сшитые кристаллы протеина с контролируемым растворением

Формула изобретения

1. Сшитый сшивающим агентом кристалл протеина, в условиях, способствующих сшивке указанного кристалла, в такой степени, что полученный сшитый кристалл способен к контролируемому растворению при изменении среды, окружающей указанный кристалл, причем указанное изменение вызывает для указанного кристалла: (a) переход из нерастворимой и стабильной формы в растворимую и активную форму; или (b) выделение его протеиновой активности с контролируемой скоростью при указанном воздействии; указанное воздействие выбирается из группы, включающей изменение температуры, изменение рН, изменение химического состава, изменение от концентрата до разбавленной формы, изменение окислительно-восстановительного потенциала, изменение падающего излучения, изменение концентрации переходного металла, изменение концентрации фторида, изменение концентрации свободных радикалов, изменение концентрации агента, хелатирующего металл, изменение силы сдвига, действующей на кристалл, и их сочетания; где указанные условия, способствующие сшивке, зависят от фактора, выбираемого из группы, включающей степень сшивки указанного кристалла протеина, длительность времени экспонирования указанного кристалла протеина сшивающему агенту, аминокислотные остатки, участвующие в сшивке, факта, является ли сшивающий агент гомобифункциональным или гетеробифункциональным, скорость добавления сшивающего агента к указанному кристаллу протеина, природа сшивающего агента, длина цепи сшивающего агента, площадь поверхности указанного кристалла протеина, размер указанного кристалла протеина, форма указанного кристалла протеина и их сочетания.

2. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что изменение от концентрата до разбавленной формы включает растворение указанного кристалла протеина в растворе.

3. Сшитый кристалл протеина по п.2, отличающийся тем, что изменение растворения указанного кристалла протеина в растворе включает увеличение или уменьшение концентрации соли.

4. Сшитый кристалл протеина по п.3, отличающийся тем, что растворение указанного кристалла протеина в растворе включает уменьшение концентрации соли.

5. Сшитый кристалл протеина по п.2, отличающийся тем, что растворение указанного кристалла протеина в растворе включает увеличение концентрации воды.

6. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что изменение химического состава среды, окружающей указанный кристалл, включает увеличение концентрации органического растворителя.

7. Сшитый кристалл протеина по п.2, отличающийся тем, что растворение указанного кристалла протеина в растворе включает уменьшение концентрации детергента.

8. Сшитый кристалл протеина по п.2, отличающийся тем, что растворение указанного кристалла протеина в растворе включает уменьшение концентрации протеина.

9. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что переход из концентрата в разбавленную форму включает изменение концентрации всех растворенных веществ от около двукратного до около 10000-кратного.

10. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что переход из концентрата в разбавленную форму включает изменение концентрации всех растворенных веществ от около двукратного до около 700-кратного.

11. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что изменение рН включает изменение от кислотного значения рН до основного значения рН.

12. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что изменение рН включает изменение от основного значения рН до кислотного значения рН.

13. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что изменение температуры включает повышение или понижение температуры.

14. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что изменение температуры включает повышение температуры с нижнего значения между около 0°С и около 20°С, до верхнего значения между около 25°С и около 70°С.

15. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что активная форма указанного протеина представляет собой форму, которая активна против макромолекулярных субстратов.

16. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что кристалл протеина имеет период половинного снижения активности в условиях хранения, превышающий, по меньшей мере, в два раза период половинного снижения активности для растворимой формы протеина, который кристаллизуют для получения указанного сшитого кристалла, а его активность аналогична активности растворимой формы протеина в условиях применения.

17. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что кристалл обладает активностью протеина, которая в 5-10 раз превышает активность в отношении любого макромолекулярного субстрата, двухфазного субстрата или субстрата, состоящего из мелких молекул, по сравнению с растворимой формой протеина, которую кристаллизуют для получения кристаллов, которые сшивают.

18. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что кристалл обладает активностью протеина, которая в 2-3 раза превышает активность в отношении любого макромолекулярного субстрата, двухфазного субстрата или субстрата, состоящего из мелких молекул, по сравнению с растворимой формой протеина, которую кристаллизуют для получения кристаллов, которые сшивают.

19. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что обладает активностью протеина, по меньшей мере, в 2 раза превышающей активность в отношении любого макромолекулярного субстрата, двухфазного субстрата или субстрата, состоящего из мелких молекул, по сравнению с растворимой формой фермента, которую кристаллизуют для получения кристаллов, которые сшивают.

20. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что является сшитым кристаллом липазы.

21. Сшитый кристалл липазы по п.20, отличающийся тем, что кристалл липазы сшит сульфосукцинимидил-6-[-метил--(2-пиридилдитио)толуамидо]гексаноатом (Sulfo-LC-SMPT).

22. Сшитый кристалл липазы по п.20, отличающийся тем, что кристалл липазы сшит гидрохлоридом 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимида (EDC).

23. Сшитый кристалл липазы по п.20, отличающийся тем, что кристалл липазы сшит диметил 3,3-дитиобиспропионимидатом НСl (DSP).

24. Сшитый кристалл липазы по п.20, отличающийся тем, что кристалл липазы сшит сшивающим агентом, выбранным из группы, включающей гидрохлорид 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимида (EDO), дитиобис(сукцинимидилпропионат) (DSP); бисмалимидогексана (ВМН), NHS-PEG-винилсульфона (NHS-PEG-VS) и дисукцинимидилглутарата (DSG).

25. Сшитый кристалл липазы по любому из пп.20-24, отличающийся тем, что кристалл липазы обладает ферментативной активностью для гидролиза двухфазного субстрата оливкового масла, которая в 5-10 раз превышает ферментативную активность растворимой формы липазы, которую кристаллизуют для получения кристаллов, которые сшивают.

26. Сшитый кристалл липазы по п.25, где указанный кристалл липазы обладает ферментативной активностью для гидролиза двухфазного субстрата оливкового масла, которая в 2-3 раза превышает ферментативную активность растворимой формы липазы, которую кристаллизуют для получения кристаллов, которые сшивают.

27. Сшитый кристалл липазы по п.26, отличающийся тем, что кристалл липазы обладает активностью протеина для гидролиза двухфазного субстрата оливкового масла, которая, по меньшей мере, в 2 раза превышает активность растворимой формы липазы, которую кристаллизуют для получения кристаллов, которые сшивают.

28. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что сшивающий агент является гомобифункциональным сшивающим агентом.

29. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что сшивающий агент является гетеробифункциональным сшивающим агентом.

30. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что сшивающий агент выбирают из группы, включающей глутаровый альдегид, янтарный альдегид, октандиальдегид и глиоксаль.

31. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что сшивающий агент выбирают из группы, включающей галогентриазины, галогенпиримидины, ангидриды, алифатические или ароматические моно- или дикарбоновые кислоты, галогенангидриды, алифатических или ароматических моно- или дикарбоновых кислот, N-метилольных соединений, диизоцианаты, диизотиоцианаты и азиридины.

32. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что сшивающий агент является эпоксидом.

33. Сшитый кристалл протеина по п.32, отличающийся тем, что эпоксид выбирают из группы, включающей диглицидиловый эфир неопентилгликоля, диглицидиловый эфир этиленгликоля, диэпоксиды, триэпоксиды и тетраэпоксиды.

34. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что контролируемая скорость выделения активности протеина определяется фактором, выбранным из группы, включающей степень сшивки указанного сшитого кристалла протеина, длительность воздействия сшивающего агента на кристалл протеина, аминокислотные остатки, участвующие в образовании сшивок, факт, является ли сшивающий агент гомобифункциональным или гетеробифункциональным, скорость добавления сшивающего агента к указанному кристаллу протеина, природу сшивающего агента, длину цепи сшивающего агента, площадь поверхности указанного сшитого кристалла протеина, размер указанного сшитого кристалла протеина, форму указанного сшитого кристалла протеина и их сочетания.

35. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что имеет скорость выделения протеиновой активности от около 0,1% в день до около 100% в день.

36. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что имеет скорость выделения протеиновой активности от около 0,01% в час до около 100% в час.

37. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что имеет скорость выделения протеиновой активности от около 1% в минуту до около 50% в минуту.

38. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что кристалл протеина практически нерастворим и стабилен в композиции в условиях хранения, и практически растворим и активен в условиях использования указанной композиции.

39. Сшитый кристалл протеина по п.38, отличающийся тем, что композицию выбирают из группы, включающей чистящие агенты, детергенты, композиции личной гигиены, косметику, лекарства, соединения для ветеринарии, вакцины, пищевые продукты, корма, диагностические агенты и композиции для удаления загрязнений.

40. Сшитый кристалл протеина по п.39, отличающийся тем, что детергент выбирают из группы, включающей порошковые детергенты, жидкие детергенты, отбеливатели, очистители для домашнего хозяйства, очистители для твердых поверхностей, очистители для промышленных целей, шампуни для ковров и мебельных тканей.

41. Сшитый кристалл протеина по п.39, отличающийся тем, что косметику выбирают из группы, включающей кремы, эмульсии, лосьоны, пены, смывки, гели, пудры, муссы, солнцезащитные агенты, суспензии, порошки, спреи, пасты, мази, помады, бальзамы, шампуни и капли.

42. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что протеин является ферментом.

43. Сшитый кристалл протеина по п.42, отличающийся тем, что фермент выбирают из группы, включающей гидролазы, изомеразы, лиазы, лигазы, трансферазы и оксидоредуктазы.

44. Сшитый кристалл протеина по п.42, отличающийся тем, что фермент выбирают из группы, включающей протеазы, амилазы, целлюлазы, липазы и оксидазы.

45. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что протеин выбирают из группы, включающей терапевтические протеины, протеины очищающих агентов, протеины для личной гигиены, протеины, используемые в ветеринарии, пищевые протеины, кормовые протеины, диагностические протеины и протеины для удаления загрязнений.

46. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что протеин выбирают из группы, включающей гормоны, антитела, ингибиторы, факторы роста, трофические факторы, цитокины, лимфокины, гормоны роста, гормоны роста нервов, костные морфогенные протеины, токсоиды и пищевые протеины.

47. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что протеин выбирают из группы, включающей инсулин, амилин, эритропротеин, фактор VIII, ТРА, дорназу-, -1-антитрипсин, уреазу, гормоны фертильности, FSH, LSH, postridical гормоны, токсоид столбняка и токсоид дифтерии.

48. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что имеет наибольшее измерение от около 0,01 мкм до около 500 мкм.

49. Сшитый кристалл протеина по п.48, отличающийся тем, что имеет наибольшее измерение от около 0,1 мкм до около 50 мкм.

50. Сшитый кристалл протеина по п.1, отличающийся тем, что имеет форму, выбранную из группы, включающей сферы, иголки, палочки, пластины, ромбоиды, кубы, бипирамиды и призмы.

51. Средство доставки протеина, включающее кристаллы сшитого протеина по п.1 и средство для доставки указанного кристалла.

52. Средство доставки протеина по п.51, отличающееся тем, что протеин выбирают из группы, включающей детергентные ферменты, косметические протеины, фармацевтические протеины, протеины для сельского хозяйства, протеины для вакцин и протеины для удаления загрязнений.

53. Средство доставки протеина по п.52, отличающееся тем, что средство доставки является средством доставки микрочастиц протеина.

54. Средство доставки протеина по п.53, отличающееся тем, что средство доставки микрочастиц протеина включает сшитые кристаллы протеина, наибольшее измерение которых составляет от около 0,01 мкм до около 500 мкм.

55. Средство доставки протеина по п.54, отличающееся тем, что средство доставки микрочастиц протеина включает сшитые кристаллы протеина, наибольшее измерение которых составляет величину от около 0,1 мкм до около 50 мкм.

56. Средство доставки протеина по п.53, отличающееся тем, что средство доставки микрочастиц протеина включает сшитые кристаллы протеина, которые имеют форму, выбранную из группы, включающей сферы, иголки, палочки, пластины, ромбоиды, кубы, бипирамиды и призмы.

57. Способ получения сшитых кристаллов протеина, включающий стадию взаимодействия кристаллов протеина с первым сшивающим агентом или первым сшивающим агентом и, по меньшей мере, со вторым сшивающим агентом, в условиях, достаточных для индуцирования сшивания указанных кристаллов до такой степени, что полученные в результате сшитые кристаллы характеризуются способностью переходить из нерастворимой и стабильной формы в растворимую и активную форму в результате изменения окружающей их среды, указанное изменение выбирается из группы, включающей изменение температуры, изменение рН, изменение химического состава, изменение от концентрата до разбавленной формы, изменение силы сдвига, действующей на кристалл, и их сочетания.

58. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.57, отличающийся тем, что включает стадию взаимодействия указанных кристаллов протеина с первым сшивающим агентом и с указанным, по меньшей мере, вторым сшивающим агентом, одновременно или последовательно.

59. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.57, отличающийся тем, что перед осуществлением взаимодействия кристаллов протеина с указанным сшивающим агентом, указанный способ включает стадию кристаллизации указанного протеина.

60. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.57, отличающийся тем, что условия, достаточные для индуцирования сшивания, зависят от фактора, выбранного из группы, включающей степень сшивки сшитых кристаллов протеина, длительность воздействия сшивающего агента на кристаллы протеина, аминокислотные остатки, участвующие в образовании сшивок, факт, является ли сшивающий агент гомобифункциональным или гетеробифункциональным, скорость добавления сшивающего агента к указанному кристаллу протеина, природу сшивающего агента, длину цепи сшивающего агента, площадь поверхности указанного сшитого кристалла протеина, размер указанного сшитого кристалла протеина, форму указанного сшитого кристалла протеина и их сочетания.

61. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.57, отличающийся тем, что сшивающим агентом является многофункциональный сшивающий агент.

62. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.61, отличающийся тем, что сшивающим агентом является бифункциональный сшивающий агент.

63. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.61, отличающийся тем, что указанный сшивающий агент выбирают из группы, включающей глутаровый альдегид, янтарный альдегид, октандиальдегид и гликосаль.

64. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.61, отличающийся тем, что указанный сшивающий агент выбирают из группы, включающей галогентриазины, галогенпиримидины, ангидриды алифатических или ароматических моно- или дикарбоновых кислот, галогенангидриды алифатических или ароматических моно- или дикарбоновых кислот, N-метилольные соединения, диизоцианаты, диизотиоцианаты и азиридины.

65. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.57, отличающийся тем, что сшивающий агент является эпоксидом.

66. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.65, отличающийся тем, что эпоксид выбирают из группы, включающей диглицидиловый эфир неопентилгликоля, диглицидиловый эфир этиленгликоля, ди-эпоксиды, три-эпоксиды и тетра-эпоксиды.

67. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.57, отличающийся тем, что в качестве сшивающего агента используют глутаровый альдегид в количестве от 0,0076 до 0,5% в расчете на объем суспензии кристаллов протеина, подвергаемых сшивке, и где условия, достаточные для индуцирования образования сшивок, включают осуществление взаимодействия кристаллов протеина со сшивающим агентом в течение промежутка времени от около 3 мин до около 120 мин.

68. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.67, отличающийся тем, что в качестве указанного сшивающего агента используют глутаровый альдегид в количестве 0,005% от объема суспензии кристаллов протеина, и где условия, достаточные для индуцирования образования сшивок, включают осуществление взаимодействия кристаллов протеина со сшивающим агентом в течение промежутка времени от около 10 мин до около 30 мин.

69. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.68, отличающийся тем, что перед осуществлением взаимодействия с указанными кристаллами протеина указанный глутаровый альдегид подвергают предварительной обработке инкубированием буфером при 60°С в течение 1 ч.

70. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.57, отличающийся тем, что в качестве сшивающего агента используют глиоксаль в количестве от 0,01 до 1% от объема суспензии кристаллов протеина и где условия, достаточные для индуцирования образования сшивок, включают осуществление взаимодействия кристаллов протеина со сшивающим агентом в течение промежутка времени от около 30 мин до около 60 мин.

71. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.57, отличающийся тем, что в качестве сшивающего агента используют октандиальдегид в количестве от 0,05 до 1% от объема суспензии кристаллов протеина, и где условия, достаточные для индуцирования образования сшивок, включают осуществление взаимодействия кристаллов протеина со сшивающим агентом в течение промежутка времени от около 30 мин до около 16 ч.

72. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.71, отличающийся тем, что в качестве сшивающего агента используют октандиальдегид в количестве 1% от объема суспензии кристаллов протеина, и где условия, достаточные для индуцирования образования сшивок, включают осуществление взаимодействия кристаллов протеина со сшивающим агентом в течение промежутка времени от около 1 ч до около 3 ч.

73. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.57, отличающийся тем, что в качестве сшивающего агента используют янтарный альдегид в количестве 1% от объема суспензии кристаллов протеина, и где условия, достаточные для индуцирования образования сшивок, включают осуществление взаимодействия кристаллов протеина с сшивающим агентом в течение промежутка времени от около 30 мин до около 3 ч.

74. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.57, отличающийся тем, что качестве первого сшивающего агента используют эпоксид в количестве от 0,01 до 4% от объема суспензии кристаллов протеина, подвергаемых сшивке, а в качестве второго сшивающего агента используют глутаровый альдегид в количестве 0,1-0,2% от объема суспензии кристаллов протеина, подвергаемых сшивке, и где условия, достаточные для индуцирования образования сшивок, включают осуществление взаимодействия кристаллов протеина с указанным первым сшивающим агентом в течение промежутка времени от около 1 ч до около 72 ч, и осуществление взаимодействия указанных кристаллов протеина с вторым сшивающим агентом в течение промежутка времени от около 1 ч до около 5 ч.

75. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.74, отличающийся тем, что в качестве первого сшивающего агента используют эпоксид в количестве 0,01% от объема суспензии кристаллов протеина, подвергаемых сшивке, а в качестве второго сшивающего агента используют глутаровый альдегид в количестве 0,1% от объема суспензии кристаллов протеина, подвергаемых сшивке, и где условия, достаточные для индуцирования образования сшивок, включают осуществление взаимодействия кристаллов протеина с указанным первым сшивающим агентом в течение промежутка времени около 5 ч, и осуществление взаимодействия указанных кристаллов протеина со вторым сшивающим агентом в течение промежутка времени около 1,5 ч.

76. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.57, отличающийся тем, что указанный протеин является ферментом.

77. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.76, отличающийся тем, что указанный фермент выбирают из группы, включающей гидролазы, изомеразы, лиазы, лигазы, трансферазы и оксидоредуктазы.

78. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.76, отличающийся тем, что указанный фермент выбирают из группы, включающей протеазы, амилазы, целлюлазы, липазы и оксидазы.

79. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.57, отличающийся тем, что указанный сшивающий агент является обратимым сшивающим агентом.

80. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.79, отличающийся тем, что указанный обратимый сшивающий агент является дисульфидным сшивающим агентом.

81. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.80, отличающийся тем, что указанный дисульфидный сшивающий агент является гомобифункциональным сшивающим агентом или гетеробифункциональным сшивающим агентом.

82. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.57, отличающийся тем, что указанный протеин выбирают из группы, включающей терапевтические протеины, протеины чистящих агентов, протеины для личной гигиены, протеины, используемые в ветеринарии, пищевые протеины, кормовые протеины, диагностические протеины и протеины для удаления загрязнений.

83. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.57, отличающийся тем, что указанный протеин выбирают из группы, включающей гормоны, антитела, ингибиторы, факторы роста, трофические факторы, цитокины, лимфокины, гормоны роста, гормоны роста нервов, костные морфогенные протеины и токсоиды.

84. Способ получения сшитых кристаллов протеина, включающий стадию взаимодействия кристаллов протеина с первым сшивающим агентом или первым сшивающим агентом и, по меньшей мере, со вторым сшивающим агентом, в условиях, достаточных для индуцирования сшивания указанных кристаллов до такой степени, что полученные в результате сшитые кристаллы характеризуются периодом половинного снижения активности в условиях хранения, превышающим, по меньшей мере, в два раза период половинного снижения активности для растворимой формы протеина, который кристаллизуют для получения указанного сшитого кристалла, а его активность аналогична активности растворимой формы протеина в условиях применения.

85. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.84, отличающийся тем, что проводят стадию взаимодействия указанных кристаллов протеина с первым сшивающим агентом и с указанным, по меньшей мере, вторым сшивающим агентом, одновременно или последовательно.

86. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.84, отличающийся тем, что перед осуществлением взаимодействия кристаллов протеина с указанным сшивающим агентом, указанный способ включает стадию кристаллизации указанного протеина.

87. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.84, отличающийся тем, что условия, достаточные для индуцирования сшивания, зависят от фактора, выбранного из группы, включающей степень сшивки сшитых кристаллов протеина, длительность воздействия сшивающего агента на кристаллы протеина, аминокислотные остатки, участвующие в образовании сшивок, факт, является ли сшивающий агент гомобифункциональным или гетеробифункциональным, скорость добавления сшивающего агента к указанному кристаллу протеина, природу сшивающего агента, длину цепи сшивающего агента, площадь поверхности указанного сшитого кристалла протеина, размер указанного сшитого кристалла протеина, форму указанного сшитого кристалла протеина и их сочетания.

88. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.84, отличающийся тем, что сшивающим агентом является многофункциональный сшивающий агент.

89. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.88, отличающийся тем, что сшивающим агентом является бифункциональный сшивающий агент.

90. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.88, отличающийся тем, что указанный сшивающий агент выбирают из группы, включающей глутаровый альдегид, янтарный альдегид, октандиальдегид и глиоксаль.

91. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.88, отличающийся тем, что указанный сшивающий агент выбирают из группы, включающей галогентриазины, галогенпиримидины, ангидриды алифатических или ароматических моно- или дикарбоновых кислот, галогенангидриды алифатических или ароматических моно- или дикарбоновых кислот, N-метилольные соединения, диизоцианаты, диизотиоцианаты и азиридины.

92. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.84, отличающийся тем, что сшивающий агент является эпоксидом.

93. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.92, отличающийся тем, что эпоксид выбирают из группы, включающей диглицидиловый эфир неопентилгликоля, диглицидиловый эфир этиленгликоля, ди-эпоксиды, три-эпоксиды и тетра-эпоксиды.

94. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.84, отличающийся тем, что в качестве сшивающего агента используют глутаровый альдегид в количестве от 0,0076 до 0,5% в расчете на объем суспензии кристаллов протеина, подвергаемых сшивке, и где условия, достаточные для индуцирования образования сшивок, включают осуществление взаимодействия кристаллов протеина со сшивающим агентом в течение промежутка времени от около 3 мин до около 120 мин.

95. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.94, отличающийся тем, что в качестве указанного сшивающего агента используют глутаровый альдегид в количестве 0,005% от объема суспензии кристаллов протеина, и где условия, достаточные для индуцирования образования сшивок, включают осуществление взаимодействия кристаллов протеина со сшивающим агентом в течение промежутка времени от около 10 мин до около 30 мин.

96. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.95, отличающийся тем, что перед осуществлением взаимодействия с указанными кристаллами протеина указанный глутаровый альдегид подвергают предварительной обработке инкубированием буфером при 60°С в течение 1 ч.

97. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.84, отличающийся тем, что в качестве сшивающего агента используют глиоксаль в количестве от 0,01 до 1% от объема суспензии кристаллов протеина и где условия, достаточные для индуцирования образования сшивок, включают осуществление взаимодействия кристаллов протеина со сшивающим агентом в течение промежутка времени от около 30 мин до около 60 мин.

98. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.84, отличающийся тем, что в качестве сшивающего агента используют октандиальдегид в количестве от 0,05 до 1% от объема суспензии кристаллов протеина, и где условия, достаточные для индуцирования образования сшивок, включают осуществление взаимодействия кристаллов протеина со сшивающим агентом в течение промежутка времени от около 30 мин до около 16 ч.

99. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.98, отличающийся тем, что в качестве сшивающего агента используют октандиальдегид в количестве 1% от объема суспензии кристаллов протеина, и где условия, достаточные для индуцирования образования сшивок, включают осуществление взаимодействия кристаллов протеина со сшивающим агентом в течение промежутка времени от около 1 ч до около 3 ч.

100. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.84, отличающийся тем, что в качестве сшивающего агента используют янтарный альдегид в количестве 1% от объема суспензии кристаллов протеина, и где условия, достаточные для индуцирования образования сшивок, включают осуществление взаимодействия кристаллов протеина с сшивающим агентом в течение промежутка времени от около 30 мин до около 3 ч.

101. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.84, отличающийся тем, что в качестве первого сшивающего агента используют эпоксид в количестве от 0,01 до 4% от объема суспензии кристаллов протеина, подвергаемых сшивке, а в качестве второго сшивающего агента используют глутаровый альдегид в количестве 0,1-0,2% от объема суспензии кристаллов протеина, подвергаемых сшивке, и где условия, достаточные для индуцирования образования сшивок, включают осуществление взаимодействия кристаллов протеина с указанным первым сшивающим агентом в течение промежутка времени от около 1 ч до около 72 ч, и осуществление взаимодействия указанных кристаллов протеина с вторым сшивающим агентом в течение промежутка времени от около 1 ч до около 5 ч.

102. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.101, отличающийся тем, что в качестве первого сшивающего агента используют эпоксид в количестве 0,01% от объема суспензии кристаллов протеина, подвергаемых сшивке, а в качестве второго сшивающего агента используют глутаровый альдегид в количестве 0,1% от объема суспензии кристаллов протеина, подвергаемых сшивке, и где условия, достаточные для индуцирования образования сшивок, включают осуществление взаимодействия кристаллов протеина с указанным первым сшивающим агентом в течение промежутка времени около 5 ч, и осуществление взаимодействия указанных кристаллов протеина со вторым сшивающим агентом в течение промежутка времени около 1,5 ч.

103. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.84, отличающийся тем, что указанный протеин является ферментом.

104. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.103, отличающийся тем, что указанный фермент выбирают из группы, включающей гидролазы, изомеразы, лиазы, лигазы, трансферазы и оксидоредуктазы.

105. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.103, отличающийся тем, что указанный фермент выбирают из группы, включающей протеазы, амилазы, целлюлазы, липазы и оксидазы.

106. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.84, отличающийся тем, что указанный сшивающий агент является обратимым сшивающим агентом.

107. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.106, отличающийся тем, что указанный обратимый сшивающий агент является дисульфидным сшивающим агентом.

108. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.107, отличающийся тем, что указанный дисульфидный сшивающий агент является гомобифункциональным сшивающим агентом или гетеробифункциональным сшивающим агентом.

109. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.84, отличающийся тем, что указанный протеин выбирают из группы, включающей терапевтические протеины, протеины чистящих агентов, протеины для личной гигиены, протеины, используемые в ветеринарии, пищевые протеины, кормовые протеины, диагностические протеины и протеины для удаления загрязнений.

110. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.84, отличающийся тем, что указанный протеин выбирают из группы, включающей гормоны, антитела, ингибиторы, факторы роста, трофические факторы, цитокины, лимфокины, гормоны роста, гормоны роста нервов, костные морфогенные протеины и токсоиды.

111. Способ получения сшитых кристаллов протеина, включающий стадию взаимодействия кристаллов протеина с первым сшивающим агентом или первым сшивающим агентом и, по меньшей мере, со вторым сшивающим агентом, в условиях, достаточных для индуцирования сшивания указанных кристаллов до такой степени, что полученные в результате сшитые кристаллы характеризуются способностью к выделению его протеиновой активности с контролируемой скоростью при изменении окружающей их среды, указанное изменение выбирается из группы, включающей изменение рН, изменение концентрации растворенных веществ, изменение температуры, изменение химического состава, изменение силы сдвига, действующей на кристалл, и их сочетания.

112. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.111, отличающийся тем, что контролируемая скорость выделения активности протеина определяется фактором, выбранным из группы, включающей степень сшивки сшитых кристаллов протеина, длительность воздействия сшивающего агента на кристаллы протеина, аминокислотные остатки, участвующие в образовании сшивок, факт, является ли сшивающий агент гомобифункциональным или гетеробифункциональным, скорость добавления сшивающего агента к указанному кристаллу протеина, природу сшивающего агента, длину цепи сшивающего агента, площадь поверхности указанного сшитого кристалла протеина, размер указанного сшитого кристалла протеина, форму указанного сшитого кристалла протеина и их сочетания.

113. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.111, отличающийся тем, что включает стадию взаимодействия указанных кристаллов протеина с первым сшивающим агентом и с указанным, по меньшей мере, вторым сшивающим агентом, одновременно или последовательно.

114. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.111, отличающийся тем, что перед осуществлением взаимодействия кристаллов протеина с указанным сшивающим агентом, указанный способ включает стадию кристаллизации указанного протеина.

115. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.111, отличающийся тем, что условия, достаточные для индуцирования сшивания, зависят от фактора, выбранного из группы, включающей степень сшивки сшитых кристаллов протеина, длительность воздействия сшивающего агента на кристаллы протеина, аминокислотные остатки, участвующие в образовании сшивок, факт, является ли сшивающий агент гомобифункциональным или гетеробифункциональным, скорость добавления сшивающего агента к указанному кристаллу протеина, природу сшивающего агента, длину цепи сшивающего агента, площадь поверхности указанного сшитого кристалла протеина, размер указанного сшитого кристалла протеина, форму указанного сшитого кристалла протеина и их сочетания.

116. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.111, отличающийся тем, что сшивающим агентом является многофункциональный сшивающий агент.

117. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.116, отличающийся тем, что сшивающим агентом является бифункциональный сшивающий агент.

118. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.116, отличающийся тем, что указанный сшивающий агент выбирают из группы, включающей глутаровый альдегид, янтарный альдегид, октандиальдегид и глиоксаль.

119. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.116, отличающийся тем, что указанный сшивающий агент выбирают из группы, включающей галогентриазины, галогенпиримидины, ангидриды алифатических или ароматических моно- или дикарбоновых кислот, галогенангидриды алифатических или ароматических моно- или дикарбоновых кислот, N-метилольные соединения, диизоцианаты, диизотиоцианаты и азиридины.

120. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.111, отличающийся тем, что сшивающий агент является эпоксидом.

121. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.120, отличающийся тем, что эпоксид выбирают из группы, включающей диглицидиловый эфир неопентилгликоля, диглицидиловый эфир этиленгликоля, ди-эпоксиды, три-эпоксиды и тетра-эпоксиды.

122. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.111, отличающийся тем, что в качестве сшивающего агента используют глутаровый альдегид в количестве от 0,0076 до 0,5% в расчете на объем суспензии кристаллов протеина, подвергаемых сшивке, и где условия, достаточные для индуцирования образования сшивок, включают осуществление взаимодействия кристаллов протеина со сшивающим агентом в течение промежутка времени от около 3 мин до около 120 мин.

123. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.122, отличающийся тем, что в качестве указанного сшивающего агента используют глутаровый альдегид в количестве 0,005% от объема суспензии кристаллов протеина, и где условия, достаточные для индуцирования образования сшивок, включают осуществление взаимодействия кристаллов протеина со сшивающим агентом в течение промежутка времени от около 10 мин до около 30 мин.

124. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.123, отличающийся тем, что перед осуществлением взаимодействия с указанными кристаллами протеина указанный глутаровый альдегид подвергают предварительной обработке инкубированием буфером при 60°С в течение 1 ч.

125. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.111, отличающийся тем, что в качестве сшивающего агента используют глиоксаль в количестве от 0,01 до 1% от объема суспензии кристаллов протеина и где условия, достаточные для индуцирования образования сшивок, включают осуществление взаимодействия кристаллов протеина со сшивающим агентом в течение промежутка времени от около 30 мин до около 60 мин.

126. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.111, отличающийся тем, что в качестве сшивающего агента используют октандиальдегид в количестве от 0,05 до 1% от объема суспензии кристаллов протеина, и где условия, достаточные для индуцирования образования сшивок, включают осуществление взаимодействия кристаллов протеина со сшивающим агентом в течение промежутка времени от около 30 мин до около 16 ч.

127. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.126, отличающийся тем, что в качестве сшивающего агента используют октандиальдегид в количестве 1% от объема суспензии кристаллов протеина, и где условия, достаточные для индуцирования образования сшивок, включают осуществление взаимодействия кристаллов протеина со сшивающим агентом в течение промежутка времени от около 1 ч до около 3 ч.

128. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.111, отличающийся тем, что в качестве сшивающего агента используют янтарный альдегид в количестве 1% от объема суспензии кристаллов протеина, и где условия, достаточные для индуцирования образования сшивок, включают осуществление взаимодействия кристаллов протеина с сшивающим агентом в течение промежутка времени от около 30 мин до около 3 ч.

129. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.111, отличающийся тем, что в качестве первого сшивающего агента используют эпоксид в количестве от 0,01 до 4% от объема суспензии кристаллов протеина, подвергаемых сшивке, а в качестве второго сшивающего агента используют глутаровый альдегид в количестве 0,1-0,2% от объема суспензии кристаллов протеина, подвергаемых сшивке, и где условия, достаточные для индуцирования образования сшивок, включают осуществление взаимодействия кристаллов протеина с указанным первым сшивающим агентом в течение промежутка времени от около 1 ч до около 72 ч, и осуществление взаимодействия указанных кристаллов протеина с вторым сшивающим агентом в течение промежутка времени от около 1 ч до около 5 ч.

130. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.129, отличающийся тем, что в качестве первого сшивающего агента используют эпоксид в количестве 0,01% от объема суспензии кристаллов протеина, подвергаемых сшивке, а в качестве второго сшивающего агента используют глутаровый альдегид в количестве 0,1% от объема суспензии кристаллов протеина, подвергаемых сшивке, и где условия, достаточные для индуцирования образования сшивок, включают осуществление взаимодействия кристаллов протеина с указанным первым сшивающим агентом в течение промежутка времени около 5 ч, и осуществление взаимодействия указанных кристаллов протеина со вторым сшивающим агентом в течение промежутка времени около 1,5 ч.

131. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.111, отличающийся тем, что указанный протеин является ферментом.

132. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.131, отличающийся тем, что указанный фермент выбирают из группы, включающей гидролазы, изомеразы, лиазы, лигазы, трансферазы и оксидоредуктазы.

133. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.131, отличающийся тем, что указанный фермент выбирают из группы, включающей протеазы, амилазы, целлюлазы, липазы и оксидазы.

134. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.111, отличающийся тем, что указанный сшивающий агент является обратимым сшивающим агентом.

135. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.134, отличающийся тем, что указанный обратимый сшивающий агент является дисульфидным сшивающим агентом.

136. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.135, отличающийся тем, что указанный дисульфидный сшивающий агент является гомобифункциональным сшивающим агентом или гетеробифункциональным сшивающим агентом.

137. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.111, отличающийся тем, что указанный протеин выбирают из группы, включающей терапевтические протеины, протеины чистящих агентов, протеины для личной гигиены, протеины, используемые в ветеринарии, пищевые протеины, кормовые протеины, диагностические протеины и протеины для удаления загрязнений.

138. Способ получения сшитых кристаллов протеина по п.111, отличающийся тем, что указанный протеин выбирают из группы, включающей гормоны, антитела, ингибиторы, факторы роста, трофические факторы, цитокины, лимфокины, гормоны роста, гормоны роста нервов, костные морфогенные протеины и токсоиды.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к сшитым кристаллам протеина, которые характеризуются способностью переходить из нерастворимой и стабильной формы в растворимую и активную форму при изменении среды, окружающей указанные кристаллы, причем указанное изменение включает: изменение температуры, изменение величины рН, изменение химического состава, переход из концентрата в разбавленную форму, изменение окислительно-восстановительного потенциала раствора, изменение падающей радиации, изменение концентрации переходного металла, изменение концентрации фтора, изменение концентрации свободных радикалов, изменение концентрации металлических хелатирующих агентов, изменение силы сдвига, действующей на кристаллы, или их сочетания. В соответствии с одним из вариантов изобретения такие сшитые кристаллы протеина способны выделять свою протеиновую активность с контролируемой скоростью. В настоящем изобретении предложены способы получения таких сшитых кристаллов протеина, способы использования их для доставки протеина и способы использования их в очищающих агентах, включая детергенты, в терапевтических композициях, в фармацевтических композициях, вакцинах, композициях личной гигиены, включая косметику, композициях для ветеринарии, пищевых продуктах, кормах, диагностических агентах и композициях для удаления загрязнений.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Протеины используют в широком спектре применений в областях промышленной химии, в фармацевтических препаратах, в продуктах для ветеринарии, в косметике и в других потребительских товарах, в продуктах питания, в кормах, в диагностических агентах и агентах для дегазации. Иногда такие применения бывают ограничены в связи с затруднениями, которые присущи самим протеинам или создаются окружением или средой, в которой их используют. Такие затруднения могут привести к плохой растворимости протеинов, изменчивости характеристик или высокой стоимости. Для того чтобы протеины могли полностью реализовать свой потенциал в областях их использования, их функции не должны чрезмерно зависеть от окружающей их среды. В прошлом элементы окружающей среды часто создавали препятствия широкому использованию протеинов.

Для преодоления таких барьеров были использованы различные подходы. Однако эти подходы приводили либо к потере протеиновой активности, либо приводили к дополнительным расходам на стабилизирующие протеины носители или композиции.

Одним уникальным подходом к преодолению препятствий для широкого использования протеинов является технология сшитых кристаллов фермента (“CLEC ”) [N.L.Clair and M.A. Navia, J. Am. Chem. Soc., 114, pp 4314-16 (1992)]. Сшитые кристаллы фермента сохраняют свою активность в условиях окружения, которое обычно не совместимо с функционированием фермента. Такие условия окружения включают длительное экспонирование протеазам и другим агентам, расщепляющим протеин, высокие температуры или экстремальные значения рН. В таких условиях окружающей среды сшитые кристаллы протеина остаются нерастворимыми и стабильными.

Растворимость протеинов, приводящая к контролируемому высвобождению или растворению протеина, играет важную роль во многих областях промышленности и медицины. Такие области включают те, которые касаются очищающих агентов, включая детергенты, фармацевтических агентов, включая терапевтические агенты и вакцины, потребительских продуктов и предметов личной гигиены, продуктов ветеринарии, пищевых продуктов, кормов, диагностических агентов и дегазирующих агентов. Были предложены различные подходы к достижению контролируемого выделения. Они включают инкапсулирование, такое, как раскрыто в патентах США №4579779 и 5500223. Другие подходы включают использование механических или электрических приспособлений и осмотические насосы.

Контролируемое выделение (высвобождение) в области фармацевтики достигалось различными средствами. В патенте США 5569467 раскрыто использование микрочастиц с длительным высвобождением, включающих биосовместимый полимер и фармацевтический агент, который выделяется по мере разложения полимера. Патент США 5603956 относится к твердой фармацевтической дозированной форме с замедленным высвобождением, включающей сшитую амилазу, альфа-амилазу и фармацевтический агент. Патент США 4606909 относится к пероральным, с контролируемым выделением фармацевтическим препаратам сложной рецептуры, в которых гомогенное ядро, содержащее частицы слабо растворимых активных ингредиентов, покрыто рН-чувствительным эродируемым покрытием. Патент США 5593697 относится к фармацевтическим или ветеринарным имплантатам, включающим, по крайней мере, один водорастворимый материал и, по крайней мере, один водонерастворимый материал и пленку полимерного покрытия, которое создано так, что разрушается за определенный промежуток времени после имплантации.

Необходимое контролируемое выделение протеинов, однако, должно быть согласовано с тем фактом, что сам протеин может оказаться нестабильным в условиях хранения. На стабильность протеина могут также оказать вредное воздействие другие компоненты композиции, в которую он включен. Например, агрессивные жидкие детергенты представляют враждебную среду для входящих в их состав ферментов. Решение таких проблем пытались найти за счет использования мутантных субтилизиновых протеаз, которые, как утверждают, обладают повышенной устойчивостью к окислению. См. патент США 4760025 и патентную заявку РСТ WО 89/06279. Протеины, ферменты, которые наиболее широко используют в детергентах, катализируют их собственное разложение. Использование подхода, который включает добавление ингибиторов протеаз (например, бората с гликолями) или снижение водной активности, оказывается лишь частично эффективным.

Другой подход, раскрытый в патенте США 5385959, состоит в инкапсулировании детергентных компонентов, чувствительных к разложению, в капсулы композитной эмульсии полимеров, что позволяет им высвобождаться при растворении. Патент США 5286404 относится к жидкой детергентной композиции, которая, как указано, обладает улучшенной растворимостью фермента при сохранении ферментной активности. Такое усовершенствование связано с химической модификацией свободных первичных аминогрупп в ферментном растворе в результате альдегидной обработки, ацилирования или алкилирования.

Несмотря на такой прогресс в технологии протеинов вообще, все еще сохраняется необходимость в протеинах, которые были бы стабильны в условиях хранения и были бы активны в условиях их использования.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к сшитым протеиновым кристаллам, которые отличаются способностью превращаться из нерастворимой и стабильной формы в растворимую и активную форму при изменении среды, окружающей указанные кристаллы, причем указанное изменение включает: изменение температуры, изменение величины рН, изменение химического состава, перехода из концентрата в разбавленную форму, изменение окислительно-восстановительного потенциала раствора, изменение падающей радиации, изменение концентрации переходного металла, изменение концентрации фтора, изменение концентрации свободных радикалов, изменение концентрации металлических хелатирующих агентов, изменение силы сдвига, действующей на кристаллы, или их сочетания. В соответствии с одним из вариантов настоящего изобретения такие сшитые кристаллы протеина способны выделять активность своих протеинов с контролируемой скоростью.

Выгодно, чтобы сшитые протеиновые кристаллы настоящего изобретения были бы нерастворимы и стабильны в условиях хранения и были бы растворимыми и активными в условиях их использования.

В настоящем изобретении предложены также очищающие агенты, включая детергенты, терапевтические протеинсодержащие фармацевтические композиции, вакцины, предметы личной гигиены, включая косметику, композиции для использования в ветеринарии, пищевые продукты, корма, диагностические агенты и композиции для удаления загрязнений. Кроме того, настоящее изобретение включает способы получения таких сшитых протеиновых кристаллов и способы доставки протеинов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

Фиг.1 представляет график стабильности различных ферментов в детергенте Ciba # 16 при 40° С.

Фиг.2 представляет график характеристики моющей способности жидких детергентных композиций, включая композицию, содержащую сшитые кристаллы субтилизина настоящего изобретения, в отношении ткани, загрязненной кровью, молоком и сажей.

Фиг.3 представляет график характеристики моющей способности жидких детергентных композиций, включая композицию, содержащую сшитые кристаллы субтилизина настоящего изобретения, после хранения при 30° С в отношении ткани, загрязненной какао.

Фиг.4 представляет график характеристики моющей способности жидких детергентных композиций, включая композицию, содержащую сшитые кристаллы субтилизина настоящего изобретения, после хранения при 40° С в отношении ткани, загрязненной какао.

Фиг.5 представляет график характеристики моющей способности жидких детергентных композиций, включая композицию, содержащую сшитые кристаллы субтилизина настоящего изобретения, после хранения при 30° С в отношении ткани, загрязненной кровью, молоком и сажей.

Фиг.6 представляет график характеристики моющей способности жидких детергентных композиций, включая композицию, содержащую сшитые кристаллы субтилизина настоящего изобретения, после хранения при 40° С в отношении ткани, загрязненной кровью, молоком и сажей.

Фиг.7 представляет график характеристики моющей способности жидких детергентных композиций, включая композицию, содержащую сшитые кристаллы субтилизина настоящего изобретения, после хранения при 30° С в отношении ткани, загрязненной кровью.

Фиг.8 представляет график растворимости сшитых кристаллов субтилизина настоящего изобретения при 30° С.

Фиг.9 представляет график растворимости сшитых кристаллов субтилизина настоящего изобретения при 37° С.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для более полного понимания настоящего изобретения приводится далее подробное его описание. В этом описании использованы следующие термины.

Смесь водно-органического растворителя - смесь, содержащая n% органического растворителя, где n принимает значения от 1 до 99, и m% водного растворителя, где m принимает значения 100-n.

Двухфазный субстрат - раствор субстрата, содержащий две фазы, либо фазы жидкость/твердое вещество, либо фазы жидкость/жидкость, одна из которых содержит субстрат для реакции, катализируемой протеиновой составляющей сшитых кристаллов протеина. Эмульсия оливкового масла в водном растворе, содержащем дискретные водную и органическую фазы, служит примером субстрата для сшитых кристаллов липазы.

Каталитически эффективное количество - количество сшитых кристаллов протеина настоящего изобретения, которое эффективно для обработки, защиты, восстановления или детоксификации участка, на который их наносят, в течение некоторого промежутка времени.

Изменение химического состава - любое изменение химических компонентов среды, окружающей сшитые кристаллы протеина, которое влияет на среду или сшивающий агент, включая добавление химических реагентов, химические изменения, вызываемые привнесением в эту среду энергии в форме света, микроволнового излучения или радиации, химические реакции, которые влияют на сшивающий агент, или их сочетания.

Изменения силы сдвига, действующей на кристалл, - любое изменение факторов среды, окружающей сшитые кристаллы протеина в условиях использования, такие как изменения механического давления, как положительные так и отрицательные, перемешивание за счет вращения, центрифугирование, переворачивание, механическое перемешивание и фильтрование под давлением.

Контролируемое растворение - растворение сшитых кристаллов протеина или переход протеиновых составляющих из кристаллического состояния в растворимое состояние, который (1) вызывается изменением среды, окружающей кристаллы, причем указанное изменение выбирают из группы, состоящей из изменения температуры, изменения величины рН, изменения химического состава, изменения концентрированной формы в разбавленную форму, изменения окислительно-восстановительного потенциала раствора, изменения падающей радиации, изменения концентрации переходного металла, изменения концентрации фтора, изменения концентрации свободных радикалов, изменения концентрации металлических хелатирующих агентов, изменения силы сдвига, действующей на кристаллы, или их сочетаний, и (2) контролируется фактором, выбираемым из группы, состоящей из следующего: степени сшивки указанных сшитых кристаллов протеина, аминокислотных остатков, участвующих в процессе сшивки, независимо от того, является ли сшивающий агент гомобифункциональным или гетеробифункциональным, длительности экспонирования кристаллов протеина действию сшивающего агента, скорости добавления сшивающего агента к указанным кристаллам протеина, природы сшивающего агента, размера указанных сшитых кристаллов протеина, формы указанных сшитых кристаллов протеина, и их сочетаний. В том смысле, как здесь использована, фраза "контролируемое растворение", не включает выщелачивание.

Контролируемое растворение сшитых кристаллов протеина - сшитые кристаллы протеинов, которые медленно растворяются после воздействия конкретного триггера (импульс побуждающий цепную реакцию) и высвобождают растворимую форму протеина в раствор. Активность контролируемого растворения сшитых кристаллов протеина определяется главным образом растворимой формой протеина, выделяемого из кристаллов.

Сшитая кристаллическая форма протеина - сшитые кристаллы протеина, которые остаются нерастворимыми и сохраняются в твердом состоянии при добавлении в раствор.

Повышенная активность протеинов - активность сшитой кристаллической формы протеинов, которая повышена по сравнению с растворимой формой протеинов. В соответствии с различными вариантами настоящего изобретения повышенная активность протеинов демонстрируется любой из следующих: сшитая кристаллическая форма протеина обладает активностью, которая в 200-300 раз превышает активность растворимой формы протеина; сшитая кристаллическая форма протеина обладает активностью, которая в 100-200 раз превышает активность растворимой формы протеина; сшитая кристаллическая форма протеина обладает активностью, которая в 10-100 раз превышает активность растворимой формы протеина; сшитая кристаллическая форма протеина обладает активностью, которая в 20-50 раз превышает активность растворимой формы протеина; сшитая кристаллическая форма протеина обладает активностью, которая в 10-20 раз превышает активность растворимой формы протеина; сшитая кристаллическая форма протеина обладает активностью, которая в 20-30 раз превышает активность растворимой формы протеина; сшитая кристаллическая форма протеина обладает активностью, которая в 5-10 раз превышает активность растворимой формы протеина; сшитая кристаллическая форма протеина обладает активностью, которая в 2-3 раза превышает активность растворимой формы протеина; сшитая кристаллическая форма протеина обладает активностью, которая, по крайней мере, в 3 раза превышает активность растворимой формы протеина; сшитая кристаллическая форма протеина обладает активностью, которая, по крайней мере, в 2 раза превышает активность растворимой формы протеина; сшитая кристаллическая форма протеина обладает активностью, которая, по крайней мере, на 25-99% выше активности растворимой формы протеина; сшитая кристаллическая форма протеина обладает активностью, которая, по крайней мере, на 25-30% выше активности растворимой формы протеина; или сшитая кристаллическая форма протеина обладает активностью, которая, по крайней мере, на 20% выше активности растворимой формы протеина.

Композиции для очистки от загрязнений - композиции, выбранные из группы, состоящей из: композиций для удаления загрязнений химическими отходами, гербицидами, инсектицидами, пестицидами, агентами, представляющими опасность для окружающей среды, и химическим оружием.

Нерастворимая и стабильная форма протеина - форма протеина, которая остается нерастворимой в водных растворителях, органических растворителях или водно/органических смесях растворителей и которая демонстрирует более высокую стабильность, нежели растворимая форма протеина. В соответствии с альтернативным вариантом настоящего изобретения фраза "нерастворимая и стабильная форма протеина" может обозначать протеин, который нерастворим в сухих композициях, но растворим во влажных композициях. В любом из вариантов сшитые кристаллы протеина могут быть активны в нерастворимой форме. И в одном из вариантов сшитые кристаллы протеина могут быть активными в нерастворимой форме, затем могут быть растворены или удалены или расщеплены после завершения их функции.

Макромолекулярный субстрат - крупные биомолекулы, такие как протеины или углеводы с молекулярным весом, по крайней мере, 600-700 Дальтон, которые также являются субстратом для реакций, катализируемых протеиновыми составляющими сшитых кристаллов протеина.

Органический растворитель - любой растворитель не водного происхождения.

Фармацевтически эффективное количество - количество сшитых кристаллов протеина, которое эффективно для лечения состояния индивидуума, которому их вводят в течение некоторого периода времени.

Профилактически эффективное количество - количество сшитых кристаллов протеина, которое эффективно для профилактики состояния индивидуума, которому их вводят в течение некоторого периода времени.

Протеин - протеин или в другом варианте гликопротеин, или в другом варианте любой пептид с третичной структурой.

Протеиновые составляющие композиций, содержащих сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения, могут быть природно или синтетически модифицированы. Они могут быть гликопротеинами, фосфопротеинами, сульфопротеинами, иодопротеинами, метилированными протеинами, немодифицированными протеинами или могут содержать другие модификации.

Протеиновой составляющей композиций, содержащих сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения, могут быть любые протеины, включая, например, гормоны, такие как паратироидный гормон, ферменты, антитела, рецепторы вирусов, гликопротеины поверхностного вируса, гликопротеины паразитов, рецепторы паразитов, рецепторы Т-клеток, МНС молекулы, модификаторы иммунитета, опухолевые антигены, муцины, ингибиторы, факторы роста, трофические факторы, цитокины, лимфокины, токсоины, гормоны роста нервов, факторы образования сгустков крови, адгезионные молекулы, протеины устойчивости ко многим лекарствам, аденилатциклазы, костные морфогенные протеины и лектины.

В протеины включены также гликопротеиновые гормоны и цитокины. Примеры гормонов включают гормон стимуляции фолликул, человеческий хорионический гонадотропин, лютеинизирующий гормон, тиротрофин и овечьи, бычьи, свиные, мышиные и крысиные аллели этих гормонов. Примеры гликопротеинов цитокинов включают -интерферон, лимфотоксин и интерлейкин-2. Они включают также гликопротеиновые антигены, связанные с опухолями, например карциноэмбрионный антиген (СЕА), человеческие муцины, her-2/neu и простато-специфицеский антиген (PSA) [R.A.Henderson and O.J.Finn, Advanced in Immunology, 62, pp.217-56 (1996)].

Активность протеина - активность, выбранная из группы, состоящей из активности в отношении связывания, катализа или активностей, которые вызывают функциональные реакции в среде, окружающей используемый протеин, таких как индуцирование иммунной реакции и иммуногеничности, или гидролиз липидов у индивидуумов с дефицитом липаз, или их сочетаний.

Скорость выделения активности протеина - количество протеина, растворенного в единицу времени.

Растворимая форма протеина - отдельные молекулы протеина в растворе и диссоциированная форма кристаллической решетки.

Субстрат, состоящий из небольших молекул, - молекулы с молекулярным весом обычно менее 600 Дальтон, которые также являются субстратом для реакций, катализируемых протеиновыми составляющими сшитых кристаллов протеина.

Терапевтический протеин - протеин, который вводят пациенту в виде фармацевтической композиции и фармацевтически приемлемым способом. Терапевтические протеины включают, например, гормоны, ферменты, включая липазы, антитела, рецепторы вирусов, рецепторы Т-клеток, хемокины, рецепторы хемокинов, МНС молекулы, опухолевые антигены, муцины, ингибиторы, факторы роста, трофические факторы, цитокины, лимфокины, токсоиды, гормоны роста нервов, факторы свертываемости крови, адгезионные молекулы, протеины устойчивости ко многим лекарствам, аденилатциклазы и протеины костной морфогеничности.

Вакцинный антиген - протеин, полученный из инфекционного агента, такого как вирус, паразит или опухолевый антиген. Активность протеина таких вакцинных антигенов состоит в индуцировании защитного иммунитета против инфицирующего агента.

Сшитые кристаллы протеинов настоящего изобретения особенно выгодны благодаря их стабильности в опасном окружении, создаваемом формами или композициями, в которых они используются, или условиями их хранения. В то же самое время эти сшитые кристаллы протеинов способны к регулируемому растворению или высвобождению их активности при воздействии одного или более триггеров их окружения. Такие триггеры могут быть выбраны из группы, состоящей из изменения температуры, изменения величины рН, изменения химического состава, перехода из концентрированной формы в разбавленную форму, изменения силы сдвига, действующей на кристаллы, и их сочетаний.

Регулируемое растворение или высвобождение активности сшитых кристаллов протеина настоящего изобретения может также изменяться с течением времени.

Конкретные примеры таких триггеров включают возрастание или понижение температуры, например повышение температуры с низкой (между около 0° С и около 20° С) до высокой температуры (между около 20° С и около 70° С). Другие триггеры включают изменение величины рН с кислотных значений на основные значения, и изменение с основных значений на кислотные. Примеры триггеров перехода из концентрированного состояния в разбавленное включают, например, изменение концентрации в растворе, изменение концентрации всех растворенных веществ примерно с 2-кратного до около 10000-кратного, изменение концентрации всех растворенных веществ с примерно 2-кратного до около 700-кратного, увеличение или уменьшение концентрации соли, увеличение или уменьшение концентрации воды, увеличение или уменьшение концентрации органического растворителя, уменьшение концентрации протеина или уменьшение концентрации детергента.

Дополнительные триггеры включают изменения химического состава среды, окружающей сшитые кристаллы протеинов, что влияет на среду или изменения сшивающего агента. Такие изменения включают, например, добавление химических реагентов, увеличение или уменьшение концентрации органического растворителя, химические акты, которые влияют на сшивающий агент, химические изменения, вызываемые подачей энергии, включая свет, микроволновое излучение или радиацию. Как разъяснялось выше, любые из этих триггеров могут действовать в сочетании или последовательно с одним или более из других триггеров.

На контролируемое растворение сшитых кристаллов протеина настоящего изобретения можно также влиять, изменяя время, которого достаточно, чтобы позволить активности протеина высвобождаться со скоростью между около 0,1% в день до около 100% в день, изменяя время, которого достаточно, чтобы позволить активности протеина высвобождаться со скоростью между около 0,01% в час до около 100% в час, и изменяя время, которого достаточно, чтобы позволить активности протеина высвобождаться со скоростью между около 1% в минуту до около 50% в минуту.

Поэтому сшитые кристаллы протеинов настоящего изобретения включают такие, которые способны высвобождать свою протеиновую активность с контролируемой скоростью при воздействии изменения их окружения, причем указанное изменение выбирают из группы, состоящей из изменения величины рН, изменения концентрации растворенных веществ, изменения температуры, изменения химического состава, изменения силы сдвига, действующей на кристаллы, или их сочетаний. Указанная контролируемая скорость выделения активности протеинов может определяться фактором, выбранным из группы, состоящей из следующего: степени сшивки сшитых кристаллов протеина, длительности времени экспонирования кристаллов протеина сшивающему агенту, скорости добавления сшивающего агента к кристаллам протеина, природы сшивающего агента, длины цепи сшивающего агента, аминокислотных остатков, участвующих в сшивках, такого факта, как является ли сшивающий агент гомобифункциональным или гетеробифункциональным, площади поверхности сшитых кристаллов протеина, размера сшитых кристаллов протеина, формы сшитых кристаллов протеина и их сочетаний.

Как результат кристаллической природы, сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения обладают однородностью по всему объему сшитого кристалла. Такая однородность поддерживается за счет внутримолекулярных контактов и химических сшивок между молекулами, составляющими кристаллическую решетку. Молекулы протеина сохраняют одинаковое расстояние друг от друга, образуя точно определенные стабильные поры внутри сшитых кристаллов протеина, что облегчает доступ субстрата в протеин, а также удаление продукта. В этих сшитых кристаллах протеина внутренние взаимодействия в решетке при фиксировании химическими связями особенно важны для обеспечения стабильности и предотвращения денатурации, особенно при хранении в условиях, которые включают вредные условия окружающей среды, создаваемые компонентами композиции, в которой эти кристаллы используют. В то же самое время кристаллы протеина сшиты таким образом, что они растворяются или высвобождают свою протеиновую активность при воздействии триггера (импульса) в окружающей их среде в условиях использования. Так, они могут быть практически не растворимы и стабильны в композиции в условиях хранения и практически растворимы и активны в условиях использования указанной композиции.

Факторы, которые вносят вклад в скорость высвобождения протеиновой активности сшитых кристаллов протеина настоящего изобретения, включают степень сшивки кристаллов протеина, длительность воздействия на кристаллы протеина сшивающего агента, скорость добавления сшивающего агента к кристаллам протеина, природу сшивающего агента, аминокислотные остатки, участвующие в образовании сшивок, тот факт, является ли сшивающий агент гомобифункциональным или гетеробифункциональным, длину цепи сшивающего агента, площадь поверхности сшитых кристаллов протеина, размер сшитых кристаллов протеина, форму сшитых кристаллов протеина и их сочетания.

В дополнение к их активности сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения особенно стабильны и нерастворимы в условиях хранения, которые включают сопутствующую температуру хранения, величину рН при хранении, время хранения, форму хранящегося концентрата, хранения в условиях отсутствия или небольшой силы сдвига, действующей на кристаллы, или их сочетания. Выгодно, чтобы эти сшитые кристаллы протеина были бы растворимы и активны в условиях использования, которые включают изменение температуры, изменение химического состава, переход из концентрированной формы в разбавленную форму, изменение силы сдвига, действующей на кристаллы, и их сочетания. Такие свойства делают сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения особенно подходящими для доставки очищающих агентов, включая детергенты, терапевтических протеинов, фармацевтических композиций, агентов личной гигиены или композиций, включая косметику, вакцину, композиций для использования в ветеринарии, продуктов питания, кормов, диагностических агентов и композиций для очистки от загрязнений.

В соответствии с одним из вариантов сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения характеризуются таким сроком полураспада активности в условиях хранения, который, по крайней мере, в два раза превышает эту величину для растворимой формы протеина, который кристаллизуется для получения сшитых кристаллов, и активностью, которая аналогична активности растворимой формы в условиях использования.

В соответствии с одним из вариантов настоящего изобретения сшитые кристаллы протеина характеризуются активностью, которая аналогична активности их растворимых или не сшитых кристаллизованных составляющих в условиях использования. Однако важно, что сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения демонстрируют повышенную стабильность в условиях хранения по сравнению с их растворимыми или не сшитыми кристаллизованными составляющими протеина.

Одним из преимуществ контролируемого растворения сшитых кристаллов протеина является то, что для выделения растворимой формы протеина из кристаллической решетки необходим триггер (импульс). Поэтому можно обеспечить контролируемое растворение сшитых кристаллов протеина, которые существуют как сшитые кристаллы протеина с протеиновой активностью в твердом кристаллическом состоянии до тех пор, пока не подвергнутся воздействию триггера. После воздействия триггера растворимый протеин высвобождается и протеиновая активность функционирует как из сшитой кристаллической формы, так и из растворимой формы протеина.

В соответствии с одним из вариантов настоящего изобретения выгодные свойства достигаются за счет сшитых кристаллов протеина, которые получают как сшитые кристаллы протеина с контролируемым растворением, но которые затем не подвергаются воздействию триггера. В частности, в отсутствии соответствующего триггера для инициирования растворения такие сшитые кристаллы протеина могут демонстрировать повышенную активность протеина в отношении макромолекулярных субстратов, бифазных субстратов или субстратов из небольших молекул по сравнению с их растворимыми составляющими. Так например, кристаллы липазы, сшитые в сульфосукцинимидил-6-[ -метил- -(2-пиридилдитио)толуамидо]гексаноатом (Sulfo-LC-SMPT), которые затем не подвергают воздействию триггера для разрушения -S-S-связей сшивок, демонстрируют повышенную активность гидролиза в отношении бифазного субстрата оливкового масла.

Более конкретно, кристаллы липазы, сшитые с Sulfo-LC-SMPT, отличаются активностью протеина примерно в 5-10 раз более высокой в отношении гидролиза субстрата оливкового масла, нежели активность растворимой формы протеина, который кристаллизуют для получения сшитых кристаллов. Кроме того, кристаллы липазы, сшитые 1-этил-3-[3-диметиламинопропил] карбодиимидгидрохлоридом (EDC), отличаются примерно в два раза более высокой активностью в отношении гидролиза субстрата оливкового масла по сравнению с растворимой формой протеина, который кристаллизуют для получения сшитых кристаллов.

Протеиновой составляющей сшитых кристаллов протеина настоящего изобретения может быть любой протеин, включая, например, терапевтические протеины, профилактические протеины, включая антитела, протеины очищающих агентов, включая протеины детергентов, протеины агентов личной гигиены, включая косметические протеины, протеины для использования в ветеринарии, протеины пищевых продуктов, кормов, диагностические протеины и протеины агентов, удаляющих загрязнения. Среди других протеинов включены также такие протеины, как ферменты, такие как, например, гидролазы, изомеразы, лиазы, лигазы, трансферазы и оксидоредуктазы. Примеры гидролаз включают термолизин, эластазу, эстеразу, липазу, нитрилазу, амилазу, пектиназу, субтилиназу, гидантоиназу, аспарагиназу, уреазу, субтилизин и другие протеазы и лизоцим. Примеры лиаз включают альдодазы и гидроксинитриллиазу. Примеры оксидоредуктаз включают пероксидазу, лакказу, глюкозооксидазу, алкоголь-дегидрогеназу и другие дегидрогеназы. Другие ферменты, которые можно кристаллизовать и сшивать, включают целлюлазы и оксидазы.

Примеры терапевтических или профилактических протеинов включают гормоны, ферменты, включая липазу, антитела, ингибиторы, факторы роста, трофические факторы, цитокины, лимфокины, токсоиды, эритропротеины. Фактор VIII, инсулин, глюкагоно-подобный пептид-1 (инсулинотропин), амилин, ТРА, дорназ- , -1-антитрипсин, человеческие гормоны роста, горомоны роста нервов, паратироидный гормон, костные морфогенные протеины, уреазу, токсоиды, гормоны фертильности, FSH, LSH, postridical гормоны, токсоид столбняка, токсоид дифтерии.

Сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения можно использовать в любом из многочисленных химических процессов. Такие процессы включают процессы, проводимые как в промышленных, так и в лабораторных масштабах, таких как органические синтезы специальных химических веществ и лекарств. Процессы ферментных превращений включают окисление, восстановление, присоединение, включая эстерификации и трансэстерификации, гидролизы, элиминирование, перегруппировки и ассиметричные превращения, включая стереоселективные, стереоспецифические и региоселективные реакции.

Так, сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения можно с успехом использовать вместо обычных растворимых или иммобилизованных протеинов в очищающих агентах, включая детергенты, фармацевтические агенты, терапевтические агенты, соединения для ветеринарии, композиции личной гигиены, включая косметические препараты, пищу, корма, вакцины, обработку целлюлозы, бумаг и текстиля, диагностические агенты и композиции для дегазации (очистки от загрязнений).

Сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения можно также использовать в различных применениях в отношении окружающей среды. Их можно использовать вместо обычных растворимых или иммобилизованных протеинов для решения задач, связанных с окружающей средой, таких как дегазация обширных площадей или источников опасности для окружающей среды.

В другом варианте сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения можно использовать в очищающих агентах, выбранных из группы, состоящей из детергентов, таких как порошковые детергенты и жидкие детергенты, отбеливатели, очистители для дома, очистители для твердых поверхностей, промышленные очистители, шампуни для очистки ковров и мебельных тканей.

Очищающие агенты, содержащие сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения, могут также включать соединения, которые обычно бывают включены в такие агенты. См. например, Soaps and Detergents, A Theoretical and Practical Review, Louis Spitz (Ed.), AOCS Press (Champlain, Illinopis) (1996). Такие соединения включают анионные, неионные, катионные или цвиттерионные поверхностно активные агенты или их смеси.

Примеры анионных поверхностно-активных агентов включают алкилсульфаты, алкиловые эфиры сульфатов, алкилсульфонаты, алкил-арилсульфонаты, олефиновые сульфонаты, алкиловые эфиры фосфатов, соли жирных кислот, мыла, изотионаты и сульфонированные ненасыщенные сложные эфиры и кислоты.

Примеры неионных поверхностно активных агентов включают продукты конденсации органических алифатических или алкил-ароматических гидрофобных соединений с алкиленоксидом, алкилполиглюкозами и сложными эфирами сахаров.

Примеры катионных поверхностно-активных агентов включают четвертичные аммониевые соли или третичные алкиламины, аминоамиды, сложные аминоэфиры или имидазолины, содержащие, по крайней мере, одну длинноцепочечную (С₈-С₂₂) алифатическую группу или алкиларильную группу, в которой алкил содержит от около 4 до около 12 атомов углерода, а арилом является предпочтительно группа фенилена.

Примеры цвиттерионных поверхностно-активных агентов включают производные четвертичных аммониевых, четвертичных фосфониевых или третичных сульфониевых соединений, производные вторичных или третичных аминов и производные гетероциклических вторичных или третичных аминов.

Сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения можно использовать в качестве ингредиентов в композициях личной гигиены, включая косметику, таких как кремы, лосьоны, эмульсии, пены, смывки, пудры, гели, муссы, суспензии, порошки, спреи, пасты, мази, помады, бальзамы, капли, шампуни и солнцезащитные препараты. В кремах и лосьонах для наружного применения, например, их можно использовать как увлажнители или для защиты кожи, смягчающие, отбеливающие, очищающие, обезжиривающие, депротеинизирующие, увлажняющие, обесцвечивающие, окрашивающие или детоксифицирующие агенты. Их можно также использовать в косметике в качестве антиоксидантов.

В соответствии с настоящим изобретением любого индивидуума, включая людей и других млекопитающих, можно лечить фармацевтически приемлемым способом фармацевтически эффективным или каталитически эффективным количеством сшитых кристаллов протеина в течение промежутка времени, которого достаточно для лечения состояния индивидуума, которому вводят указанный протеин в течение некоторого промежутка времени. В качестве альтернативы индивидуумы могут получать профилактически эффективное или каталитически эффективное количество сшитых кристаллов протеина настоящего изобретения, которое эффективно предотвращает у индивидуума, которому его вводят в течение некоторого промежутка времени, возникновение такого состояния.

Такие сшитые кристаллы протеина можно вводить отдельно, как часть фармацевтической композиции, часть средства личной гигиены или ветеринарного препарата, или как часть профилактического препарата, такого как вакцина, с добавлением адьюванта или без добавления адьюванта. Их можно вводить парэнтевально или не парэнтерально. Например, их можно вводить перорально, через легкие, через нос, через уши, анально, через кожу, в глаза, внутривенно, внутримышечно, через артерии, внутрибрюшинно, через слизистую, под язык, подкожно или путем внутричерепного введения. Либо в лекарственных, либо в ветеринарных препаратах, либо в средствах личной гигиены, сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения можно использовать для наружного применения, нанося на любые эпителиальные поверхности. Такие эпителиальные поверхности включают ротовые, глазные, ушные, анальные и носовые поверхности, которые необходимо лечить, защитить, восстановить или детоксифицировать, нанося указанные кристаллы.

Настоящее изобретение включает также композиции с контролируемым высвобождением, включающие сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения. В таких композициях сшитые кристаллы протеина практически не растворимы в условиях хранения и способны высвобождать свою протеиновую активность in vivo с контролируемой скоростью. Например, фармацевтические композиции настоящего изобретения с контролируемым высвобождением, введенные перорально, характеризуются тем, что компоненты сшитых кристаллов протеина практически нерастворимы в условиях рН желудка и практически растворимы в условиях рН тонкого кишечника. В другом варианте для этих и других целей настоящего изобретения сшитые кристаллы протеина могут быть активны в нерастворимой форме, а затем могут растворяться и могут быть удалены или расщеплены после завершения их функций.

Фармацевтические, ветеринарные или профилактические композиции или композиции личной гигиены, включающие сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения, можно также выбрать из группы, состоящей из таблеток, липосом, гранул, шариков, микрочастиц, микросфер и капсул.

Для таких применений, а также для других применений в соответствии с настоящим изобретением сшитые кристаллы протеина могут быть приготовлены в виде таблеток. Такие таблетки состоят из не содержащей жидкости и не содержащей пылевидных частиц формы сшитых кристаллов протеина, которые легко хранить и которые сохраняют приемлемые уровни активности.

В другом варианте, сшитые кристаллы протеина могут быть в удобных формах пролонгированного действия, которые используют для введения для обеспечения реакционноспособных композиций. Они включают, например, твердые, полутвердые и жидкие дозированные формы, такие как жидкие растворы или суспензии, гели, кремы, бальзамы, эмульсии, лосьоны, взвеси, порошки, спреи, пены, пасты, мази, помады и капли.

Композиции или составы, включающие сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения, могут также включать любые обычные носители или адьюванты, которые используют в фармацевтических композициях, композициях личной гигиены или ветеринарных рецептурах. Эти носители и адьюванты включают, например, адьювант Фреунда, ионообменники, окись алюминия, стеарат алюминия, лецитин, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, частичные глицеридные смеси насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как протаминсульфат, динатрийгидрофосфат, хлорид натрия, соли цинка, коллоидную двуокись кремния, магнезию, трисиликат, вещества на основе целлюлозы и полиэтиленгликоль. Адьюванты для наружного применения или формы на основе гелей могут включать, например, карбоксиметилцеллюлозу, полиакрилаты, блок-сополимеры полиоксиэтилен-полиоксипропилена, полиэтиленгликоль и древесные смолы и спирты.

В соответствии с одним из вариантов этого изобретения сшитые кристаллы протеина могут быть объединены с обычными материалами, которые используются для введения с контролируемым высвобождением. Такие материалы включают, например, покрытия, оболочки и пленки, такие как желудочные покрытия и полимерные покрытия и пленки.

Наиболее эффективный способ введения и режим дозирования рецептур или композиций, включающих сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения, будет зависеть от нужного эффекта, предшествующего лечения (если оно имело место), состояния здоровья индивидуума или состояния его самого и реакции на сшитые кристаллы протеина, и заключения лечащего врача или клинициста. Сшитые кристаллы протеина можно вводить в любой дозированной форме, приемлемой для фармацевтического препарата, композиций средств личной гигиены или ветеринарной рецептуры, единовременно или в несколько приемов.

Количество сшитых кристаллов протеина, которое можно объединить с материалами носителя для получения единичной дозированной формы, будет меняться в зависимости от конкретного способа введения, рецептуры, уровня доз и частоты приема доз. Типичный препарат будет содержать от около 0,01% до около 99%, предпочтительно от около 1% до около 50% сшитых кристаллов протеина (вес/вес).

После улучшения состояния индивидуума при необходимости можно вводить поддерживающую дозу сшитых кристаллов протеина, причем дозы или частоту введения, или и то и другое, можно снизить как функцию симптомов до уровня, при котором это улучшенное состояние будет сохраняться. После того как состояние облегчается до нужного уровня, лечение можно прекратить. Однако индивидуумам может понадобиться периодическое длительное лечение после любого возврата состояния или его симптомов.

Альтернативный вариант настоящего изобретения включает систему доставки протеина, включающую описываемые здесь сшитые кристаллы протеина. Такую систему можно использовать для доставки протеинов, таких, как те, которые включены в очищающие агенты, такие как детергенты, продукты личной гигиены, такие как косметические препараты и фармацевтические препараты, такие как липазы, композиции для использования в ветеринарии, вакцины, пищевые продукты, корма, диагностические агенты и композиции для дегазации. Системы доставки протеина настоящего изобретения, которые могут быть композициями или приспособлениями, такими как имплантируемые устройства, могут быть системами доставки протеина, состоящими из микрочастиц, где сшитые кристаллы протеина имеют наибольшее измерение от около 0,01 до около 500 мкм, в другом варианте от около 0,1 мкм до около 50 мкм. Компоненты сшитых кристаллов протеина в таких системах могут иметь форму, выбранную из группы, состоящей из: сфер, иголок, палочек, пластин, таких как шестигранники и квадраты, ромбоидов, кубов, бипирамид и призм. Выгодно, чтобы сшитые кристаллические формы протеинов настоящего изобретения обеспечивали бы содержание вплоть до от около 50% до около 90% протеина на единицу веса.

Одним из примеров защищенных протеиновых систем настоящего изобретения является система, подходящая для хранения в среде, такой как жидкий детергент, до использования. Компоненты сшитых кристаллов протеина такой системы нерастворимы в условиях хранения в указанной среде, которая обычно вызывает разложение растворимой формы протеина, который кристаллизуют для получения указанных сшитых кристаллов, и растворимы в условиях использования.

В соответствии с настоящим изобретением получение сшитых кристаллов протеина включает стадии кристаллизации и сшивки протеина. Это можно осуществить в соответствии с приводимой далее иллюстрацией.

Получение сшитых кристаллов протеина - кристаллизация протеина

Кристаллы протеина выращивают путем контролируемой кристаллизации протеина из водного раствора или водного раствора, содержащего органический растворитель. Условия, которые необходимо контролировать, включают, например, скорость испарения растворителя, присутствие соответствующих сорастворенных веществ и буферов, рН и температуру. Исчерпывающий обзор различных факторов, которые влияют на кристаллизацию протеинов, опубликован McPherson, Methods Enzymol., 114, pp.112-20 (1985).

McPherson and Gilliland, J.Cryst. Growth, 90, pp.51-59 (1988) собрали обширный список протеинов и нуклеиновых кислот, которые были кристаллизованы, а также условий их кристаллизации. Полный перечень кристаллов и способов их кристаллизации, так же как и ссылки на хранилища определенных структур протеинов и нуклеиновых кислот, содержатся в Protein Data Bank в Brookhaven National Laboratory [http//www. pdb.dnl.gov; Bernstein et al., J.Mol. Biol., 112, pp 535-42 (1977)]. Эти ссылки можно использовать для определения условий, необходимых для кристаллизации протеина, как прелюдии к образованию соответствующего сшитого кристалла протеина и как руководство к определению стратегии кристаллизации для других протеинов. В другом варианте разумная стратегия проб и ошибок в большинстве случаев приводит к определению подходящих условий для кристаллизации для многих протеинов, при условии, что для них можно достичь приемлемого уровня степени чистоты [см., например, C.W.Carter, Jr. and C.W.Carter, J.Biol. Chem., 254 PP 12219-23 (1979)].

Для использования сшитых кристаллов протеина настоящего изобретения не требуются крупные одиночные кристаллы, которые нужны для анализа дифракции рентгеновских лучей. Пригодны мелкокристаллические частицы.

Так, например, сшитые кристаллы протеина могут иметь наибольшее измерение от около 0,01 мкм до около 500 мкм или от около 0,1 мкм до около 50 мкм. Они также могут иметь форму, выбранную из группы, состоящей из: сфер, иголок, палочек, пластин, таких как гексагоны и квадраты, ромбоидов, кубов, бипирамид и призм.

Обычно кристаллы получают, объединяя подлежащий кристаллизации протеин с соответствующим водным растворителем или водным растворителем, содержащим соответствующие агенты кристаллизации, такие как соли или органические растворители. Растворитель объединяют с протеином и можно перемешивать при температуре, определенной экспериментально, которая необходима для индуцирования кристаллизации и приемлема для сохранения активности протеина и стабильности. Растворитель может необязательно включать сорастворенные вещества, такие как двухвалентные катионы, кофакторы или хаотропные агенты, а также различные типы буферов для регулирования рН. Необходимость в таких сорастворенных веществах и их концентрации определяются экспериментально для облегчения кристаллизации.

В промышленных процессах контролируемое осаждение, приводящее к кристаллизации, можно лучше всего осуществить простым объединением протеина, осаждающего агента, сорастворенного вещества и, необязательно, буферов в периодическом процессе. В качестве другой возможности протеины можно кристаллизовать, используя в качестве исходного материала осажденные протеины. В этом случае осадки протеина добавляют к кристаллизационному раствору и инкубируют до образования кристаллов. Альтернативные лабораторные способы кристаллизации, такие как диализ или диффузия паров, также можно адаптировать.

McPherson (см. выше) и Gilliland (см. выше) в своих обзорах литературы, относящейся к кристаллизации, представили исчерпывающий список подходящих условий.

Иногда несовместимость сшивающего агента и среды для кристаллизации может потребовать переноса кристаллов в более подходящую систему растворителя.

Многие протеины, для которых условия кристаллизации уже были описаны, можно использовать для получения сшитых кристаллов протеина настоящего изобретения. Следует заметить, однако, что условия, указанные в приведенных выше ссылках, были оптимизированы для получения, в большинстве случаев, нескольких крупных кристаллов для дифракционных исследований. Соответственно, специалистам должно быть ясно, что может оказаться необходимым несколько изменить эти условия для создания процесса для крупномасштабного получения более мелких кристаллов, которые используют для получения сшитых кристаллов протеина.

Получение сшитых кристаллов протеина - сшивание кристаллов протеина

После того как кристаллы протеина были выращены в подходящей среде, их можно сшить. Сшивание приводит к стабилизации кристаллической решетки за счет введения ковалентных связей между молекулами протеина, составляющими кристалл. Это делает возможным перенос протеина в другое окружение, которое, в противном случае, могло бы оказаться несовместимым с существованием кристаллической решетки или даже с самим существованием неизмененного протеина.

Выгодно, чтобы сшивание по способу настоящего изобретения было осуществлено таким образом, чтобы в условиях хранения взаимодействия сшивок предотвращали обратный переход в раствор молекул протеина, составляющих кристалл, эффективно делая нерастворимыми или иммобилизованными молекулы протеина в микрокристаллических частицах. Под воздействием триггера в среде, окружающей сшитые кристаллы протеина, как, например, в условиях использования, отличающихся от условий хранения, молекулы протеина растворяются, выделяя свою протеиновую активность. Скорость растворения контролируется одним или более из следующих факторов, которые включают степень сшивки, длительность экспонирования кристаллов протеина сшивающему агенту, аминокислотные остатки, участвующие в образовании сшивок, тот факт, является ли сшивающий агент гомобифункциональным или гетеробифункциональным, скорость добавления сшивающего агента к кристаллам протеина, длительность экспонирования кристаллов сшивающему агенту, природу сшивающего агента, длину цепи сшивающего агента, размер сшитых кристаллов протеина, площадь поверхности сшитых кристаллов протеина, форму сшитых кристаллов протеина и их сочетания.

В другом варианте контролируемое растворение сшитых кристаллов протеина действуют как сшитые кристаллы в отсутствие специфического триггера, необходимого для инициирования и поддержания растворения.

Образования сшивок можно достичь, используя один реагент или комбинацию широкого круга многофункциональных реагентов одновременно (параллельно) или последовательно, включая бифункциональные реагенты. После воздействия триггера в окружающей среде или по прошествии определенного промежутка времени сшивки между кристаллами протеина, сшитыми такими многофункциональными сшивающими агентами, уменьшаются или ослабевают, что приводит к растворению протеина или высвобождению активности.

Такие сшивающие агенты включают глутаральдегид, янтарный альдегид, октандиальдегид и глиоксаль. Дополнительные многофункциональные сшивающие агенты включают галоидтриазины, например хлорангидрид циануровой кислоты; галоидпиримидины, например 2,4,6-трихлор/бромпиримидин; ангидриды или галиды алифатических или ароматических моно- или ди-карбоновых кислот, например малеиновый ангидрид, (мет)акрилоилхлорид, хлорацетилхлорид; соединения N-метилола, например N-метилолхлорацетамид; ди-изоцианаты или изотиоцианаты, например фенилен-1,4-ди-изоцианат и азиридины. Другие сшивающие агенты включают эпоксиды, такие как, например, ди-эпоксиды, три-эпоксиды и тетра-эпоксиды.

В соответствии с предпочтительным вариантом настоящего изобретения сшивающим агентом является глутаральдегид, который используют отдельно или последовательно с эпоксидом. Для представителей других доступных сшивающих агентов (см., например, каталог 1996 Pierce Chemical Company). Такие многофункциональные сшивающие агенты можно также использовать одновременно (параллельно) или последовательно с обратимыми сшивающими агентами, такими как те, которые будут описаны далее.

Сшивающими агентами, которые пригодны для использования в различных вариантах настоящего изобретения, являются (1) те, которые создают ковалентные связи между одной цистеиновой боковой цепью протеина и другой цистеиновой боковой цепью, (2) те, которые создают ковалентные связи между одной лизиновой боковой цепью протеина и другой, или (3) те, которые создают ковалентные связи между одной цистеиновой боковой цепью протеина и лизиновой боковой цепью. Сшивание может происходить как за счет внутримолекулярных, так и межмолекулярных ковалентных сшивок.

Кристаллы протеина для обеспечения контролируемого растворения сшитых кристаллов протеина могут быть сшиты одним из следующих сшивающих агентов: диметил 3,3 -дитиобиспропионимидат· НСl (DTBP); дитиобис(сукцинимидилпропионат) (DSP); бисмалеимидогексан (ВМН); бис(сульфосукцинимидил)суберат (BS); 1,5-дифтор-2,4-динитробензол (DFDNB); диметилсуберимидат· 2НСl (DMS); дисукцинимидилглутарат (DSG); дисульфосукцинимидилтартарат (Sulfo-DST); 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимидгидрохлорид (EDC); этиленгликольбис [сульфосукцинимидил-сукцинат] (Sulfo-EGS); сложный эфир N-[ -малеимидобутирилокси]сукцинимида (GMBS); N-гидроксисульфосукцинимидил-4-азидобензоат (Sulfo-HSAB); сульфосукцинимидил-6-[ -метил- -(2-пиридилдитио)толуамидо]гексаноат (Sulfo-LC-SMPT); бис-[ -(4-азидосалициламидо)этил]дисульфид (BASED); и NHS-PEG-винилсульфон (NHS-PEG-VS).

В соответствии с другим вариантом настоящего изобретения сшивание можно осуществить, используя обратимые сшивающие агенты параллельно или последовательно. Полученные сшитые кристаллы протеина отличаются реакционноспособным многофункциональным связующим, в которое триггер включен как отдельная группа. Реакционноспособная функциональность участвует в связывании вместе с реакционноспособными аминокислотными боковыми цепями протеина, и триггер состоит из связи, которая может быть нарушена при изменении одного или более из условий окружающей среды (например, рН, температуры или термодинамической активности воды). Схематически это можно проиллюстрировать следующим образом:

X-Y-Z+2АА остатки --> AA₁-X-Y-Z-AA ₂

изменение в окружающей среде --> AA ₁-X+Y-Z-AA₂,

где Х и Z представляют группы с реакционноспособной функциональностью,

где Y представляет триггер,

где AA₁ и АА₂ представляют реакционноспособные аминокислотные остатки одного и того же протеина или двух различных протеинов. Связь между сшивающим агентом и протеином может быть ковалентной, или ионной связью, или водородной связью. Изменение окружающей среды приводит к разрушению триггерной связи и растворению протеина. Так сшивки между кристаллами протеина, сшитые такими обратимыми сшивающими агентами, разрушаются, что приводит к растворению кристаллов протеина или выделению активности.

В другом варианте реакционноспособная функциональность сшивающего агента и триггер могут быть одними и теми же, как в:

X-Z+2АА остатки --> AA₁-X-Z-AA₂

изменение окружающей среды --> AA₁+X-Z-АА ₂.

Сшивающий агент может быть гомофункциональным (X=Y) или гетерофункциональным (X не равен Y). Реакционноспособные функциональности Х и Y могут быть (но ими не ограничиваются) следующими функциональными группами (где R, R , R и R могут представлять алкильные, арильные группы или водород):

I. Примеры реакционноспособных ацильных доноров: карбоксилатные сложные эфиры RCOOR , амиды RCONHR , ацилазиды RCON₃, карбодиимиды R-N=C=N-R , сложные эфиры N-гидроксиимидов RCO-O-NR , сложные имидоэфиры R-C=NH2⁺ (OR ), ангидриды RCO-O-COR , карбонаты RO-CO-O-R , уретаны RNHCONHR , галоидангидриды RCO-Hal (где Наl=галоген), ацилгидразиды RCONNR R , O-ацилизомочевины RCO-O-C=NR (-NR R ),

II. Примеры реакционноспособных карбонильных групп: альдегиды RCHO и кетоны RCOR , ацетали RCO(H₂)R , кетали RR CO₂R R . Реакционноспособные карбонилсодержащие функциональные группы, хорошо известные специалистам в области иммобилизации и сшивания протеинов, раскрыты в литературе [Pierce Catalog and Handbook, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1994); S.S.Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press, Boca Raton, Florida (1991)].

III. Примеры алкильных или арильных доноров: алкил или арилгалоиды R-Hal, азиды R-Ns, сульфатные сложные эфиры RSО₃R , фосфатные сложные эфиры RРО(ОР ₃), алкилоксониевые соли R₃O+, сульфоний R₃S+, нитратные сложные эфиры RONO₂, акцепторы Михаэля RCR =CR CO-R , арилфториды ArF, изонитрилы RN+=C-, галоидамины R₂ N-Hal, алкены и алкины.

IV. Примеры серусодержащих групп: дисульфиды RSSR , сульфгидрилы RSH, эпоксиды RCO-CR ₂.

V. Примеры солей представлены алкил- или ариламмониевыми солями R₄N+, карбоксилатами RCOO-, сульфатами ROSO₃-, фосфатами RОРО ₃ и аминами R₃N.

Приведенная табл.1a включает примеры триггеров, созданных механизмом выделения. В этой таблице R= представляет многофункциональный сшивающий агент, который может быть алкилом, арилом или может представлять другие цепочки с активирующими группами, которые могут реагировать с протеином для сшивания. Эти реакционноспособные группы могут быть любыми из различных групп, таких как те, которые подвержены нуклеофильному, свободно-радикальному или электрофильному замещению, включая, наряду с другими, галоиды, альдегиды, карбонаты, уретаны, ксантаны и эпоксиды.

Растворение сшитых кристаллов протеина настоящего изобретения можно контролировать, выбирая соответствующие сшивающие агенты и соответствующие триггеры. Примеры доступных физических и химических триггеров включают: изменение температуры, изменение величины рН, изменение химического состава, переход из концентрата в разбавленную форму, изменение окислительно-восстановительного потенциала раствора, изменение падающей радиации, изменение концентрации переходного металла, изменение концентрации фтора, изменение концентрации свободных радикалов, изменение концентрации металлических хелатирующих агентов, изменение силы сдвига, действующей на кристаллы, или их сочетания.

Дополнительные примеры обратимых сшивающих агентов описаны в T.W.Green, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley &; Sons (Eds.) (1981). Любые подходы, используемые для обратимых защитных групп, можно использовать для сшивающего агента, пригодного для получения сшитых кристаллов протеина, способных к обратимой контролируемой солюбилизации. Различные подходы перечислены в обзоре Waldmann s в Angewante Chemie Inl. Ed. Engi., 35, p.2056 (1996).

Другие типы обратимых сшивающих агентов представляют сшивающие агенты, содержащие дисульфидные связи. Триггером, разрушающим сшивки, образованные такими сшивающими агентами, является добавление восстанавливающего агента, такого как цистеин, к среде, окружающей сшитые кристаллы протеина.

Дисульфидные сшивающие агенты раскрыты в Pierce Catalog and Handbook (1994-1995).

Примеры таких сшивающих агентов включают:

Гомобифункциональные (симметричные)

DSP - Дитиобис(сукцинимидилпропионат), известный также как реагент Ломанта (Lomant s)

DTSSP - 3,3 -дитиобис(сульфосукцинимидилпропионат), водно-растворимая версия DSP

DTBP - Диметил 3,3 -дитиобиспропионимидат· НСl

BASED - Бис-( -[4-азидосалициламидо]этил)дисульфид

DPDPB - 1,4-ди-(3 -[2 -пиридилдитио] пропионамидо) бутан

Геторобифункциональные (асимметричные)

SPDP - N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат

LC-SPDP - Сукцинимидил-6-(3-[2-пиридилдитио]пропионат)гексаноат

Sulfo-LC-SPDP - Сульфосукцинимидил-6-(3-[2-пиридилдитио]пропионат)гексаноат, водно-растворимая версия LC-SPDP

APDP - N-(4-[п-азидосалициламидо]бутил)-3 -(2 -пиридилтио)пропионамид

SADP - N-сукцинимидил(4-азидофенил) 1,3 -дитиопропионат

Sulfo-SADP - Сульфосукцинимидил(4-азидофенил) 1,3 -дитиопропионат, водно-растворимая версия SADP

SAED - Сульфосукцинимидил-2-(7-азидо-4-метилкумарин-3-ацетамид) этил-1,3 -дитиопропионат

SAND - Сульфосукцинимидил-2-(м-азидо-о-нитробензамидо)этил-1, 3 -дитиопропионат

SASD - Сульфосукцинимидил-2-(п-азидосалициламидо)этил-1,3 -дитиопропионат

SMPB - Сукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират

Sulfo-SMPB - Сульфосукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират

SMPT - 4-сукцинимидилоксикарбонилметил- -(2-пиридилтио)толуол

Sulfo-LC-SMPT - Сульфосукцинимидил-6-( -метил- -(2-пиридилтио) толуамидо)гексаноат.

Для лучшего понимания настоящего изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры служат лишь целям иллюстрации, и ни коим образом не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1 - Получение сшитых кристаллов субтилизина

Кристаллизация субтилизина

Один объем Алькалазы 2,5 л (Novo Nordisk Bioindustrials, Franklinton, North Carolina) добавляют к 2 объемам 15%-ного раствора сульфата натрия (рН 5,5), полученного при 30-35° С. В кристаллизационный раствор вносят затравку, составляющую 1/2000-1/500 объема (30 мг/мл) суспензии кристаллов в 15%-ном сульфате натрия (рН 5,5), рН поддерживают при 5,5, добавляя NaOH. Кристаллизационный раствор с внесенной затравкой инкубируют при 30-35° С, перемешивая с помощью магнитной мешалки в течение ночи. В результате через 24-48 ч получают 60-80% (по активности) кристаллических палочек, длиной 10-50 мкм, шириной 1-3 мкм.

Пример 2 - Сшивание кристаллов субтилизина

Кристаллы субтилизина сшивают, используя один из различных сшивающих агентов, включая: глутаральдегид, глиоксаль, янтарный альдегид, октандиальдегид и эпоксиды.

Сшивание глутаральдегидом

Глутаральдегид ("GA") (поставляется в виде 50%-ного водного раствора Aldrich Chemical Co.) разбавляют при 4° С различными количествами деионизированной воды, указанными далее в табл.I. На каждый мл кристаллов субтилизина (27 мг/мл) в 15% сульфате натрия, 10 мкл разбавленного глутаральдегида добавляют к суспензии, встряхивая при вращении с малой скоростью (для количеств менее 5 мл) или перемешивая расположенной сверху мешалкой с умеренной скоростью (для количеств 25 мл - 500 мл). После перемешивания в течение определенного времени сшивания образцы центрифугируют в течение 20 с с максимальной скоростью, надосадочную жидкость сливают и заменяют 15% сульфатом натрия. Такую "промывку" повторяют всего 5 раз. Окончательное суспендирование осуществляют в 900 мкл 15% сульфата натрия.

Сшивание глиоксалем

Глиоксаль (поставляется в виде 40% водного раствора Aldrich Chemical Co.) ("GY") добавляют к суспензии кристаллов до получения конечной концентрации 0,01-1,0%. Для каждого мл кристаллов субтилизина (27 мг/мл) в 15% сульфате натрия 0,25 мкл до 25 мл (0,01 до 1%) глиоксаля добавляют к суспензии, перемешивая магнитной мешалкой при комнатной температуре. После перемешивания в течение 1 ч сшитые кристаллы центрифугируют и промывают, как указано для сшивания глутаральдегидом.

Сшивание октандиальдегидом

Октандиальдегид ("ОА") (100% как поставляет DSM Chemie Linz) в количествах, указанных далее в табл.II, добавляют неразбавленным к 1 мл суспензии кристаллов субтилизина (27 мг/мл в 15% сульфате натрия) при перемешивании магнитной мешалкой при комнатной температуре. Перемешивание продолжают в течение определенного количества минут или часов, прежде чем сшитые кристаллы центрифугируют и промывают, как указано для сшивания глутаральдегидом.

Сшивание янтарным альдегидом

Янтарный альдегид ("SА") (40% как поставляет DSM Chemie Linz) в количествах, указанных далее в табл.III, добавляют неразбавленным к 1 мл суспензии кристаллов субтилизина (27 мг/мл в 15% сульфате натрия) при перемешивании магнитной мешалкой при комнатной температуре. Перемешивание продолжают в течение определенного количества минут или часов, прежде чем сшитые кристаллы центрифугируют и промывают, как указано для сшивания глутаральдегидом.

Сшивание эпихлоргидрином

10 мкл эпихлоргидрина ("ЕР") (99%, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) добавляют неразбавленными к 1 мл суспензии кристаллов субтилизина (27 мг/мл в 15% сульфате натрия) при перемешивании при комнатной температуре. Перемешивание продолжают в течение определенного количества минут или часов, прежде чем сшитые кристаллы центрифугируют и промывают, как указано для сшивания глутаральдегидом.

Сшивание эпоксидом

Общая процедура

Сшивание субтилизина осуществляют отдельно, используя один из следующих эпоксидов:

1) Общее название DENACOL

a) DENACOL EX-411

b) DENACOL EX-421

c) DENACOL EX-614

d) DENACOL EX-201

e) DENACOL EX-202; все получены от Nagase American Corporation.

2) Полученные от Tokyo Kasei Inc. America:

a) Диглицидиловый эфир неопентилгликоля (N448) ("NP")

b) Диглицидиловый эфир этиленгликоля (Е0342) ("EG")

Концентрация эпоксида меняется от 0,01 до 4,0%, а время процесса сшивания меняется от 1 ч до 72 ч. Процедура добавления к ферменту и удаления сшивающего агента из фермента такая же, что указана для сшивания глутаральдегидом.

После сшивания глутаральдегидом (0,01 до 0,2%) в течение 1-5 ч получают сильно сшитые кристаллы фермента, которые нерастворимы в воде, но активны в анализе с использованием азоказеина.

Образец 1 мл суспензии кристаллов субтилизина (27 мг/мл в 15% сульфате натрия) перемешивают, встряхивая при вращении с малой скоростью для обеспечения однородной суспензии кристаллов. Эпоксид (10% раствор в DMF) добавляют к суспензии кристаллов в количествах, которые указаны далее в табл.IV, и полученную смесь встряхивают при комнатной температуре. После определенного промежутка времени от 1 до 72 ч при комнатной температуре к смеси эпоксид/кристаллы добавляют глутаральдегид (10% в DMF) и перемешивание продолжают при комнатной температуре в течение промежутка времени, указанного в табл.IV. Полученные сшитые кристаллы фермента промывают 2× 1% (NH₄)₂SO₄/10 mM CaCl ₂, затем трижды водой и наконец 1× 1% (NH ₄)₂SO₄/10 mM CaCl₂ перед тем, как снова суспендируют в 1% (NH₄)₂ SO₄/10 mM CaCl₂.

Получение предпочтительного эпоксидного образца в крупном масштабе

Перед сшиванием образец 380 мл кристаллического субтилизина в 15%-ном сульфате натрия (27 мг/мл) смешивают при интенсивном перемешивании при комнатной температуре в течение 5 мин для обеспечения однородной суспенции кристаллов. Диглицидиловый эфир неопентилгликоля (3,838 мл в 10% раствора в DMF) добавляют к суспензии кристаллов и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре. После 5 часов при комнатной температуре 3,838 мл глутаральдегида (10% в DMF) добавляют к смеси эпоксид/кристаллы, и перемешивание продолжают при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Полученные сшитые кристаллы фермента промывают 2× 1% (NH₄)₂SO₄/10 mM CaCl ₂, затем трижды водой и наконец 1× 1% (NH₄ )SO₂/10 mM CaCl₂ перед тем, как снова суспендируют в 1% (NH₄)₂SO₄/10 mM CaCl ₂.

Пример 3 - Анализ активности

Для тестирования активности сшитых кристаллов протеина по способу настоящего изобретения, а также других образцов ферментов авторами разработан следующий анализ с использованием азоказеина.

Материалы:

2,0 М Tris буфер, 500 част. на млн CaCl₂

0,2 М Tris буфер, 50 част. на млн CaCl₂

50% мочевина

Азоказеин

5% трихлоруксусная кислота ("ТСА")

Алькалаза (2,5 л)

ChiroCLEC-BL^tm (сшитые кристаллы субтилизина, поставляемые Altus Biologies, Inc., Cambridge, Massachusetts).

Анализ осуществляют, приготавливая азоказеин непосредственно перед использованием, растворяя 600 мг азоказеина в 10 мл 50% мочевины, и слегка встряхивая, и вращая для полного растворения. Затем 10 мл 2,0 Tris добавляют и встряхивают, вращая, для перемешивания, увеличивая объем до 100 мл, добавляя деионизированную воду.

Приготавливают исходные растворы фермента для анализа в 0,2 М Tris буфере, получая 50 мкл аликвоты для анализа следующим образом:

Без детергента: 0,03 мг/мл Алькалазы (растворимый не сшитый субтилизин Carlsberg 80,3 мг/мл); 3,0 мг/мл ChiroCLEC-BL ^tm.

Со 120 мкл детергента/мл раствора: 0,03 мг/мл Алькалазы и 3,0 мг/мл ChiroCLEC-BL^tm

Добавляют 50 мкл аликвоты фермента к 150 мкл 0,2 М Tris и помещают смеси в 5 мл тестовые ампулы с микробрусками для перемешивания. Затем нагревают как тестовые ампулы, так и азоказеин при 40° С в течение 1 мин, используя металлический нагревающий блок. После этого добавляют 1 мл азоказеина в каждую ампулу и перемешивают при 40° С в течение 15 мин, используя металлический нагревающий блок при скорости перемешивания 4. Затем добавляют 2 мл ТСА в каждую ампулу, перемешивают при встряхивании и вращении и немедленно помещают ампулы в баню со льдом, оставляя образцы при 0° С на 20 мин. Образцы обрабатывают в микроцентрифуге в течение 5 мин при максимальных оборотах, при необходимости микрофильтруют. Определяют поглощение проявленной активности надосадочной жидкости в абс. ед./мг протеина в минуту на длине волны 390 нм. В этом анализе все измерения повторяют трижды. В качестве контроля используют образец без фермента, но содержащий детергент, если он присутствует в анализе. Это время=0. Анализ повторяют в момент времени=15 мин и в другие моменты при необходимости.

Детергенты, используемые в анализе, включая Tide, Wisk и Ciba-Deigy детергенты # 15, # 16 и # 44 ("Ciba детергенты"). Ciba детергент # 15 представляет собой типичную Европейскую детергентную композицию - жидкий (водный) детергент на основе 15% алкилбензолсульфоната, 14% этоксилата жирного спирта и 10% соли жирной кислоты (мыло). Ciba детергент # 16 представляет типичную детергентную композицию США - жидкий (водный) детергент на основе 7,5% алкилбензолсульфоната, 10% этоксилата жирного спирта и 17% алкилэфирсульфата. Ciba детергент # 44 представляет типичную компактную детергентную композицию - жидкий (водный) детергент на основе 6% этоксилата жирного спирта, 23% алкилэфирсульфата и 10% цитрата натрия. Ciba детергенты # 15, # 16 и # 44 можно получить, завербовав от Ciba Specialty Chemicals Corp., Division Consumer Care Chemicals, Creensboro, North Carolina.

Приготавливают аналитические рабочие растворы из разбавленных исходных и анализы осуществляют следующим образом.

Анализ активности - 200 × разбавление - Сшитые кристаллы субтилизина и кристаллический субтилизин в жидком детергенте для сильных загрязнений (Ciba # 15, Ciba # 44, Tide и Wisk)

Рабочие растворы А, В, С и D приготавливают в 10 мл неопреновых ампулах следующим образом.

Рабочий раствор А: Сшитые кристаллы субтилизина, полученные по способу настоящего изобретения (~ 27 мг/мл)

Центрифугируют 37 мкл суспензии сшитых кристаллов субтилизина (эквивалентно 1 мг сшитых кристаллов фермента) для удаления надосадочной жидкости, добавляют 1 мл детергента и встряхивают, вращая, для перемешивания. 50 мл аликвоты полученной смеси добавляют к 9,95 мл воды до конечной концентрации 5 мкг/мл.

Рабочий раствор В: Не сшитые кристаллы субтилизина (~ 27 мг/мл)

Центрифугируют 37 мкл суспензии кристаллов субтилизина (эквивалентно 1 мг кристаллов фермента) для удаления надосадочной жидкости, добавляют 1 мл детергента и встряхивают, вращая, для перемешивания. 50 мкл аликвоты полученной смеси добавляют к 9,95 мл воды до конечной концентрации 5 мкг/мл.

Рабочий раствор С: Алькалаза

Добавляют 18,75 мкл Алькалазы (80,3 мг/мл) к 3 мл детергента и встряхивают, вращая, для перемешивания. 50 мл аликвоты полученной смеси добавляют к 9,95 мл воды до конечной концентрации 5 мкг/мл.

Рабочий раствор D: Детергент

50 мкл аликвоты детергента добавляют к 9,95 мл воды.

Азоказеиновый исходный раствор (6 мг/мл) приготавливают, как указано ранее. После разбавления рабочих растворов А и В до 5 мкг/мл время t=0 анализа устанавливают немедленно и анализ осуществляют, как указано ранее, за исключением того, что количество рабочего образца используют 200 мкл вместо 50 мкл+150 мкл 0,2 М Tris. Пока ампулы нагреваются при 40° С в течение 1 мин, два дополнительных образца по 2 мл каждый растворов А, В и С помещают в 1,5 мл микроцентрифужные ампулы и нагревают до 52° С при встряхивании, для дальнейшего тестирования через 5 мин и 15 мин разбавления при нагревании.

Анализ активности - 670 × разбавление - Сшитые кристаллы субтилизина и кристаллический субтилизин в детергентном концентрате (Ciba # 16)

Рабочие растворы А, В, С и D приготавливают в 10 мл неопреновых ампулах следующим образом.

Рабочий раствор А: Сшитые кристаллы субтилизина, полученные по способу настоящего изобретения (~ 27 мг/мл)

Центрифугируют 124 мкл суспензии сшитых кристаллов субтилизина (эквивалентно 3,35 мг сшитых кристаллов фермента) для удаления надосадочной жидкости, добавляют 1 мл детергента, и встряхивают, и вращают для перемешивания. 50 мл аликвоты полученной смеси добавляют к 33,45 мл воды до конечной концентрации 5 мкг/мл.

Рабочий раствор В: Не сшитые кристаллы субтилизина (~ 27 мг/мл)

Центрифугируют 124 мкл суспензии кристаллов субтилизина (эквивалентно 3,35 мг кристаллов фермента) для удаления надосадочной жидкости, добавляют 1 мл детергента и встряхивают, вращая, для перемешивания. 50 мл аликвоты полученной смеси добавляют к 33,45 мл воды до конечной концентрации 5 мкг/мл.

Рабочий раствор С: Алькалаза

Добавляют 167 мкл Алькалазы (80,3 мг/мл) к 8 мл детергента, и встряхивают, и вращают для перемешивания. 50 мкл аликвоты полученной смеси добавляют к 33,45 мл воды до конечной концентрации 2,5 мкг/мл.

Рабочий раствор D: Детергент

50 мкл аликвоты детергента добавляют к 33,45 мл воды.

Азоказеиновый исходный раствор (6 мг/мл) приготавливают, как указано ранее. Время t=0 анализа устанавливают немедленно и анализ осуществляют, как указано ранее, за исключением того, что количество рабочего образца используют 200 мкл вместо 50 мкл плюс 150 мкл 0,2 М Tris. Пока ампулы нагревают в течение 1 мин при 40° С, два дополнительных образца по 2 мл каждый растворов А, В и С помещают в ампулы Эппендорфа и нагревают до 40° С при встряхивании, для дальнейшего тестирования через 5 мин и 15 мин разбавления при нагревании.

Пример 4 - Исследование стабильности

Для исследования стабильности сшитых кристаллов фермента настоящего изобретения, а также образцов других ферментов был разработан следующий способ анализа.

Анализ с азоказеином - Исследование стабильности при 52° С

Вначале приготавливают исходные растворы образцов фермента в детергенте в 2 мл ампулах Эппендорфа с завинчивающимися крышками. После инкубирования смесей в водяной бане при 52° С в течение соответствующих промежутков времени добавляют 1,47 мл 0,2 М Tris буфера в одну из ампул каждых образцов фермента и тщательно перемешивают. Для анализа активности после соответствующего промежутка времени инкубирования после разбавления отбирают 50 мкл аликвоты из каждой ампулы и анализируют, как указано далее. Остальные образцы фермент/детергент исходных растворов помещают в водяную баню при 52° С, при этом далее отбирают аликвоты для анализа в конкретные моменты времени.

Анализ осуществляют, добавляя 50 мкл образца фермента к 150 мкл 0,2 М Tris буфера и нагревая до 40° С в течение 1 мин. При постоянной температуре 40° С добавляют 1,0 мл азоказеинового рабочего раствора (как указано в примере 1) к каждому образцу, перемешивают в течение 15 мин, используя нагревательный блок и скорость перемешивания 4. Затем добавляют 2 мл ТСА в каждую ампулу, перемешивают встряхиванием и вращением и немедленно помещают ампулы в баню со льдом, оставляя образцы при 0° С на 20 мин. Образцы обрабатывают в микроцентрифуге в течение 5 мин при максимальных оборотах, при необходимости микрофильтруют. Определяют поглощение проявленной активности надосадочной жидкости на длине волны 390 нм и выражают активность в абс. ед./мг протеина в минуту. В этом анализе все измерения повторяют трижды. В качестве контроля используют образец без фермента, но содержащий детергент, если он присутствует в анализе.

Для оценки активности как части исследований стабильности, проводимых при 52° С, приготавливают аналитические исходные растворы, разбавляя рабочие растворы, и анализ осуществляют следующим образом.

Для Алькалазы

Рабочие растворы

Рабочий раствор А: Алькалаза (80,3 мг/мл) в коммерческом детергенте (Tide или Wisk, дезактивированный нагреванием при 70° С в течение 4 ч) - конечная концентрация=0,25 мг/мл. Раствор приготавливают, добавляя 31,2 мкл Алькалазы к 9,97 мл детергента. 200 мкл аликвоты полученной смеси помещают в каждую из нескольких 2 мл ампул Эппендорфа (по 3 для t=0, 30 и т.д.).

Рабочий раствор В: Алькалаза (80,3 мг/мл) в Ciba детергенте (Ciba # 15, Ciba # 16 или Ciba # 44) - конечная концентрация=0,25 мг/мл. Раствор приготавливают, добавляя 31,2 мкл Алькалазы к 9,97 мл детергента. 200 мкл аликвоты полученной смеси помещают в каждую из нескольких 2 мл ампул Эппендорфа (по 3 для t=0, 1 ч и 4-6 ч).

Рабочий раствор С: Коммерческий детергент (Tide или Wisk, дезактивированный нагреванием при 70° С в течение 4 ч). 3× (200 мкл вышеуказанного в 2 мл ампулах Эппендорфа).

Рабочий раствор D: Ciba детергент (Ciba # 15, Ciba # 16 или Ciba # 44) 3× (200 мкл вышеуказанного в 2 мл ампулах Эппендорфа).

Анализ при t=0 начинают немедленно после того, как 1,47 мл 0,2 М Tris добавляют в одну из каждых ампул, содержащих рабочие растворы A-D, и содержимое тщательно перемешивают. Остальные образцы рабочих растворов A-D помещают в водяную баню и нагревают до 52° С. Во всем остальном анализы осуществляют, как указано выше.

Для сшитых кристаллов субтилизина и кристаллического субтилизина

Рабочие растворы А, В, С и D приготавливают в 2 мл ампулах Эппендорфа с завинчивающимися крышками.

Рабочий раствор A: ChiroCLEC-BL^tm в коммерческом детергенте (денатурированный Tide или Wisk) - конечная концентрация=25 мг/мл. Рабочий раствор приготавливают, центрифугируя 31,2 мл суспензии фермента для удаления воды, а затем разбавляя фермент до 10 мл детергентом. 200 мкл аликвоты полученной смеси помещают в каждую из нескольких 2 мл ампул Эппендорфа (4 x для t=0, 24 ч, 48 ч и 72 ч).

Рабочий раствор В: ChiroCLEC-BL^tm в Ciba детергенте (Ciba # 15, Ciba # 16 или Ciba # 44) - конечная концентрация=0,25 мг/мл. Рабочий раствор приготавливают, центрифугируя 31,2 мл суспензии фермента для удаления воды, а затем разбавляя фермент до 10 мл детергентом. 200 мкл аликвоты полученной смеси помещают в каждую из нескольких 2 мл ампул Эппендорфа (4 x для t=0, 24 ч, 48 ч и 72 ч при 52° С).

Рабочий раствор С: Коммерческий детергент (Tide или Wisk, дезактивированный нагреванием при 70° С в течение 4 ч). 4 x (200 мкл вышеуказанного в 2 мл ампулах Эппендорфа).

Рабочий раствор D: Ciba-Geigy детергент (Ciba # 15, Ciba # 16 или Ciba # 44, в зависимости от того, какой детергент выбран для рабочего раствора В) 4 x (200 мкл вышеуказанного в 2 мл ампулах Эппендорфа).

Анализ при t=0 начинают немедленно после того, как 1,47 мл 0,2 М Tris добавляют в одну из каждых ампул, содержащих рабочие растворы A-D, и содержимое тщательно смешивают. Остальные образцы рабочих растворов A-D помещают в водяную баню и нагревают до 52° С. Во всем остальном анализы осуществляют, как указано выше.

Для сшитых кристаллов субтилизина и кристаллического субтилизина

Рабочие растворы А, В и С приготавливают в 2 мл ампулах Эппендорфа с завинчивающимися крышками.

Рабочий раствор А: Несшитые кристаллы субтилизина (~ 27 мг/мл) в Ciba детергенте (Ciba # 15, Ciba # 16 или Ciba # 44) - конечная концентрация =~ 1 мг/мл. Рабочий раствор приготавливают, центрифугируя 50 мкл суспензии кристаллов для удаления надосадочной жидкости, затем добавляя 1,35 мл детергента (Ciba # 15, Ciba # 16 или Ciba # 44) до конечной концентрации 1 мг/мл. 80 мкл аликвоты полученной смеси помещают в каждую из нескольких 2,0 мл ампул Эппендорфа (по 3 для t=0, 15 мин и др.).

Рабочий раствор В: Сшитые кристаллы субтилизина настоящего изобретения (~ 27 мг/мл) в детергенте Ciba (Ciba # 15, Ciba # 16 или Ciba # 44) - конечная концентрация =~ 1 мг/мл. Рабочий раствор приготавливают, центрифугируя 50 мкл суспензии кристаллов для удаления надосадочной жидкости, затем добавляя 1,35 мл детергента до конечной концентрации 1 мг/мл. 80 мкл аликвоты полученной смеси помещают в каждую из нескольких 2,0 мл ампул Эппендорфа (по 3 для t=0, 15 мин и др.).

Рабочий раствор С: Ciba детергент (Ciba # 15, Ciba # 16 или Ciba # 44) 3 × (80 мкл вышеуказанного в 2,0 мл ампулах).

Анализ при t=0 начинают немедленно после того, как 1,8 мл воды добавляют в одну из каждых ампул, содержащих рабочие растворы А-С, и содержимое тщательно смешивают. Остальные образцы рабочих растворов А-С помещают в водяную баню и нагревают до 52° С. Во всем остальном анализы осуществляют, как указано выше, за исключением того, что добавляют 150 мкл 0,2 М Tris буфера вместо 200 мкл.

Анализ с азоказеином - Исследование стабильности при 40° С

Вначале приготавливают исходные растворы образцов фермента в детергенте в 2 мл ампулах Эппендорфа с завинчивающимися крышками. Для анализа стабильности при t=0 добавляют 1,8 мл деионизированной воды к 25 мкл каждого образца и тщательно смешивают. Отбирают 25 мкл аликвоты из каждой ампулы и анализируют, как указано далее. Остальные образцы фермент/детергент исходных растворов помещают в водяную баню при 40° С, при этом далее отбирают аликвоты для анализа в конкретные моменты времени.

Анализ осуществляют, добавляя 25 мкл разбавленного образца фермента к 175 мкл 0,2 М Tris буфера и нагревая до 40° С в течение 1 мин. При постоянной температуре 40° С добавляют 1,0 мл азоказеинового рабочего раствора (как указано в примере 3) к каждому образцу, перемешивают в течение 15 мин, используя нагревательный блок при скорости перемешивания 4. Затем добавляют 2 мл ТСА в каждую ампулу, перемешивают встряхиванием и вращением и немедленно помещают ампулы в баню со льдом, оставляя образцы при 0° С на 20 мин. Образцы обрабатывают в микроцентрифуге в течение 5 мин при максимальных оборотах, при необходимости микрофильтруют. Определяют поглощение надосадочной жидкости на длине волны 390 нм и выражают активность как абс. ед./мг протеина в минуту. В этом анализе все измерения повторяют трижды. В качестве контроля используют образец без фермента, но содержащий детергент, если он присутствует в анализе.

Для оценки активности как части исследований стабильности, проводимых при 40° С, приготавливают аналитические исходные растворы, разбавляя рабочие растворы, и анализ осуществляют следующим образом.

Раствор А: Сшитые кристаллы субтилизина, полученные по способу настоящего изобретения (~ 27 мг/мл)

Центрифугируют 124 мкл суспензии сшитых кристаллов субтилизина (эквивалентно 3,35 мг сшитых кристаллов фермента) для удаления надосадочной жидкости, добавляют 1 мл детергента, и встряхивают, и вращают для перемешивания до конечной концентрации 3,35 мкг/мл.

Раствор В: Несшитые кристаллы субтилизина (~ 27 мг/мл)

Центрифугируют 124 мкл суспензии кристаллов субтилизина (эквивалентно 3,35 мг кристаллов фермента) для удаления надосадочной жидкости, добавляют 1 мл детергента и вращают для перемешивания до конечной концентрации 3,35 мкг/мл.

Раствор С: Алькалаза

Добавляют 20,9 мкл Алькалазы (80,3 мг/мл) к 1 мл детергента Ciba (Ciba # 15, Ciba # 16 или Ciba # 44) и коммерческий детергент (Tide или Wisk, денатурированные нагреванием при 70° С в течение 4 мин), и встряхивают, и вращают для перемешивания до конечной концентрации 1,67 мкг/мл.

Раствор D: Детергент

1 мл коммерческого детергента (Tide или Wisk, дезактивированные нагреванием при 70° С в течение 4 мин) и детергенты Ciba # 15, Ciba # 16 или Ciba # 44. 25 мкл аликвоты каждого рабочего раствора добавляют к 1,8 мл деионизированной воды и тщательно перемешивают. Дополнительно 25 мкл аликвоты разбавленного рабочего раствора добавляют в каждую реакционную ампулу.

Анализ при t=0 осуществляют немедленно после того, как 175 мкл 0,2 М Tris добавляют в каждую ампулу, содержащую 25 мкл различных исходных образцов. Остальные образцы рабочих растворов A-D помещают в водяную баню и нагревают до 40° С. Что касается всего остального, анализы осуществляют, как указано ранее.

Пример 5 - Исследование растворимости

Проводилась также оценка характеристик сшитых кристаллов фермента настоящего изобретения, а также образцов других ферментов, в отношении растворимости в концентрате и после разбавления, как указано далее. Исходные растворы приготавливают и разбавляют, как указано далее. Полученные дисперсии нагревают при 40° С и процесс растворения исследуют под микроскопом при увеличении 250х.

Пример 6 - Результаты анализов активности и стабильности

Сшитые кристаллы фермента субтилизина, как указано выше, а также растворимые ферменты и другие коммерческие ферменты, взятые отдельно и в присутствии коммерческих детергентов, тестируют на активность в анализе с использованием азоказеина, как указано выше. Концентрации катализатора для эквивалентных активностей определяют для Алькалазы, ChiroCLEC-BL^tm , Wisk с активной протеазой и Tide с активной протеазой;

ChiroCLEC-BL^tm: 150 мкг/6 мкл детергента 0,4-0,5 ед. поглощения

Алькалаза: 15 мкг/6 мкл детергента 0,5-0,6 ед. поглощения

Tide: 6 мкл детергента примерно 0,6 ед. поглощения

Wisk: 6 мкл детергента примерно 0,6 ед. поглощения.

Исследования разбавления (обсуждалось ранее) начинают с оценки активностей Алькалазы и несшитых кристаллов Алькалазы в детергентах Ciba # 15 и # 16. Начальные активности оказались сравнимыми, и потери вплоть до примерно 50% наблюдались через 15 мин при 52° С.

В табл.V суммированы стабильности образцов Алькалазы (0,25 мг/мл) и ChiroCLEC-BL^tm (25 мг/мл) в денатурированных детергентах Wisk или Tide, или в детергентах Ciba # 15 и # 16 при 52° С. Активности определяют в анализе с использованием азоказеина.

Проводилась также оценка стабильности различных ферментов в детергентах Ciba #15 при 52° С. Результаты представлены в таблице VI далее.

Все сшитые кристаллы, приготовленные в указанных в таблице условиях, которые имеют срок полураспада в концентрате детергента примерно 30 мин или более, обладают также хорошими характеристиками растворимости.

Кроме того, проводилась оценка стабильности различных ферментов в детергенте Ciba # 15 по сравнению с детергентом Ciba # 16 при 40° С. Полученные результаты приведены в табл.VII далее.

Оценивалось также влияние времени сшивания на активность и стабильность полученных сшитых кристаллов фермента. Эти результаты приведены в табл.VIII далее. В табл.VIII звездочками отмечены значения, полученные при инкубировании 25 мкл в 2 мл ампулах, a "Xs" означает несшитые кристаллы протеина.

Для получения сшитых кристаллов протеина, представленных в табл.VIII, IX и X, кристаллы протеина кристаллизовали по способу примера 1 и сшивали глутаральдегидом по способу примера 2, используя время сшивания и концентрации глутаральдегида, представленное в примерах, или то, которое указано в таблицах.

В табл.IX звездочками указано, что кристаллы были разрушены в процессе сшивки, а -- указывают, что для этих точек измерения не проводились. Все образцы приготовлены в масштабе 1 мл (27 мг).

В табл.Х звездочками отмечено, что процессы сшивания существляли в масштабе 1-2 г, указывает, что процессы сшивания осуществляли в масштабе 10 г для предварительно измельченных кристаллов, а -- указывают, что для этих точек измерения не проводили.

На фиг.1 графически представлена стабильность препаратов сшитых кристаллов субтилизина настоящего изобретения, полученных в масштабе 10 г, в детергенте Ciba # 16 при 40° С. На фиг.1 "Altus I" представляет кристаллы, сшитые 0,25% глутаральдегидом в течение 2 ч; "Altus II" представляет кристаллы, сшитые 0,20% глутаральдегидом в течение 2 ч; "Altus III" представляет кристаллы, сшитые 0,15% глутаральдегидом в течение 2 ч, и "Altus IV" представляет кристаллы, сшитые 0,1% диглицидиловым эфиром неопентилгликоля в течение 5 ч с последующей обработкой 0,1% глутаральдегидом в течение 1,5 ч. Все сшитые образцы измельчают перед сшиванием, используя гомогенизатор Brinkman Polytron, затем приготавливают в масштабе 10 г и исследуют с использованием азоказеина в течение 1 недели при 40° С.

Пример 7 - Результаты исследований растворимости

Исследования растворимости демонстрируют, как различные сшитые кристаллы ферментов растворяются в концентрате, и степень, до которой они растворяются при разбавлении в условиях использования, например в условиях стирки. Представительные результаты этого теста включены в таблицы, приводимые далее, причем в этих таблицах "+" указывает, что образец растворяется, "-" указывает, что образец не растворяется, "-/+" указывает, что образец немного растворяется (1 мг/мл в жидком детергенте). В этих таблицах "GP" обозначает кристаллы, сшитые, как указано для GA сшивания, используя вместо этого ультрачистый глутаральдегид (поставляемый как 8%-ный водный раствор Sigma Chemical Co), который не разбавляют перед добавлением кристаллов протеина.

Как представлено в приведенных выше таблицах, сшитые кристаллы фермента по способу настоящего изобретения практически нерастворимы в концентрированном детергенте и существенно растворимы в разбавленном детергенте в условиях стирки.

Пример 8 - Суммарные свойства сшитых кристаллов ферментов настоящего изобретения

В приводимой далее табл.XIII суммированы все свойства стабильности/нестабильности, активности и растворимости в детергенте Ciba # 15 сшитых кристаллов субтилизина, полученных по способу настоящего изобретения с использованием ди-альдегидов.

Как видно из табл.XIII, сшитые кристаллы фермента настоящего изобретения нерастворимы и поэтому стабильны в условиях хранения, хотя быстро выделяют свою активность в условиях использования. Выгодно, чтобы сшитые кристаллы фермента настоящего изобретения демонстрировали бы активность, аналогичную активности их растворимых или не сшитых кристаллизованных составляющих в условиях использования, демонстрируя при этом 5-6-кратно улучшенную стабильность, а также благоприятные характеристики растворимости.

Пример 9 - Влияние изменения химического состава на сшитые кристаллы субтилизина

Субтилизин кристаллизуют по способу примера 1 и сшивают полученные кристаллы по способу примера 2, используя GA 1%/1 ч. Когда 100 мкл (2,2 мг) полученных сшитых кристаллов субтилизина суспендируют в 1,5 мл 33,3% ацетонитрил/фосфатного буфера (0,3 М, рН 7,5), эти кристаллы полностью растворяются через 45 мин при 40° С.

Используя аналогичные условия суспендируют сшитые кристаллы субтилизина в 1,2 мл 16,7% ацетонитрил/фосфатного буфера, при этом кристаллы полностью растворяются через 5 ч.

Анализ: 0,2 ммоля (75,8 мг) TAME в 2,5 мл фосфатного буфера инкубируют с каждым образцом суспензии (или раствора) сшитых кристаллов субтилизина (эквивалентно 0,044 мг кристаллов фермента) при комнатной температуре.

Одна единица гидролизует 1,0 мкмоль TAME в минуту из мг сшитых кристаллов.

Полученные выше результаты иллюстрируют действие добавления органического растворителя к среде, окружающей сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения.

Пример 10 - Моющие характеристики детергента, содержащего сшитые кристаллы субтилизина

Оценивают активность и стабильность при хранении сшитых кристаллов фермента настоящего изобретения в жидком детергенте, используя анализ моющих характеристик, созданный для проверки способности детергента удалять пятна с тканей.

Анализ моющих средств

Подготовка ткани

Образцы ткани одинакового размера нарезают из одного рулона:

5 г загрязненной тестовой ткани и

5 г хлопкового балласта без загрязнений (Ciba №1-3005)

Пред стиркой образцов изменяют интенсивность света (=освещенность), отраженную загрязненными образцами ткани (как указано далее).

Приготовление раствора детергента

Образец жидкого детергента, подлежащего тестированию, нагревают в колбе в течение 2 ч при 20° С. Затем образец гомогенизируют, интенсивно встряхивая, и 0,8 г детергента отбирают из колбы, и добавляют к 200 мл водопроводной воды (20° С) в металлическом стакане. Водный раствор детергента перемешивают в течение 60 с.

Стирка

Образец загрязненной тестируемой ткани и образец чистого балласта помещают вместе в стакан, содержащий водный раствор детергента. Стакан плотно закрывают и немедленно помещают в предварительно нагретую (40° С) стиральную машину (Unitest, производства Hereus, Switzerland). В процессе стирки стакан непрерывно вращается в водяной бане, нагретой до 40° С. В результате содержимое стакана непрерывно нагревается вплоть до температуры 40° С.

Точно через 20 мин после того, как ткань поместили в раствор детергента, стирку останавливают, и отстиранную ткань немедленно вынимают из раствора детергента, и промывают в течение 30 с холодной водопроводной водой (13-15° С). Влажную ткань центрифугируют и гладят для удаления морщин и сушат в то же время.

Определение моющих характеристик

Каждый образец выстиранной и высушенной ткани исследуют на предмет удаления пятен, измеряя отраженный свет (освещенность Y) в интервале длин волн 460-700 нм, используя Spectraflash 500 (Datacolor). Отсекающий фильтр используют для исключения потенциальных помех, которые могут вызвать загрязнения веществами, поглощающими УФ-часть спектра. Величину освещенности для каждого тестируемого образца ткани определяют пятикратно и берут среднее значение.

С улучшением моющих характеристик освещенность ткани повышается. Таким образом, моющую характеристику определяют как разницу в освещенности, Y:

Y=освещенность ткани после стирки - освещенность ткани перед стиркой.

Пример 11 - Влияние концентрации сшитых кристаллов субтилизина на моющие характеристики содержащего их детергента

Моющие характеристики сшитых кристаллов фермента настоящего изобретения исследуют как функцию их концентрации в жидком детергенте, используя описываемые далее материалы.

Тестовая ткань: ЕМРА (Eidgenossische Materialprufungs und Forschungsanstalt, St. Gallen, Switzerland) # 116, загрязненная комбинацией крови, молока и сажи.

Жидкий детергент: Детергент Ciba # 16.

Фермент: Сшитые кристаллы фермента; образец Altus IV (как указано в примере 6)

- Несшитый фермент (Алькалаза)).

Концентрация фермента в жидком детергенте: Концентрация фермента составляет величину от 0,05 до 0,9 вес.% (вес сухого вещества). В табл.XIV приведены остальные подробности.

Приготовление жидкого детергента с ферментом

Конкретные аликвоты суспензии кристаллов фермента (см. табл.XIV) добавляют в колбу и центрифугируют для выделения кристаллов из жидкости. Жидкость сливают, а кристаллы суспендируют и гомогенизируют в жидком детергенте (в отношении количеств см. таблицу XIV). Полученные препараты используют в тестах для определения моющих характеристик.

Тесты для определения моющих характеристик композиций детергента с ферментом осуществляют, как указано в разделе анализ выше. Результаты исследований представлены на фиг.2, где продемонстрировано, что при концентрациях фермента 0,1 вес.% моющий эффект жидкого детергента Ciba # 16 совместно с Altus IV превышает таковой для композиции с несшитой Алькалазой. Эффективность как сшитого, так и несшитого фермента снижается при концентрациях фермента ниже 0,1 вес.%.

Пример 12 - Стабильность при хранении и моющие характеристики детергентов, содержащих сшитые кристаллы субтилизина

Детергенты, в композиции которых входят сшитые и несшитые ферменты, хранят при постоянной температуре для исследования стабильности фермента в концентрированном жидком детергенте. Детергентные композиции (150 г каждая) приготавливают тем же способом, что и образцы в примере 10.

Жидкий детергент: Детергент Ciba # 16

Фермент:

- Сшитые кристаллы фермента: образец Altus IV (пример 6)

- Несшитый фермент (Алькалаза)

Концентрация фермента: 0,3 вес.% (сухого вещества) в жидком детергенте

Температура хранения для исследования стабильности

Все образцы хранят при 30° С в течение 0-7 дней. После 7 дней образцы делят на две равные части для исследования стабильности при повышенной температуре. Одну часть продолжают хранить при 30° С, а другую часть хранят при 40° С. Тестируемая ткань: Используют три различные загрязненные ткани. Все они представляют стандартные тестовые материалы, доступные от ЕМРА:

ЕМРА # 112: ткань, загрязненная какао

ЕМРА # 116: ткань, загрязненная смесью крови, молока и сажи

ЕМРА # 111: ткань, загрязненная кровью

Моющие характеристики для ткани, загрязненной какао

Моющие характеристики различных жидких детергентов с ферментами исследуют в отношении удаления пятен какао с тестовой ткани, загрязненной какао, используя описываемый выше анализ для определенных моющих характеристик. Стабильность при хранении определяют, периодически оценивая моющие характеристики во время хранения детергента, контролируя таким образом влияние температуры хранения на характеристики фермента в жидком детергенте. В этом анализе эффективность жидкого детергента уменьшается по мере нарушения стабильности детергента. Результаты этого анализа, представленные на фиг.3 и 4, обсуждаются далее.

Стабильность при хранении при 30° С

Как видно на фиг.3, детергенты, приготовленные как с Алькалазой, так и с Altus IV, демонстрируют улучшенные характеристики после 2 дней хранения (по сравнению с начальными значениями). Однако при увеличении времени хранения характеристики композиции с Алькалазой непрерывно ухудшаются, тогда как композиция детергента с Altus IV не демонстрирует разложения даже после 28 дней.

Стабильность при хранении при 40° С

Как видно на фиг.4, когда температуру повышают с 30° С до 40° С, композиция детергента с Алькалазой теряет активность в течение 2 дней, тогда как композиция детергента с Altus IV разлагается лишь слегка, при этом существенно удаляет загрязнение какао с испытываемой ткани даже после 21 дня хранения при 40° С.

Моющие характеристики ткани, загрязненной комбинацией крови, молока и сажи (ЕМРА # 116 тестовая ткань)

Условия эксперимента и детергенты были теми же самыми (за исключение окрашенных тканей), что и для отмывания загрязнений какао. Результаты теста стирки представлены на фиг.5 и 6.

Стабильность при хранении при 30° С

Фиг.5 отчетливо иллюстрирует ухудшение моющих характеристик композиции детергента с Алькалазой после 2 дней хранения при 30° С. Однако жидкий детергент, содержащий фермент Altus IV, сохраняет исходные моющие характеристики даже после 28 дней хранения.

Стабильность при хранении при 40° С

Как продемонстрировано на фиг.6, когда температуру хранения повышают с 30° С до 40° С, детергентная композиция с Алькалазой теряет почти все свои моющие характеристики в течение 2 дней. Напротив детергент, содержащий Altus IV, сохраняет свою моющую эффективность дополнительно в течение еще 14 дней.

Моющие характеристики для ткани, загрязненной кровью

Моющие характеристики в отношении пятен крови тестируют ферментом, содержащим детергенты, которые хранились при 30° С. Детергентная композиция и условия стирки были такими же, что и для стирки пятен какао. Результаты теста на моющие характеристики проиллюстрированы на фиг.7.

Анализ показал, что моющий эффект в отношении пятен крови композиции жидкого детергента Ciba # 16 с Алькалазой оказался меньше при сравнении с детергентом без фермента. С другой стороны, композиция с Altus IV оказалась более активной в условиях стирки и более стабильной при хранении.

Стабильность при хранении при 30° С

Моющий эффект детергентной композиции с Алькалазой быстро снижается по мере увеличения времени хранения, тогда как композиция детергента с Altus IV сохраняет почти полностью свою эффективность после 28 дней хранения.

Пример 13 - Растворимость сшитых кристаллов субтилизина при 30 и при 37° С

Была исследована растворимость различных кристаллов субтилизина, которые были сшиты глутаральдегидом (GA), октандиальдегидом (ОА), диглицидиловым эфиром неопентилгликоля (NP) с последующей обработкой глутаральдегидом или DENACOL ЕХ(411) с последующей обработкой глутаральдегидом.

В 1,5 мл ампулах Эппендорфа образцы суспензий несшитых кристаллов субтилизина и сшитых кристаллов субтилизина, эквивалентные 37,5 мг фермента, обрабатывают в микроцентрифуге при 5000 об/мин в течение 5 мин и надосадочную жидкость удаляют. 1,5 мл аликвоты PBS буфера (0,01 М фосфат, 0,0027 М хлорид калия, 0,137 М хлорид натрия, рН 7,4) добавляют к каждому образцу, доводя концентрацию субтилизина до 25 мг/мл. Образцы переносят в 2 мл стеклянные ампулы с завинчивающимися крышками и палочками магнитных мешалок, затем инкубируют при 30° С или при 37° С. Исследуют растворимость образцов, периодически отбирая 50 мкл суспензии, обрабатывая в микроцентрифуге при 13000 об/мин в течение 5 мин, отбирая 20 мкл аликвот, и помещая их в 980 мкл деионизированной воды, и затем измеряя УФ поглощение на длине волны 280 нм.

Были исследованы следующие образцы:

Кривые растворимости образцов, представленные на фиг.8 и 9, иллюстрируют различные скорости растворения для сшитых кристаллов.

Пример 14 - Обратимые сшивающие агенты - Кристаллы субтилизина, сшитые дисульфидными связями

Получены кристаллы субтилизина (30-40 мкм в среднем, 27 мг/мл в Na₂SO₄ ), как было ранее указано для кристаллизации субтилизина.

Были получены сшитые кристаллы с использованием одного из следующих сшивающих агентов:

1) Диметил 3,3 -дитиобиспропионимидат· НСl - (DTBP) (Pierce)

2) Дитиобис(сукцинимидилпропионат) - (DSP) (Pierce)

3) 3,3 -дитиобис(сульфосукцинимидилпропионат) - (DTSSP) (Pierce)

Сшивание осуществляют в 15 мл неопреновых ампулах с завинчивающимися крышками, помещая 740 мкл суспензии кристаллов субтилизина (20 мг) в 9,26 мл буфера (25 мМ NaCO₃/50 мМ NaHCO ₃ рН 8,0). Один сшивающий агент добавляют в каждую ампулу следующим образом: А) 93 мг DTBP (30 мМ) В) 100 мг DTSSP (16 мМ) С) 120 мг DSP (30 мМ).

Ампулы переворачивают при комнатной температуре (24-26° С) до тех пор, пока не подтверждается, что все образцы нерастворимы в 32 мМ NaOH (5 дней) - 100 мкл образца в 300 мкл NaOH. Несшитые образцы легко растворяются в 32 мМ NaOH в тех же условиях. Процесс образования сшивок останавливают, добавляя 1 мл 1 М Tris, рН 7,5. Образцы центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин, надосадочную жидкость удаляют и заменяют 5 мл 100 мМ Tris, pH 7,5. Такое центрифугирование при 3000 об/мин в течение 5 мин с последующей заменой надосадочной жидкости 5 мл 100 мМ Tris, pH 7,5, повторяют три раза.

Пример 15 - Растворение сшитых кристаллов субтилизина, содержащих дисульфидную связь

200 мМ раствор цистеина приготавливают, растворяя 121 мг цистеина в 5 мл 100 мМ Tris (pH 7,5). 400 мкл аликвоты раствора цистеина добавляют в 3× 750 мкл ампулы. 400 мкл аликвоты 100 мМ Tris (pH 7,5) добавляют в другие 3× 750 мкл ампулы. Каждый сшиваемый образец (100 мкл) помещают в одну ампулу, содержащую цистеин, и в одну ампулу без цистеина. Все образцы инкубируют при 37° С и контролируют процесс растворения (визуально и с помощью микроскопа).

После инкубирования в течение 3 ч при 37° С образец DTBP, по-видимому, полностью растворяется в присутствии цистеина и остается нерастворимым в его отсутствии. Образец DTSSP, по-видимому, почти полностью растворяется в присутствии цистеина и не растворяется в его отсутствии. Образец DSP оказывается едва растворим в присутствии цистеина и не растворяется в его отсутствии.

Пример 16 - Кристаллизация Candida Rugosa липазы

5 кг аликвот порошка Candida Rugosa липазы ("CRL") от (Metio) смешивают с 5 кг целита и растворяют в 102 л дистиллированной деионизированной воды и объем доводят до 200 л деионизированной водой. Суспензию перемешивают в смесителе Air Drive Lightning Mixer в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем фильтруют через 0,5 мк фильтр для удаления целита. Затем смесь подвергают ультрафильтрации и концентрируют до 14 л (469 г), используя картридж мембраны с фильтром из полого волокна ЗК. Твердый ацетат кальция добавляют до концентрации 5 мМ Са(СН₃СОО)₂. РН доводят до 5,5 концентрированной уксусной кислотой при необходимости. 7 л аликвоты кристаллизуют, либо добавляя 1,75 л 2-метил-2,4-пентандиола ("MPD"), либо добавляя 3,5 л 30%-ного раствора PEG-8000. Полученный раствор смешивают и кристаллизации дают протекать в течение ночи при комнатной температуре в течение около 17-20 ч. Выход кристаллов составляет около 70%.

Перекристаллизация

Кристаллы Candida Rugosa липазы солюбилизируют, добавляя 50 мМ фосфат натрия (рН 5,2). Концентрацию растворимого протеина кристаллизационного раствора доводят до 20 мг/мл. MPD добавляют постепенно при перемешивании в течение 6 ч до конечной концентрации 25%. Полученный раствор перемешивают и кристаллизации дают протекать при комнатной температуре в течение 20 ч.

Пример 17 - Кристаллизация Candida Rugosa липазы

Кристаллы Candida Rugosa липазы, полученные по способу примера 16, перед стадиями солюбилизации и перекристаллизации солюбилизируют, добавляя 50 мМ ацетат натрия (рН 6,5). Концентрацию растворимого протеина в кристаллизационном растворе доводят до 20 мг/мл. Постепенно добавляют MPD при перемешивании в течение 6-часового периода до конечной концентрации 20%. Полученный раствор перемешивают и кристаллизации дают протекать при комнатной температуре в течение 20 ч.

Пример 18 - Сшивание кристаллов Candida Rugosa липазы

Кристаллы Candida Rugosa липазы, полученные по способу примера 16, сшивают, добавляя необработанный чистый глутаральдегид (Sigma), добавляя поэтапно 2 мл 20% глутаральдегида в объеме 40,5 мл в течение 1 ч к 8 мл перемешиваемых кристаллов липазы (25 мг/мл), при комнатной температуре. Окончательная концентрация сшивающего агента составляет 4,0%. Процесс сшивки продолжается в течение 24 ч. Кристаллы выделяют с помощью центрифугирования с низкой скоростью и промывают 25% MPD в 50 мМ фосфата натрия (рН 5,2).

Пример 19 - Сшивание кристаллов Candida Rugosa липазы

Кристаллы Candida Rugosa липазы, полученные по способу примера 16, сшивают, добавляя необработанный чистый глутаральдегид, добавляя поэтапно 2 мл 20% глутаральдегида в течение 1 ч. Кристаллы сшивают и обрабатывают по способу примера 18.

Пример 20 - Сшивание кристаллов Candida Rugosa липазы

Кристаллы Candida Rugosa липазы, полученные по способу примера 16, сшивают по способу примера 19, за исключением того, что реакции дают возможность протекать в течение 24 ч. Затем кристаллы обрабатывают по способу примера 18.

Пример 21 - Сшивание кристаллов Candida Rugosa липазы

Кристаллы Candida Rugosa липазы, полученные по способу примера 17, сшивают, добавляя глутаральдегид до конечной концентрации 4,0%. Процесс образования сшивок протекает 3 ч. Кристаллы обрабатывают по способу примера 18.

Пример 22 - Сшивание кристаллов Candida Rugosa липазы

Кристаллы Candida Rugosa липазы, полученные по способу примера 17, сшивают в чистом глутаральдегиде при концентрации 6,5% в течение 1 ч. Кристаллы сшивают и обрабатывают по способу примера 18.

Пример 23 - Сшивание кристаллов Candida Rugosa липазы

Кристаллы Candida Rugosa липазы, полученные по способу примера 17, сшивают в чистом глутаральдегиде при концентрации 6,0% в течение 1 ч. Кристаллы сшивают и обрабатывают по способу примера 18.

Пример 24 - рН контролируемая растворимость сшитых кристаллов Candida Rugosa липазы

Растворимость различных сшитых кристаллов Candida Rugosa липазы исследуют после повышения величины рН с 6,5 до 9,0. Кристаллы инкубируют при концентрации 1 мг/мл в 50 мМ фосфате натрия (рН 9,0), содержащем 25% MPD. Аликвоты отбирают после 3 ч и 24 ч инкубирования при 25° С при перемешивании. Активность и растворимость различных концентраций протеина определяют по способу примера 25. Полученные результаты представлены далее в таблице.

Пример 25 - рН растворимость сшитых кристаллов Candida Rugosa липазы

Растворимость различных сшитых кристаллов Candida Rugosa липазы исследуют после повышения величины рН с 5,2 до 7,5. Кристаллы инкубируют при концентрации 1 мг/мл в 50 мМ фосфате натрия (рН 7,5), содержащем 25% MPD. Аликвоты отбирают после 3 ч и 24 ч инкубирования при 25° С при перемешивании. Нерастворимый материал удаляют фильтрованием (0,25 мк). Активность в растворе определяют спектрофотометрически, следя за гидролизом пара-нитрофенилацетата (Fluka) на длине волны 400 нм. Концентрация субстрата 1 мМ. Анализ ведут при 25° С в объеме 1 мл 50 мМ ацетата натрия (рН 6,5). Концентрацию растворимого протеина определяют по поглощению на длине волны 280 нм. Результаты представлены далее в таблице.

Пример 26 - Кристаллизация альбумина сыворотки человека

Альбумин сыворотки человека ("HSA") получают от Sigma Chemical Company в виде лиофилизованного порошка. Добавляют 10 г порошка протеина к 75 мл перемешиваемого раствора 100 мМ фосфатного буфера с рН 5,5 при 4° С. Окончательная концентрация протеина составляет 120 мг/мл (определяют по оптической плотности ОП₂₈₀, а коэффициент экстинкции для альбумина сыворотки принимают равным 1). Насыщенный раствор сульфата аммония (767 г/л), полученный в деионизированной воде, добавляют к раствору протеина до конечной концентрации 50% насыщения (350 г/л). В кристаллизационный раствор вводят "затравку" - 1 мл кристаллов альбумина (50 мг/мл) в 50% сульфате аммония (рН 5,5). Затравочные кристаллы приготавливают, промывая образец кристаллов свободный от осадка раствором 50% насыщенного сульфата аммония в 100 мМ фосфатном буфере (рН 5,5). Кристаллизационный раствор с введенной затравкой инкубируют при 4° С в течение ночи на интенсивно вращающейся платформе. Кристаллические палочки (20 мк) появляются в растворе после 16 ч.

Пример 27 - Сшивание кристаллов альбумина сыворотки человека

Сшивают кристаллы альбумина сыворотки человека, полученные по способу примера 18, при 4° С в 10 мл перемешиваемого раствора кристаллов и маточного раствора, содержащего 50% насыщенного сульфата аммония, как указано выше. Кристаллы, которые не были промыты перед процессом сшивки, сшивают глутаральдегидом, как он поставляется изготовителем (Sigma). Глутаральдегид ("GA") (20%) добавляют к перемешиваемому кристаллизационному раствору в 4 равных объемах (62,5 мкл) с 15-минутными интервалами до конечной концентрации 0,5% (250 мкл GA). Затем кристаллы инкубируют при 4° С. Аликвоты отбирают в процессе инкубирования в следующие моменты времени: 0, 30 мин, 60 мин и 4 ч. Сшитые кристаллы альбумина собирают с помощью центрифугирования с малой скоростью и промывают повторно при рН 7,5 100 мМ Tris HCl, 4° C. Такую промывку прекращают, когда кристаллы уже можно центрифугировать с высокой скоростью без опасности образования агрегатов.

Пример 28 - Сшивание кристаллов альбумина сыворотки человека

Сшивают кристаллы альбумина сыворотки человека, по способу примера 27, с одной модификацией: глутаральдегид (20%) добавляют к кристаллизационному раствору 4 равными объемами (131,3 мкл) с 15-минутными интервалами до конечной концентрации 1% (525 мкл GA).

Пример 29 - Растворимость кристаллов альбумина сыворотки человека, сшитых в 0,5% GA, время: 0 мин инкубирования. Растворение вызвано повышением температуры

Альбумин сыворотки человека, закристаллизованный по способу примера 26 и сшитый в течение 0 минут в 0,5% глутаральдегиде по способу примера 27, анализируют на растворимость, инкубируя кристаллы (20 мг/мл) при перемешивании в буферированном фосфатом физиологическом растворе (рН 7,5) при комнатной температуре ("RT") или при 37° С. Аликвоты для анализа отбирают в моменты времени 0,5, 1, 4 и 24 ч. Нерастворимый материал удаляют из раствора центрифугированием и концентрацию растворимого протеина определяют спектрофотометрически на длине волны 280 нм, как представлено в табл.XV.

Пример 30 - Растворимость кристаллов альбумина сыворотки человека, сшитых в 0,5% GA, время: 30 мин инкубирования. Растворение вызвано повышением температуры

Альбумин сыворотки человека, закристаллизованный по способу примера 26 и сшитый в 0,5% глутаральдегиде по способу примера 27, анализируют на растворимость, инкубируя кристаллы (20 мг/мл) при перемешивании в буферированном фосфатом физиологическом растворе (рН 7,5) при комнатной температуре или при 37° С. Аликвоты для анализа отбирают в моменты времени 0,5, 1, 4 и 24 ч. Нерастворимый материал удаляют из раствора центрифугированием и концентрацию растворимого протеина определяют спектрофотометрически на длине волны 280 нм, как представлено в табл.XVI.

Пример 31 - Растворимость кристаллов альбумина сыворотки человека, сшитых в 0,5% GA, время: 60 мин инкубирования. Растворение вызвано повышением температуры

Альбумин сыворотки человека, закристаллизованный по способу примера 26 и сшитый 0,5% глутаральдегидом по способу примера 27, анализируют на растворимость, инкубируя кристаллы (20 мг/мл) при перемешивании в буферированном фосфатом физиологическом растворе (рН 7,5) при комнатной температуре или при 37° С. Аликвоты для анализа отбирают в моменты времени 0,5, 1, 4 и 24 ч. Нерастворимый материал удаляют из раствора центрифугированием и концентрацию растворимого протеина определяют спектрофотометрически на длине волны 280 нм, как представлено в табл.XVII.

Пример 32 - Растворимость кристаллов альбумина сыворотки человека, сшитых в 0,5% GA, время: 240 мин инкубирования. Растворение вызвано повышением температуры

Альбумин сыворотки человека, закристаллизованный по способу примера 26 и сшитый 0,5% глутаральдегидом по способу примера 27, анализируют на растворимость, инкубируя кристаллы (20 мг/мл) при перемешивании в буферированном фосфатом физиологическом растворе (рН 7,5) при комнатной температуре или при 37° С. Аликвоты для анализа отбирают в моменты времени 0,5, 1, 4 и 24 ч. Нерастворимый материал удаляют из раствора центрифугированием и концентрацию растворимого протеина определяют спектрофотометрически на длине волны 280 нм, как представлено в табл.XVIII.

Пример 33 - Растворимость кристаллов альбумина сыворотки человека, сшитых в 1,0% GA, время: 0 мин инкубирования. Растворение вызвано повышением температуры

Альбумин сыворотки человека, закристаллизованный по способу примера 26 и сшитый по способу примера 27, анализируют на растворимость, инкубируя кристаллы (20 мг/мл) при перемешивании в буферированном фосфатом физиологическом растворе (рН 7,5) при комнатной температуре или при 37°С. Аликвоты для анализа отбирают в моменты времени 0,5, 1, 4 и 24 ч. Нерастворимый материал удаляют из раствора центрифугированием и концентрацию растворимого протеина определяют спектрофотометрически на длине волны 280 нм, как представлено в табл.XIX.

Пример 34 - Растворимость кристаллов альбумина сыворотки человека, сшитых в 1,0% GA, время: 30 мин инкубирования. Растворение вызвано повышением температуры

Альбумин сыворотки человека, закристаллизованный по способу примера 26 и сшитый по способу примера 27, анализируют на растворимость, инкубируя кристаллы (20 мг/мл) при перемешивании в буферированном фосфатом физиологическом растворе (рН 7,5) при комнатной температуре или при 37° С. Аликвоты для анализа отбирают в моменты времени 0,5, 1, 4 и 24 ч. Нерастворимый материал удаляют из раствора центрифугированием и концентрацию растворимого протеина определяют спектрофотометрически на длине волны 280 нм, как представлено в табл.XX.

Пример 35 - Растворимость кристаллов альбумина сыворотки человека, сшитых в 1,0% GA, время: 60 мин инкубирования. Растворение вызвано повышением температуры

Альбумин сыворотки человека, закристаллизованный по способу примера 26 и сшитый по способу примера 27, анализируют на растворимость, инкубируя кристаллы (20 мг/мл) при перемешивании в буферированном фосфатом физиологическом растворе (рН 7,5) при комнатной температуре или при 37° С. Аликвоты для анализа отбирают в моменты времени 0,5, 1, 4 и 24 ч. Нерастворимый материал удаляют из раствора центрифугированием и концентрацию растворимого протеина определяют спектрофотометрически на длине волны 280 нм, как представлено в табл.XXI.

Пример 35^а - Растворимость кристаллов альбумина сыворотки человека, сшитых в 1,0% GA, время: 240 мин инкубирования. Растворение вызвано повышением температуры

Альбумин сыворотки человека, закристаллизованный по способу примера 26 и сшитый по способу примера 27, анализируют на растворимость, инкубируя кристаллы (20 мг/мл) при перемешивании в буферированном фосфатом физиологическом растворе (рН 7,5) при комнатной температуре или при 37° С. Аликвоты для анализа отбирают в моменты времени 0,5, 1, 4 и 24 ч. Нерастворимый материал удаляют из раствора центрифугированием и концентрацию растворимого протеина определяют спектрофотометрически на длине волны 280 нм, как представлено в табл.XXII.

Пример 36 - Кристаллизация термолизина

Термолизин получают от Diawa (Japan) в виде лиофилизованного порошка. 15 г порошка протеина добавляют к 100 мл перемешиваемого раствора 10 мМ ацетата кальция (рН 11) при комнатной температуре. Величину рН поддерживают 11, добавляя 2 н. NaOH, до тех пор, пока термолизин полностью не солюбилизируется. Затем рН доводят до 7,5, добавляя 2 н. уксусную кислоту. Кристаллизации дают возможность протекать в течение ночи при 4° С. Конечная концентрация протеина составляет 40 мг/мл (определяют по Оп_280, коэффициент экстинкции для термолизина принимают равным 1,8). Кристаллы выделяют центрифугированием и перекристаллизацией для получения кристаллов более однородного размера. Перекристаллизацию осуществляют способом, который почти идентичен способу, указанному для начальной кристаллизации. Кристаллы протеина (40 мг/мл) растворяют, добавляя основание при комнатной температуре. рН кристаллизационного раствора устанавливают 6,5 и кристаллизации дают возможность протекать при комнатной температуре. Кристаллические палочки (50 мк) появляются в растворе после ночи (16 ч).

Пример 37 - Сшивание кристаллов термолизина

Кристаллы термолизина, полученные по способу примера 36, суспендируют (50 мг/мл) в 50 мМ растворе ацетата натрия (рН 6,5). Кристаллы сшивают глутаральдегидом, как он поставляется изготовителем (Sigma). 10 мл глутаральдегида (10%) постепенно добавляют в течение 1 ч при перемешивании к 10 мл суспензии кристаллов. После того как добавляют весь глутаральдегид, кристаллизационный раствор инкубируют при комнатной температуре. Аликвоты отбирают после инкубирования в моменты времени 0,5, 1 и 3 ч. Сшитые кристаллы собирают центрифугированием с низкой скоростью и промывают тщательно 50 мМ Tris HCl, рН 7,5, содержащим 10 мМ ацетата кальция.

Пример 38 - Растворимость кристаллов термолизина, сшитых в течение 0,5 ч. Растворение вызвано удалением ионов кальция с помощью EDTA

Термолизин, закристаллизованный по способу примера 36 и сшитый в течение 0,5 ч по способу примера 37, анализируют на растворимость, инкубируя кристаллы (1 мг/мл) при перемешивании, в 10 мМ Tris HCl (рН 7,2), содержащем 1 мМ EDTA (Sigma), 40° С. 1 мл аликвоты отбирают для анализа в моменты времени 0,5, 3 и 24 ч. Нерастворимые кристаллы удаляют из раствора фильтрованием. 1 мл 500 мМ ацетата кальция (рН 7,2) добавляют к каждой из аликвот. Определяют концентрацию растворимого протеина на длине волны 280 нм. Ферментативную активность определяют спектрофотометрически, регистрируя гидролиз дипептидного субстрата, FAGLA (Feder). Концентрация субстрата составляет 1,67 мМ. Одну единицу определяют как количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкмоля субстрата в одну минуту при рН 7,2, 40° С. Активность растворимого термолизина составляет 27 ед/мг протеина. Данные представлены в табл.XXIII.

Пример 39 - Растворимость кристаллов термолизина, сшитых в течение 1 часа. Растворение вызвано удалением ионов кальция с помощью EDTA

Термолизин, закристаллизованный по способу примера 36 и сшитый в течение 1 ч по способу примера 37, анализируют на растворимость, инкубируя кристаллы (1 мг/мл) при перемешивании, в 10 мМ Tris HCl (рН 7,2), содержащем 1 мМ EDTA (Sigma), 40° C. 1 мл аликвоты отбирают для анализа в моменты времени 0,5, 3 и 24 ч. Нерастворимые кристаллы удаляют из раствора фильтрованием. 1 мл 500 мМ ацетата кальция (рН 7,2) добавляют к каждой из аликвот. Определяют концентрацию растворимого протеина на длине волны 280 нм. Ферментативную активность определяют спектрофотометрически, регистрируя гидролиз дипептидного субстрата, FAGLA (Feder). Концентрация субстрата составляет 1,67 мМ. Одну единицу определяют как количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкмоля субстрата в одну минуту при рН 7,2, 40° С. Активность растворимого термолизина составляет 27 ед/мг протеина. Данные представлены в табл.XXIV.

Пример 40 - Растворимость кристаллов термолизина, сшитых в течение 3 ч. Растворение вызвано удалением ионов кальция с помощью EDTA

Термолизин, закристаллизованный по способу примера 36 и сшитый в течение 3 ч по способу примера 37, анализируют на растворимость, инкубируя кристаллы (1 мг/мл) при перемешивании, в 10 мМ Tris HCl (рН 7,2), содержащем 1 мМ EDTA (Sigma), 40° C. 1 мл аликвоты отбирают для анализа в моменты времени 0,5, 3 и 24 ч. Нерастворимые кристаллы удаляют из раствора фильтрованием. 1 мл 500 мМ ацетата кальция (рН 7,2) добавляют к каждой из аликвот. Концентрацию растворимого протеина определяют на длине волны 280 нм. Ферментативную активность определяют спектрофотометрически, регистрируя гидролиз дипептидного субстрата, FAGLA (Feder). Концентрация субстрата составляет 1,67 мМ. Одну единицу определяют как количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкмоля субстрата в одну минуту при рН 7,2, 40° С. Активность растворимого термолизина составляет 27 ед/мг протеина. Данные представлены в табл.XXV.

Пример 41 - Растворимость кристаллов термолизина, сшитых в течение 3 ч. Растворение вызвано удалением ионов кальция путем разбавления

Кристаллы термолизина, полученные по способу примера 36 и сшитые в течение 3 ч по способу примера 37, промывают не содержащим кальция буфером и анализируют на растворимость, инкубируя кристаллы (1 мг/мл) при перемешивании, в деионизированной воде. 1 мл аликвоты отбирают для анализа в моменты времени 0,5, 3 и 24 ч. Нерастворимые кристаллы удаляют из раствора фильтрованием. 1 мл 500 мМ ацетата кальция (рН 7,2) добавляют к каждой из аликвот. Концентрацию растворимого протеина определяют на длине волны 280 нм. Ферментативную активность определяют спектрофотометрически, регистрируя гидролиз дипептидного субстрата, FAGLA (Feder). Концентрация субстрата составляет 1,67 мМ. Одну единицу определяют как количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкмоля субстрата в одну минуту при рН 7,2, 40° С. Активность растворимого термолизина составляет 27 ед/мг протеина, Данные представлены в табл.XXVI.

Пример 42 - Кристаллизация глюкозо-изомеразы

Глюкозо-изомеразу ("GA") поставляет Cultor (Finland) в виде суспензии кристаллов. Фермент перекристаллизовывают, солюбилизируя в 50 мл объеме суспензии кристаллов при 50° С при перемешивании в течение 15 мин. Раствор очищают фильтрованием и оставляют медленно остывать до комнатной температуры. В течение 5 ч появляются 50 мк кристаллы. Кристаллы выделяют центрифугированием с низкой скоростью и промывают 166 мМ сульфата магния.

Пример 43 - Сшивание кристаллов глюкозо-изомеразы

500 мг кристаллов глюкозо-изомеразы, полученных по способу примера 42, суспендируют в 50 мл раствора 166 мМ сульфата магния. Кристаллы сшивают глутаральдегидом, как он поставляется изготовителем (Sigma). 5 мл глутаральдегида (10%) постепенно добавляют в течение 1 ч при перемешивании к 50 мл суспензии кристаллов. После того как добавляют весь глутаральдегид, кристаллизационный раствор инкубируют при комнатной температуре. Аликвоты отбирают после инкубирования в моменты времени 1, 3 и 24 ч.

Сшитые кристаллы собирают центрифугированием с низкой скоростью и промывают тщательно 50 мМ Tris НСl, рН 7,0.

Пример 44 - Растворимость кристаллов глюкозо-изомеразы, сшитых в течение 1 ч. Растворение вызывают, удаляя ионы кальция, разбавляя при 50°

Кристаллы глюкозо-изомеразы, полученные по способу примера 42 и сшитые в течение 1 ч по способу примера 43, анализируют на растворимость, инкубируя кристаллы (1 мг/мл) при перемешивании в деионизированной воде. 1 мл аликвоты отбирают и анализируют в моменты времени 1, 3 и 24 ч. Концентрацию растворимого протеина определяют спектрофотометрически на длине волны 280 нм (ОП₂₈₀) (коэффициент экстинкции для GI принимают равным 1). Ферментативную активность измеряют спектрофотометрически, регистрируя превращение фруктозы в глюкозу.

Концентрацию глюкозы количественно определяют спектрофотометрически, используя анализ связанного фермента, содержащего гексокиназу и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназу. Дегидрогеназа использует NADP в качестве кофактора и количество NADPPH, образующееся в реакции, стехиометрично с концентрацией субстрата (глюкоза). Анализ закупают в виде набора от Boehinger Mannheim и используют в соответствии с инструкциями изготовителей. Одну единицу определяют как количество фермента, необходимое для превращения 1 мкмоля фруктозы в глюкозу за одну минуту при рН 7,0, 60° С. Активность растворимой глюкозо-изомеразы составляет 51 ед/мг протеина. Полученные результаты представлены в табл.XXVII.

Пример 45 - Растворимость кристаллов гдюкозо-изомеразы, сшитых в течение 3 ч. Растворение вызывают, удаляя ионы кальция, разбавляя при 50°

Кристаллы глюкозо-изомеразы, полученные по способу примера 42 и сшитые в течение 3 ч по способу примера 43, анализируют на растворимость, инкубируя кристаллы (1 мг/мл) при перемешивании в деионизированной воде. 1 мл аликвоты отбирают и анализируют в моменты времени 1, 3 и 24 ч. Концентрацию растворимого протеина определяют спектрофотометрически на длине волны 280 нм (ОП₂₈₀) (коэффициент экстинкции для GI принимают равным 1). Ферментативную активность измеряют спектрофотометрически, регистрируя превращение фруктозы в глюкозу.

Концентрацию глюкозы количественно определяют спектрофотометрически, используя анализ связанного фермента, содержащего гексокиназу и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназу, как указано в примере 44. Полученные результаты представлены в табл.XXVIII.

Пример 46 - Растворимость кристаллов глюкозо-изомеразы, сшитых в течение 24 ч. Растворение вызывают, удаляя ионы кальция, разбавляя при 50°

Кристаллы глюкозо-изомеразы, полученные по способу примера 42 и сшитые в течение 24 ч по способу примера 43, анализируют на растворимость, инкубируя кристаллы (1 мг/мл) при перемешивании в деионизированной воде. 1 мл аликвоты отбирают и анализируют в моменты времени 1, 3 и 24 ч. Концентрацию растворимого протеина определяют спектрофотометрически на длине волны 280 нм (ОП₂₈₀) (коэффициент экстинкции для глюкозо-изомеразы принимают равным 1). Ферментативную активность измеряют спектрофотометрически, регистрируя превращение фруктозы в глюкозу.

Концентрацию глюкозы количественно определяют спектрофотометрически, используя анализ связанного фермента, содержащего гексокиназу и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназу, как указано в примере 44. Полученные результаты представлены в табл.XXIX.

Пример 47 - Получение таблеток, содержащих сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения

Таблетки, содержащие сшитые кристаллы протеина настоящего изобретения, можно получить следующим образом. Суспензию сшитых кристаллов протеина помещают в 0,1 М ацетат натрия, 20 мМ хлорида кальция и буфер (рН 7,9) и сушат при 35° С. Полученный высушенный материал можно смешать с сорбитолом 50: 50 (по весу) и гранулировать с Eudragit NE 30D (нейтральный сополимер на основе этил- и метилакрилата) или Eudagit RL 30D (сополимер аммоний-метакрилат). Гранулы сушат (например, в течение 16 ч при 40° С) и прессуют в круглые таблетки примерно 5 мм диаметром и весом около 125 мг. Содержание сшитых кристаллов протеина в таких твердых препаратах составляет около 45% по весу. Если вышеуказанный препарат приготавливают без использования сорбитола, полученные таблетки содержат около 63 вес.% сшитых кристаллов протеина.

Если такие таблетки поместить в воду или в водный буфер (такой, как вышеуказанный ацетатный буфер), все таблетки разрушаются в течение 10 мин при несильном встряхивании при комнатной температуре), в результате чего образуются частицы с размером менее 100 мкм, причем большая часть их имеет размер 4-10 мкм. Исследование под микроскопом выявляет не содержащие полимера отдельные кристаллы протеина, как основную часть. Суспензию, образовавшуюся при разрушении таблеток, анализируют титрованием, используя гидролиз метилового сложного эфира N-( )-п-тозил-L-аргинина (TAME) при 25° С (рН 8). Активность соответствует примерно 50-80% активности равного количества сшитых кристаллов протеина (считая идентичный вес сшитых кристаллов, а не вес целой таблетки).

Пример 48 - Кристаллизация Candida Rugosa липазы

Candida Rugosa липазу получают по способу примера 16. После добавления твердого ацетата кальция до 5 мМ, однако, рН доводят до 4,8 вместо величины рН 5,5 с помощью концентрированной уксусной кислоты при необходимости. Затем семь литров аликвот кристаллизуют, добавляя 1,4 л MPD. Полученный раствор перемешивают и кристаллизации дают протекать в течение 72 ч при 4° С.

В последующих примерах, если нет других указаний, кристаллы липазы приготавливают таким же способом.

Пример 49 - Сшивание кристаллов липазы

Кристаллы липазы сшивают, используя следующие сшивающие агенты: диметил 3,3 -дитиобиспропионимидат· НСl (DTBP); ди-тиобис(сукцинимидилпропионат) (DSP); бисмалеимидогексан (ВМН); бис[сульфосукцинимидил]суберат (BS); 1,5-дифтор-2,4-динитробензол (DFDNB); диметилсуберимидат· 2НСl (DMS); дисукцинимидилглутарат (DSG); дисульфосукцинимидилтартарат (Sulfo-DST); 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимидгидрохлорид (EDC); этиленгликольбис[сульфосукцинимидилсукцинат] (Sulfo-EGS); сложный эфир N-[ -малеимидобутирилокси]сукцинимида (GMBS); N-гидроксисульфосукцинимидил-4-азидобензонат (Sulfo-HSAB); сульфосукцинимидил-6-[ -метил- -(2-пиридилдитио)толуамидо]гексаноат (Sulfo-LC-SMPT); бис-[ -(4-азидосалициламидо) этил] дисульфид (BASED); NHS-PEG-винилсульфон (NHS-PEG-VS); и глутаральдегид (GA).

Сшивание диметил 3,3 -дитиобиспропионимидатом· НСl (DTBP)

Раствор диметил 3,3 -дитиобиспропионимидата· НСl (DTBP) получают, растворяя 27,9 мг DTBP в 60 мкл воды. Затем 40 мкл этого раствора добавляют к 21 мг кристаллов липазы в 1,5 мл 10 мМ HEPES буфера, рН 8,5 и содержащего 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Реакцию сшивания осуществляют при комнатной температуре в течение 24 ч при переворачивании. Через 24 ч суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин и надосадочную жидкость сливают. Осадок затем суспендируют в 10 мМ HEPES буфере, рН 7,5 и содержащем 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Добавляют дополнительное количество (20 мкл) DTBP раствора и процесс сшивания продолжают еще 24 ч. Реакцию сшивания заканчивают, вымывая избыток реагента буфером 10 мМ ацетата натрия, рН 4,8 и содержащим 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD (5 промывок по 1 мл буфера).

Сшивание дитиобис(сукцинимидилпропионатом) (DSP)

Раствор дитиобис(сукцинимидилпропионата) (DSP) получают, растворяя 36 мг DSP в 60 мкл диметилсульфоксида (DMSO). Затем 40 мкл этого раствора добавляют к 21 мг кристаллов липазы в 1,5 мл 10 мМ HEPES буфера, рН 8,5 и содержащего 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Реакцию сшивания осуществляют при комнатной температуре в течение 24 ч при переворачивании. Через 24 ч суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин и надосадочную жидкость сливают. Осадок затем суспендируют в 10 мМ HEPES буфере, рН 7,5 и содержащем 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Добавляют дополнительное количество (20 мкл) DSP раствора и процесс сшивания продолжают еще 24 ч. Реакцию сшивания заканчивают, вымывая избыток реагента буфером 10 мМ ацетата натрия, рН 4,8 и содержащим 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD (5 промывок по 1 мл буфера).

Сшивание бисмалеимидогексаном (ВМН)

Раствор бисмалеимидогексана (ВМН) получают, растворяя 12 мг ВМН в 40 мкл диметилсульфоксида (DMSO). Затем 40 мкл этого раствора добавляют к 21 мг кристаллов липазы в 1,5 мл 10 мМ HEPES буфера, рН 7,5 и содержащего 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Реакцию сшивания осуществляют при комнатной температуре в течение 24 ч при переворачивании. Через 24 ч суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин и надосадочную жидкость сливают. Осадок затем суспендируют в 10 мМ HEPES буфере, рН 7,5 и содержащем 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Добавляют дополнительное количество (20 мкл) ВМН раствора и процесс сшивания продолжают еще 24 ч. Реакцию сшивания заканчивают, вымывая избыток реагента буфером 10 мМ ацетата натрия, рН 4,8 и содержащим 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD (5 промывок по 1 мл буфера).

Сшивание бис[сульфосукцинимидил]субератом (BS)

Раствор бис[сульфосукцинимидил]суберата (BS) получают, растворяя 29 мг BS в 50 мкл воды. Затем 40 мкл этого раствоpa добавляют к 21 мг кристаллов липазы в 1,5 мл 10 мМ HEPES буфера, рН 8,5 и содержащего 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Реакцию сшивания осуществляют при комнатной температуре в течение 24 ч при переворачивании. Через 24 ч суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин и надосадочную жидкость сливают. Осадок затем суспендируют в 10 мМ HEPES буфере, рН 7,5 и содержащем 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Добавляют дополнительное количество (20 мкл) BS раствора и процесс сшивания продолжают еще 24 ч. Реакцию сшивания заканчивают, вымывая избыток реагента буфером 10 мМ ацетата натрия, рН 4,8 и содержащим 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD (5 промывок по 1 мл буфера).

Сшивание 1,5-дифтор-2,4-динитробензолом (DFDNB)

Раствор 1,5-дифтор-2,4-динитробензола (DFDNB) получают, растворяя 10 мг DFDNB в 40 мкл ацетона. Затем 40 мкл этого раствора добавляют к 21 мг кристаллов липазы в 1,5 мл 10 мМ HEPES буфера, рН 8,5 и содержащего 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Реакцию сшивания осуществляют при комнатной температуре в течение 24 ч при переворачивании. Через 24 ч суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин и надосадочную жидкость сливают. Осадок затем суспендируют в 10 мМ HEPES буфере, рН 7,5 и содержащем 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Добавляют дополнительное количество (20 мкл) DFDNB раствора и процесс сшивания продолжают еще 24 часа. Реакцию сшивания заканчивают, вымывая избыток реагента буфером 10 мМ ацетата натрия, рН 4,8 и содержащим 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD (5 промывок по 1 мл буфера).

Сшивание диметилсуберимидатом· 2НСl (DMS)

Раствор диметилсуберимидата· 2НСl (DMS) получают, растворяя 33 мг DMS в 40 мкл диметилсульфоксида (DMSO). Затем 40 мкл этого раствора добавляют к 21 мг кристаллов липазы в 1,5 мл 10 мМ HEPES буфера, рН 8,5 и содержащего 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Реакцию сшивания осуществляют при комнатной температуре в течение 24 ч при переворачивании. Через 24 ч суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин и надосадочную жидкость сливают. Осадок затем суспендируют в 10 мМ HEPES буфере, рН 7,5 и содержащем 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Добавляют дополнительное количество (20 мкл) DMS раствора и процесс сшивания продолжают еще 24 ч. Реакцию сшивания заканчивают, вымывая избыток реагента буфером 10 мМ ацетата натрия, рН 4,8 и содержащим 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD (5 промывок по 1 мл буфера).

Сшивание дисукцинимидилглутаратом (DSG)

Раствор дисукцинимидилглутарата (DSG) получают, растворяя 17 мг DSG в 50 мкл диметилсульфоксида (DMSO). Затем 40 мкл этого раствора добавляют к 21 мг кристаллов липазы в 1,5 мл 10 мМ HEPES буфера, рН 8,5 и содержащего 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Реакцию сшивания осуществляют при комнатной температуре в течение 24 ч при переворачивании. Через 24 ч суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин и надосадочную жидкость сливают. Осадок затем суспендируют в 10 мМ HEPES буфере, рН 7,5 и содержащем 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Добавляют дополнительное количество (20 мкл) DSG раствора и процесс сшивания продолжают еще 24 ч. Реакцию сшивания заканчивают, вымывая избыток реагента буфером 10 мМ ацетата натрия, рН 4,8 и содержащим 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD (5 промывок по 1 мл буфера).

Сшивание дисульфосукцинимидилтартаратом (Sulfo-DST)

Раствор дисульфосукцинимидилтартарата (Sulfo-DST) получают, растворяя 27 мг Sulfo-DST в 50 мкл воды. Затем 40 мкл этого раствора добавляют к 21 мг кристаллов липазы в 1,5 мл 10 мМ HEPES буфера, рН 8,5 и содержащего 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Реакцию сшивания осуществляют при комнатной температуре в течение 24 ч при переворачивании. Через 24 ч суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин и надосадочную жидкость сливают. Осадок затем суспендируют в 10 мМ HEPES буфере, рН 7,5 и содержащем 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Добавляют дополнительное количество (20 мкл) Sulfo-DST раствора и процесс сшивания продолжают еще 24 ч. Реакцию сшивания заканчивают, вымывая избыток реагента буфером 10 мМ ацетата натрия, рН 4,8 и содержащим 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD (5 промывок по 1 мл буфера).

Сшивание 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимид гидрохлоридом (EDC)

Раствор 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимид гидрохлорида (EDC) получают, растворяя 10 мг EDC в 1 мл воды. Затем 200 мкл этого раствора и 5 мг твердого Sulfo-NHS добавляют к 21 мг кристаллов липазы в 1,5 мл 10 мМ HEPES буфера, рН 8,5 и содержащего 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Реакцию сшивания осуществляют при комнатной температуре в течение 24 ч при переворачивании. Через 24 ч суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин и надосадочную жидкость сливают. Осадок затем суспендируют в 50 мМ MES буфера, рН 6 и содержащем 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Добавляют дополнительное количество EDC+Sulfo-NHS раствора (200 мкл+5 мг Sulfo-NHS) и процесс сшивания продолжают еще 24 ч. Реакцию сшивания заканчивают, вымывая избыток реагента буфером 10 мМ ацетата натрия, рН 4,8 и содержащим 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD (5 промывок по 1 мл буфера).

Сшивание этиленгликоль бис[сульфосукцинимидилсукцинатом] (Sulfo-EGS)

Раствор этиленгликоль бис[сульфосукцинимидилсукцината] (Sulfo-EGS) получают, растворяя 33 мг Sulfo-EGS в 40 мкл воды. Затем 40 мкл этого раствора добавляют к 21 мг кристаллов липазы в 1,5 мл 10 мМ HEPES буфера, рН 8,5 и содержащего 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Реакцию сшивания осуществляют при комнатной температуре в течение 24 ч при переворачивании. Через 24 ч суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин и надосадочную жидкость сливают. Осадок затем суспендируют в 10 мМ HEPES буфере, рН 7,5 и содержащем 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Добавляют дополнительное количество (20 мкл) Sulfo-EGS раствора и процесс сшивания продолжают еще 24 ч. Реакцию сшивания заканчивают, вымывая избыток реагента буфером 10 мМ ацетата натрия, рН 4,8 и содержащим 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD (5 промывок по 1 мл буфера).

Сшивание сложным эфиром N-[ -малеимидобутирилокси]сукцинимида (GMBS)

Раствор сложного эфира N-[ -малеимидобутирилокси] сукцинимида (GMBS) получают, растворяя 23 мг GMBS в 50 мкл диметилсульфоксида (DMSO). Затем 40 мкл этого раствора добавляют к 21 мг кристаллов липазы в 1,5 мл 10 мМ HEPES буфера, рН 8,5 и содержащего 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Реакцию сшивания осуществляют при комнатной температуре в течение 24 ч при переворачивании. Через 24 ч суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин и надосадочную жидкость сливают. Осадок затем суспендируют в 10 мМ HEPES буфере, рН 7,5 и содержащем 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Добавляют дополнительное количество (20 мкл) GMBS раствора и процесс сшивания продолжают еще 24 ч. Реакцию сшивания заканчивают, вымывая избыток реагента буфером 10 мМ ацетата натрия, рН 4,8 и содержащим 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD (5 промывок по 1 мл буфера).

Сшивание N-гидроксисульфосукцинимидил-4-азидобензонатом (Sulfo-HSAB)

Раствор N-гидроксисульфосукцинимидил-4-азидобензоната (Sulfo-HSAB) получают, растворяя 5 мг Sulfo-HSAB в 40 мкл воды. Затем 40 мкл этого раствора добавляют к 21 мг кристаллов липазы в 1,5 мл 10 мМ HEPES буфера, рН 8,5 и содержащего 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Реакцию сшивания осуществляют при комнатной температуре в течение 24 ч при переворачивании. Через 24 ч суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин и надосадочную жидкость сливают.

Осадок затем суспендируют в 10 мМ HEPES буфере, рН 8,5 и содержащем 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Вторую реакцию осуществляют при комнатной температуре в течение 10 мин при встряхивании, используя УФ-облучение на длине волны 254 нм. Лампа УФ находится на расстоянии 2,5 см от образца. Через 10 мин суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин и надосадочную жидкость сливают. Реакцию сшивания заканчивают, вымывая избыток реагента буфером 10 мМ ацетата натрия, рН 4,8 и содержащим 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD (5 промывок по 1 мл буфера).

Сшивание сульфосукцинимидил-6-[ -метил- -(2-пиридилдитио) толуамидо]гексаноатом (Sulfo-LC-SMPT)

Раствор сульфосукцинимидил-6-[ -метил- -(2-пиридилдитио) толуамидо] гексаноата (Sulfo-LC-SMPT) получают, растворяя 12 мг Sulfo-LC-SMPT в 60 мкл воды. Затем 40 мкл этого раствора добавляют к 21 мг кристаллов липазы в 1,5 мл 10 мМ HEPES буфера, рН 8,5 и содержащего 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Реакцию сшивания осуществляют при комнатной температуре в течение 24 ч при переворачивании. Через 24 ч суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин и надосадочную жидкость сливают. Осадок затем суспендируют в 10 мМ HEPES буфере, рН 7,5 и содержащем 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Добавляют дополнительное количество (20 мкл) Sulfo-LC-SMPT раствора и процесс сшивания продолжают еще 24 ч. Реакцию сшивания заканчивают, вымывая избыток реагента буфером 10 мМ ацетата натрия, рН 4,8 и содержащим 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD (5 промывок по 1 мл буфера).

Сшивание бис-[ -(4-азидосалициламидо) этил] дисульфидом (BASED)

Раствор бис-[ -(4-азидосалициламидо) этил] дисульфида (BASED) получают, растворяя 3 мг BASED в 40 мкл диметилсульфоксида (DMSO). Затем 40 мкл этого раствора добавляют к 21 мг кристаллов липазы в 1,5 мл 10 мМ HEPES буфера, рН 8,5 и содержащего 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Реакцию сшивания осуществляют при комнатной температуре в течение 30 мин при встряхивании, облучая УФ с длиной волны 365 нм. Лампа УФ находится от образца на расстоянии 2,5 см. Спустя 30 мин суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин и надосадочную жидкость сливают. Реакцию сшивания заканчивают, вымывая избыток реагента буфером 10 мМ ацетата натрия, рН 4,8 и содержащим 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD (5 промывок по 1 мл буфера).

Сшивание NHS-PEG-винилсульфоном (NHS-PEG-VS)

Раствор NHS-PEG-винилсульфона (NHS-PEG-VS) получают, растворяя 20 мг NHS-PEG-VS в 50 мкл воды. Затем 50 мкл этого раствора добавляют к 34 мг кристаллов липазы, полученной по способу примера 16, в 1,5 мл 10 мМ HEPES буфера, рН 8,5 и содержащего 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Реакцию сшивания осуществляют при комнатной температуре в течение 24 ч при переворачивании. Через 24 ч суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин и надосадочную жидкость сливают. Осадок затем суспендируют в 10 мМ HEPES буфере, рН 7,5 и содержащем 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD. Добавляют дополнительное количество (25 мкл) GMBS раствора и процесс сшивания продолжают еще 24 ч. Реакцию сшивания заканчивают, вымывая избыток реагента буфером 10 мМ ацетата натрия, рН 4,8 и содержащим 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD (5 промывок по 1 мл буфера).

Сшивание глутаральдегидом (GA)

Кристаллы Candida Rugosa липазы получают по способу примера 16. Реакцию сшивания инициируют, добавляя необработанный чистый глутаральдегид (Sigma) к раствору кристаллов до достижения окончательной концентрации сшивающего агента 0,3% или 0,5%. Реакции сшивания дают возможность протекать в течение 1 ч. Сшитые кристаллы выделяют центрифугированием с невысокой скоростью и промывают буфером 10 мМ ацетата натрия, рН 4,8 и содержащим 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD.

Пример 50 - рН растворимость сшитых Candida Rugosa липазы кристаллов при 37° С

Оценивают растворимость кристаллов Candida rugosa липазы сшитых по способу примера 49. В качестве сшивающих агентов для сшитых кристаллов использованы следующие агенты: диметил 3,3 -дитиобиспропионимидат· НСl (DTBP); дитиобис(сукцинимидилпропионат) (DSP); бисмалеимидогексан (ВМН); бис[сульфосукцинимидил]суберат (BS); 1,5-дифтор-2,4-динитробензол (DFDNB); диметилсуберимидат· 2НСl (DMS); дисукцинимидилглутарат (DSG); дисульфосукцинимидилтартарат (Sulfo-DST); 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимидгидрохлорид (EDC); этиленгликольбис[сульфосукцинимидилсукцинат] (Sulfo-EGS); сложный эфир N-[ -малеимидобутирилокси]сукцинимида (GMBS); N-гидроксисульфосукцинимидил-4-азидобензонат (Sulfo-HSAB); сульфосукцинимидил-6-[ -метил- -(2-пиридилдитио) толуамидо] гексаноат (Sulfo-LC-SMPT); бис-[ -(4-азидосалициламидо)этил]дисульфид (BASED); и глутаральдегид (GA).

Образцы несшитых кристаллов липазы, полученные по способу примера 16, и сшитых кристаллов липазы в суспензии, соответствующей 2,8 мг кристаллического фермента, помещают в 1,5 мл ампулы Эппендорфа и обрабатывают в микроцентрифуге при 3000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость удаляют и растворимость полученных кристаллов оценивают при рН 7,4 и рН 2,0.

Для определения растворимости при рН 7,4 200 мкл аликвоты 0,01 М фосфатного буфера, содержащего 0,0027 М хлорида калия и 0,137 М хлорида натрия при рН 7,4 (PBS), добавляют к каждому образцу. В этих условиях концентрация липазы составляет 14 мг/мл. Затем образцы инкубируют при 37° С в течение 24 ч.

Для определения растворимости при рН 2,0 образцы сшитых кристаллов вначале уравновешивают в буфере 10 мМ глицин· НСl. Уравновешивающий буфер получают, смешивая 80% буфера 10 мМ глицин· НСl, содержащего 10 мМ хлорида кальция, при рН 2,0 и 20% MPD до конечного значения рН 4,8. Уравновешивание осуществляют в течение ночи при 25° С с переворачиванием. Затем уравновешиванные образцы обрабатывают на микроцентрифуге при 300 об/мин в течение 5 мин и надосадочную жидкость сливают. Образцы центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин и осадок суспендируют в 200 мкл буфера глицин· НСl, рН 2,0. В этих условиях концентрация липазы составляет 14 мг/мл. И наконец, образцы инкубируют при 37° С в течение 5 ч.

Количество растворенного протеина в надосадочной жидкости после 5 ч инкубирования при рН 2,0 или после 24 ч инкубирования при рН 7,4 определяют, используя анализ протеинов Bio-Rad Micro-protein. После периода инкубирования образцы центрифугируют при 14000 об/мин в течение 5 мин. Затем надосадочную жидкость фильтруют через 0,22 мкм целлюлозоацетатный фильтр (Sigma Chemical Co.). Затем концентрацию растворенного протеина определяют, разбавляя 2 мкл отфильтрованной надосадочной жидкости в 798 мкл деионизированной воды. Затем 200 мкл аналитического реагента Bio-Rad-Protein добавляют к образцам и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Поглощение измеряют на длине волны 595 мкм и сравнивают со стандартной кривой для протеина, полученной для 0-20 мкг альбумина бычьей сыворотки от Pierce.

Различные триггеры, взятые отдельно или в сочетании, определяют кинетики выделения протеина. Были исследованы приводимые далее образцы, и полученные результаты приведены в табл.XXX далее.

Пример 51 - Определение активности липазы с использованием оливкового масла

Активности различных сшитых кристаллов фермента оценивают, измеряя гидролиз субстрата, содержащего оливковое масло. Во время реакции поддерживают постоянное значение рН, титруя 0,05 М NaOH. За реакцией следят, используя pH-Stat (Titralab ^tm) электрод от радиометра, контролируемый VIT90 Video Titrator и автопипетку ABU91.

Процедура:

Вначале в реакционный раствор добавляют 20 мл эмульсии оливкового масла и реакционную смесь уравновешивают при 37° С при перемешивании. Затем рН доводят до 7,7, используя 0,05 М NaOH, и добавляют аликвоту (34 мг) сшитых кристаллов. рН смеси поддерживают 7,7, титруя NaOH. Регистрируют объем расхода основания в зависимости от времени (мл/мин) и строят график. Наклон начального линейного участка кривой используют для определения начальной скорости реакции.

А) Температура реакции: аналитический реактор уравновешивают и поддерживают в нем температуру 37° С с помощью водяной бани на протяжении всего времени реакции.

b) Расчет: Начальная скорость=расход основания=мл/мин (NaOH)× мин.

c) Удельная активность (мкмоль/мин/мг протеина)=начальная скорость× 1000× концентрация титруемого агента/количество фермента (мг).

d) Контроль: Без фермента - вместо фермента в реакционной смеси используют буфер.

Реагенты:

а) 3,0 М NaCl (раствор А): 34,8 г NaCl добавляют к 150 мл дистиллированной воды и перемешивают. Конечный объем доводят до 200 мл.

b) 75 mm CaCl₂ · 2H₂O (раствор В): 220 мг CaCl ₂· 2H₂O добавляют к 150 мл дистиллированной воды при перемешивании. После того как CaCl₂· 2H₂O растворяется, объем доводят до 200 мл.

c) Смесь: Раствор А (40 мл) добавляют к раствору В (20 мл) и Н₂O (100 мл).

d) 0,5% альбумин: 500 мг альбумина в 100 мл дистиллированной воды получают, растворяя 1 г альбумина бычьей сыворотки Фракцию V (Sigma) в воде при осторожном перемешивании (чтобы избежать образования пены). После растворения объем доводят до 200 мл.

e) Эмульсию оливкового масла получают, вначале растворяя 16,5 г гуммиарабика (Sigma) в 130 мл воды реагентной степени чистоты. После того как смола растворяется, объем увеличивают до 180 мл дистиллированной водой и раствор фильтруют через хлопок. Затем добавляют 20 мл оливкового масла (Sigma) и эмульсию получают, перемешивая в смесителе Quick Prep в течение 3 мин.

f) Субстрат: 50 мл эмульсии оливкового масла добавляют к 40 мл смеси (с) и 10 мл 0,5% альбумина.

Пример 52 - Активность сшитых кристаллов Candida Rugosa липазы

Активность кристаллов Candida Rugosa липазы, сшитых по способу примера 51, анализируют, используя в качестве субстрата оливковое масло (табл.XXXI). Анализируют кристаллы, сшитые следующими сшивающими агентами: дитио-бис(сукцинимидилпропионатом) (DSP); бисмалеимидогексаном (ВМН); NHS-PEG-винилсульфоном (NHS-PEG-VS); дисукцинимидилглутаратом (DSG); 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимидгидрохлоридом (EDC); сульфосукцинимидил-6-[ -метил- -(2-пиридилдитио)толуамидо]гексаноатом (Sulfo-LC-SMPT); и глутаральдегидом (GA).

Приведенная выше табл.XXXI демонстрирует влияние различных сшивающих агентов и степени сшивок на кристаллы Candida Rugosa липазы. Амино/сульфо реакционноспособный гетеробифункциональный сшивающий агент sulfo-LC-SMPT резко повышает активность липазы (более чем в 7 раз) по отношению к субстрату оливкового масла по сранению с активностью растворимого фермента. Аминореактивный (DSP) или сульфгидрилреактивный (ВМН) гомобифункциональные сшивающие агенты демонстрируют несколько повышенную активность и примерно двукратное повышение активности, соответственно, при сравнении с растворимым ферментом.

Пример 53 - Обратимые сшивающие агенты - сшитые кристаллы Candida Rugosa липазы с дисульфидными мостиками

Кристаллы Candida Rugosa липазы получают по способу примера 48. Образцы, содержащие кристаллы со средним размером 20-30 мкм и с полным содержанием протеина 42 мг/мл, сшивают, используя любой из обратимых сшивающих агентов:

(1) диметил 3,3 -дитиобиспропионимидат· НСl (DTBP) (Pierce), или

(2) дитиобис(сукцинимидилпропионат) (DSP) (Pierce),

(3) бис[2-(сульфосукцинимидооксикарбонилокси)этил]сульфон (Sulfo-BSOCOES) (Pierce).

Реакцию сшивания осуществляют с дублированием в 1,5 мл микроцентрифужных ампулах (USA/Scientific), помещая 250 мкл суспензии кристаллов липазы (11,5 мг) в 500 мкл буфера, содержащего 10 мМ HEPES, 10 мМ ацетата кальция, 20% MPD при рН 8,5. Затем реакцию образования сшивок инициируют, добавляя один раствор сшивающего агента в каждую ампулу следующим образом:

(А) 50 мМ DTBP - 27,9 мг DTBP растворяют в 60 мкл воды и 20 мкл этого раствора добавляют в одну ампулу с кристаллами; и

(B) 14,8 mm DSP - 35,0 мг DSP растворяют в 120 мкл DMSO, а затем 10 мкл этого раствора добавляют в одну ампулу с кристаллами;

(C) 7,5 мМ Sulfo-BSOCOES - 7,2 мг Sulfo-BSOCOES растворяют в 60 мкл воды, а затем 20 мкл этого раствора добавляют в одну ампулу с кристаллами.

Ампулы с DTBP и DSP переворачивают при комнатной температуре (24-26° С) примерно в течение 2 дней или до тех пор, пока можно будет определить, что образец не растворяется в 32 мМ NaOH. Ампулы с Sulfo-BSOCOES переворачивают при комнатной температуре (24-26° С) примерно в течение 2 дней. Тест на растворимость состоит в добавлении 50 мкл образца к 150 мкл 32 мМ NaOH. В этом тесте несшитые образцы оказываются легко растворимыми в 32 мМ NaOH при той же концентрации. Реакцию сшивания заканчивают, центрифугируя образцы при 3000 об/мин в течение 5 мин. Затем надосадочную жидкость сливают и промывают трижды 1 мл 10 мМ Tris· НСl буфером, содержащим 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD при рН 7,0.

Пример 54 - Растворение сшитых кристаллов Candida Rugosa липазы, содержащих дисульфидную связь

200 мМ раствора цистеина получают, растворяя 242 мг цистеина в 10 мл 10 мМ Tris· НСl буфера, содержащего 10 мМ хлорида кальция и 20% MPD при рН 7,0. 200 мкл образца суспензии сшитых кристаллов центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин и надосадочную жидкость сливают. Осадок суспендируют в 200 мкл Tris буфера, содержащего цистеин.

Другие 200 мкл сшитого образца отбирают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин и надосадочную жидкость сливают. Осадок суспендируют в 200 мкл 10 мМ Tris· НСl буфера при рН 7,0 без цистеина. Все образцы инкубируют при 37° С в течение 1 ч и визуально и с помощью микроскопа наблюдают за растворением в 32 мМ NaOH.

Образец, обработанный DTBP, оказался полностью растворимым в присутствии 200 мМ цистеина и нерастворимым при его отсутствии после инкубирования в течение 1 ч при 37° С. Образец, обработанный DSP, был слегка растворим после 1 ч инкубирования в присутствии цистеина и нерастворим в его отсутствии.

Пример 55 - Растворение расщепляемых основаниями сшитых кристаллов Candida Rugosa липазы

200 мкл образца суспензии сшитых кристаллов центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин и надосадочную жидкость сливают. Осадок суспендируют в 200 мкл Tris буфера и 600 мкл 32 мМ NaOH. Другие 200 мкл сшитого образца отбирают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин и надосадочную жидкость сливают. Затем этот осадок суспендируют в 200 мкл 10 мМ Tris· НСl буфера при рН 7,0. Все образцы инкубируют при 37° С в течение 1 ч и визуально и с помощью микроскопа наблюдают за растворением в 32 мМ NaOH.

Образец, обработанный sulfo-BSOCOES, оказался полностью растворимым в присутствии NaOH и нерастворимым в его отсутствии.

Хотя до сих пор авторы описывали ряд воплощений настоящего изобретения, очевидно, что основные конструкции можно изменить, получая другие воплощения, которые используют процессы и композиции настоящего изобретения. Поэтому объем изобретения должен определяться прилагаемой формулой изобретения, а не его конкретными вариантами, которые были представлены ранее в примерах.