штамм mycelia sterilia-продуцент комплекса биологически активных веществ, обладающих рострегуляторными свойствами

Формула изобретения

Штамм гриба Mycelia sterilia - продуцент комплекса биологически активных веществ, обладающих рострегуляторными свойствами, коллекционный номер ВКПМ F-833.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, продуцирующей биологически активные вещества, обладающие рострегуляторными свойствами, которые могут быть использованы в сельском хозяйстве при обработке таких культур как зерновые, крыжовник, смородина, картофель, огурцы, томаты, газоны и др.

Известно сообщество микроорганизмов для получения регуляторов роста растений, состоящее из микромицета Acremonium panaxeorum UHMU F-160, дрожжей Candida muscorum UHMU Y-411, Rhodotorula glutinis UHMU Y-42 и бактерий Azomonas macrocytogenes UHMU B-28 и Xantobacter sp UHMU B-29 (пат. РФ № 2100932). Недостатком указанного сообщества является сложность и трудоемкость его культивирования, нестабильность полученного препарата.

Известны препараты, стимулирующие развитие и рост растений, полученные из чистых культур грибов-эндофитов, выделенных из корней пшеницы, овса, картофеля, пырея, мать-и-мачихи. Каждый препарат состоит из растворенных в 70% этиловом спирте продуктов метаболизма соответствующего ему эндофита. Обработка одним из указанных препаратом семян пшеницы, огурцов или клубней картофеля перед посевом способствовала повышению урожая (Гельцер Ф.Ю. Новые продуценты стимулирующих веществ для растений. Доклады ВАСХНИЛ, № 5, 1975).

Известен препарат “Симбиот-2”, стимулирующий урожайность растений, полученный из продуктов метаболизма грибов-эндофитов (ав.св. СССР № 921488).

В качестве сырья для его изготовления используют эндофиты, выделенные из корней облепихи.

Недостатком известных стимуляторов роста является невысокая активность препаратов, полученных из эндофитов растений, обладающих наибольшей лекарственной ценностью.

Известен препарат Симбионт-1, изготавливающийся из эндофитов, выделенных из корней женьшеня. Препарат эффективен только при хороших условиях роста растений (ав.св. СССР № 370932).

Общий недостаток известных препаратов - невозможность идентифицировать получаемую с помощью известных штаммов продукцию, содержание значительных количеств спирта в препарате.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому изобретению является известный штамм Cylinddrocarpon magntsianum, являющийся продуцентом регулятора роста растений (патент Украины № 17558). Штамм выделен из корневой системы облепихи. В качестве питательной среды используют, г/л: глюкозу, КН₂РО₄, К₂НРО₄, MgSО₄, К₂SО₄, MnSО₄, FeSО₄, аспарагин. Основным его недостатком является сложность его получения в промышленном масштабе, штамм оказывает эффективность только в прикорневой зоне определенного растения-хозяина, наличие спирта в составе препарата.

Целью изобретения является расширение источников сырья из новых штаммов и повышение активности регулятора роста.

Цель достигается тем, что из корней багульника выделен новый штамм Mycelia sterilia. Штамм хранится в Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, коллекционный номер ВКПМ F-833. Штамм предназначен для получения биостимулятора роста растений.

Штамм выделен из корней багульника. Видовое название культуры Mycelia sterilia var. Ledum., наименование штамм НЖ-13. Родословная штамма: природный изолят. Подобный тип выделенного гриба сходен с грибами “эрикоидной микоризы”.

Культурально-морфологические особенности штамма: Аэроб. Гриб дает медленно растущие прижато-бархатистые колонии черного цвета (ростовой коэффициент по Бухало, 1988 - равен 10). У культур развит не только поверхностный, но и субстратный мицелий. Окраска среды под воздействием гриба не изменяется. При микроскопировании было выявлено, что гифы гриба темноокрашенные, с большим содержанием капель масла (диаметр гиф не превышает 3 мкм). На гифах формируется значительное количество интеркалярных, собранных в цепочки шаровидных хламидоспор.

Продукт, синтезируемый штаммом, - комплекс биологически активных веществ.

При культивировании штамма в течение 3-х недель в жидкой среде Гельцер с последующим выделением комплекса вторичных метаболитов полученный препарат дает увеличение показателя всхожести сельскохозяйственных культур на 20-30%, а также прирост гипокотиля экспериментальной линии горчицы 30-60% к контролю (воде).

Биологическую активность определяли, используя стандартную методику биотестов на семенах растений.

Штамм хранили на агаризованных питательных средах при температуре 4-7°С с пересевами один раз в 3 месяца.

Агаризованная среда Гельцер (ГА), г/л, рН 6,2-6,6:

Глюкоза 8,0

КН₂РО₄ 0,6

К₂НРО₄ 1,8

MgSО₄ 0,2

К₂SО₄ 0,1

MnSО₄ Следы

FeSО₄ Следы

L-аспарагин 0,02

Агар-агар 15,0

Вода До 1000 мл

Размножение культуры осуществляли путем пересева на агаризованной среде Гельцер, состав которой представлен выше.

Условия и состав среды для ферментации: на жидкой питательной среде Гельцер продолжительность культивирования 20-30 дней при температуре 26±1°С. Состав среды: жидкая питательная среда Гельцер, г/л, рН 6,0-6,4:

Глюкоза 8,0

КН₂РО₄ 0,6

К₂НРО₄ 1,8

MgSО₄ 0,2

К₂SО₄ 0,1

MnSО₄ Следы

FeSО₄ Следы

L-аспарагин 0,02

Вода До 1000 мл

Штамм не является зоопатогенным, не является фитопатогенным, не представляет опасности для окружающей среды.

Препарат на основе штамма НЖ-13 получили при выращивании культуры в колбах. Проводили культивирование в колбах, затем осуществляли грубую и тонкую фильтрацию. Затем полученный продукт лиофильно высушивали. При проведении биотестов и химических анализов использовали лиофильно высушенный фильтрат культуральной жидкости.

Содержание фитогормонов в препарате: цитокинины (ЦК), гибберелины (ГА) - определяли хроматографическим методом.

Цитокинины представляют собой наиболее активные природные соединения, участвующие в гормональной регуляции онтогенеза растений и характеризующиеся способностью индуцировать деление растительных клеток.

Гибберелловая кислота ГА₃ наиболее широко применяется в сельском хозяйстве как регулятор роста растений. Однако ГА₇ представляет наибольший интерес, т.к. имеет более широкий спектр действия и физиологическую активность выше.

Индолилуксусная кислота (ИУК) является ростстимулятором, но из-за плохой растворимости в воде и относительно высокой стоимости имеет узкий спектр рекомендованых для обработки культур.

Все эти соединения, относящиеся к известным регуляторам роста растений, подробно описаны в литературе /Регуляторы роста растений. Под редакцией Г.С. Муровцева. М., 1979/.

Заявляемый штамм позволил получить одновременно все эти соединения, что значительно повысило биологическую активность препарата и одновременно повысило экономическую эффективность его применения.

Биологическая активность сухого препарата на основе заявляемого штамма на мятлике, сорт Деним, (контроль-вода) и содержание фитогормонов в этом препарате приведены в таблице 1.

Способ получения штамма позволяет масштабировать процесс производства, что является необходимым условием коммерциализации проекта. Оптимальная концентрация штамма в препарате - 10 ppm.

В таблице 2 приведен элементный состав лиофилизированного препарата.

Анализ элементного состава показал, что препарат почти не содержит тяжелых металлов. В препарате по сравнению с питательной средой значительно увеличивается содержание калия и молибдена, содержание остальных элементов уменьшается.

Содержание свободных углеводов, мг/г сух. веса:

Сахароза 178

Глюкоза 376

Фруктоза 91

Маннит 106

В препарате содержатся следующие аминокислоты: лизин - 0,0066, гистидин - 0,0547, аспарагин - 0,0221, серин - 0,0050, глутамин - 0,0121, глицин - 0,0218, аланин - 0,0410, валин - 0,0513. Аминокислоты определяли методом ионнообменной хроматорграфии. При проведении жесткого гидролиза (с целью определения связанных аминокислот) в препарате определяется довольно широкий спектр аминокислот, присутствующих в небольших количествах. Качественный состав свободных аминокислот менее разнообразный, они также присутствуют в небольших количествах.

В препарате содержатся жирные кислоты, в том числе арахидоновая кислота, которая является важным компонентом комплекса метаболитов, стимулирующая рост и развитие растений. Содержание жирных кислот определяли методом газожидкостной хроматографии.

В препарате также содержится аскорбиновая кислота и цитрин (витамин Р). Определялись методом цветных реакций.

Данные по химическому составу препарата, мг/г сух. веса:

Фитогормоны 18,478

Аминокислоты 0,0660

Углеводы 751,000

Зольные элементы 27,737

Полученный биостимулятор осаждают этанолом, ацетоном, термоустойчив до 150°С, характеризуется биологической стабильностью, устойчив к воздействию микроорганизмов.

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1.

Штамм Мусеliа sterilia растет на богатой органической среде (жидком сусле) в условиях аэрации при 20-30°С, в течение 48 часов продуцирует 25 г вторметаболитов, проявляющих биостимулирующую активность. Культивирование штамма осуществляют на жидкой питательной среде Гельцер, продолжительность культивирования 20-30 дней при температуре 26±1°С.

Состав среды: жидкая питательная среда Гельцер, г/л, рН 6,0-6,4:

Глюкоза 8,0

КН₂РO₄ 0,6

К₂НРO₄ 1,8

MgSO₄ 0,2

К₂SO₄ 0,1

MnSO₄ Следы

FeSO₄ Следы

L-аспарагин 0,02

Вода До 1000 мл

В качестве источника углеродного питания использовали глюкозу в концентрации 1,0% или 2,0 вес.%.

При культивировании на жидкой питательной среде заявляемый штамм требует дополнительный фактор роста - ферментализат БВК в количестве 0,2%. Выращивание осуществляют при 28-30°С, в условиях аэрации и перемешивании в колбах объемом 750 мм³ со 100 мл среды указанного состава в течение 48 часов на качалках (220 об/мин). Было установлено оптимальное значение рН для роста культуры Mycelia sterilia 6,8-7,0 и для синтеза метаболитов - 6,8-7,2.

Процесс идет стабильно, штамм устойчиво сохраняет свойство синтезировать метаболиты в пяти последовательных ферментациях.

Полученный жидкий препарат на основе заявляемого штамма осторожно перемешивали и применяли для обработки (внесение в почву) посадок сеянцев ели, крыжовника, смородины (внекорневая подкормка), картофеля (полив всходов), капусты поздней (подкормка рассады накануне высадки в грунт), томаты (внекорневая подкормка), огурцы (полив всходов). Вели морфофизиологические и фенологические наблюдения, учитывали урожай продукции, определяли некоторые параметры, характеризующие качество продукции. Результаты по отдельным культурам приведены в таблице 3. Контроль (100%) - показатели продукции с участка, не обрабатываемого заявляемым штаммом.

Заявляемый штамм осуществляет положительное влияние на растения посредством прямой и непосредственной стимуляции роста растений за счет синтеза различных метаболитов, полезных для растений. Препарат, изготовленный на основе заявляемого штамма, найдет широкое применение в современной агробиотехнологии.

Вторметаболиты, состав которых указан в таблице 1, синтезируемые заявляемым штаммом, использовали также при обработке посевов зерновых как путем обработки семян, так и опрыскивания растений по всходам. Кроме того, положительный результат получен при обработке посевов подсолнечника, сахарной свеклы, гречихи. Урожайность по этим культурам повысилась в среднем на 32-34%.

Заявляемый штамм при проведении патентного и информационного поиска на уровне техники не обнаружен, в связи с чем можно сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения условиям патентоспособности, предусмотренной Патентным законом РФ.