способ приготовления вискоэластичного протектора эндотелия роговицы

Формула изобретения

1. Способ приготовления вискоэластичного протектора эндотелия роговицы, включающий растворение натрия гиалуроната в фосфатном буфере и стерилизацию, отличающийся тем, что раствор гиалуроната натрия получают с помощью бактериальной ферментации, его исходный раствор готовят с избыточной вязкостью, а после фильтрации осуществляют стерилизацию автоклавированием до получения требуемого значения вязкости.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что автоклавирование проводят при 120^оС в течение 8 мин.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к химии природных соединений, в частности к способу приготовления вискоэластичного протектора эндотелия роговицы на основе натрия гиалуроната в сбалансированном фосфатном буфере, и может быть использовано в производстве вискоэластиков для офтальмологии.

При различных видах офтальмологического хирургического вмешательства, таких как имплантация интраокулярных линз, хирургия катаракты, отслойки сетчатки и т.п., возникает необходимость использования вязких гелеобразных композиций (вискоэластичных протекторов эндотелия роговицы или вискоэластиков), чтобы заполнить камеры глаза и тем самым защитить чувствительные ткани, в частности эндотелий роговицы от травмирования. Наиболее широко используемыми вискоэластиками являются растворы натрия гиалуроната, хондроитин сульфата и метилцеллюлозы. Одним из лучших вискоэластиков является раствор натрия гиалуроната в сбалансированном солевом буфере. В мировой практике широко применяются следующие вискоэластичные протекторы на основе натрия гиалуроната: "Vislube" (Chemedica AG, Германия); "Amvisc", "Amvisc plus" (Chiron vision, Франция); "Oculocrom" (Croma Pharma GmbH, Австрия); "Healon" (Pharmacia & Upjohn, Швеция). В офтальмологии применяются стерильные вискоэластики, однако стерилизация растворов натрия гиалуроната представляет известную сложность.

Известен способ стерилизации растворов натрия гиалуроната методом стерилизующей фильтрации (Патент США №4517295, МКИ С 12 Р 19/04). К сожалению, в офтальмохирургии применяются растворы натрия гиалуроната высокой вязкости (от 60 до 120 Па с). Растворы такой высокой вязкости не могут быть профильтрованы, как другие лекарственные препараты, через мембрану с диаметром пор 0,2 мкм, обеспечивающим стерильность продукта после фильтрации. Для стерилизации растворов натрия гиалуроната высокой вязкости известен химический способ (Патент США №5559104, МКИ А 61 К 31/725). Он заключается в добавлении к раствору одного из бактерицидных веществ, например цетилпиридиниумхлорида. Этот способ стерилизации не слишком удобен, поскольку обычно процедура проводится несколько раз, кроме того, при использовании этого способа возможно присутствие остатков цетилпиридиниумхлорида в конечном продукте. Другим известным способом стерилизации является стерилизация ионизирующей радиацией, однако этот процесс сопровождается деполимеризацией натрия гиалуроната, вследствие чего вязкость раствора уменьшается. Для предотвращения деполимеризации растворов натрия гиалуроната при стерилизации ионизирующей радиацией в качестве ингибитора деполимеризации используют сульфат меди и аскорбинат натрия (Патент РФ №2051154, С 08 В 37/08). Этот метод стерилизации не может быть применен при изготовлении вискоэластичных протекторов, т.к. присутствие ингибиторов оказывает неблагоприятное воздействие на глазные ткани.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ приготовления вязкого раствора на основе натрия гиалуроната, полученного из органического сырья (петушиные гребешки или пуповина новорожденных) (Патент США №4141973, МКИ А 61 К 31/70). Этот способ позволяет получать вискоэластичную композицию для использования в офтальмохирургии. Однако недостатками данного способа являются многостадийность и дороговизна процесса. Так, сырье требует предварительного замораживания и сложной многостадийной очистки с многократной экстракцией хлороформом. Полученный в результате натрия гиалуронат стерилизуется цетилпиридиниумхлоридом и три раза обрабатывается стерильным ацетоном. Затем высушенный под вакуумом натрия гиалуронат растворяется в стерильном фосфатном буфере следующего состава: NaСl - 8,1661 г/л, Na₂HPO₄ 7H₂O - 0,4003 г/л, NaH₂PO₄ 4Н₂О - 0,04455 г/л. Необходимость применения в производстве стерильных солей усложняет технологический процесс и увеличивает стоимость конечного продукта. Кроме того, применение метода химической стерилизации делает возможным наличие в конечном продукте остатков стерилизующего агента, что может отрицательно сказаться на его качестве.

Целью изобретения является разработка дешевого и простого способа приготовления стерильного вискоэластичного протектора эндотелия роговицы на основе натрия гиалуроната в сбалансированном фосфатном буфере. Для достижения поставленной цели предложено на стадии приготовления исходного раствора получать раствор избыточной вязкости, а требуемых значений вязкости достигать при последующем автоклавировании. Растворы натрия гиалуроната являются термолабильными. При стерилизации горячим паром (автоклавировании) происходит деполимеризация натрия гиалуроната, и вязкость стерильного растворе становится значительно меньше, чем исходного. Автоклавирование растворов натрия гиалуроната в сбалансированном фосфатном буферном растворе осуществляли в течение 8 минут при 120 С, т.к. согласно утвержденным методам стерилизации лекарственных средств (ГФ XI, вып.2) время стерилизации насыщенным водяным паром при 120 С образца объемом до 100 мл составляет 8 минут. Известные вискоэластичные протекторы роговицы на основе соединений гиалуроновой кислоты, используемые в офтальмохирургии, имеют различную вязкость: 45 Па с ("Viscoat:, Alcon), 40 Па с ("Healon", Pharmacia & Upjohn), 60 Па с ("Healon GV", Pharmacia & Upjohn). Поэтому для получения растворов заданной вязкости необходимо было исследовать зависимость вязкости стерильных растворов, получаемых в результате автоклавирования, от исходной концентрации раствора натрия гиалуроната. Результаты, полученные в ходе экспериментальных исследований процесса автоклавирования растворов натрия гиалуроната в сбалансированном фосфатном буферном растворе, представлены в таблице.

Используя график зависимости вязкости раствора, получаемого после автоклавирования, от концентрации исходного раствора, можно определять концентрацию исходного раствора для приготовления вискоэластичного протекторы роговицы заданной вязкости.

Для производства вязких офтальмологических растворов предлагается использовать натрия гиалуронат, полученный из гиалуроновой кислоты, источником которой является бактериальная ферментация (стрептококковые бактерии). Это сырье не требует сложной предварительной обработки и является более дешевым по сравнению с гиалуроновой кислотой, получаемой из животного сырья. В то же время это сырье является высокоочищенным, апирогенным, что очень важно при использовании в офтальмологии. Содержание белка в этом сырье составляет 0,03-0,3%. Сырье растворяется в фосфатном буфере следующего состава: NaCl - 8,40 мг/мл, Na₂HPO₄ 2Н₂O - 0,27 мг/мл, NaH₂PO₄ 4Н₂О - 0,05 мг/мл. Растворение ведется при температуре 20 С в течение 48 часов при эпизодическом перемешивании, полученный гель подогревается до 65-70 С, фильтруется через мембранный фильтр с размером пор 2,0 мкм, расфасовывается в стеклянные шприцы и автоклавируется. Данный способ не требует использования в процессе производства стерильных ингредиентов, что значительно упрощает технологический процесс.

Токсикологические испытания приготовленного вискоэластичного протектора эндотелия роговицы, проведенные на белых кроликах, показали отсутствие значительной клеточной инфильтрации в передней и задней камерах глаза, а также отсутствие воспалительных процессов в эндотелии роговицы.

Пример 1. Навеску 1,32 г натриевой соли гиалуроновой кислоты (источник получения - бактериальная ферментация, фирма "Sigma-Aldrich",США) растворяют в 98,68 мл фосфатного буферного раствора с рН 7,0-7,4. Растворение ведется при температуре 20 С в течение 48 часов. В процессе растворения раствор подвергают двукратному перемешиванию в течение 8 часов. Получают раствор с вязкостью 18 Па с. Раствор подогревают на водяной бане до 65 С, фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 2,0 мкм, расфасовывают в стеклянные шприцы по 1 мл и автоклавируют при 120 С в течение 8 минут. Получают стерильный раствор с вязкостью 5,7 Па с.

Пример 2. Навеску 2,0 г натриевой соли гиалуроновой кислоты (источник получения - бактериальная ферментация, фирма "Sigma-Aldrich",CIIIA) растворяют в 98,0 мл фосфатного буферного раствора с рН 7,0-7,4. Растворение ведется при температуре 20 С в течение 48 часов. В процессе растворения раствор подвергают двукратному перемешиванию в течение 8 часов. Получают раствор с вязкостью 290 Па с. Раствор подогревают на водяной бане до 70 С, фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 2,0 мкм, расфасовывают в стеклянные шприцы по 1 мл и автоклавируют при 120 С в течение 8 минут. Получают стерильный раствор с вязкостью 85 Па с.

Пример 3. Для приготовления 100 мл стерильного раствора натрия гиалуроната с вязкостью ~50 Па с по графику определяют концентрацию исходного раствора. Она составляет 1,84%. Соответственно берут навеску 1,84 г натриевой соли гиалуроновой кислоты (источник получения - бактериальная ферментация, фирма "Sigma-Aldric h",США), растворяют ее в 98,16 мл фосфатного буферного раствора, имеющего следующий состав: NaCl (натрия хлорида) - 8,40 мг/мл, Na₂HPO₄ 2H₂O (динатрия фосфата дигидрата) - 0,27 мг/мл, NaH₂PO₄ 4Н₂О (натрия дигидрофосфата гидрата) - 0,05 мг/мл. рН буферного раствора составляет 7,0-7,4. Растворение ведут при температуре 20 С в течение 48 часов. В процессе растворения раствор дважды подвергают перемешиванию в течение 8 часов. В результате получают раствор с вязкостью 155,0 Па с. Раствор подогревают на водяной бане до 70 С, фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 2,0 мкм, расфасовывают в стеклянные шприцы по 1 мл и автоклавируют при 120 С в течение 8 минут. После автоклавирования получается стерильный раствор с вязкостью 49,0 Па с, что в пределах погрешности метода соответствует поставленной задаче.

На графике представлена зависимость вязкости раствора, получаемого после автоклавирования, от концентрации исходного раствора.