рекомбинантная плазмида pgbp450f для получения трансгенных растений и способ получения трансгенных растений табака с повышенной продуктивностью и устойчивостью к грибным фитопатогенам

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pGBP450f для получения трансгенных растений с повышенной продуктивностью и устойчивостью к грибным фитопатогенам, содержащая в составе EcoRI-фрагмента длиной 2535 п.о. окаймленную последовательностями 35S промотора и терминатора вируса мозаики цветной капусты комплементарную ДНК гена CYP11A1 длиной 1754 п.о., кодирующего белок-предшественник цитохрома P450scc (P450XIA1) из коры надпочечников быка с лидерным N-концевым экстрапептидом из 39 а.о. и суммарной молекулярной массой 60,3 кДа, и состоящая из находящегося под контролем nos-промотора гена фосфинотрицин-ацетилтрансферазы (ген bar), обуславливающего устойчивость к фосфинотрицину; полилинкера; гена устойчивости к канамицину; участка начала репликации (ori) из плазмиды широкого круга хозяев pSa.

2. Способ получения трансгенных растений табака путем кокультивации их протопластов с рекомбинантной плазмидной ДНК pGBP450f, линеаризованной путем гидролиза эндонуклеазой рестрикции Bsp 1201 по уникальному сайту 5"-GGGCCC.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к созданию плазмиды pGBP450f, а также к способу получения трансгенных растений, несущих цитохромы Р450 животных.

В растениях обнаружено и изучено около 150 цитохромов, относящихся к классу цитохромов Р450. Данные белки вовлечены во многие процессы первичного и вторичного метаболизма, включая биосинтез лигнинов, терпеноидов, стеринов, жирных кислот, гормонов, пигментов, фитоалексинов и т.д. Растительные цитохромы Р450 участвуют как в регуляции процессов роста и развития, так и в индукции защитной реакции растений [CRC Crit. Rev. Biochem., 1986, Т.19, С.247-305]. Например, цитохром CYP90 является ключевым ферментом биосинтеза брассиностероидов (биологически активных стероидов растений) в арабидопсисе [Cell, 1996, V.65, Р.171-182]. Интрон-экзонная структура и последовательность консервативных и функционально-важных доменов CYP90 имеет высокую степень гомологии с таковыми Р450-монооксигеназ млекопитающих, включая стероидные гидроксилазы, одной из которых является цитохром P450_scc (P450XIA1) [DNA, 1993, V.12, Р.1-51]. Дефект (мутация) гена cpd, кодирующего CYP90, приводит к нарушению роста гипокотиля у растений арабидопсиса. Это может быть обусловлено отсутствием С23-гидроксилированных производных брассинолида катастерона, экдизонподобного растительного стероидного гормона [Annu. Rev. Plant Physiol.&Plant. Mol. Biol., 1988, V.39, P.2352-2371].

В последнее время для создания трансгенных растений, характеризующихся интенсивным ростом, развитием и повышенной устойчивостью к фитопатогенам используются природные растительные гены, контролирующие уровень таких гормонов роста, как, например, индолил-3-уксусная кислота [Science, 1994, V.265, Р.1699-1701], гены, кодирующие растительные липооксигеназы [The Plant Cell, 2001, V.13, N.3], а также гены других ферментов, катализирующих синтез важных регуляторных молекул.

Известны наиболее близкие к заявленным рекомбинантная плазмида pK22rs, содержащая ген пептидного антибиотика из Raphanus sativus, и способ получения трансгенных растений, включающий трансформацию генома растений указанной плазмидой (Пат. РФ №2176669, МКИ С 12 N 15/29, опубл. 10.12.2001). Однако использование трансгенных растений, содержащих ген антибиотика, не может считаться абсолютно безвредным для человека.

Изобретение решает задачу создания рекомбинантной плазмидной ДНК pGBP450f, содержащей кДНК гена CYP11A1 из коры надпочечников быка, а также разработку способа получения трансгенных растений, экспрессирующих кДНК гена CYP11A1 животных, с повышенной продуктивностью и устойчивостью к грибным фитопатогенам, безвредных для человека.

Поставленная задача решается за счет того, что рекомбинантная плазмидная ДНК pGBP450f содержит в составе EcoRI-фрагмента длиной 2535 п.о. окаймленную последовательностями 35S промотора и терминатора вируса мозаики цветной капусты комплементарную ДНК гена CYP11A1 длиной 1754 п.о., кодирующий белок-предшественник цитохрома P450_scc (P450XIA1) из коры надпочечников быка с лидерным N-концевым экстрапептидом из 39 а.о. и суммарной молекулярной массой 60,3 кДа, и состоит из находящегося под контролем nos-промотора гена фосфинотрицин-ацетилтрансферазы (ген bar), обуславливающего устойчивость к фосфинотрицину; полилинкера; гена устойчивости к канамицину; участка начала репликации (ori) из плазмиды широкого круга хозяев рSа; последовательностей RB и LB, а также за счет того, что в способе получения трансгенных растений путем кокультивации их протопластов с рекомбинантной плазмидной ДНК кокультивацию проводят с использованием рекомбинтной плазмидной ДНК pGBP450f, линеаризованной путем гидролиза эндонуклеазой рестрикции Bsp120I по уникальному сайту 5"-GGGCCC.

Известно, что в коре надпочечников быка экспрессируется белок P450XIA1, который катализирует начальную лимитирующую стадию стероидогенеза - отщепление боковой цепи холестерина и превращение его в прегненолон [Ann. Rev. Biochem., 1987, V.56, Р.945-993].

Для осуществления заявленного изобретения из коры надпочечников быка вначале выделяют суммарную РНК, а затем из нее - фракцию мРНК. Используя полученный препарат мРНК в качестве матрицы, с помощью обратной транскрипции на ней синтезируют двухцепочечные кДНК, которые далее используют для создания кДНК клонотеки. При помощи гибридизации с радиоактивно меченным зондом, сконструированным на основе известной аминокислотной последовательности цитохрома P450XIA1, отбирают клоны, несущие последовательность гена CYP11A1 из коры надпочечников быка. Фрагмент, представляющий собой полноразмерную кДНК незрелого P450XIA1 и содержащий собственный инициирующий кодон, клонируют в векторе pDH51 под контролем 35S промотора. Из полученного промежуточного вектора с помощью эндонуклеаз рестрикции вырезают кассету, содержащую 35S промотор, кДНК гена цитохрома P450XIA1 (P450scc) и терминатор. Данную кассету встраивают в вектор pGreen0229. Отбирают векторы, содержащие кассету в ориентации “голова к хвосту” (pGBP450f) и “хвост к хвосту” (pGBP450b) по отношению к гену bar под контролем nos промотора, который присутствует в векторе pGreen0229 изначально. Для трансформации растений табака методом кокультивации протопластов используют ДНК векторов, линеаризованную с помощью эндонуклеаз рестрикции. Отбор трансформантов проводят на селективных средах. Наличие встроенных генов определяют методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) и гибридизации по Саузерну. Устойчивость растений к фитопатогенам определяют стандартными методиками.

Последовательность выделенной нами кДНК гена CYP11A1 из коры надпочечников быка (1754 п.о.), использованной в дальнейшем для создания рекомбинантной плазмиды для ее экспрессии в растениях, приведена на фиг. 1.

Использование плазмиды pGBP450f, описанной в данном изобретении, позволяет достаточно простым путем вводить кДНК гена CYP11A1 из коры надпочечников быка в геном растений для создания линий и сортов растений с более интенсивным ростом и с повышенной устойчивостью к фитопатогенам, чем исходная нетрансформированная форма.

Изобретение иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1. Клонирование полноразмерной кДНК гена CYP11A1 из коры надпочечников быка.

Тотальную клеточную РНК выделяют из коры надпочечников быка гуанидинтиоцианатным методом [Biochemistry. 1979. V.18. Р.5294-5299]. 20 г ткани замораживают в жидком азоте и растирают до порошкообразного состояния, проводят экстракцию 40 мл лизирующего буфера следующего состава: 50 мМ трис-гидрохлорид, рН 7,6, 25 мМ ЭДТА (этилендиаминотетрауксусная кислота), 0,07 мМ 2-меркаптоэтанол, 2% N-лаурилсаркозил. Полученный лизат трижды экстрагируют смесью фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (200:200:4) до исчезновения интерфазы. Фазы разделяют центрифугированием 5 мин 5000 об/мин. Из водной фазы РНК осаждают 3 М ацетатом натрия (рН 6,05) в течение ночи в ледяной бане. Полученный осадок собирают центрифугированием, растворяют в ТЕ-буфере (0,05 мМ трис-гидрохлорид, рН 7,5, 0,01 мМ ЭДТА) и осаждают этанолом в присутствии 0,3 М хлористого натрия.

Качество полученного препарата РНК исследуют методом гель-электрофореза в агарозном геле в присутствии формальдегида. Пробы растворяют в 20 мкл денатурирующего буфера следующего состава: 3 мкл 36% формальдегида, 7 мкл формамида концентрированного и 8 мкл буфера для электрофореза (фосфоацетатный буфер). РНК прогревают в течение 5 мин при 65С и вносят в лунки 0,8% агарозного геля, приготовленного на электродном буфере, содержащем 1.1 М формальдегид. Гель окрашивают бромистым этидием (0,5 мкг/мл) и фотографируют в ультрафиолете.

Препарат поли(А)⁺-PHK получают хроматографией на олиго(dТ)-целлюлозе [PNAS. 1972. V.69. Р.1408-1412]. Спиртовой осадок РНК растворяют в 10 мл 0,01 М трис-гидрохлорида (рН 7,5), содержащем 0,5 М хлорид калия и наносят на колонку с олиго((dТ)-целлюлозой. Колонку промывают 10 объемами раствора 0,5 М хлорида калия. РНК элюируют раствором 0,01 М трис-гидрохлорида, рН 7,5.

На выделенной поли(А)⁺-PHK синтезируют двухцепочечную кДНК; далее ее встраивают с помощью соответствущего полилинкера в ДНК плазмидного вектора pUC 13 по EcoRI-сайту. Отобранные на селективной среде белые колонии (рекомбинантные клоны) анализируют методом гибридизации на фильтрах с ³²Р-меченным олигонуклеотидным зондом, комплементарным как экстрапептиду, так и началу зрелого фермента P450XIA1. Радиоактивную метку вводят в зонд методом ник-трансляции, который включает две ферментативные реакции: введение в ДНК с помощью ДНКазы I случайно распределенных однонитевых разрывов (ников) с дальнейшим их расширением и одновременной достройкой с помощью ДНК-полимеразы I E. coli. Комплементарный олигонуклеотид инкубируют в смеси следующего состава: 0,05 М трис-гидрохлорида (рН 7,5), 5 мМ хлорида магния, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 50 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, ДНК (примерно 0,1 мкг), все дезоксинуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), в присутствии ДНКазы I и ДНК-полимеразы I E. coli (+15С, 30 мин). Меченый зонд выделяют из реакционной смеси на колонке с сефадексом G-50.

Соответствие клонированной последовательности кДНК гена CYP11A1 подтверждают посредством частичного секвенирования и рестрикционного анализа, а также гибридизацией с геномной ДНК быка по Саузерну (J. Mol. Biol. 1975. V.98. Р.503-517). Полученная кДНК кодирует белок-предшественник P450XIA1, состоящий из 520 аминокислотных остатков (а.о.), на NН₂-конце которого содержится экстрапетид (39 а.о.), обусловливающий способность белка проникать через митоходриальную мембрану, где он подвергается процессингу и приобретает каталитическую активность. Плазмида, несущая кДНК гена белка P450XIA1, названа pUC13-P450XIAl.

PvuII-PvuII фрагмент кДНК CYP11A1 из pUC13-P450XIAl переклонируют по РvuII-сайту в плазмидный вектор pDSl. Плазмиды pUC13-P450XIAl и pDSl обрабатывают эндонуклеазой рестрикции PvuII в условиях, рекомендованных фирмой-производителем ("Сибэнзим", Новосибирск) при четырехкратном избытке фермента. Реакцию проводят в объеме 25-50 мкл 2 ч при 37С. Инкубационную смесь далее экстрагируют смесью фенол/хлороформ (1:1) рН 8,0, ДНК осаждают двумя объемами этилового спирта в присутствии 0,1 М хлорида натрия в ледяной бане и собирают центрифугированием в течение 10 мин при 5000 об/мин. Осадок растворяют в однократном трис-боратном буфере, фрагменты рестрикции разделяют при помощи агарозного гель-электрофореза в этом же буфере [Молекулярное клонирование. - М.: Мир, 1984. С.240-242].

Разделенные фрагменты ДНК выделяют из геля посредством электроэлюции. Электрофоретические зоны, содержащие нужные фрагменты, вырезают из геля, помещают в диализные мешки и подвергают электроэлюции в однократном трис-боратном буфере при напряжении 80V в течение 1 ч. Элюат экстрагируют смесью фенол/хлороформ (1:1) и очищают на микроколонке с сефадексом G-50 в ТЕ-буфере, осаждают этиловым спиртом и проверяют гель-электрофорезом в агарозе. Лигирование проводят при стандартных условиях: 12 ч при +15С при пятикратном избытке вставки по отношению к векторному фрагменту [Молекулярное клонирование. - М.: Мир, 1984. С.240-242]. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки Е. coli JM109. Трансформацию проводят с применением CaCl₂ [Молекулярное клонирование. - М.: Мир, 1984. С.240-242]. Из устойчивых к ампициллину рекомбинантных клонов выделяют плазмидную ДНК по методу Бирнбойма и Долли [Nucleic Acids Res. 1979. V.7, Р.1513-1517]. Трансформированные клетки Е. coli JM109 выращивают в жидкой среде YT с ампициллином (100 мкг/мл), содержащей 5 г NaCl (о.с.ч.), 8 г триптона ("Difco", США), 5 г дрожжевого экстракта ("Difco", США) в течение ночи при 37С. Клетки (10 мл культуры) осаждают центрифугированием 3000 об/мин 20 мин, ресуспендируют в 200 мкл буфера следующего состава: 25 мМ трис-гидрохлорида рН 8,0, 50 мМ глюкозы, 20 мМ ЭДТА, 2 мг/мл лизоцима ("Sigma", США), затем добавляют 200 мкл раствора 0,2 N NaOH с 1% SDS, инкубируют до полного просветления суспензии в ледяной бане. Добавляют 150 мкл 3 М ацетата натрия рН 4,8, перемешивают и удаляют осадок центрифугированием (20 мин, 3000 об/мин). ДНК из супернатанта осаждают двумя объемами этилового спирта, осадок растворяют в 0,3 М ацетате натрия (рН 6,0) и осаждают двумя объемами этилового спирта. Осадок, собранный центрифугированием, растворяют в ТЕ-буфере. Физическое картирование полученной рекомбинантной ДНК проводят с помощью эндонуклеаз рестрикции PvuII, КрnI, BamHI, SphI.

Пример 2. Получение плазмидной ДНК (плазмиды) pGBP450f.

Удобным вектором для молекулярно-генетических манипуляций является плазмида pDH51. Она является производной плазмиды pUC18 и содержит в своем составе промотор и терминатор вируса мозаики цветной капусты [NAR. 1986. V.14. Р.5857-5868]. Между промотором и терминатором находятся сайты узнавания некоторых широко используемых рестриктаз (SmaI, ВаmHI, XbaI, SalI, PstI, SphI). Удобным является также и то, что экспрессирующую кассету можно вырезать из вектора с помощью сразу нескольких рестриктаз (EcoRI, NcoI, SstI, HindIII). Вектор является многокопийным и несет ген устойчивости к ампициллину.

Полученная конструкция pDHP450scc является удобной при создании векторов, предназначенных для переноса гена CYP11A1 в геном растений, т.к. в ее последовательности удобно расположены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, что позволяет легко вырезать кассету с геном CYP11A1 для переклонирования в других плазмидах.

Для создания вектора pDHP450scc ДНК плазмиды pDH51 гидролизуют эндонуклеазой рестриции SmaI при 30С в буфере, содержащем 33 мМ трис-ацетат (рН 7,9 при 37С), 10 мМ ацетат магния, 66 мМ ацетат калия, 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина. Затем после тепловой инактивации рестриктазы ДНК вектора дефосфорилируют инкубацией с 1 единицей щелочной фосфатазы при 37С. Продукты реакций разделяют в 1% агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Фрагмент геля, содержащий линеаризованный вектор, вырезают с помощью скальпеля, затем из него с использованием процедуры замораживания-оттаивания выделяют ДНК. После очистки путем экстракции смесью фенол-хлороформ ДНК вектора лигируют с PvuII-фрагментом, содержащим полноразмерную кДНК гена цитохрома P450scc быка. Реакцию лигирования проводят в течение ночи при 16С с помощью ДНК лигазы фага Т4. Лигированную ДНК используют для трансформации штамма DH5 (генотип thi-1; hsdR17; gyrA96; recA1; endAl; glnV44; relAl; phi80dlacZdelM15; phoA8; lambda-) no стандартной методике с использованием хлорида кальция (см. пример 1). Трансформированные клетки отбирают на агаризованной среде LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Для проверки наличия плазмиды отдельные колонии отсевают в пробирку с 4 мл LB с ампициллином. Плазмидную ДНК выделяют, как было описано выше. Полученные препараты анализируют с помощью эндонуклеаз рестрикции. Отбирают плазмиду, содержащую вставку последовательности, которая кодирует цитохром P450scc быка. Проверяют правильность ориентации вставки с помощью рестрикции.

При конструировании вектора для переноса последовательности кДНК гена цитохрома P450scc быка в растения была использована плазмида pGreen0229, которая представляет собой удобный вектор для трансформации растений [Plant Molecular Biology. 2000. V.42. Р.819-832]. Она содержит под контролем nos-промотора ген фосфинотрицин-ацетил-трансферазы (ген bar), который обуславливает устойчивость к фосфинотрицину. В векторе также имеется удобный для клонирования полилинкер, ген устойчивости к канамицину для отбора в бактериях, участок начала репликации (ori) из плазмиды широкого круга хозяев pSa, что позволяет поддерживать плазмиду не только в Escherichia coli, но и в Agrobacterium tumefaciens. Ген bar и полилинкер фланкированы участками RB и LB, необходимыми для агробактериальной трансформации.

Плазмиды pGreen0229 и pDHP450scc гидролизуют эндонуклеазой рестрикции ЕсоRI при 37С в буфере, содержащем 10 мМ трис-НСl (рН 8,5), 10 мМ хлорид магния, 100 мМ хлорид калия, 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина. После тепловой инактивации рестриктазы ДНК вектора pGreen0229 дефосфорилируют с помощью 1 единицы щелочной фосфатазы в той же реакционной смеси. Очистку фрагментов в агарозном геле, лигирование и трансформацию проводят так же, как было описано выше. Отбор трансформантов проводят на агаризованной среде LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина. После выделения плазмидной ДНК по методу щелочного лизиса ее анализируют с помощью эндонуклеаз рестрикции. Отбирают клоны, содержащие плазмиды со вставками в ориентации “голова к хвосту” (pGBP450f) и “хвост к хвосту” (pGBP450b) по отношению к гену bar под контролем nos-промотора [Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984]. Схема полученной конструкции представлена на фиг. 2.

Пример 3. Трансформация растений с использованием плазмидной ДНК pGBP450f и анализ включения кДНК гена CYP11A1 в геном трансформированных растений и ее экспрессии в них.

Подготовку ДНК плазмид pGreen0229 (пустой вектор) и pGBP450f (содержит нужный ген) для трансформации проводят следующим образом. ДНК выделяют из штамма Е. coli DH5 [pGBP450f] по методике, указанной в примере 1, в пересчете на больший объем. Для трансформации выделенную и очищенную плазмиду вначале линеаризуют с помощью соответствующей эндонуклеазы рестрикции. Вектор pGBP450f, который содержит последовательность гена CYP11A1 под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты линеаризуют путем гидролиза эндонуклеазой рестрикции Вsp 120I при 37С в буфере, содержащем 10 мМ трис-НСl (рН 7,5 при 37С), 10 мМ хлорид магния, 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина. Для плазмиды pGreen0229 используют гидролиз рестриктазой HindIII при 37С в буфере, содержащем 10 мМ трис-НСl (рН 8,5 при 37С), 10 мМ хлорид магния, 100 мМ хлорид калия, 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина. Обработанные плазмиды (2-3 мкл) разделяют в 0,8% агарозном геле для подтверждения полноты рестрикции. ДНК плазмид осаждают этанолом, промывают 75% этанолом и высушивают в стерильном потоке воздуха. Плазмиду растворяют в стерильной дистиллированной воде, концентрацию доводят до 1 мкг/мкл.

Получение трансгенных растений проводят на растениях табака. Могут быть использованы и другие двудольные и однодольные растения.

Для трансформации используют асептическую культуру линии табака Nicotiana tabacum cv. petit Havana SRI. Табак культивируют при 24/18С, 16/8-часовом фотопериоде, освещенности порядка 2000-3000 лк.

Для трансформации используют листья 6-8-недельных растений табака, выросших в стерильных условиях. Листья нарезают в растворе фермента и оставляют для выделения протопластов на 16-18 ч при температуре 24С в темноте. Выделение протопластов осуществляют в ферментативном растворе следующего состава: 0,4 М среда К3 (макросоли К3, микросоли В5, хелатирующий агент, витамины К3, ксилоза, сахароза, 2,4 D, НУК, БАП (рН 5,8), агароза “Sea plag”), целлюлаза R-10, мацерозим R-10, рН 5,6.

На следующий день смесь фермента с протопластами фильтруют через металлическую сеточку диаметром 100 мкм. Остатки тканей дополнительно промывают средой К4 (макросоли К3, микросоли В5, хелатирующий агент, витамины К3, ксилоза, сахароза, 2,4 D, НУК, БАП, рН 5,8) для полного выделения оставшихся протопластов. На протопласты наслаивают среду W5 (NaCl, СаСl₂, КСl, глюкоза, рН 5,8) и центрифугируют 10 мин при 80g. Хорошие протопласты собирают из интерфазы и дважды отмывают от фермента в среде W5, центрифугируя по 5 мин при 70g. Проводят подсчет общего количества протопластов в W5-среде. Для этого 100 мкл протопластов растворяют в 900 мкл среды W5, отбирают 10 мкл суспензии и подсчитывают жизнеспособные протопласты в гематоцитометре.

Протопласты инкубируют в термостате 30 мин при 24С, центрифугируют в течение 5 мин при 70g, полностью удалив при этом среду W5, и ресуспендируют в среде МММ (манитол, MgCl₂, MES, рН 5,6.) для получения 1000000 протопластов в 0,7 мл раствора. К протопластам (~1 млн. на вариант) добавляют линеаризованную плазмиду (10 мкг), тимусную ДНК-носитель (40 мкг) и полиэтиленгликоль (0,7 мл). Через 15-20 мин проводят отмывку в среде W5. После центрифугирования при 70g в течение 5 мин удаляют надосадочную жидкость, и протопласты ресуспендируют в 0,5 мл среды К3. Протопласты запаивают в среду К3, содержащую 0,6% агарозы (Sea Plaque). Культивирование запаянных протопластов проводят при 24С в течение 1 суток в темноте, затем при 24/18С, 16/8-часовом фотопериоде, освещенности порядка 500 лк (рассеянный свет) в течение 5 суток. Колонии из трансформированных протопластов прорастают через 5-6 недель при 24/18С, 16/8-часовом фотопериоде, освещенности порядка 500 лк в среде A-med (макросоли A-med, микросоли В5, витамины КЗ, НУК, БАП, сахароза, манитол, рН 5,6) с селективным агентом фосфинотрицином (РРТ) 20 мкг/мл. Культивирование колоний для каллусообразования и регенерации проводят при 24/18С, 16/8-часовом фотопериоде и освещенности порядка 2000-3000 лк.

Спустя 5-6 недель, когда колонии достигают размера 2-3 мм в диаметре, их переносят на среду MS-morpho (макросоли MS, микросоли В5, хелатирующие агенты, CaCl₂, БАП, НУК, рН 5,6) с 0,6% агаром для каллусообразования и регенерации растений. Эффективность трансформации конструкциями pGBP450f и pGreen0229 - 32 независимых растения на 1000000 протопластов. Проростки размером 3-4 см пересаживают на среду T-med для укоренения. Укоренившиеся растения высаживают в почву для дальнейшего молекулярно-генетического, морфологического и патофизиологического анализов.

Первичный отбор растений проводят по результатам теста на устойчивость к фосфинотрицину. Растения, укоренившиеся в почве, обрабатывают гербицидом фосфинотрицином в концентрации 40 и 80 мг/л для проверки наличия экспрессии гена bar.

Выделение ДНК из отобранных растений проводят следующим образом. Растительные ткани, замороженные или свежие, растирают в ступке с жидким азотом. Гомогенат заливают буфером S (100 mM tris HCl рН 8,5, 100 mM NaCl, 50 mМ EDTA рН 8,0, 2% SDS) в соотношении 1:2. После размораживания добавляют протеиназу К (10 мг/мл) прямо в ступку - 50-100 мкг на 1 мл смеси, инкубируют при 65С 1,5-2 ч. После этого добавляют равный объем смеси фенол-хлороформ (1:1), перемешивают и центрифугируют при 4,5 тыс. оборотов в течение 20-30 мин. Снимают верхнюю фазу и переносят в новую пробирку, добавляют равный объем хлороформа, встряхивают, центрифугируют 20-30 мин при 4,5 тыс. оборотов. Верхний слой переносят в маленькие стаканчики на 50 мл, добавляют изопропанол в соотношении 0,6-0,9 V от образца. С помощью палочки накручивают ДНК до полного ее извлечения. Палочки с намотанной на них ДНК промывают 75% спиртом и сушат около 40 мин. Высушенную ДНК растворяют в 300 мкл стерильного ТЕ-буфера (10 mM Tris HC1, 1 mM EDTA, pH 8,0).

После растворения ДНК обрабатывают РНКазой в течение 45-60 мин при 37С. Затем проводят стандартную очистку фенол-хлороформом. ДНК осаждают этанолом, промывают 80% этанолом. После того как ДНК будет высушена, ее растворяют в ТЕ-буфере. Концентрацию ДНК определяют с помощью агарозного мини-гель-электрофореза и с помощью спектрометрии.

Пример 4. Фенотипический анализ трансгенных растений.

Анализ изменений в фенотипе bar-трансгенных клонов табака и трансгенных растений, содержащих одновременно ген bar и кДНК гена CYP11A1, проводят путем оценки и сравнения с контрольными растениями таких морфологических параметров, как скорость укоренения, высота растений, время начала цветения, продуктивность растений. Фенотипический анализ проводили независимыми наблюдателями в начале, середине и конце вегетационного периода. Результаты приведены в таблице 1; на фиг. 3 представлена фотография контрольных и трансгенных растений табака в полевых условиях. Цифрами обозначены: 1-контрольное растение табака (высота 15 см), 2-трансгенное растение табака, содержащее кДНК гена CYP11A1 (высота 72 см).

Трансгенные растения, содержащие кДНК гена CYP11A1, характеризуются более быстрыми процессами укоренения, более ранними сроками цветения и образования плодов (эти процессы происходят на 2 недели раньше по сравнению с контрольными растениями), более высокой продуктивностью (превосходит параметры контрольных растений в 3 раза), большей площадью листовой пластинки (больше по сравнению с контролем в 2-3 раза).

Пример 5. Биотесты на белковых экстрактах из трансгенных растений, несущих кДНК гена CYP11A1 из коры надпочечников быка.

На устойчивость к неспецифическим патогенам пасленовых - грибку Botrytis cynerea - растения проверяют методом подсчета количества проросших спор в капле сока из листьев. Биотесты проводят следующим образом. В лунки микрокюветы наносят по 20 мкл суспензии спор Botrytis cynerea (10⁵ спор/мл), 20 мкл неочищенных белковых экстрактов из контрольных (нетрансформированных и трансформированных пустым вектором) и трансгенных растений, содержащих исследуемый ген. Микрокюветы инкубируют в течение 24 часов при 24С, после чего под микроскопом проводят подсчет количества проросших спор. Полученные результаты приведены в таблице 2.

Средние арифметические значения количества проросших спор для контрольных трансгенных (с пустым вектором) и нетрансгенных линий табаков варьируют от 80 до 96%. Для трансгенных табаков, содержащих кДНК гена CYP11A1, количество проросших спор варьирует от 7 до 21%. Эти результаты свидетельствуют о подавлении роста патогенных грибов экстрактами белка, выделенного из трансгенных растений, содержащих исследуемый ген.

Пример 6. Биотесты на устойчивость трансгенных растений, содержащих кДНК гена CYP11A1, к грибным фитопатогенам.

Опыты проводят на изолированных листьях трансгенных табаков, содержащих кДНК гена CYP11A1. В качестве тест-культуры используют фитопатогенные грибы вида Botrytis cynerea, вызывающие пятнистость и раннюю гниль. В провоцирующих условиях листья среднего возраста и одного размера помещают в чашки Петри на фильтровальную бумагу, увлажненную водой. По 10 мкл суспензии спор возбудителя, содержащей 2000 спор/мл, наносят в 6 точек на лист, после чего чашки с листьями герметично закрывают для создания повышенной влажности и выдерживают в климокамере при температуре 24С и 16 часовом световом дне. В качестве контроля используют листья нетрансформированных растений и растений, содержащих пустой вектор. Результаты биотеста на устойчивость к Botrytis cynerea, оцененные по количеству и размеру некротических пятен на 10 сутки после заражения, представлены на фиг. 4.

Цифрами обозначены: 1 - контрольное нетрансгенное растение (поражение 7 баллов); 2 - контрольное трансгенное растение с пустым вектором (поражение 7 баллов); 3-5 - независимые линии трансгенных растений, содержащих кДНК гена CYP11A1 (3 - поражение 1 балл; 4 - поражение 0 баллов; 5 - поражение 2 балла); а - поражение листа.

У устойчивых трансгенных линий табака, содержащих кДНК гена CYP11A1, средняя площадь пораженных на листьях участков на 10-е сутки была в 12 раз меньше, чем у контрольных растений, или же области некроза на листьях вообще отсутствовали.