аналоги витамина d3

Формула изобретения

1. Соединение формулы I

где R₁ означает водород, и R₂ означает С₁-С₄алкил; или

R₁ означает С₁-С₄алкил, и R₂ означает водород;

А означает –СН₂-СН₂-группу,

R₃ означает С₁-С₄алкил, гидрокси С₁-С₄алкил или фтор С₁-С₄алкил; и

R₄ означает С₁-С₄алкил, гидрокси С₁-С₄алкил или фтор С₁-С₄алкил.

2. Соединение по п.1, где r₁ означает водород и R₂ означает метил или R₁ означает метил и R₂ означает водород.

3. Соединение по п.2, где R₃ и R₄ означают независимо друг от друга метил, гидроксиметил или трифторметил.

4. Соединение по п.3, представляющее собой 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-холекальциферолом.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к соединению формулы

где

R₁ означает водород или алкильную группу,

R₂ означает водород или алкильную группу или

R₁, R₂ и С₂₀ вместе представляют циклопропил;

А означает

R₃ означает алкил, гидроксиалкил или фторалкил и

R₄ означает алкил, гидроксиалкил или фторалкил.

Было обнаружено, что соединения формулы I вызывают ингибирование пролиферации в линиях клеток опухолей предстательной железы, молочной железы и миелоидного лейкоза. Таким образом, соединения формулы I полезны для лечения рака предстательной железы, рака молочной железы и для лечения лейкоза.

Также было обнаружено, что соединения формулы I обладают антиандрогенной активностью. Поэтому соединения формулы I пригодны для лечения доброкачественной опухоли предстательной железы, алопеции и рака предстательной железы.

Также было обнаружено, что соединения формулы I обладают активностью, делающей их пригодными для лечения заболеваний сальных желез, как, например, угри или себорейный дерматит.

Также было найдено, что соединения формулы I обладают активностью, делающей эти соединения пригодными для лечения остеопороза.

Подробное описание изобретения

Используемый здесь термин "алкильная группа" означает алкильную группу с прямой или разветвленной цепочкой, содержащую 1-4 углеродных атома, например метил, этил, пропил, изопропил, бутил, трет-бутил и им подобные группы. Термин "гидроксиалкил" означает алкильную группу с заместителем в виде гидроксила при любом из углеродных атомов алкильной группы. Термин "фторалкил" означает алкильную группу, содержащую один, два или три атома фтора в виде заместителей при любом из углеродных атомов алкильной группы.

В представленных здесь формулах различные заместители представлены в виде присоединенных к ядру с помощью одного из следующих символов: клинообразная сплошная линия (), указывающая на заместитель, находящийся над плоскостью молекулы, и клинообразная пунктирная линия (), указывающая на заместитель, находящийся под плоскостью молекулы.

Предпочтительно R₁ означает водород и R₂ означает алкил или R₁ означает алкил и R₂ означает водород. Более предпочтительно R₁ означает водород и R₂ означает метил или R₁ означает метил и R₂ означает водород.

Предпочтительно R₃ и R₄ означают независимо алкил, гидроксиалкил или трифторалкил. Более предпочтительно R₃ и R₄ означают независимо друг от друга метил, гидроксиметил или трифторметил.

Предпочтительно А означает

Наиболее предпочтительным соединением формулы I является 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-холекальциферол.

Соединения формулы I получают, как описано далее, в полном соответствии с представленной ниже химической схемой.

Химическая схема

R₅ означает водород или триметилсилил.

В приведенной выше химической схеме, где Ph означает фенил, соединение формулы II, которое является [3S-(1E, 3, 5)]-[2-[3,5-[[бис(1,1-(диметилэтил)диметилсилил]окси]-2-метиленциклогексилиден]этил]дифенилфосфиноксидом, превращают в соединение формулы IA при реакции с соединением формулы III.

Реакцию проводят при температуре от -60°С до -90°С в полярном апротонном органическом растворителе, как, например, безводный простой эфир или более предпочтительно безводный тетрагидрофуран, в присутствии сильного основания, как, например, литийалкил, такой как бутиллитий.

Защитные группы соединений формулы IA удаляют при реакции с фтористыми солями, как, например, фтористый тетрабутиламмоний, в полярном органическом растворителе, например в простом эфире или более предпочтительно в тетрагидрофуране, и получают соответствующее соединение формулы I.

Соединение формулы II получают как здесь далее описано в примерах 1-6 или, альтернативно, как описано в примерах 7 и 8.

Соединения формулы III известны (например, из патента США №5087619) или они могут быть получены в соответствии с известными способами.

Полезная активность соединений формулы I в качестве средств для лечения рака предстательной железы, рака молочной железы и для лечения лейкоза может быть продемонстрирована следующими методами исследований, хорошо известными в данной области.

Выбранные материалы для использования здесь и примененные методики были следующими:

Линии клеток. Линия клеток рака молочной железы (MCF-7), линия клеток рака предстательной железы (LNCaP) и линия клеток миелоидного лейкоза (HL-60) сохранялись следующим образом: клетки MCF-7 содержались в модифицированной Дюльбекко среде Игла (DMEM) с 10% околоплодной сыворотки теленка (FCS); LNCaP и HL-60 культивировали в среде RPMI 1640 с 10% FCS. Все три линии клеток сохранялись в инкубаторе с температурой 37°С, содержащем 5% двуокиси углерода.

Производные витамина D₃. Производные витамина D₃ растворяли в абсолютном этаноле в концентрации 10^-3 М, такие растворы использовали в качестве исходных растворов, которые хранили при -20°С и защищали от света. Для использования in vitro соединения разбавляли в DMEM или в среде RPMI. Для применения in vivo соединения разбавляли забуференным фосфатом физиологическим раствором (ЗФР). Аликвоту использовали только один раз и клетки LNCaP подвергали действию трипсина. Промытые одноклеточные суспензии клеток подсчитывали и помещали в 24-ячеечные планшеты с плоским дном с общим количеством 110^-3 клеток/ячейка в объеме 400 мкл/ячейка. Питающий слой получали с агаром, который уравновешивали при 42°С. Перед этой стадией соединения с помощью пипетки помещали в ячейки. После инкубирования подсчитывали колонии. Все эксперименты были проведены как минимум три раза с использованием тройных планшетов для каждой экспериментальной точки.

Уровни кальция в сыворотке in vivo. Двадцать восемь самцов мышей Balb/c в возрасте от 8 до 9 недель содержались в условиях в отсутствии патогенов, мыши получали стандартный лабораторный рацион. Четырех мышей из группы инъецировали внутрибрюшинно каждый день (кроме субботы и воскресенья) либо производным витамина D₃, либо разбавителем (100 мкл/мышь) в течение 3 недель. Дозы 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃ составляли: 0,1, 0,5, 1,0 и 2,0 мкг. Дозы 1,25-дигидрокси-D₃ составляли 0,1 мкг/мышь. Контрольным мышам инъецировали 100 мкл ЗФР. Содержание кальция в сыворотке еженедельно измеряли с помощью анализа количественного колориметрического определения.

Эксперименты по импульсному воздействию. Клетки MCF-7 инкубировали в жидкой культуре с 10^-7 1,25-дигидрокси-D₃ или 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃ с различной продолжительностью. После инкубирования эти клетки тщательно промывали дважды ЗФР и жизнеспособные клетки подсчитывали и помещали в 24-ячеечные планшеты для анализа колоний на мягком агаре, как описано выше.

Анализ клеточного цикла с помощью проточной цитометрии. Анализ клеточного цикла проводили на клетках MCF-7, инкубированных в течение 4 дней либо с 1,25-дигидрокси-D₃, либо с 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃ в концентрации 10^-7 М. Клетки фиксировали в охлажденном метаноле в течение ночи перед окрашиванием с помощью 50 мкг/мл пропидийиодида, 1 мг/мл рибонуклеазы (100 ед./мл) и 0,1% NP40. Анализ осуществляли непосредственно после окрашивания. Все эксперименты проводили независимо как минимум три раза. Все данные были подвергнуты статистическому анализу с использованием критерия Стьюдента.

Анализ Вестерн-блоттингом. Клетки дважды промывали ЗФР, суспендировали в буфере для лизиса (50 мМ трис, рН 8,0, 150 мМ NaСl, 0,1% додецилсульфата натрия, 0,5% дезоксихолата натрия, 1% NP40, 100 мкг/мл фтористого фенилметилсульфонила, 2 мкг/мл апротинина, 1 мкг/мл пепстатина и 10 мкг/мл лейпептина) и помещали на лед на 30 минут. После центрифугирования при 15000 g в течение 20 минут при 4°С собирали надосадочную жидкость. Количественно оценивали концентрации белка. Все лизаты (15 мкг) разделяли с помощью полиакриламидного геля с 15% додецилсульфата натрия, переносили на фиксированную мембрану из поливинилидендифторида и подвергали анализу с помощью aнти-p27^kipl кроличьего поликлонального антитела и мышиного моноклонального антитела против актина. Блоты проявляли.

Теломеразная активность. Для определения относительной теломеразной активности проводили анализы протоколов амплификации теломерной последовательности (TRAP). Для человеческой теломеразной обратной транскриптазы (hTERT) выделяли все РНК из HL-клеток, которые обрабатывали или с 1,25-дигидрокси-D₃, или с 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃ (10^-9, 10^-8 и 10^-7 М) в течение 4 дней с помощью однофазового раствора фенола и изотиоцианата гуанидина. Полимеразную цепную реакцию с обратной транскриптазой (RT-PCR) осуществляли с 1 мкг общей РНК и случайными гексамерными затравками. кДНК была амплифицирована с использованием затравок, специфичных для гена hTERT или для гена GAPDH, и была использована в качестве контроля. Затравки, используемые для hTERT, были: 5’-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3’ (смысловая) /последовательность, идентифицированная №1, (Поел. ид. №1)/ и 5’-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3’ (антисмысловая) (Посл. ид. №2). Термические циклы осуществляли при 94°С в течение 90 секунд, далее 33 цикла с температурой 95°С в течение 20 секунд, 68С в течение 40 секунд и 72°С в течение 30 секунд. Затравками для гена GAPDH служили:5’-ССАТGGАGААGGСТGGGG-3’ (смысловая) (Посл. ид. №3) и 5’-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3’ (антисмысловая) (Посл. ид. №4). Условия амплификации GAPDH составляли: 94°С в течение 2 минут, 26 циклов с температурой 94°С в течение 30 секунд, 62°С в течение 40 секунд, 72°С в течение 60 секунд, затем 72°С в течение 4 минут. Продукты полимеразной цепной реакции подвергали электрофорезу на 1%-ном агарозном геле и окрашивали этидийбромидом.

Влияние аналогов витамина D₃ на анализ клоногенности. Клетки LNCaP, MCF-7 и HL-60 клонировали в мягком агаре в присутствии аналогов витамина ₃ в концентрации от 10^-11 до 10^-7 М. Были получены зависящие от дозы кривые и была определена эффективная доза (ED₅₀), вызывавшая 50%-ное ингибирование образования колоний. 1,25-Дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃ был эффективен при ингибировании клональной пролиферации трех линий клеток в зависимости от дозы. ED₅₀ 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃ составляла 1,410^-9 М для клеток LNCaP, 4,310^-9 М для клеток MCF-7 и 3,010^-11 М для клеток HL-60, это соединение было примерно в 10-100 раз более активно, чем 1,25-(дигидрокси)-D₃.

Уровни кальция в сыворотке in vivo. Поскольку гиперкальциемия является основным видом токсичности, вызываемой производными витамина D₃, кальциемические эффекты 1,25-дигидрокси-D₃ сравнивали с таковыми для 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃. Все мыши выжили при исследовании в течение трех недель. У всех мышей, получавших 0,1 мкг 1,25-дигидрокси-D₃, наблюдалась гиперкальциемия с уровнями кальция в сыворотке примерно 12 мг/дл (в норме 8,5-10,5 мг/дл). Наоборот, у мышей, получавших 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃ (0,1-2,0 мкг/мышь), обнаруживали почти такой же уровень кальция (8-10 мг/дл), как и у контрольных мышей (8-9 мг/дл).

Эксперименты по импульсному воздействию. Для исследования того, является ли ингибирование клоногенной пролиферации аналогами витамина D₃ обратимым, были проведены эксперименты по импульсному воздействию. Клетки MCF-7 подвергали воздействию либо 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃, либо 1,25-дигидрокси-D₃ с различной продолжительностью, тщательно промывали, помещали в полужидкий агар и подсчитывали число колоний на 14-ый день культивирования. Примерно сорок и тридцать процентов клоногенных клеток ингибировались на 4-ый день воздействия 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃ и 1,25-дигидрокси-D₃ соответственно.

Анализ клеточного цикла. Определяли эффект 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃ и 1,25-дигидрокси-D₃ (10^-7, 4 дня) на клеточный цикл клеток MCF-7. Значительное увеличение (Р0,05) числа клеток в фазе G₀-G₁ происходило с сопутствующим уменьшением относительного содержания клеток в фазе S.

Анализ Вестерн-блоттингом. Циклин-зависимые ингибиторы киназы, известные как р21^wafl и p27^kipl, способны ингибировать активность циклинкиназы и, таким образом, замедлять развитие клеток в течение клеточного цикла. Контрольные клетки MCF-7, как установлено, имели средний уровень экспрессии p21^wafl и p27^kipl, как определено с помощью анализа Вестерн-блоттингом. Воздействие в течение одного дня 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃ (10^-7 М) увеличивало экспрессию р21^wafl и p27^kipl примерно в 3,2-3,5 раза, тогда как в культуре с 1,25-дигидрокси-D₃ (10^-7 М) наблюдали увеличение экспрессии p21^wafl и p27^kipl примерно в 1,6-1,8 раза. Воздействие на клетки MCF-7 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃ (10^-7 М) в течение 3 дней приводило к 2,8-кратному и 3,4-кратному увеличению экспрессии p21^wafl и p27^kipl соответственно. 1,25-Дигидрокси-D₃ (10^-7 М, 3 дня) увеличивал экспрессию p21^wafl и p27^kipl в 4,8 раза и 3,3 раза соответственно.

Исследовали зависящее от дозы влияние производных витамина D₃ на экспрессию p27^kipl клеток HL-60. И 1,25-дигидрокси-D₃, и 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃ повышали регулирование экспрессии p27^kipl, и эти уровни заметно возрастали после инкубирования с 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃ (4 дня, 10^-9 М). Уровни p27^kipl заметно возрастали, когда клетки HL-60 культивировали с 10^-8-10^-7 М 1,25-дигидрокси-D₃.

Теломеразная активность. Применяя анализ TRAP, оценивали влияние 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃ и 1,25-дигидрокси-D₃ (10^-9-10^-7 М, 4 дня) на теломеразную активность. Теломеразная активность заметно уменьшалась в клетках HL-60, культивированных либо с 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃, 10^-9 М, либо с 1,25-дигидрокси-D₃, 10^-7 М.

Влияние аналогов витамина D₃ на экспрессию hTERT в клетках HL-60 оценивали, применяя RT-PCR. И 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃, и 1,25-дигидрокси-D₃ ингибировали экспрессию мРНК hTERT в зависимости от дозы с почти полным ингибированием экспрессии, происходящим при 10^-8 М 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃ и при 10^-7 М 1,25-дигидрокси-D₃.

Полезная активность соединений формулы I в качестве средств для лечения доброкачественных опухолей предстательной железы может быть продемонстрирована следующими способами исследований, известными в данной области.

На кастрированных, стимулированных тестостероном самцах сирийских хомячков оценивали антиандрогенную активность 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃. Исследования показали, что 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃ существенно подавлял у этих животных индуцированную андрогеном гипертрофию семенных пузырьков и вентральной предстательной железы, тогда как 1,25-дигидрокси-D₃ был неактивен в нетоксичных дозах (1 мкг).

Кастрированным самцам сирийских хомячков ежедневно вводили подкожно 20 мкг пропионата тестостерона и 1 мкг 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃ в течение 14 последующих дней. Оба соединения вводили в каждом случае в носителе из 0,2 мл кунжутного масла. Аутопсию проводили на 15-ый день. Предстательную железу и семенные пузырьки удаляли, осушали и взвешивали. Анализировали данные на статистическую значимость, используя критерий Стьюдента, и результаты выражали как процент ингибирования стимулированного ответа.

Ингибирование новообразований предстательной железы и семенных пузырьков у кастрированных стимулированных тестостероном хомячков представлено в табл.1

Материалы и методы

Животные и обработка:

Использовали трехмесячных взрослых особей самок крыс. После недели адаптации животных группировали в соответствии с массой тела и обрабатывали путем перорального введения 1 мл/кг/день 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃ в нескольких концентрациях. На седьмой день дозирования животных обескровливали и определяли уровень кальция в сыворотке.

Приготовление соединений

Соединение растворяли в 200 мл этанола установленной крепости для получения концентрации 100 мкг/мл. Носитель в виде кунжутного масла и раствор соединения в этаноле готовили для наивысшей дозовой концентрации, затем упаривали в роторном испарителе при 37°С для удаления этанола. Объем дозы рассчитывали, учитывая среднюю массу тела в группе, которой производится дозирование. Серийные разведения растворенного в носителе соединения делались до соответствующих дозовых концентраций.

Сбор сыворотки и определение

Кровь (1,5 мл) собирали от каждого животного путем пункции из глазницы при анестезии эфиром на седьмой день дозирования. Кровь собирали в сепараторные трубки для сыворотки, центрифугировали при 2000 об/мин в течение 15 минут и затем отбирали аликвотные пробы сыворотки для определений кальция. Кальций в сыворотке определяли колориметрическим анализом.

Результаты

Уровни кальция в сыворотке приведены в табл.2.

Уровни кальция в сыворотке находились в пределах нормального диапазона для групп, получавших дозу до 2 мкг/кг/день при обработке 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃.

Материалы и методы

Животные и обработка:

Трехмесячных взрослых особей самок крыс подвергали двусторонней овариэктомии или симулированному хирургическому вмешательству. Через неделю адаптации животных группировали в соответствии с массой тела и обрабатывали путем перорального введения 1 мг/кг определенной концентрации.

Объем дозы рассчитывали еженедельно, учитывая среднюю массу тела в группе. Дозирование начинали через 17 дней после хирургического вмешательства и продолжали в течение 19 дней. На 20-ый день животных подвергали безболезненному умерщвлению путем вдыхания двуокиси углерода и иссекали левые бедра.

Общий кальций бедренных костей:

При аутопсии иссекали левые бедра животных из всех групп и удаляли мягкую ткань. Кости измеряли и разрезали пополам посередине диафиза; затем дистальный участок разрезали пополам продольно после удаления эпифиза. Костный мозг вымывали и кальций экстрагировали путем погружения в 5%-ную трихлоруксусную кислоту. Содержание кальция в трихлоруксусных экстрактах анализировали, используя количественное колориметрическое определение кальция. Результаты выражали как средний общий кальций в костях в мг/дистальная половина бедренной кости (DHF)±сыворотка.

Сбор сыворотки и определение

Кровь (1,5 мл) собирали от каждого животного при пункции из глазницы при анестезии эфиром на день 7 и день 18 дозирования. Кровь собирали в сепараторные трубки для сыворотки, центрифугировали при 2000 об/мин в течение 15 минут и затем отбирали аликвотные пробы сыворотки для определений кальция. Кальций в сыворотке определяли с помощью колориметрического анализа.

Статистика:

Для подтверждения влияния овариэктомии на содержание кальция в костях сравнивали с использованием критерия Стьюдента группы, подвергшиеся симулированному хирургическому вмешательству /sham/ и подвергшиеся овариэктомии /ovx/ с обработкой наполнителем. Группы после овариэктомии сравнивали с помощью однонаправленного анализа расхождения (ANOVA) с последующей обработкой методом наименьших квадратов по Фишеру для сравнения каждой подвергшейся обработке группы с получавшей наполнитель группой, когда общий эффект был статистически значим.

Результаты

Влияние на кальций бедренной кости, приведенный к массе тела, представлено в табл.3.

Впервые была определена полезная активность соединений формулы I в качестве средств для лечения заболеваний сальных желез, как продемонстрировано следующими методиками испытаний, известными в этой области.

Растворяли 200 мкл 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃ в пропиленгликоле, ежедневно вводили (5 дней в неделю) с кормом самцам золотистых сирийских хомячков. Животных умерщвляли через 4 недели и уши подвергали обработке для гистологической оценки. Площадь сальных желез измеряли на гистологически полученных поперечных срезах уха с помощью анализа изображения.

Результаты приведены в табл.5.

Также была исследована общая липидная фракция от одного из ушей (экстракция органическим растворителем с последующим взвешиванием оставшегося липидного материала).

Результаты приведены в табл.6.

Соединения формулы I могут быть введены перорально для лечения рака молочной железы, рака предстательной железы или лейкоза людям, которые нуждаются в таком лечении. Более конкретно, соединения формулы I могут быть введены для такого лечения перорально взрослому человеку в дозах, лежащих в диапазоне примерно от 1 до 20 мкг в день.

Соединения формулы I могут быть введены перорально для лечения доброкачественной опухоли предстательной железы и алопеции людям, нуждающимся в таком лечении. Конкретнее, соединения формулы I могут быть введены для такого лечения перорально взрослому человеку в дозах, находящихся в пределах примерно от 1 до 20 мкг в день.

Соединения формулы I могут быть введены перорально для лечения остеопороза у людей в дозе примерно от 1 до 20 мкг в день.

Соединения формулы I могут быть применены местно для лечения алопеции у людей, нуждающихся в таком лечении. Более конкретно, соединения формулы I могут быть применены для такого лечения местно в дозах, которые лежат в пределах примерно от 5 до 50 мкг на грамм лекарственной формы для местного применения в день.

Соединения формулы I могут быть введены перорально для лечения заболеваний сальных желез у человека в дозе примерно от 1 до 20 мкг в день.

Пероральные дозированные лекарственные формы, включающие соединения формулы I по изобретению, могут быть включены в капсулы, таблетки и им подобные формы вместе с фармацевтически приемлемыми веществами-носителями.

Примерами фармацевтически приемлемых носителей, которые могут быть включены в капсулы и им подобные формы, являются следующие: связывающее вещество, как, например, трагакант, акация, кукурузный крахмал или желатина; наполнитель, как, например, вторичный кислый фосфат кальция; размельчающее средство, например кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота и им подобные; смазывающее вещество, как, например, стеарат магния; подсластитель, например сахароза, лактоза или сахарин; корригент, например мята перечная, масло грушанки или вишни. Другие различные вещества могут присутствовать в качестве оболочки или для того, чтобы иначе модифицировать физическую форму стандартной дозы. Например, таблетки могут быть покрыты шеллаком, сахаром или ими обоими. Сироп или эликсир могут содержать активное соединение, сахарозу в качестве подсластителя, метиловый и пропиловый эфиры парабензойной кислоты в качестве консервантов, краситель и ароматизатор, придающий, например, вкус вишни или апельсина.

Дозированные лекарственные формы для местного применения, содержащие соединения формулы I по изобретению, включают: мази и кремы, заключающие в себе готовые лекарственные формы, имеющие маслянистые, абсорбируемые, водорастворимые основы и основы эмульсионного типа, как, например, вазелин, ланолин, полиэтиленгликоли и им подобные соединения.

Лосьоны являются жидкими препаратами и отличаются от простых растворов наличием водных или гидроспиртовых препаратов, содержащих тонкоизмельченные вещества. Лосьоны могут содержать суспендирующие или диспергирующие средства, например производные целлюлозы, как, например, этилцеллюлоза, метилцеллюлоза и им подобные; желатину или гумми, которые включают активный ингредиент в наполнитель, составленный из воды, спирта, глицерина и им подобных веществ.

Гели являются полутвердыми препаратами, приготовленными путем загустевания раствора или суспензии активного ингредиента в несущем наполнителе. Наполнители, которые могут быть водными или безводными, загустевают при использовании образующего гель средства, как, например, карбоксиполиметилен, и нейтрализуются до надлежащей гелевой консистенции при использовании щелочей, как, например, гидроксид натрия, и аминов, например полиэтиленкокоамина.

Используемый здесь термин "местный" означает использование активного ингредиента, включенного в подходящий фармацевтический носитель и наносимого на участок воспаления для оказания местного действия. Соответственно, композиции для местного применения включают те фармацевтические формы, в которых вещество употребляется наружно при прямом контакте с кожей. Дозированные лекарственные формы для местного применения включают гели, кремы, лосьоны, мази, порошки, аэрозоли и другие общепринятые формы для нанесения лекарственного средства на кожу, полученные путем смешивания соединений формулы I с известными фармацевтическими носителями для местного применения.

Следующие примеры приведены для дальнейшего описания изобретения, но не для ограничения изобретения тем или иным образом.

Пример 1

(2R,3S,5S,7S)-2-[5.7-Бис[(1,1-диметилэтил)диметилсилил]окси]-4-метилен-1-оксаспиро[2.5]октан-2-метилацетат

К перемешиваемому магнитной мешалкой раствору 18,5 г (0,0523 моля) (2R, 3S, 5S, 7S)-5-гидрокси-4-метилен-7-[(1,1-диметилэтил)диметилсилилокси]-1-оксаспиро-[2,5]октан-2-метилацетата (Y. Kiegiel, P.M. Wovkulich and M.R. Uskokovic, Tetrahedron Letters, 32. pgs.6057-6060 (1991)) и 6,8 г (0,099 моля) имидазола в 50 мл диметилформамида прибавляли в атмосфере аргона 9,8 г (0,065 моля) трет-бутилдиметилсилилхлорида.

Реакционную смесь перемешивали 5 часов, прекращали реакцию при добавлении 5 мл воды, перемешивали 30 минут и выливали в 400 мл воды. Затем смесь экстрагировали гексаном (2500 мл) и серным эфиром (2500 мл). Органические слои объединяли, промывали 300 мл воды, сушили над сульфатом натрия и упаривали. После хроматографии на колонке с силикагелем получали 22,31 г (92%) указанного в заглавии соединения в виде бесцветного масла.

Пример 2

[3S-(1E,3,5)]-2-[3,5-Бис[[(1,1-диметилэтил)диметилсилил]окси]-2-метилен-циклогексилиден]этилацетат

В трехлитровую трехгорлую колбу, снабженную впускным отверстием для аргона, механической мешалкой и термометром, загружали 500 мл тетрагидрофурана и охлаждали до -60°С в бане с сухим льдом в ацетоне. Прибавляли порциями 43,23 г (0,108 моля) безводного гексахлорида вольфрама, поддерживая при этом температуру -60°С, и затем осуществляли быстрое прибавление по каплям 200 мл 1,6 М н-бутил-лития в гексане, поддерживая температуру ниже -45°С (около 5 минут). Баню с сухим льдом в ацетоне заменяли баней с водой и льдом, позволяя подняться температуре до 5°С. Цвет менялся от синего до хаки до появления черного цвета с красноватым оттенком. Через 30 минут прибавляли при 5°С быстро по каплям в течение 3 минут раствор 22,31 г (0,04884 моля) (2R, 3S, 5S, 7S)-2-[5,7-бис[(1,1-диметилэтил)-диметилсилил]окси]-4-метилен-1-оксаспиро[2,5]октан-2-метилацетата в 50 мл гексана. Через 4 часа реакционную смесь разбавляли 2 литрами гексана, фильтровали через слой силикагеля, который промывали 3500 мл гексана-этилацетата 9:1, и упаривали. Остаток хроматографировали на колонке с 75 г силикагеля, получали 22,56 г технического продукта. Хроматография среднего давления на колонке с силикагелем и элюирование смесью 100:1 дихлорметана-этилацетата приводили к 17,42 г (80,1%) указанного в заглавии соединения и небольшому количеству соответствующего 1Z-эпимера.

Пример 3

[3S-(1E,3,5)]-2-[3,5-Бис[[(1,1-диметилэтил)диметилсилил]окси]-2-метиленциклогексилиден]этилацетат (E-диен)

и

[3S-(1Z,3,5)]-2-[3,5-бис[[(1,1-диметилэтил)диметилсилил]окси]-2-метиленциклогексилиден]этилацетат (Z-диен)

К 465 мл безводного ТГФ при -78°С прибавляли при перемешивании 64,3 г (160 ммолей) WCl₆ (синий раствор), затем прибавляли 337,5 мл 1,43 М н-бутиллития в гексане (с такой скоростью, чтобы температура в реакционной смеси не поднималась выше -20°С). Затем смеси давали нагреться до комнатной температуры. Прибавляли по каплям раствор 24,5 г (53,6 ммолей) (2S, 3R, 5S, 7S)-2-[5,7-бис[(1,1-диметилэтил)-диметилсилил]окси]-4-метилен-1-оксаспиро[2,5]октан-2-метилацетата в 65 мл ТГФ и смесь перемешивали 4 часа. Смесь разбавляли 600 мл пентана и фильтровали через слой силикагеля в 4 см, промывая гексаном/этилацетатом (19:1), получали после выпаривания летучих примесей при пониженном давлении 27 г неочищенной смеси диенов. Дальнейшая очистка с помощью хроматографии при элюировании гексаном/этилацетатом (25:1) приводила к 21,6 г (91%) смеси (2:3) Z/E-диенов (указанные в заглавии соединения), которые разделяли с помощью хроматографии на силикагеле (гексан/этилацетат 40:1).

Z-диен, ¹Н-ЯМР : 0,052 (s, 6H), 0,06 (s, 6H), 0,87 (s, 9H), 0,89 (s, 9H), 1,74-1,90 (m, 2Н), 2,04 (s, 3Н), 2,20 (dd, J=6,0, 12,8 Hz, 1H), 2,41 (d, J=11,1 Hz, 1H), 4,19 (m, 1H), 4,42 (m, 1H), 4,61 (dd, J=7,3, 12,1 Hz, 1H), 4,68 (dd, J=7,3, 12,1 Hz, 1H), 4,80 (s, 1H), 5,20 (s, 1H), 5,47 (t, J=7,2 Hz, 1H). []²⁵_D=+1,2° (c=0,4, EtOH). Анализ, вычислено для С₂₃Н₄₄O₄Si₂: С 62,67; Н 10,06; найдено: С 62,55; Н 10,33.

Е-диен, ¹Н-ЯМР : 0,046 (s, 3Н), 0,057 (s, 3Н), 0,065 (s, 6H), 0,88 (s, 9H), 0,89 (s, 9H), 1,77 (ddd, J=3,1, 9,4, 11,9 Hz, 1H), 1,89 (m, 1H), 2,09 (s, 3Н), 2,31 (dd, J=2,0, 15,2 Hz, 1H), 2,39 (dd, J=6,3, 15,2 Hz, 1H), 4,21 (уш.s, 1H), 4,50 (m, 1H), 4,58 (dd, J=7,2, 12,9 Hz, 1H), 4,65 (dd, J=7,2, 12,9 Hz, 1H), 4,95 (s, 1H), 4,99 (s, 1H), 5,69 (t, J=7,2 Hz, 1H). []²⁵_D=+8,0° (с=0,5, ЕtOН). Анализ, вычислено для C₂₃H₄₄O₄Si₂: С 62,67; Н 10,06; найдено: С 62,42; Н 10,01.

Пример 4

[3S-(1E,3,5)]-2-[3,5-Бис[[(1,1-диметилэтил)диметилсилил]окси]-2-метилен-циклогексилиден]этанол

К перемешиваемому магнитной мешалкой раствору 10,84 г (0,0246 моля) [3S-(1E,3,5)]-2-[3,5-бис[[(1,1-диметилэтил)диметилсилил]окси]-2-метиленциклогексилиден]-этилацетата в 100 мл метанола прибавляли в атмосфере аргона 3,5 г гранул гидроксида натрия и реакционную смесь перемешивали под аргоном в течение 3 часов. Затем смесь упаривали в вакууме до объема 50 мл, разбавляли 500 мл воды, экстрагировали 2500 мл гексаном-диэтиловым эфиром 1:1. Органический слой промывали водой, сушили над сульфатом натрия и упаривали. Получали 9,80 г (100%) указанного в заглавии соединения в виде твердого вещества белого цвета.

Пример 5

1R-(1,3,5Е)-[[5-(2-Хлорэтилиден)-4-метилен-1,3-циклогександиил]бис-(окси)]бис(1,1-диметилэтил)диметилсилан

К перемешиваемому раствору 6,67 г (0,050 моля) N-хлорсукцинимида в 150 мл дихлорметана, охлажденному до 2°С в бане со льдом в ацетоне, в атмосфере аргона прибавляли по каплям в течение 2 минут 4 мл (0,055 моля) диметилсульфида. Образовывался белый осадок. Через 30 минут при 0°С баню заменяли на баню с сухим льдом в ацетоне и устанавливали температуру реакционной смеси -20°С. Прибавляли раствор 9,8 г (0,0246 моля) [3S-(1E,3,5)]-2-[3,5-бис[[(1,1-диметилэтил)-диметилсилил]окси]-2-метиленциклогексилиден]этанола в 60 мл дихлорметана. Через 15 минут охлаждающую баню удаляли и реакционную смесь перемешивали 50 минут и затем переносили в делительную воронку, содержащую 500 мл воды. Смесь экстрагировали 2350 мл гексана. Органический слой промывали 500 мл воды, сушили над сульфатом натрия и упаривали, получали 10,49 г технического продукта в виде жидкости желтого цвета. После очистки с помощью флэш-хроматографии получали очищенное, указанное в заглавии вещество в виде бесцветного масла.

ЯМР (CDCl₃) : 0,03 (s, 3H), 0,05 (s, 3H), 0,07 (s, 6H), 0,87 (s, 9H), 0,89 (s, 9H), 1,70-1,94 (m, 2H), 2,34 (m, 2H), 4,13 (m, 2H), 4,28 (m, 1H), 4,53 (m, 1H), 5,00 (m, 1H), 5,03 (m, 1H), 5,78 (tm, J=8 Hz, 1H).

Пример 6

[3S-(1E,3,5)]-[2-[3,5-Бис[[(1,1-диметилэтил)диметилсилил]окси]-2-метилен-циклогексилиден]этил]дифенилфосфиноксид

В трехгорлую колбу объемом 1 л, снабженную впускным отверстием для аргона, термометром и механической мешалкой, загружали раствор 10,26 г (0,0246 моля) 1R-(1,3,5Е)-[[5-(2-хлорэтилиден)-4-метилен-1,3-циклогександиил]бис(окси)]бис-(1,1-диметилэтил)диметилсилана в 100 мл свежеперегнанного безводного тетрагидрофурана и охлаждали в бане с сухим льдом и ацетоном до -65°С. Прибавление 0,5 М калийдифенилфосфида в тетрагидрофуране в течение 30 минут до устойчивого красного цвета требовало 60 мл реагента. После перемешивания 1 час при -65С прибавляли 10 мл воды и удаляли баню для охлаждения. Реакционная смесь обесцвечивалась. Затем прибавляли 200 мл дихлорметана и далее быстро 200 мл водного раствора, содержащего 10 мл 30% перекиси водорода. Через 1 час прибавляли 13,5 г сульфита натрия, 100 мл соляного раствора и 200 мл дихлорметана. После тщательного встряхивания фазы разделяли и водную фазу промывали 200 мл дихлорметана. Органические фазы промывали 200 мл соляного раствора. Объединенные органические слои сушили над сульфатом натрия, фильтровали и упаривали, получали 16,33 г технического продукта. Этот технический продукт очищали с помощью хроматографии среднего давления (силикагель G-60), получали 12,54 г (87%) указанного в заглавии соединения в виде кристаллов белого цвета.

ЯМР (CDCl₃) : 0,02 (s, 3H), 0,07 (s, 6H), 0,08 (s, 3H), 0,84 (s, 18H), 1,76 (m, 2Н), 2,98-3,15 (m, 2H), 4,06 (m, 1H), 4,37 (m, 1H), 4,53 (m, 1H), 4,72 (m, 1H), 4,79 (m, 1H), 7,45 (m, 6H), 7,72 (m, 4H).

Пример 7

Метиловый эфир E-(3S,5R)-[3,5-бис(трет-бутилдиметилсиланилокси)-2-метиленциклогексилиден]уксусной кислоты (Ro 65-8821)

Раствор 4,45 г (0,01043 моля) метилового эфира Z-(3S, 5R)-[3,5-бис(третбутил-диметилсиланилокси)-2-метиленциклогексилиден]уксусной кислоты (X) (A. Mowrino et al., Tetrahedron Letters, 38, pgs. 4713-4716 (1997) в 100 мл гексана облучали ультрафиолетовой лампой в течение 3 часов. После упаривания получали 4,25 г (95,5%) указанного в заглавии соединения в виде бесцветного масла.

ЯМР (CDCl₃) : 0,06 (s, 3H), 0,07 (s, 9H), 0,85 (s, 9H), 0,89 (s, 9H), 1,76 (m, 1H), 1,84 (m, 1Н), 2,70 (m, 1H), 3,36 (m, 1H), 3,70 (s, 3H), 4,26 (m, 1H), 4,58 (m, 1H), 5,07 (m, 2H), 5,91 (уш. s, 1H).

Пример 8

[3S-(1E,3,5)]-2-[3,5-Бис[[(1,1-диметилэтил)диметилсилил]окси]-2-метилен-циклогексилиден]этанол

К раствору 4,25 г (0,00996 моля) метилового эфира E-(3S,5R)-[3,5-бис(трет-бутил-диметилсиланилокси)-2-метиленциклогексилиден]уксусной кислоты в 100 мл толуола при -78°С прибавляли по каплям 25 мл 1,25 М диизобутилалюминийгидрида (0,03 моля) и реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа. После прибавления 5 мл метанола реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры. Затем смесь разбавляли 150 мл 2 М водного раствора калиевой-натриевой соли винной кислоты и интенсивно перемешивали. Органическую фазу отделяли, сушили над сульфатом натрия и упаривали досуха. Технический продукт очищали с помощью флэш-хроматографии с применением гексана-этилацетата 8:2, получали 2,8 г (70%) указанного в заглавии соединения в виде бесцветного воскообразного твердого вещества.

ЯМР (CDCl₃) : 0,05 (s, 3Н), 0,07 (s, 9Н), 0,88 (s, 9H), 0,91 (s, 9Н), 1,74 (m, 1H), 2,06 (m, 1H), 2,26 (dm, J=13,6 Hz, 1H), 2,40 (dd, J=13,6, 5,2 Hz, 1H), 4,30-40,11 (m, 3H), 4,53 (m, 1H), 4,98 (m, 1H), 5,00 (m, 1H), 5,80 (tm, J=7 Hz, 1H).

Пример 9

1,25-Дигидрокси-16-ен-5,6-транс-холекальциферол

Перемешиваемый раствор 796 мг (0,00137 моля) [3S-(1E,3,5)]-[2-[3,5-бис[[(1,1-диметилэтил)диметилсилил]окси]-2-метиленциклогексилиден]этил]дифенил-фосфиноксида в 10 мл безводного тетрагидрофурана обрабатывали при -78°С путем прибавления по каплям под аргоном 0,83 мл (0,00133 моля) 1,6 М н-бутиллития в гексане. К полученному таким образом окрашенному в красный цвет раствору прибавляли по каплям под аргоном в течение 10 минут раствор 280 мг (0,000803 моля) [3aR-[1(R),3а,7а]]-1-[1,5-диметил-5-[(триметилсилил)окси]гексил]-3,3а,5,6,7,7а-гексагидро-7а-метил-4Н-инден-4-она в 5 мл тетрагидрофурана. Реакционную смесь перемешивали при -78°С в течение 90 минут, затем реакцию останавливали путем добавления 40 мл смеси (1:1) 2 н. виннокислого калия-натрия и 2 н. бикарбоната калия и давали реакционной смеси нагреться до комнатной температуры. Реакционную смесь экстрагировали (3100 мл) этилацетатом. Органические слои промывали трижды водой/соляным раствором, сушили над сульфатом натрия и упаривали досуха. Такой технический продукт очищали с помощью флэш-хроматографии на колонке 40 мм 6’’ с силикагелем при элюировании гексаном-этилацетатом 40:1, получали 278 мг трисилилированного производного указанного в заглавии соединения и 140 мг исходного кетона.

Раствор 278 мг (0,000389 моля) этого трисилилированного промежуточного продукта в 8 мл безводного тетрагидрофурана обрабатывали 1,9 мл (1,9 ммоля) 1 М раствора тетрабутиламмонийфторида в тетрагидрофуране под аргоном в течение 17 часов. Реакцию останавливали при добавлении 6 мл воды и перемешивали 30 минут. После выпаривания тетрагидрофурана в вакууме оставшийся раствор экстрагировали этилацетатом 3100 мл. Органические слои промывали четырежды водой/соляным раствором, сушили над сульфатом натрия и упаривали досуха. Технический продукт, 192 мг, очищали с помощью флэш-хроматографии на колонке с силикагелем, которую предварительно промывали 1% раствором триэтиламина в этилацетате (300 мл); элюирование проводили этилацетатом. При этом получали 152 мг кристаллического соединения, указанного в заглавии. Образец, перекристаллизованный из тетрагидрофурана: метилформиата (0,3:7), имел t_пл 95-100°С. []²⁵_D+160,5° (EtOH, c=0,20). _mах 272/3 нм ( 20600).

Пример 10

Мягкая желатиновая капсула

Состав I представлен в табл.7.

Методика приготовления:

1. Готовят суспензию БГТ и БГА в миглиоле 812. Нагревают примерно до 50°С и перемешивают до растворения.

2. Растворяют 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃ в растворе от операции 1 при 50°С.

3. Охлаждают раствор от операции 2 до комнатной температуры.

4. Заполняют мягкие желатиновые капсулы раствором от операции 3.

Примечание: Все операции приготовления выполняют в атмосфере азота, защищая от попадания света.

Пример 11

Мягкая желатиновая капсула

Состав II представлен в табл.8.

Методика приготовления:

1. Готовят суспензию ди--токоферола в миглиоле 812. Нагревают примерно до 50°С и перемешивают до растворения.

2. Растворяют 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-D₃ в растворе от операции 1 при 50°С.

3. Охлаждают раствор от операции 2 до комнатной температуре.

4. Заполняют мягкие желатиновые капсулы раствором от операции 3.

Примечание: Все операции приготовления выполняют в атмосфере азота, защищая от попадания света.