к вакцинации, не вакцинированных ранее против ГВ и подлежащих возрастной ревакцинации АДС-М анатоксином при условии, что предыдущая ревакцинация против дифтерии проведена не менее 4-х лет назад.

Вакцинация осуществлялась после получения письменного информированного согласия.

Отдельно была проведена работа по изучению реактогенности и иммуногенности новой вакцины при вакцинации ослабленных детей с различной соматической патологией (14 чел.).

Реактогенность новой вакцины и иммуногенность дифтерийного и столбнячного компонентов с составе вакцины оценивали после однократного введения препарата.

Для оценки иммунологической активности HBsAg-компонента в составе новой вакцины однократно вакцинированных новой вакциной дополнительно вакцинировали двукратно (через 1 и 6 месяцев) монопрепаратом вакцины против гепатита В детской или взрослой дозой в соответствии с возрастом. Дополнительно была выделена группа взрослых, которая после вакцинации новой вакциной была двукратно привита детской дозой монопрепарата вакцины против гепатита В. Реактогенность вакцины оценивали по суммарной частоте и интенсивности местных и общих реакций (26 симптомов) на каждое введение препарата через 30 минут и далее в течение 1-5 дней после иммунизации путем опроса и осмотра места введения препарата.

Уровень антител к дифтерийному и столбнячному анатоксинам определяли с помощью иммуноферментных тест-систем для выявления противодифтерийных и противостолбнячных антител производства НПО “Биомед” (г. Пермь); уровень анти-HBs с использованием иммуноферментных тест-систем фирмы “Санофи” (Франция) и “Эбботт” (США).

Все полученные сыворотки до их исследования в ИФА были зашифрованы и сформированы в блоки. Статистическая обработка материала проведена с использованием методов вариационной статистики. Достоверность различий определяли по t-критерию Стьюдента при р<0,05.

Сравнительная оценка реактогенности новой вакцины, АДС-М и вакцины против гепатита В у взрослых выявила следующее: у 80% получивших новую вакцину не было выявлено никаких симптомов. Среди одномоментно привитых АДС-М и вакциной гепатита В число лиц с отсутствием поствакцинальных реакций составило всего лишь 52,3%. Среди отмеченных побочных эффектов в обеих группах наиболее частыми были местные реакции в виде гиперемии, отека и легкой болезненности. Общие реакции наблюдались значительно реже. Так, на новую вакцину было зарегистрировано 2 общие реакции (температура 37,0С и 37,7С) через 24 часа после первого введения вакцины.

Оценка реактогенности вакцины при иммунизации как здоровых, так и ослабленных детей подтвердила, что новая комбинированная вакцина малореактогенна. Число поствакцинальных реакций в группе привитых новой вакциной (25,9%) статистически значимо не отличалось от числа реакций в группе детей, получивших АДС-М анатоксин и вакцину против гепатита В при сочетанном введении их в разные участки тела (26,7%) (р>0,05).

Изучение иммунологической активности новой комбинированной вакцины выявило следующее: при практически одинаковом фоновом уровне противодифтерийных и противостолбнячных антител (р>0,05), после завершения первичной вакцинации иммунный ответ как на столбнячный, так и на дифтерийный компоненты вакцины у взрослых был выше, чем при использовании АДС-М (р<0,05). Следует также отметить, что в то время как при иммунизации новой вакциной отмечалось 100% нарастание титров антител по дифтерийному и столбнячному компонентам, при раздельном введении АДС-М анатоксина и вакцины против гепатита В нарастание титров наблюдалось лишь у 95% вакцинированных. До проведения вакцинации анти-HBs антитела у взрослых в 2-х группах наблюдения и группе сравнения отсутствовали. После завершения цикла вакцинации сероконверсия в первой группе сравнения составила 100%. Во второй (дополнительной) группе наблюдения удельный вес лиц с защитным уровнем антител составил 92%.

Более выраженный иммунный ответ имел место в первой группе наблюдения (средняя геометрическая титра антител составила 658,6 мМЕ/мл). Суммарная доза введенного HBs-антигена составила у нее 50 мкг. Статистически значимых различий в показателях средней геометрической титра антител во второй группе наблюдения (222,4 мМЕ/мл) и группе сравнения (273,3 мМЕ/мл) не выявлено, хотя суммарные дозы введенного HBsAg составили 30 мкг и 60 мкг соответственно. Эти данные не только подтверждают высокую иммунологическую активность новой вакцины, но и обосновывают возможность перехода к вакцинации взрослых лиц монопрепаратом вакцины против гепатита В в детской дозировке.

Оценка иммунологической активности вакцины при иммунизации детей показала, что по прошествии 1 месяца после завершения первичного курса вакцинации у всех детей как в испытуемой группе, так и в группе сравнения наблюдалось значительное нарастание уровня противодифтерийных и противостолбнячных антител (р<0,05). При этом уровень титров противостолбнячных антител в испытуемой группе статистически значимо (р<0,05) превышал соответствующий показатель в группе сравнения. В то же время, содержание противодифтерийных антител после вакцинации в группе сравнения было несколько выше, чем в первой (р<0,05), хотя по кратности нарастания титров (в 33,7 и 39,9 раза соответственно) различия были не существенными.

Иммунный ответ на HBs-компонент новой вакцины наблюдался через 1 месяц после завершения цикла вакцинации у 100% детей. При этом в группе вакцинированных новой вакциной уровень антител был значительно выше защитного (СГТ антител 13721 мМЕ/мл). При сочетанном введении препаратов уровень сероконверсии составил 95%, а СГТ - 2441 мМЕ/мл.

Исследования показали, что иммунологическая активность столбнячного, дифтерийного и гепатитного компонентов в составе комбинированного препарата выше, чем каждого из них в отдельности, что подтверждает наличие потенциирующего эффекта.

Таким образом, комбинированная вакцина для профилактики дифтерии, столбняка и гепатита Д и В характеризуется слабой реактогенностью, безопасностью и высокой иммуногенностью.