применение определенных лекарственных средств для лечения повреждения нервного корешка

Формула изобретения

1. Применение ингибитора альфа-ФНО, выбранного из группы, состоящей из ингибиторов металлопротеиназ, исключая метилпреднизолон, тетрациклинов, включая химически модифицированные тетрациклины, хинолонов, лазароидов, пентоксифиллинов, производных гидроксамовых кислот, нафтопиранов, растворимых рецепторов цитокинов, моноклональных антител к альфа-ФНО, амринона, пимобендана, веснаринона, ингибиторов фосфодиэстеразы III, лактоферрина и аналогов, производных лактоферрина, мелатонина в виде основания или их аддитивных солей, в качестве активного вещества фармацевтической композиции для лечения спинно-мозговых нарушений, представляющих собой повреждение нервного корешка, вызванное выделением альфа-ФНО или присутствием альфа-ФНО, путем ингибирования альфа-ФНО межпозвонкового диска.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что ингибитор альфа-ФНО выбран из соединений гидроксамовых кислот и их производных, лазароидов, пентоксифиллина, нафтопиранов, амринона, пимобендана, веснаринона, ингибиторов фосфодиэстеразы III, мелатонина в виде оснований или аддитивных солей.

3. Применение по п.1, отличающееся тем, что ингибитор альфа-ФНО выбран из норфлоксацина, офлоксацина, ципрофлоксацина, гатифлоксацина, пефлоксацина, ломефлоксацина и темафлоксацина в виде оснований или аддитивных солей.

4. Применение по п.1, отличающееся тем, что ингибитор альфа-ФНО является ингибитором металлопротеиназы в виде основания или аддитивных солей.

5. Применение по п.1, отличающееся тем, что ингибитор альфа-ФНО выбран из группы, состоящей из тетрациклина, доксициклина, лимециклина, окситетрациклина, миноциклина и химически модифицированных тетрациклинов, дедиметиламинотетрациклина, в виде оснований или аддитивных солей.

6. Применение по п.5, отличающееся тем, что ингибитор альфа-ФНО представляет собой доксициклин.

7. Применение ингибитора альфа-ФНО в виде растворимого рецептора цитокина в качестве активного вещества фармацевтической композиции для лечения спинно-мозговых нарушений, представляющих собой повреждение нервного корешка, вызванное высвобождением альфа-ФНО или присутствием альфа-ФНО, путем ингибирования альфа-ФНО межпозвонкового диска.

8. Применение по п.1 или 7, отличающееся тем, что ингибитор альфа-ФНО является растворимым рецептором цитокина этанерсептом.

9. Применение ингибитора альфа-ФНО в виде моноклонального антитела к альфа-ФНО для получения фармацевтической композиции для лечения спинно-мозговых нарушений, представляющих собой повреждение нервного корешка, вызванное выделением альфа-ФНО или присутствием альфа-ФНО, путем ингибирования альфа-ФНО межпозвонкового диска.

10. Применение по п.1 или 9, отличающееся тем, что ингибитор альфа-ФНО представляет собой моноклональное антитело инфликсимаб.

11. Применение тетрациклинов, стероидов или циклоспорина А, ингибирующих соединение, инициируемое высвобождением альфа-ФНО, такое как интерферон-гамма, интерлейкин-1 и окись азота (NO), в виде основания или аддитивных солей, в получении фармацевтической композиции для лечения спинно-мозговых нарушений, таких, как повреждение нервного корешка, вызванное выделением альфа-ФНО или присутствием альфа-ФНО, путем ингибирования альфа-ФНО межпозвонкового диска.

12. Применение по любому из пп.1-11, отличающееся тем, что указанное повреждение нервного корешка вызвано образованием грыжи межпозвонкового диска.

13. Применение по любому из пп.1-11, отличающееся тем, что указанное повреждение нервного корешка вызвано студенистым ядром.

14. Применение по п.12 или 13, отличающееся тем, что указанное повреждение нервного корешка представляет собой ишиалгию.

15. Фармацевтическая композиция для лечения повреждения нервного корешка, содержащая фармацевтически эффективное количество растворимого рецептора цитокина и фармацевтически приемлемый носитель.

16. Фармацевтическая композиция по п.15, отличающаяся тем, что указанный растворимый рецептор цитокина является этанерсептом.

17. Фармацевтическая композиция для лечения повреждения нервного корешка, содержащая фармацевтически эффективное количество моноклонального антитела, избирательного в отношении альфа-ФНО, и фармацевтически приемлемый носитель.

18. Фармацевтическая композиция по п.17, отличающаяся тем, что указанное моноклональное антитело является инфликсимабом.

19. Способ частичного блокирования индуцированного студенистым ядром снижения скорости нервной проводимости, включающий в себя введение эффективно блокирующего количества моноклонального антитела, избирательного в отношении альфа-ФНО.

20. Способ по п.19, отличающийся тем, что указанное моноклональное антитело является инфликсимабом.

21. Способ лечения спинномозговых нарушений, представляющих собой повреждение нервного корешка, вызванное выделением альфа-ФНО у млекопитающих, включая человека, заключающийся во введении фармацевтически эффективного количества ингибитора альфа-ФНО, выбранного из группы, состоящей из ингибиторов металлопротеиназы, исключая метилпреднизолон, тетрациклинов, включая химически модифицированные тетрациклины, хинолонов, лазароидов, пентоксифиллинов, производных гидроксамовых кислот, нафтопиранов, растворимых рецепторов цитокинов, моноклональных антител к альфа-ФНО, амринона, пимобендана, веснаринона, ингибиторов фосфодиэстеразы III, лактоферрина и аналогов, производных лактоферринов, мелатонина в виде основания или их аддитивных солей.

22. Способ лечения спинно-мозговых нарушений, таких как повреждение нервного корешка, вызванного высвобождением альфа-ФНО у млекопитающих, включая человека, включающий в себя введение фармацевтически эффективного количества ингибитора альфа-ФНО в виде растворимого рецептора цитокина.

23. Способ по п.21 или 22, отличающийся тем, что указанный ингибитор альфа-ФНО является растворимым рецептором цитокина этанерсептом.

24. Способ лечения спинно-мозговых нарушений, таких, как повреждение нервного корешка, вызванное высвобождением альфа-ФНО у млекопитающих, включая человека, включающий в себя введение фармацевтически эффективного количества ингибитора альфа-ФНО в виде моноклонального антитела к альфа-ФНО.

25. Способ по п.21 или 24, отличающийся тем, что указанный ингибитор альфа-ФНО представляет собой моноклональное антитело инфликсимаб.

26. Способ по п.21, отличающийся тем, что ингибитор альфа-ФНО выбран из группы, состоящей из тетрациклина, доксициклина, лимециклина, окситетрациклина, миноциклина и химически модифицированных тетрациклинов, дедиметиламинотетрациклина, в виде оснований или аддитивных солей.

27. Способ по п.26, отличающийся тем, что ингибитор альфа-ФНО является доксициклином.

28. Способ по п.21, отличающийся тем, что ингибитор альфа-ФНО выбран из соединений гидроксамовых кислот, лазароидов, пентоксифиллина, нафтопиранов, амринона, пимобендана, веснаринона, ингибиторов фосфодиэстеразы III, мелатонина в виде оснований или аддитивных солей.

29. Способ по п.21, отличающийся тем, что ингибитор альфа-ФНО выбран из группы, состоящей из норфлоксацина, офлоксацина, ципрофлоксацина, гатифлоксацина, пефлоксацина, ломефлоксацина и темафлоксацина в виде оснований или аддитивных солей.

30. Способ по п.21, отличающийся тем, что ингибитор TNF- является ингибитором металлопротеиназы в виде основания или аддитивных солей.

31. Способ лечения спинно-мозговых нарушений, таких, как повреждение нервного корешка, вызванное выделением альфа-ФНО и соединений, инициируемых в результате высвобождения или присутствия альфа-ФНО у млекопитающих, включая человека, включающий в себя введение фармацевтически эффективного количества тетрациклинов, стероидов или циклоспорина А, ингибирующих соединение, инициируемое в результате высвобождения альфа-ФНО, такого, как интерферон-гамма, интерлейкин-1 и окись азота (NO) в виде основания или аддитивных солей.

32. Способ по п.22, отличающийся тем, что указанное повреждение нервного корешка вызвано образованием грыжи межпозвонкового диска.

33. Способ по п.21, отличающийся тем, что указанное повреждение нервного корешка вызвано студенистым ядром.

34. Способ по п.21, отличающийся тем, что указанное повреждение нервного корешка является ишиалгией.

Приоритет пунктам:

29.10.1998 - по признакам “химически модифицированные тетрациклины, хинолоны, нафтопираны, растворимые рецепторы цитокина, моноклональные антитела к альфа-ФНО, амринон, пимобендан, веснаринон, ингибиторы фосфодиэстеразы III, мелатонин”;

25.09.1998 - по остальным признакам формулы.

Описание изобретения к патенту

Данное изобретение относится к применению ингибитора TNF- для получения фармацевтических композиций для лечения повреждения нервного корешка, а также к способу лечения повреждения нервного корешка.

Цель данного изобретения заключается в достижении возможности лечить повреждение нервного корешка, вызванного образованием грыжи межпозвонкового диска, что может проявляться внезапно как иррадиирующая боль в руке или ноге (ишиалгия) посредством связанного с цитокинами блокирования диска.

Образование грыжи межпозвонкового диска является нарушением, связанным с мучениями для больного, когда может возникать резко выраженная боль и мышечная дисфункция и в связи с этим потеря трудоспособности. Образование грыжи может происходить в позвоночнике в любом диске, но наиболее часто грыжи образуются в поясничном и шейном отделах позвоночника. Образование грыжи в шейном отделе позвоночника может вызывать иррадиирующие боли и мышечную дисфункцию в руке, а образование грыжи в поясничном отделе позвоночника может вызывать иррадиирующую боль и мышечную дисфункцию в ноге. Иррадиирующая боль в ноге обычно упоминается как “ишиалгия”. Образование грыжи диска причиняет страдание в различной степени, а боль может сохраняться в течение одного или двух месяцев или в тяжелых случаях вплоть до 6 месяцев. Боль в руке или ноге в результате образования грыжи межпозвонкового диска может быть очень интенсивной и, таким образом, в период боли может оказывать влияние на жизненную ситуацию индивидуума в целом.

В патенте США US-A-5703092 описано применение соединений гидроксамовых кислот и карбоциклических кислот в качестве ингибиторов металлопротеиназ и TNF и, в частности, для лечения артрита и других родственных воспалительных заболеваний. О применении этих соединений для лечения повреждений нервных корешков нет и намека.

В патенте США US-A-4925833 описано применение тетрациклинов для увеличения синтеза белка в кости и лечения остеопороза.

В патенте США US-A-4666897 описано ингибирование коллагенолитических ферментов млекопитающих тетрациклинами. Коллагенолитическая активность проявляется избыточной резорбцией кости, заболеванием периодонта, ревматоидным артритом, изъявлениями роговицы или резорбцией коллагена кожи или другой соединительной ткани.

Ни в одном из этих патентов не упоминается ни о повреждении нервного корешка, ни о его лечении.

В настоящее время неожиданно было показано, что появилась возможность лечить повреждение нервного корешка, используя фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически активное количество ингибитора TNF-, выбранного из группы, состоящей из ингибиторов металлопротеиназ, исключая метилпреднизолон, тетрациклинов, включая химически модифицированные тетрациклины, хинолинов, кортикостероидов, талидомида, лазароидов, пентоксифиллина, производных гидроксамовых кислот, нафтопиранов, растворимых рецепторов цитокинов, моноклональных антител к TNF-, амринона, пимобендана, веснаринона, ингибиторов фосфодиэстеразы III, лактоферрина и аналогов, производных лактоферрина и мелатонина в виде оснований или аддитивных солей вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

Терапевтически эффективное количество представляет собой обычно употребляемую дозированную форму при применении таких соединений для других терапевтических целей. Многие из этих лекарственных средств являются коммерчески известными, зарегистрированными лекарственными средствами.

Соединения, которые проявляют эту активность, являются тетрациклинами, такими как тетрациклин, доксициклин, лимециклин, окситетрациклин, миноциклин и химически модифицированные тетрациклины - дедиметиламинотетрациклин, соединения гидроксамовых кислот, карбоциклические кислоты и производные, талидомид, лазароид, пентиксифиллин, нафтопираны, растворимые рецепторы цитокинов, моноклональные антитела к TNF-, амринон, пимобендан, веснаринон, ингибиторы фосфодиэстеразы III, лактоферрин и аналоги, производные лактоферрина, мелатонин, нирфлоксацин, офлоксацин, ципрофлоксацин, гатифлоксацин, пефлоксацин, ломефлоксацин и темафлоксацин. Они могут быть в виде оснований или в форме солей присоединения, любые из них проявляют лучше всего фармацевтический эффект и обладают лучшими свойствами для введения в подходящую фармацевтическую композицию.

Далее, активное соединение содержит вещество, ингибирующее соединение, запускаемое в результате высвобождения TNF-, такое как интерферон-гамма, интерлейкин-1 и окись азота (NO) в виде основания или аддитивных солей.

Кроме того, изобретение относится к способу ингибирования симптомов повреждения нервного корешка.

Исследовали действие доксициклина, растворимых рецепторов цитокинов и моноклональных антител к цитокинам, а используемые способы и полученные результаты описываются ниже.

Примеры

Цель исследования

Оценить воздействие студенистого ядра и различных терапий для блокирования активности TNF- в экспериментах с использованием иммуногистохимии и регистрирования скорости нервной проводимости.

Выводы из основных результатов:

Мета-анализ наблюдаемых воздействий, индуцированных студенистым ядром, выявил, что эти эффекты могут быть связаны с одним специфическим цитокином - фактором некроза опухоли альфа (TNF-).

Цель

Выявить присутствие TNF- в клетках студенистого ядра свиньи и установить, блокирует ли также блокада TNF- индуцированное студенистым ядром снижение скорости проводимости нервного корешка.

Способы

Серия-1: Культивированные клетки студенистого ядра окрашивали иммуногистологически моноклональным антителом к TNF-.

Серия-2: Студенистое ядро извлекали из поясничных дисков и аутогенно наносили на пучок крестцово-копчиковых спинномозговых корешков 13 свиньям. Четыре свиньи получали 100 мг доксициклина внутривенно, 5 свиньям вводили блокирующее моноклональное антитело к TNF- местно на студенистое ядро, а 4 свиней не лечили и использовали как контроль. Через три дня определяли скорость проводимости нервного корешка выше зоны нанесения с помощью местной электрической стимуляции.

Серия-3: Аутогенное студенистое ядро помещали на пучок крестцово-копчиковых спинномозговых корешков тринадцати свиньям, как в серии-2. Пять свиней (вес тела 25 кг получали ремикад^R (инфликсимаб) 100 мг внутривенно перед операцией и 8 свиней получали энбрел^R (этанерсепт) 12,5 мг подкожно перед операцией и дополнительно 12,5 мг подкожно через три дня после операции. Через семь дней после применения студенистого ядра определяли скорость проводимости нервного корешка выше места нанесения с помощью местной электрической стимуляции согласно серии 2.

Результаты

Серия-1: Обнаружено, что TNF- присутствует в клетках студенистого ядра.

Серия-2: Избирательные антитела к TNF- ограничивали снижение скорости нервной проводимости, хоть статистически и не достоверно относительно контрольной серии. Однако лечение доксициклином существенно блокировало индуцированное студенистым ядром снижение скорости нервной проводимости.

Серия-3: Оба лекарственных средства (инфликсимаб и этанерсепт) эффективно блокировали индуцированное студенистым ядром повреждение нерва и обнаружены нормальные средние скорости нервной проводимости после лечения обоими из этих двух лекарственных средств.

Заключение

Впервые специфическое вещество, фактор некроза опухоли альфа, связан с индуцированными студенистым ядром эффектами нервного корешка после местного применения. Хотя воздействия этого вещества могут быть синергическими с другими подобными веществами, результаты данного исследования могут иметь важное значение для дальнейшего понимания биологической активности студенистого ядра, а также могут найти возможное применение для будущих стратегий лечения ишиалгии.

Согласно предварительно рассмотренному точно так же, как биологически неактивный тканевый компонент сдавливает спинномозговой нервный корешок при образовании грыжи диска, студенистое ядро, как недавно было установлено, оказывается высоко активным, вызывая как структурные, так и функциональные изменения в соседних нервных корешках при эпидуральном применении (24, 37, 38, 41, 42). Таким образом установлено, что аутогенное студенистое ядро может вызывать изменения аксонов и характерные повреждения миелина (24, 38, 41, 42), увеличенную сосудистую проницаемость (9, 44), внутрисосудистое свертывание (24, 36), и мембраносвязанные структуры или вещества клеток студенистого ядра оказываются ответственными за эти эффекты (24, 37). Также было установлено, что эти воздействия эффективно блокируются метилпреднизолоном и циклоспорином А (2, 38). Если внимательно посмотреть на эти данные, ясно представляется, что есть по крайней мере один цитокин, который имеет отношение ко всем этим эффектам, фактор некроза опухоли альфа (TNF-). Чтобы установить, может ли TNF- быть вовлеченным в индуцированное студенистым ядром повреждение нервного корешка, оценивали присутствие TNF- в клетках студенистого ядра и исследовали вопрос о том, могут ли эффекты, индуцированные студенистым ядром, быть блокированы доксициклином, растворимым рецептором TNF и селективными моноклональными антителами к TNF, последние вводили как местно в студенистое ядро, так и системно.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Серия-1. Присутствие TNF- в клетках студенистого ядра: Студенистые ядра (NP), всего из 13 поясничных и грудных дисков, были получены у свиней, используемых для других целей. NP промывали один раз средой F12 Гама (Ham; Gibco BRL, Paiseley, Scotland) и затем центрифугировали и суспендировали в 5 мл раствора коллагеназы в среде F12 Гама (0,8 мг/мл, Sigma Chemical Co., St. Louis, МО, USA) в течение 40 минут при 37С в 25 см² флаконах для тканевых культур. Отделенный осадок клеток NP суспендировали в среде DMEM/F12 1:1 (Gibco BRL, Paisley, Scotland), обогащенной 1% L-глутамином 200 мМ (Gibco BRL, Paisley, Scotland), 50 мкг/мл гентамицином сульфатом (Gobco BRL, Paisley, Scotland) и 10% фетальной телячьей сывороткой (FCS) (Gibco BRL, Paisley, Scotland). Клетки культивировали при 37С и в атмосфере 5% CO₂ в течение 3-4 недель, а затем культивировали непосредственно на предметных стеклах, обработанных культурой ткани (Becton Dickinson & Со Labware, Franklin Lakes, NJ, USA). После 5 дней культивирования на предметных стеклах клетки фиксировали in situ ацетоном в течение 10 минут. После блокирования не относящихся к делу антигенов применением 3% H₂O₂ (Sigma Chemical Co., St. Louis, МО, USA) в течение 30 минут и лошадиной сыворотки (ImmunoPure ABC, окрашивание пероксидазой IgG мыши, набор №32028, Pierce, Rockford, IL) в течение 20 минут применяли первичные антитела (моноклональные антитела против TNF- свиньи, Endogen, Cambridge, МА, USA) в течение ночи при 40С, разбавляли до 1:10, 1:20 и 1:40. Для контроля BSA (бычий сывороточный альбумин, Intergen, Co, New York, USA), суспендированный в PBS (фосфатом забуференный физиологический раствор, Merck, Darmstadt, Germany), применяли таким же способом. На следующий день клетки промывали 1% BSA в PBS, и вторичные антитела (ImmunoPure ABC, окрашивание пероксидазой IgG мыши, набор №32028, Pierce, Rockford, IL) применяли в течение 30 минут. Для усиления этой реакции клетки обрабатывали комплексом авидин-биотин в течение дополнительных 30 минут (ImmunoPure ABC, окрашивание пероксидазой IgG мыши, набор №32028, Pierce, Rockford, IL). Затем клетки обрабатывали 20 мг DAB (3,3-диаминобензидинтетрагидрохлорид, №D-5905, Sigma Chemical Co., St Louis, МО, USA) и 0,033 мл 3% Н₂O₂ в 10 мл физиологического раствора в течение 10 минут. Клетки промывали PBS, обезвоживали в серии этанолов, фиксировали и исследовали в световом микроскопе, не учитывая при наблюдении появления коричневого окрашивания, указывающего на присутствие TNF-.

Серия-2. Нейрофизиологическое определение:

Тринадцать свиней (вес тела 25-30 кг) внутримышечно инъецировали 20 мг/кг веса тела кеталара^R (кетамин 50 мг/мл, Parke-Davis, Morris Plains, New Jersey) и внутривенно инъецировали 4 мг/кг веса тела гипнодила^R (метомидат хлорид 50 мг/мл, АВ Leo, Helsingborg, Sweden) и 0,1 мг/кг веса тела стреспила^R (азаперон 2 мг/мл, Janssen Pharmaceutica, Beerse, Belgium). Обезболивание поддерживали дополнительными внутривенными инъекциями 2 мг/кг веса тела гипнодила^R и 0,05 мг/кг веса тела стреснила^R. После операции свиньям также вводили с внутривенной инъекцией 0,1 мг/кг стесолида новума^R (диазепам, Dumex, Helsingborg, Sveden).

Студенистое ядро извлекали из 5-го поясничного диска путем забрюшинного доступа (42). Приблизительно 40 мг студенистых ядер наносили на пучок крестцово-копчиковых спинномозговых корешков, сделав разрез по средней линии и ламиноэктомию первого позвонка копчика. Четыре свиньи не получали никакого лечения (необработанные). Четырем другим свиньям делали внутривенное вливание 100 мг доксициклина (вибрамицин, Pfizer Inc., New York, USA) в 100 мл физиологического раствора в течение 1 часа. У 5 свиней студенистое ядро перед применением смешивали со 100 мкл, 1,11 мг/мл суспензии анти-TNF--антител, использованных в серии-1.

Через три дня после аппликации свиньям проводили повторное обезболивание внутримышечной инъекцией 20 мг/кг веса тела кеталара^R и внутривенной инъекцией 35 мг/кг веса тела пентотала^R (тиопентал натрия, Abbott lab, Chicago, IK). Свиней вентилировали с по мощью аппарата для длительного искусственного дыхания. Обезболивание поддерживали внутривенной болюс-инъекцией 100 мг/кг веса тела хлоралоза -D(+)-глюкохлоралоз, Merck, Darmstadt, Germany) и непрерывной доставкой 30 мг/кг/ч хлоралоза. Осуществляли ламинэктомию из 4-го крестцового и 3-го копчикового позвонков. Нервные корешки покрывали спонгостаном^R (феррозан, Denmark). Непрерывно следили за местной температурой ткани, поддерживая ее 37,5-38,0С с помощью нагревающей лампы.

Хвостовой пучок спинномозговых корешков стимулировали с помощью двух подкожных платиновых игл-электродов Е2 (Grass Instrument Co., Quincy, MA), которые соединяли со стимулятором Grass SD9 (grass Instrument Co., Quincy, MA) и мягко с помощью механизма непрерывного движения размещали на хвостовом пучке крестцовых и копчиковых спинномозговых корешков, сначала на 10 мм краниальной, а затем 10 мм хвостовой области, подвергаемой воздействию. Чтобы гарантировать, что регистрируются только импульсы от подвергаемых воздействию нервных волокон, отсекали нервный корешок, который выходит из позвоночного канала между двумя участками стимуляции. EMG регистрировали с помощью двух подкожных платиновых игл-электродов, которые помещали в парапозвоночных мышцах в нижней части на расстоянии приблизительно 10 мм. Этот способ воспроизводим и представляет собой функциональное измерение двигательных нервных волокон пучка поясничных, крестцовых и копчиковых нервных корешков. EMG визуализировали, используя компьютер Macintosh IIci, снабженный программным обеспечением Superscope и преобразователем MacAdios II AID (GW Instruments, Sommerville, MA) вместе с предусилителем Grass P18 (Grass Instrument Co., Quincy, MA). Определяли расстояние, разделяющее два первых пика ЕМС из двух регистраций, а расстояние, разделяющее два участка стимуляции на пучке спинномозговых корешков, измеряли циркулем. Таким образом, из этих двух измерений может быть рассчитана скорость нервной проводимости между двумя участками стимуляции.

Субъект, осуществляющий нейрофизиологический анализ, ничего не знает об экспериментальных протоколах индивидуальных животных, а после окончания полного исследования данные распределяли по трем экспериментальным группам, и статистические различия между группами оценивали по критерию Стъюдента. Экспериментальный протокол этих экспериментов был утвержден в местном Комитете по этике исследования животных.

Серия-3: Тринадцати свиньям аутогенное студенистое ядро помещали на пучок крестцово-копчиковых спинномозговых корешков, как в серии-2. Пяти свиньям (вес тела 25 кг) вводили моноклональное антитело человека/мыши ремикад^R (инфликсимаб, Immunex Corporation, Seattle, WA 98101, USA), 100 мг внутривенно перед операцией и 8 свиньям вводили энбрел^R (этанерсепт, Centocor B.V., Leiden, The Netherlands) 12,5 мг подкожно перед операцией и дополнительно 12,5 мг подкожно через три дня после операции. Через семь дней после применения студенистого ядра определяли скорость проводимости нервного корешка выше зоны нанесения с помощью местной электростимуляции согласно серии-2. Для получения слепого невыборочного исследования нейрофизиологическую оценку проводили параллельно с другим исследованием, и субъект, осуществляющий анализ, не знал, из какого исследования животное и какому лечению подвергали каждое отдельное животное. Нелеченных животных не включали в серию-3, поскольку предварительно была известна скорость нервной проводимости после семи дней применения студенистого ядра или жира (контроль). Статистическое различие между группами, получившими либо инфликсимаб, либо этанерсепт, либо студенистое ядро без лечения (положительный контроль из предварительных данных), либо забрюшинный жир (отрицательный контроль из предварительных данных) оценивали, используя систему ANOVA и PLSD-статистику Фишера для 5%.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Серия-1. Присутствие TNF-(в клетках студенистого ядра свиньи.

Примеры изображений в световом микроскопе окрашенных предметных стекол. В срезах, используя BSA в PBS в качестве "первичных антител" (контроль), не наблюдали никакого окрашивания, что гарантирует, что нет мечения и визуализации не относящихся к делу антигенов. Когда применяли анти-TNF--антитела в разведении 1:40, имелось только слабое окрашивание. Однако окрашивание увеличивалось с уменьшением разведений антител. Окрашивание наблюдалось в соме клеток и было невозможно дифференцировать, локализуется ли TNF- в цитоплазме, на клеточной поверхности, связан ли он с клеточной мембраной или и то, и другое.

Серия-2. Нейрофизиологическое определение:

Применение немодифицированного студенистого ядра и без какого-либо лечения вызывало снижение скорости проводимости нервного корешка подобно предварительному исследованию (таблица 1), тогда как лечение доксициклином полностью блокировало это снижение (р<0,01 критерий Стъюдента). Местное применение анти-TNF--антител также вызывало частичное блокирование этого снижения, хотя не так полно, как доксициклин, и не выявлено статистической достоверности данных ни в одной серии лечения.

Серия-3: Оказалось, что лечение обоими лекарственными средствами предотвращает индуцированное студенистым ядром снижение скоростей проводимости нервного корешка, так как средняя скорость проводимости для этих двух групп лечения оказалась близкой средней проводимости в серии, где применялся жир, как показано в предшествующем исследовании (таблица 2). Имеется статистически значимое различие между применением студенистого ядра, но без какого-либо лечения, и использованием двух лекарственных средств.

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты данного исследования продемонстрировали, что TNF- может быть обнаружен в клетках студенистого ядра свиньи. Когда TNF- блокировали применяемыми местно избирательными моноклональными антителами, то частично блокировалось индуцированное студенистым ядром снижение скорости проводимости нервного корешка, хотя нет никакой статистической достоверности по сравнению с серией нелеченных животных. Однако, если для ингибирования TNF- использовали системные терапии доксициклином, инфликсимабом и этанерсептом, существенно предотвращалось снижение скорости нервной проводимости.

В последние годы было подтверждено, что местное применение аутогенного студенистого ядра может повредить смежные нервные корешки. Таким образом становится очевидным, что повреждение нервного корешка, наблюдаемое при образовании грыжи межпозвонкового диска, не может быть исключительно результатом механической деформации нервного корешка, а может также стимулироваться “биохимическими воздействиями”, связанными с эпидуральным присутствием студенистого ядра, вышедшего при образовании грыжи за пределы полости. Хотя этот новый уровень изучения порождает множество экспериментальных исследований, вовлеченные механизмы и вещества полностью не известны. Оказалось, что местное применение аутогенного студенистого ядра может приводить к повреждению аксона (24, 37, 38, 0-42), характерному повреждению миелиновой оболочки (24, 38, 40-42), локальному увеличению сосудистой проницаемости (9, 36, 44), внутрисосудистому свертыванию, уменьшению кровотока в нервной ткани (43) и лейкотаксису (36). Очевидно, что связанные со студенистым ядром воздействия могут быть эффективно блокированы метилпреднизолоном (38) и циклоспорином А (2) и несколько менее эффективно - индометацином (3) и лидокаином (69). Кроме того, ясно, что воздействия опосредованы клетками студенистого ядра (37), в частности веществами или структурами, связанными с клеточными мембранами (25). Если критически рассматривать эти данные, становится очевидным, что по крайней мере один специфический цитокин может быть связан с этими наблюдаемыми эффектами, это - фактор некроза опухоли альфа (TNF-). TNF- может вызывать повреждение нерва (29, 31, 45, 50, 66), проявляющееся большей частью как характерное повреждение миелина, которое довольно сильно напоминает повреждение миелина, индуцированное студенистым ядром (29, 47, 51, 54, 62, 64, 66, 70). Также TNF- может вызывать увеличение в сосудистой проницаемости (47, 66) и инициировать свертывание (22, 34, 63). К тому же TNF- может быть блокирован стероидами (4, 8, 21, 61, 68) и циклоспорином А (11, 55, 67, 68). Однако блокирующее влияние на TNF- не было столь выраженным при действии NSAID (14, 17, 20), а лидокаин оказывал очень низкое или противоположное действие (5, 32, 46, 60). Недавно установили, что местное применение студенистого ядра может вызывать у крыс боль, связанную с поведенческой активностью, особенно термическую повышенную болевую чувствительность (23, 40). Также обнаружено, что TNF- связан с такими болевыми поведенческими изменениями (12, 35, 56, 66), а также с невропатиями вообще (30, 54, 56, 57). Однако нет исследований, в которых определялось бы возможное присутствие TNF- в клетках студенистого ядра.

Для выяснения того, связан ли TNF- с наблюдаемым индуцированным студенистым ядром снижением в скорости проводимости нервного корешка, необходимо сначала исследовать, присутствует ли TNF- в клетках студенистого ядра. Результаты четко показывают, что TNF- присутствует в этих клетках. TNF- образуется в виде предшественника (про-TNF), который связывается с мембраной и активируется в результате его отщепления от клеточной мембраны под действием цинкзависимой металлоэндопептидазы (TNF--превращающий фермент, ТАСЕ) (6, 15, 16, 48, 49). Таким образом, вполне может быть связано с результатами экспериментов то, что использование одних лишь клеточных мембран клеток аутогенного студенистого ядра вызывает снижение скорости нервной проводимости; это указывает на то, что воздействие опосредовано мембраносвязанными веществами. Второе, эффекты TNF- следовало блокировать контролируемым способом. Тогда решили прежде всего, до применения, к студенистому ядру добавить то же самое избирательное антитело, которое использовали для иммуногистохимии в серии-1, которое, как известно, также подавляет действие TNF-. Также решили лечить свиней доксициклином, который, как известно, блокирует TNF- (26, 27, 33, 52, 53). Однако вследствие низкого рН препарата доксициклина предпочли лечить свиней, используя внутривенную инъекцию вместо местного добавления к студенистому ядру, так как, как было установлено, студенистое ядро при низком рН усиливает действие студенистого ядра (38, 39).

Два недавно разработанных лекарственных средства для специфического ингибирования TNF- также включены в исследование.

Инфликсимаб является химерным моноклональным антителом, составленным из константной человеческой вариабельной мышиной областей, и специфически связывает TNF- человека. В отличие от моноклонального антитела, использованного в серии 2 в течение 3-дневного периода наблюдения, инфликсимаб не применяли местно в аутотрансплантированное студенистое ядро, а вместо этого вводили системно в клинически рекомендованной дозе (4 мг/кг). Этанерсепт представляет собой димерный слитый белок, состоящий из Fc-участка IgG человека. Лекарственное средство вводили в дозировке, сравнимой с рекомендованной дозой для применения в педиатрической практике (0,5 мг/кг, дважды в неделю).

Данные, относящиеся к скорости нервной проводимости, показали, что ее снижение полностью блокируется системным лечением и что скорости нервной проводимости в этих сериях были близки к скорости нервной проводимости после применения контрольного вещества (забрюшинного жира) из предшествующего исследования (42). Нанесение анти-TNF--антитела на студенистое ядро также частично предотвращало снижение скорости нервной проводимости, однако не так резко выражено, как при действии доксициклина, и скорость в этой серии статистически не отличалась от скорости в серии с нелеченными животными вследствие большого разброса данных.

Факт, что местное лечение анти-TNF--антителом только частично блокирует индуцированное студенистым ядром снижение скорости нервной проводимости, а высокое стандартное отклонение данных, вероятно, может иметь, по крайней мере, три различных объяснения. Первое, если обратить внимание на характерные данные в пределах этой группы, то выявляется, что скорость нервной проводимости была низкой у 3 животных (средняя 37,5 м/с) и высокой у 3 животных (средняя 81,3 м/с). К тому же имеются 2 группы явно различных данных в пределах серии лечения анти-TNF--антителом. Это объясняет высокое стандартное отклонение и может означать, что блокирующее действие оказалось достаточным у 3 животных и недостаточным у 2 животных. Недостаточное воздействие на этих животных может просто быть связано с недостаточным количеством антител в связывании с молекулами TNF- и, если использовать более высокую дозу антител, действие TNF- будет блокировано даже у этих животных. Подобный сценарий в таком случае теоретически может означать, что TNF- сам по себе является ответственным за наблюдаемые эффекты, индуцированные студенистым ядром, и что это не может быть подтверждено экспериментально вследствие того, что имеется слишком низкое количество антител.

Второе, также известно, что тетрациклины, такие как доксициклин и миноциклин, могут блокировать ряд цитокинов и других веществ. Например, они могут подавлять IL-1 (1, 28, 58), IEN- (27) NO-синтетазу I и металлопротеиназы (1, 53, 58). В частности, известно, что IL-1 и IEN- действуют синергично с TNF- и что являются более или менее нейротоксичными (7, 10, 13, 18, 19, 56, 59). Эти соединения также блокируются стероидами и циклоспорином А, что хорошо согласуется с предшествующими исследованиями индуцированного студенистым ядром повреждения нервного корешка, в которых было показано, что индуцированные студенистым ядром эффекты могут подавляться этими соединениями (8, 67). Поэтому также можно рассмотреть возможность, что избирательное блокирование TNF- может не быть достаточным для полного подавления индуцированных студенистым ядром эффектов на функцию нерва и что также необходимо одновременное блокирование других синергических соединений. Таким образом, этот сценарий, с другой стороны, подразумевает, что не только TNF- является ответственным за индуцированные студенистым ядром эффекты и что могут быть необходимы и другие синергические соединения, которые также подавляются доксициклином.

Третье объяснение заключается в том, что количество TNF в студенистом ядре может быть вполне достаточным для того, чтобы локально, в нервном корешке, начался патофизиологический каскад, включающий в себя повышенную сосудистую проницаемость и агрегацию и рекрутинг системных лейкоцитов. Однако этот рекрутинг лейкоцитов относится к таким лейкоцитам, которые характеризуются основным содержанием TNF-, и что необходимо системное лечение достаточной дозой, чтобы блокировать вклад этих лейкоцитов и тем самым также блокировать явления, ведущие к повреждению нерва.

TNF- может вызывать различные патофизиологические эффекты. Он может непосредственно оказывать воздействия на ткани, такие как нервная ткань и кровеносные сосуды, он может в других клетках запускать продукцию других патогенных веществ и может быть триггером высвобождения большего количества TNF- как воспалительными клетками, так и шванновскими клетками локально в нервную ткань (65). Таким образом, есть основание полагать, что даже низкие количества TNF- могут быть достаточными, чтобы инициировать эти процессы, и что происходит локальный рекрутинг клеток, продуцирующих цитокины, и последующее увеличение продукции и высвобождения других цитокинов так же, как и TNF-. Поэтому TNF- может действовать как “ключ зажигания” патофизиологических процессов и играть важную роль для инициации патофизиологического каскада вслед за повреждением нерва, индуцированным студенистым ядром. Однако главный вклад TNF- может происходить из рекрутинга лейкоцитов, агрегированных и, может быть, даже из вышедших из сосудов лейкоцитов, и успешная фармакологическая блокада может быть достигнута только с помощью системного лечения.

В заключение, хотя точная роль TNF- не может быть полностью понята из экспериментов, можно заключить, что впервые специфическое вещество (TNF-) связывается с повреждением нервного корешка, индуцированным студенистым ядром. Эта новая информация может иметь важное значение для продолжающегося изучения индуцированного студенистым ядром повреждения нерва, а также для возникающего вопроса о возможном будущем клиническом применении фармакологической интерференции TNF- и родственных веществ для лечения ишиалгии.

Таким образом, иммуногистохимически установлено присутствие TNF- в клетках студенистого ядра свиньи. Блокада TNF- с помощью местно применяемого моноклонального антитела частично ограничила индуцированное студенистым ядром снижение скорости проводимости нервного корешка, тогда как внутривенная терапия доксициклином, инфликсимабом и этанерсептом значительно блокировала это снижение. Эти результаты впервые связывают одно определенное вещество, TNF-, с повреждением нерва, индуцированным студенистым ядром.

Показано, что аминогуанидин ингибирует высвобождение окиси азота (NO) при повреждении нервных корешков путем ингибирования индуцибельной синтетазы окиси азота, таким образом, аминогуанидин является соединением, которое ингибирует соединение, запускаемое высвобождением TNF-.

Соединение согласно изобретению можно вводить в различных дозированных формах, например перорально в виде таблеток, капсул, таблеток, покрытых сахаром или пленкой, жидких растворов; ректально в виде суппозиториев; парентерально, например внутримышечно или с помощью внутривенных инъекции или вливания. Терапевтическую схему для различных клинических синдромов следует адаптировать к типу патологии, принимая во внимание также, как обычно, способ введения, форму, в которой вводят соединение, и возраст, вес и состояние субъекта, которого лечат.

Обычно применяется пероральный путь для всех состояний, требующих введения таких соединений. В неотложных случаях предпочтение отдается внутривенной инъекции. Для этих целей соединение согласно изобретению можно вводить перорально в дозах, колеблющихся приблизительно от 20 до 1500 мг/день. Конечно, эти схемы приема лекарственного средства можно корректировать, чтобы обеспечить оптимальный терапевтический ответ.

Природа фармацевтической композиции, содержащей соединения согласно изобретению в сочетании с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями, конечно, будет зависеть от желаемого способа введения. Композиция может быть приготовлена общепринятым способом с обычными ингредиентами. Например, соединения согласно изобретению можно вводить в виде водных или масляных растворов или суспензий, таблеток, пилюль, желатиновых капсул (твердых или мягких), сиропов, капель или суппозиториев.

Так, для перорального введения фармацевтические композиции, содержащие соединения согласно изобретению, предпочтительно представляют собой таблетки, пилюли или желатиновые капсулы, которые содержат активные соединения вместе с разбавителями, такими как лактоза, декстроза, сахароза, маннит, сорбит, целлюлоза; смазывающими веществами, например диоксидом кремния, тальком, стеариновой кислотой, стеаратом магния или кальция и/или полиэтиленгликолями; или они также могут содержать связующие вещества, такие как крахмалы, желатин, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, аравийская камедь, трагакант, поливинилпирролидон; дезагрегирующие агенты, такие как крахмалы, альгиновая кислота, альгинаты, натриевая соль крахмалгликолевой кислоты, микрокристаллическая целлюлоза; вспенивающие агенты, такие как карбонаты и кислоты; красители, подсластители, смачивающие вещества, такие как лецитин, полисорбаты, лаурилсульфаты; и обычно нетоксичные и фармацевтически инертные вещества, используемые при приготовлении композиций. Упомянутые фармацевтические композиции можно производить известными способами, например смешиванием, гранулированием, таблетированием, способом покрытия сахаром или пленкой. В случае, предусматривающем пленку, можно выбрать соединения, обеспечивающие высвобождение в надлежащем месте в кишечном тракте с учетом абсорбции и максимального эффекта. Таким образом, можно применять вещество, образующее рН-зависимую пленку, чтобы предусмотреть абсорбцию в кишечнике как таковую, при этом обычно используются различные фталаты или производные акриловой кислоты/метакриловой кислоты и полимеры.

Жидкие дисперсии для перорального введения могут быть, например, сиропами, эмульсией и суспензиями.

Сиропы могут содержать в качестве носителя, например, сахарозу или сахарозу с глицерином и/или маннит, и/или сорбит.

Суспензии или эмульсии могут содержать в качестве носителя, например, природные смолы, такие как аравийская камедь, ксантановая камедь, агар, альгинат натрия, пектин, метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, поливиниловый спирт.

Суспензии или растворы для внутримышечных инъекций могут содержать вместе с активным соединением фармацевтически приемлемый носитель, например, такой как стерильная вода, оливковое масло, этилолеат, гликоли, например пропиленгликоль, и, если требуется, соответствующее количество гидрохлорида лидокаина. Также могут быть добавлены адъюванты для усиления действия инъекции.

Растворы для внутривенной инъекции или вливания могут содержать в качестве носителя, например, стерильную воду или, предпочтительно, стерильный изотонический физиологический раствор, а также адъюванты, используемые в инъекциях активных соединений.

Суппозитории могут содержать вместе с активным соединением фармацевтически приемлемый носитель, например масло какао, полиэтиленгликоль, полиэтиленсорбитан жирной кислоты, эфирное поверхностно-активное вещество или лецитин.

Источники информации

1. Amin AR, Attur MG, Thakker GD, Patel PD, Vyas PR, Patel RN, Patel IR, Abramson SB. A novel mechanism of action of tetracyclines: effects on nitric oxide syntheses. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 14014-9.

2. Arai I, Konno S, Otani K, Kikuchi S, Olmaeker K. Cyclosporin A blocks the toxic effects of nucleus pulposus on nerve roots. Manuscript.

3. Arai I, Мао GP,. Otani K, Konno S, Kikuchi S, Olmaeker K. Indomethacin blocks nucleus pulposus related effects in adjacent nerve roots. Manuscript.

4. Baumqarther RA, Deramo VA, Beaven MA. Constitutive and inducible mechanisms for synthesis and release of cytokines in immune cell lines. J Immunol 1996; 157; 4087-93.

5. Bidani A, Heming ТА. Effects of lidocaine on cytosolic hY regulation and stimulus-induced effector functions in alveolar macrophages. Lung 1997; 175: 349-61.

6. Black RA, Rauch CT, Kozlosky CJ, Peschon JJ, Slack JL, Wolfson MF, Castner BJ, Stocking KL, Reddy P, Srinivasan S, Nelson N, Boiani N, Schooley KA, Gerhart M, Davis R, Fitzner JN, Johnson RS, Paxton RJ, March CJ, Cerretti DP. A metalloproteinase disintegrin that releases tumour-necrosis factor- from cells. Nature 1997; 385: 729-3.

7. Bluthe RM, Dantzer R, Kelley KW. Interleukin-1 mediates behavioural but not metabolic effects of tumor necrosis factor alpha in mice. Eur J Pharmacol 1991; 209: 281-3.

8. Brattsand R, Linden M. Cytokine modulation by qlucocorticoids: mechanisms and actions in cellular studies. Aliment Pharmacol Ther 1996; 10: 81-90.

9. Byrod G, Otani К, Rydevik В, Olmarker К. Acute increase in endoneural vascular permeability induce by epidural application of nucleus pulposus on spinal nerve roots. Manuscript.

10. Chao CC, Hu S, Ehrlich L, Peterson PK. Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and N-methyl-D-aspartate receptors. Brain Behav Immun 1995; 9: 355-65.

11. Dawson J, Hurtenbach U, MacKenzie A. Cyclosporin A inhibits the in vivo production of interleukin-Ibeta and tumour necrosis factor alpha, but not interieukin-6, by a T-cell-independent mechanism. Cytokine 1996; 8: 882-8.

12. DeLeo JA, Colbum PW, Rickman AJ. Cytokne and growth factor immunohistochemical spinal profiles in two animal models of mononeuropathy. Brain Res 1997; 759: 50-7.

13. Gadient RA, Cron КС, Otten U. Interleukin-1 beta and tumor necrosis factor-alpha synergistically stimulate nerve growth factor (NGF) release from cultured rat astrocytes. Neurosci Lett 1990; 117: 335-40.

14. Garcia-Vicuna R, Diaz-Gonzalez F, Gonzalez-Alvaro I, del Pozo MA, Moilinedo F, Cabanas C, Gonzalez-Amaro R, Sanchez-Madrid F. Prevention of cytokine-induced changes in leucocyte adhesion receptors by nonsteroidal antiinflammatory drugs from the oxicam famili. Arthritis Rheum 1997; 40; 143-53.

15. Gearing AJ, Beckett P, Christodoulou M, Churchill M, Clements J, Davidson AH, Drummond AH, Galloway WA, Gilbert R, Gordon JL, et al. Processing of tumour necrosisfactor-alpha precursor by metalloproteinases. Nature 1994; 370: 555-7.

16. Gazelle EJ, Banda MJ, Leppert D. Matrix metalloproteinases in immunity. J Immunol 1996; 156: 14.

17. Gonzalez E, de la Cruz С, de Nicolas R, Egido J, Herrero-Beaumont G. Long-term effect of nonsteroidal anti-inflammatiry drugs on the production of cytokines and other inflammatory mediators by blood cells of patients with osteosis. Agents Actions 1994; 41: 171-8.

18. Hartung HP, Jung S, Stoll G, Zielasek J, Schmidt B, Archelos JJ, Toyka KV. Inflammatory mediators in demyelinating disorders of the CNS and PNS. J Meuroinununol 1992; 40: 197-210.

19. Hattori A, Iwasald S, Murase К, Tsujimoto M, Sato M, Hayashi K, Kohno M. Tumor necrosis factor is markedly synergistic with interleukin I and interferon-gamma in stimulating the production of nerve growth factor in fibroblasts. FEBS Lett 1994; 340: 177-80.

20. Herman JH, Sowder WG, Hess EV. Nonsteroidal antiinflammatory drug modulation of prosthesis pseudomembrane induced bone resorption. J Rheumatol 1994; 21: 38-43.

21. Iwamoto S, Takeda К. [Possible cytotoxic mechanisms TNF in vitro). Hum Cell 1990; 3: 107-12.

22. Jurd KM, Stephens CJ, Black MM, Hunt BJ. Endothelial cell activation in cutaneous vasculitis. Clin Exp Dermatol 1996; 21: 28-32.

23. Kawakami M, Tamaki Т, Weinstein JN, Hashizume H, Nishi H, Meller ST. Pathomechanism ox pain-related behavior produced by allografts of intervertebral disc in the rat. Spine 1996; 21: 2101-7.

24. Kayama S, Konno S, Olmarker К, Yabuki S, Kikuchi S. Incision of the anulus fibrosis induces nerve root morphologic, vascular and functional chanqes. An experimental study. Spine 1996; 21: 2539-43.

25. Kayama S, Olmarker К, Larsson К, Sjogren-Jansson E, Lindahl A, Rydevik B. Cultured, autologous nucleus pulposus cells induce structural and functional changes in spinal nerve roots. Spine, 1998; 23: 2155-58.

26. Kloppenburg M, B~an BM, de Rooij-Dijk HH, Miltenburg AM, Daha MR, Breedveld FC, Dijkmans BA, Verweij C. The tetracycline derivative minocycline differentially affects cytokine production by monocytes and Т lymphocytes. Antimicrob Agents Chemother 1996; 40: 934-40.

27. Kloppenburg M, Verweij CL, Miltenburg AM, Verboeven AJ, Daha MR, Dijkmans BA, Breeveld FC. The influence of tetracyclines on Т cell activation. Clin Exp Inununol 1995; 102: 635-41.

28. Lamster IB, Pullman IR, Celenti RS, Grbic JT. The effect of tetracycline fiber therapy on beta-glucuronidase and interleukin-1 beta in crevicular fluid. J Clin Periodontol 1996; 23: 816-22.

29. Liberski PP, Yanagihara R, Nerurkar V, Gajdusek DC. Futher ultrastructural studies of lesions induced in the optic nerve by tumor necrosis factor alpha (TNF-): a comparison with experimental Creutzfeld-Jakob disease. Acta Neurobiol Exp (Warsz) 1994; 54: 209-18.

30. Lin XH, Kashima Y, Khan M, Heller KB, Gu XZ, Sadun AA. An immunohistochemical study of TNF- in optic nerves from AIDS patients. Curr Eye Res 1997; 16: 1064-8.

31. Madigan MC, Sadun AA, Rao NS, Dugel PU, Tenhula WN, Gill PS. Tumor necrosis factor-alpha (TNF-)-induced optic neuropathy in rabbits. Neurol Res 1996; 18: 176-84.

32. Matsumori А, Оnо К, Nishio R, Nose Y, Sassayama S. Amiodarone inhibit production of tumor necrosis factor-alpha by human mononuclear cells: a possible mechanism for its effect in heart failure. Circulation 1997; 96: 1386-9.

33. Milano S, Arcoleo F, D"Agostino P, Cillari E. Intraperitoneal injection of tetracyclines protects mice from lethal endotoxemia downregulating inducible nitric oxide synthase in various organs and cytokine and nitrate secretion in blood. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 117-21.

34. Nawroth P, Handley D, Matsueda G, De Waal R, Gerlach H, Blohm D, Stem D. Tumor necrosis factor/cachectin-induced intra vascular fibrin formation in meth A fibrosarcomas. J Exp Med 1988; 168: 637-47.

35. Oka T, Wakugawa Y, Hosoi M, Oka K, Hori T. Intracerebroventricular injection of tumor necrosis factor-alpha induces thermal heperalgesia in rats. Neuroimmunomodulation 1996; 3: 135-40.

36. Olmarker К, Blonquist J, Stromberg J, Nannmark U, Thomsen P, Rydevik B. Inflamma-togenic properties of nucleus pulposus. Spine 1995; 20: 665-9.

37. Olmarker К, Brisby H, Yabuki S, Nordborg C, Rydevik B. The effects of normal, frozen and hyaluronidase-digested nucleus pulposus on nerve root structure and function. Spine 1997; 22: 4115; discussion 476.

38. Olmarker К, Byrod G, Cometjord M, Nordborg C, Rydevik B. Effects of methylprednisolone on nucleus pulposus-induced nerve root injury. Spine 1994; 19: 1803-8.

39. Olmarker К, Iwabuchi M, Larsson К, Rydevik B. Effects of in vitro degenerated nucleus pulposus on nerve root conduction velocity. Manuscript.

40. Olmarker K, Myers RR. Pathogenesis of sciatic pain: Role of herniated nucleus pulposus and deformation of spinal nerve root and DRC. Pain, 1998; 78: 9-105.

41. Olmarker K, Nordborg С, Larsson K, Rydevik B. Ultrastructural changes in spinal nerve roots induced by autologous nucleus pulposus. Spine 1996; 21: 411-4.

42. Olmarker K, Rydevik В, Nordborg С. Autologous nucleus pulposus induces neurophysiologic and histologic changes in porcine cauda equina nerve roots {see comments]. Spine 1993; 18: 1425-32.

43. Otani К, Arai I, Мао GP, Konno S, Olmarker K, Kikuchi S. Nucleus pulposus-induced nerve root injury. The relationship between blood flow and nerve conduction velocity. Manuscript.

44. Otani К, Мао GP, Arai I, Konno S, Olmarker K, Kikuchi S. Nucleus pulposus-induced increase in vascular permeability in the nerve root. Manuscript.

45. Petrovich MS, Hsu HY, Gu X, Dugal P, Heller KB, Sadum AA. Pentoxifylline suppression of TNF-alpha mediated axonal degeneration in the rabbit optic nerve. Neurol Res 1997; 19: 551-4.

46. Pichler WJ, Zanni M, von Greyerz S, Schnyder B, Mauri-HeUweg D, Wendiand T. High IL-5 production by human drug-specific T cell clones. Int Arch Allergy Immunol 1997; 113: 177-80.

47. Redford EJ, Hall SM, Smith KJ. Vascular changes and demyelination induced by the intra neural injection of tumour necrosis factor. Brain 1995; 118: 869-78.

48. Robache-Gallea S, Bruneau JM, Robbe H, Morand V, Capdevila C, Bhatnagar N, Chouaib S, Roman-Roman S. Partial purification and characterization of a tumor necrosis factor-alpha converting activity. Eur J Immunol 1997; 27: 1275-82.

49. Rjsendahl MS, Ко SC, Long DL, Brewer MT, Rosenzweig B, Held E, Anderson L, Pyle SM, Moreland J, Meyers MA, Kohno T, Lyons D, Lichenstein HS. Identification and characterization of a pro-tumor necrosis factor-alpha-processing enzeme from the ADAM family of zinc metalloproteinases. J Biol Chem 1997; 272: 24588-93.

50. Said G, Hontebeyrie-Joskowicz M. Nerve lesions induced by macrophage activation. Res Immunol 1992; 143: 589-99.

51. Sehnaj KV, Raine CS. Tumor necrosis factor mediates myelin and oligodendrocyte damage in vitro. Ann. Neurol 1988; 2: 339-46.

52. Shapira L, Houri Y, Barak V, Halabi A, Soskoine WA, Stabholz A. Human monocyte response to cementum extracts from periodontally deseased teeth: effect of conditioning with tetracycline. J Periodontol 1996; 67: 682-7.

53. Shapira L, Houri Y, Barak V, Soskolne WA, Halabi A, Stabholz A. Tetracycline inhibits" Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide-induced lesions in vivo and TNF- processing in vitro. J Periodontal Res 1997; 32: 183-8.

54. Sharief MK, Ingram DA, Swash M. Circulating tumor necrosis factor-alpha correlates with electrodiagnostic abnormalities in Guillain-Barre syndrome. Ann Neurol 1997; 42: 68-73.

55. Smith CS, Ortega G, Parker L, Shearer WT. Ceclosporin A blocks induction of tumor necrosis factor-alpha in human В lymphocytes. Biochem Biophys Res Commun 1994; 204: 383-90.

56. Sonuner С, Schmidt С, George A, Toyka KV. A metalloproteinase-inhibitor reduces pain associated behavior in mice with experimental neuropathy. Neurosci Lett 1997; 237: 45-8.

57. Sorkin LS, Xiao WH, Wagner R, Myers RR. Tumour necrosis factor-alpha induces ectopic activity in nociceptive primary afferent fibres. Neuroscience 1997; 81: 255-62.

58. Steinmeyer J, Daufeldt S, Taiwo YO. Pharmacological effect of tetracyclines on proteoglycanases from interleukin-1-treated articular cartilage. Biochem Pharmacol 1998; 55: 93-100.

59. Stoll G, Junq S, Jander S, van der Meide P, Hartung HP. Tumor-necrosis factor-alpha in immunomediated demyelination and Wallerian degeneration of the rat peripheral nervous system. Neuroimmunol 1993; 45: 175-82.

60. Takao Y, Mikawa К, Nishina К, Maekawa N, Obara H. Lidocaine attenuates hyperoxic lung injury in rabbits. Acta Anaesthesiol Scand 1996; 40: 18-25.

61. Teoh KH, Bradley СА, Gait J, Burrows H. Steroid inhibition of cytokine-mediated vasodilation after warm heart surgery. Circulation 1995; 92: 11347-53.

62. Tsukamoto Т, Ishikawa M, Yamamoto Т. Suppressive effects of TNF- on myelin formation in vitro. Acta Heurol Scand 1995; 91: 71-5.

63. Van der Poll T, Jansen PM, Van Zee KJ, Welborn MBr, de Jong I, Hack CE, Loetscher H, Lesslauer W, Lowry SF, Moidawer LL. Tumor necrosis factor-alpha induces activation of coagulation and fibrinolysis in baboons through an exclusive effect on the p55 receptor. Blood 1996; 88: 922-7.

64. Villarroya H, Violleau K, Ben Younes-Chennoufi A, Baumann N. Myelin-induced experimental allergic encephalomyelitic in Lewis rats: tumor necrosis factor alpha levels in serum of cerebrospinal fluid immunohistochemical expression in glial cells and neurophages of optic nerve and spinal cord. J Neuroimmunol 1996; 64: 55-61.

65. Wagner R, Myers RR. Schwann cells produce tumor necrosis factor alpha: expression in injured non-injured nerves. Neuroscience 1996; 73: 625-9.

66. Wagner R, Myers RR. Endoneurial injection of TNF- produces neuropathic pain behaviours. Neuroreport 1996; 7: 2897-901.

67. Wasaki S, Sakaida I, Uchida K, Kinura T, Kayano K, Okita K. Preventive effect of cyclosporin A on experimentally induced acute liver injury in rats. Liver 1997; 17: 107-14.

68. Wershil BK, Furuta GT, Lavigne JA, Choudhury AR, Wang ZS, Galli SJ. Dexamethasone cyclosporin A suppress mast celleukocyte cytokine cascades by multiple mechanisms. Int Arch Allergy Immunol 1995; 107: 323-4.

69. Yabuki S, Kawaguchi Y, Olmarker K, Rydevik B. Effects of lidocain on nucleus pulposus-induced nerve root injury. Spine 1998; 23: 29: 2383-89.

70. Zhu J, Bai XF, Mix E, Link H. Cytokine dichotomy in peripheral nervous system influences the outcome of experimental allerqic neuritis: dynamics of MRNA expression for I1-1 beta, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-, TMF-beta and cytolysin. Clin Immunol Immunopathol 1997; 84: 85-94.