производные гиперфорина, их использование и препараты, содержащие эти производные

Формула изобретения

1. Соединение формулы I

в которой R представляет собой ароматический ацильный фрагмент, который необязательно имеет один или несколько заместителей, которые могут быть одинаковыми или различными и которые выбирают из гидрокси, метокси и аминогруппы.

2. Соединения по п.1, в которых R выбирают из п-аминобензоила или триметоксибензоила.

3. Соединение по п.2, где R представляет собой триметоксибензоил.

4. Антидепрессантная фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента соединение по пп.1-3 в смеси с подходящим носителем.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к новым производным гиперфорина, их применению для лечения депрессии и состояния тревоги, а также к препаратам, содержащим эти производные.

Надземная масса цветущего Hypericum perforatum содержит вещества, относящиеся к нескольким классам веществ с различной структурой, которые оказывают прямое или косвенное воздействие на центральную нервную систему.

Более конкретно указанные соединения включают в себя гиперицин, гиперфорин и димерные флавоны, которые оказывают антидепрессивное и транквилизирующее действие на животных и человека.

Механизмы воздействия этих соединений различны: действие в качестве ингибитора моноаминоксидазы, влияние на высвобождение серотонина и действие, подобное действию бензодиазепина.

Гиперфорин формулы

который является одним из основных компонентов липофильной фракции в надземной массе цветущего Hypericum perforatum, в последнее время стал объектом многочисленных исследований, которые позволили установить его важную роль в качестве антидепрессанта; исследования, проведенные заявителем, подтвердили, что эта молекула обладает действием, аналогичным действию серотонина.

Гиперфорин не очень стабилен в условиях обычного экстрагирования и консервации; как описано в заявке WO 97/13489 (на имя Шваба), содержание гиперфорина в водно-спиртовом экстракте зверобоя падает почти до нуля уже через несколько недель.

И снова, как сказано в заявке WO 97/13489, чтобы получить стабильные экстракты с постоянным содержанием гиперфорина, экстрагирование, очистку и консервацию, необходимо производить в присутствии антиоксидантов, таких как витамин С и его сложные эфиры, серосодержащие аминокислоты и т.п.

Высокая нестабильность гиперфорина существенно затрудняет изготовление лекарственных препаратов из него.

Благодаря настоящему изобретению открыты производные гиперфорина, которые являются более стабильными и проявили более высокую активность в качестве антидепрессантов в специфических фармакологических тестах. Этими производными по настоящему изобретению являются соединения формулы I:

в которых R представляет собой

- насыщенную или ненасыщенную, с прямой или разветвленной цепью, C₁ -C₂₂ ацильную группу, необязательно имеющую один или несколько заместителей, которые могут быть одинаковыми или различными и которые выбирают из группы, в которую входят атомы галогенов, нитро, амино, C₁-C₆ алкиламино, ди-C ₁-C₆ алкиламино, C₁-C₆ ациламиногруппы;

-циклоалифатический или ароматический ацильный остаток, в котором ароматический фрагмент необязательно имеет один или несколько заместителей, которые могут быть одинаковыми или различными и которые выбирают из группы, включающей в себя атомы галогенов, гидрокси, метоксиаминогруппы;

-глицидный остаток, в котором одна или несколько гидроксильных групп необязательно являются алкилированными или ацилированными.

Термин “ароматический ацильный остаток” обозначает предпочтительно бензоильный или циннамильный остаток, имеющий одну или несколько амино- или алкоксигрупп.

Термин “глицидный остаток” обозначает остаток из одного сахара, связанного посредством эфирной связи с гидроксильной группой в 1 положении пиранозильного или фуранозильного кольца, причем другие гидроксильные группы этого сахара необязательно являются метилированными или ацетилированными.

Предпочтительными R-группами являются ацетил, монохлороацетил, бутирил, -аминобутирил, п-аминобензил, триметоксибензил, триметоксициннамил, -глюкозил и -галактозил.

Производные гиперфорина по настоящему изобретению можно получить обычными способами ацилирования или гликозилирования гидроксильных групп.

Например, по существу чистый гиперфорин или экстракт, обогащенный гиперфорином, можно подвергнуть взаимодействию с хлоридами кислот или ангидридами кислот RCOOH (R имеет вышеуказанные значения) в подходящих растворителях, например, в пиридине.

С другой стороны, гликозилирование можно провести, используя реакционноспособные производные нужного сахара (ROH) с подходящими защитными группами, например, -D-глюкопиранозил-бромид-тетраацетат.

В соответствии с наиболее удобным способом по настоящему изобретению соединения I получают путем экстрагирования надземной массы цветущего Hypericum perforatum двуокисью углерода в сверхкритических условиях, с последующим разделением между растворителями и получением производных гиперфорина в полученном экстракте.

Листья и стебли цветущего зверобоя отдельно или в смеси, в основном в виде природной смеси, экстрагируют двуокисью углерода в сверхкритических условиях под давлением от 180 до 260 бар, предпочтительно 240 бар, и при температуре в диапазоне от 35 до 50°С, предпочтительно 40°С. Получают липофильный экстракт, содержащий около 50% гиперфорина. Экстракт содержит значительные количества ксантонов, восков, жирных кислот и триглицеридов. Процентное содержание гиперфорина можно затем повысить, если, в соответствии с настоящим изобретением, солюбилизировать полученный экстракт в метаноле или в частично водном растворе ацетонитрила, а затем экстрагировать полученный раствор н-гексаном или алифатическими углеводородами. Углеводородная фаза содержит нежелательные вещества, которые удаляют; гидрофильную фазу разбавляют приблизительно равным объемом воды и алифатическими углеводородами. Для получения производных, как описано выше, можно использовать экстракт зверобоя.

Производные по настоящему изобретению могут не проявлять активности in vitro на рецепторы, а в то же время они особенно активны in vivo, оказывая сильное антидепрессивное действие, зависящее от дозы.

В тестах in vivo на мышах и крысах соединения по настоящему изобретению показали более высокую активность, чем гиперфорин и этанольные или метанольные экстракты Hypericum.

В качестве испытаний in vivo для проверки антидепрессивного эффекта были использованы тест на развитие недостаточной активности при попытках избежать воздействия и тест на подавление потребления этанола сардинскими крысами с алкогольной зависимостью; тесты проводили способами, описанными в литературе.

В тесте на развитие недостаточной активности при попытках избежать воздействия, соединения по настоящему изобретению показали более высокую активность, чем известные экстракты, и эта активность была сопоставима с активностью известных медикаментов, таких как имипрамин. В этом тесте крыс закрепляли и подвергали слабым кратковременным неизбежным электрошоковым воздействиям в течение 50 мин. (предварительное испытание). Через двадцать четыре часа по хвостам животных определяли их способность избегать таких же стимулов в ситуации, когда избежать воздействий невозможно. Крыса в среднем совершает 26 попыток избежать воздействия на 30 воздействий (контрольные экземпляры, не подвергавшиеся воздействиям), в то время как животные, которых подвергали предварительному испытанию, совершали только 1-3 попытки избежать воздействия (контрольные экземпляры, не проходившие лечения). Гипореактивность, вызванную предварительным испытанием, не наблюдали у животных, которых за 1-3 недели до испытаний лечили антидепрессантами, такими как имипрамин или флуоксетин. Соединения по настоящему изобретению, введенные крысам за один час до того, как подвергнуть их неизбежному стрессу, вызывали повышение реактивности в тесте на попытки избежать воздействия, причем это повышение было еще более сильным, когда животных подвергали предварительному лечению за 1-2 недели до испытания.

Например, результаты лечения крыс соединением I, в котором R представляет собой ацетил, показаны в приведенной ниже таблице.

В таблице показан антидепрессивный эффект гиперфоринацетата у крыс в ходе проведения теста на развитие недостаточной активности при попытках избежать воздействия, где крыс подвергали предварительному испытанию в течение 2 недель.

Статистический анализ: Крускал-Уоллиса, непараметрический, ANOVA KW=13,462 р + 0,0012.

Спиртовый экстракт Hypericum и гексановый экстракт против контроля, не подвергавшегося воздействию, р<0,01.

Гиперфоринацетат, 25 мг, против контроля, не подвергавшегося воздействию - не оговорено.

Контроль, не подвергавшийся воздействию, против AND - р<0,01.

В тесте на снижение потребления алкоголя у сардинских крыс (что является показателем депрессии и тревожного состояния) в соответствии с протоколами тестов, описанными в литературе, вещества по настоящему изобретению, после двухдневного введения, вызывали 60-70% снижение потребления алкоголя, которому крысы предпочитали воду (в сравнении с контролем).

Используя соединения формулы I, можно изготовить лекарственные препараты в мягких желатиновых капсулах, твердых желатиновых капсулах, в таблетках, в виде свечей; предпочтительно изготавливать из соединений по настоящему изобретению лекарственные препараты в мягких желатиновых капсулах или в формах с постепенным высвобождением активного ингредиента. Дозировки соединений по настоящему изобретению в таких лекарственных препаратах варьируются от 5 до 50 мг на дозу в обычных лекарственных формах и до 200 мг на дозу в лекарственных формах, обеспечивающих постепенное высвобождение; в этом случае предпочтительной дозой является 200 мг для ежедневной дозы.

Приведенные ниже примеры более подробно иллюстрируют настоящее изобретение.

Пример 1 - Получение экстракта, обогащенного гиперфорином.

10 кг биомассы Hypericum perforatum экстрагируют в соответствии со способом, описанным ниже, в экстракторе на 25 л для газа под сверхкритическим давлением; экстрактор оснащен двумя сепараторами.

10 кг надземной массы цветущего Hypericum perforatum механически высушивают после сбора, при температуре не выше 60°С, подвергают экструзии, чтобы разрушить клетки, и экстрагируют при помощи СO₂ в условиях сверхкритического давления:

- температура: 45°С в экстракторе, 30°С в первом сепараторе и 20°С во втором сепараторе;

- давление: 240 бар в экстракторе, 100 бар в первом сепараторе и 50 бар во втором сепараторе.

Поток СO₂ пропускали со скоростью 10 л в минуту в течение 45 минут.

Экстракт концентрировали во втором сепараторе, в то время как большую часть воды, присутствующей в растительной матрице, концентрировали во втором сепараторе. Экстракт, присутствующий во втором сепараторе, солюбилизировали в 3,2 л метанола, и этот раствор экстрагировали 3×1,5 л н-гексана.

Гексановую фазу промыли потоком 98 метанола, используя гиперфорин в качестве маркера, который должен оставаться в метанольной фазе. Гексановую фазу удаляют, а комбинированные метанольные разбавляют 0,6 л воды и повторно экстрагируют 2×0,6 л н-гексана.

Комбинированные фазы гексана обесцвечивают 0,3% углем, высушивают под Na₂SO₄, затем концентрируют под вакуумом при температуре не выше 40°С до получения масла. Получают 0,22 кг воскообразного экстракта, в котором содержание гиперфорина составляет около 70%.

Пример 2 - Синтез гиперфоринацетата.

В раствор 12 г растительного экстракта, полученного в примере 1, в 48 мл пиридина добавили Ас₂O (9,8 мл) и перемешивали при комнатной температуре. Ход реакции контролировали при помощи тонкослойной хроматографии (гексан: ЕtОАс 95:5; гиперфорин Rf: 0,24; ацетат Rf: 0,49) (Rf - скорость движения вещества по хроматографической бумаге). Через 24 часа реакционную смесь разбавляли водой и экстрагировали смесью гексана с эфиром (3:1). Органическую фазу промывали разбавленной НСl, насыщенным NаНСО₃ и соляным раствором. После высушивания (Na₂SO₄) и выпаривания остаток очищали хроматографией на колонне с силикагелем (около 30 г), элюировали сначала петролейным эфиром, чтобы удалить жиры, затем использовали смесь гексан: ЕtOАс 95:5, как только искомое соединение начинало элюироваться; получали 3,34 г (0,28) гиперфоринацетата в виде бесцветной пасты.

С₃₇Н₅₄O ₅, MW 578

CI-MS: 579 (М+Н)+

ИК (жидкая пленка): 1779, 1732, 1660, 1634, 1447, 1377, 1339, 1146 см^-1 .

¹H ЯМР (200 МГц, CDCl₃): 5,03 (br s, 2Н), 5.00 (br s, 2H), 3.05 (dd, J=15, 7Hz, 1H), 2.87 (dd, J=15, 7Hz, 1H), 2.22 (s, OAc), 1.66-1.53 (br s, 8×3H), 1.08 (d, J=6.5 Hz, 3H), 0.98 (s, 3H), 0.85 (d, J=6.5 Hz, 3H).

Пример 3 - Синтез гиперфорин-3,4,5-триметоксибензоата

В раствор растительного экстракта из примера 1 (1,0 г) в пиридине (4 мл) добавили 3, 4, 5-триметоксибензоилхлорид (323 мг), и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. За ходом реакции не могли следить при помощи тонкослойной хроматографии, поскольку перемешиваемый материал и продукт имеют очень близкий показатель Rf (скорость движения вещества по хроматографической бумаге) в различных растворителях. Реакционную смесь разбавляли водой и экстрагировали смесью эфира и гексана (3:1). Органическую фазу промывали разбавленной НСl, насыщенным NаНСО₃ (промывка соляным раствором вызывает образование эмульсии). После высушивания Na₂SO₄ и выпаривания остаток очищали хроматографией на колонне с силикагелем (около 5 г), элюировали сначала петролейным эфиром, чтобы удалить жиры, затем использовали смесь гексан: ЕtOАс 95:5 до получения гиперфоринтриметоксибензоата (317 мг) в виде бесцветного масла.

С₄₅Н ₆₂O₈, MW 730

CI-MS: 731 (М+Н)+

ИК (жидкая пленка): 1732, 1660, 1634, 1589, 1465, 1331, 1153, 1130, 914 см^-1.

¹Н ЯМР (200 МГц, CDCl ₃): 7.27 (s, 2H), 5.04 (br s, 2H), 5.02 (br s, 2H), 3.86 (s, OMe), 3.82 (s, 2 × ОМе), 3.10 (dd, J=15, 7Hz, 1H), 2.92 (dd, J=15, 7Hz, 1H), 1.66-1.53 (br s, 8 x 3H), 1.13 (d, J=6.5 Hz, 3H), 1.04 (s, 3H), 0.99 (d, J=6.5 Hz, 3H).

Пример 4 - Таблетки в оболочке, содержащие продукт по примеру 2, мг:

Гиперфоринацетат 100

Соевые полисахариды 18,25

Поперечносшитая натрий-карбоксиметилцеллюлоза 13,50

Кремнезем 6,50

Поливинилпирролидон 5,00

Стеарат магния 0,50

Оболочка:

Гидроксипропилметилцеллюлоза 3,75

Тальк 2,75

Диоксид титана 1,25

Триацетин 0,75

Полисорбат 80 0,25

Красная окись железа 1,00