новые гены растений и их применение

Формула изобретения

1. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая гомолог NIM1, участвующий в каскаде трансдукции сигнала, который приводит к развитию системной приобретенной устойчивости у растений, выбранная из группы, включающей

(а) нуклеотидную последовательность, которая кодирует SEQ ID NO:4, 6, 8, 16, 18, 20, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66, 68, 70, 72 или 74;

(б) SEQ ID NO:3, 5, 7, 15, 17, 19, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67, 69, 71 или 73;

(в) нуклеотидная последовательность, которая может быть амплифицирована из библиотеки ДНК Lycopersicon esculentum с помощью полимеразной цепной реакции с использованием пары праймеров, представленных в виде SEQ ID NO:9 и 10, SEQ ID NO:21 и 24, SEQ ID NO:22 и 24, SEQ ID NO:25 и 28, SEQ ID NO:26 и 28 или SEQ ID NO:59 и 60;

(г) нуклеотидная последовательность, которая может быть амплифицирована из библиотеки ДНК Beta vulgaris с помощью полимеразной цепной реакции с использованием пары праймеров, представленных в виде SEQ ID NO:22 и 24 или SEQ ID NO:26 и 28;

(д) нуклеотидная последовательность, которая может быть амплифицирована из библиотеки ДНК Helianthus annuus с помощью полимеразной цепной реакции с использованием пары праймеров, представленных в виде SEQ ID NO:26 и 28;

(е) нуклеотидная последовательность, которая может быть амплифицирована из библиотеки ДНК Solanum tuberosum с помощью полимеразной цепной реакции с использованием пары праймеров, представленных в виде SEQ ID NO:21 и 24, SEQ ID NO:21 и 23, SEQ ID NO:22 и 24, SEQ ID NO:25 и 28 или SEQ ID NO:26 и 28;

(ж) нуклеотидная последовательность, которая может быть амплифицирована из библиотеки ДНК Brassica napus с помощью полимеразной цепной реакции с использованием пары праймеров, представленных в виде SEQ ID NO:9 и 10 или SEQ ID NO:26 и 28;

(з) нуклеотидная последовательность, которая может быть амплифицирована из библиотеки ДНК Arabidopsis thaliana с помощью полимеразной цепной реакции с использованием пары праймеров, представленных в виде SEQ ID NO:13 и 14, SEQ ID NO:21 и 24, или SEQ ID NO:22 и 24;

(и) нуклеотидная последовательность, которая может быть амплифицирована из библиотеки ДНК Nicotiana tabacum с помощью полимеразной цепной реакции с использованием пары праймеров, представленных в виде SEQ ID NO:9 и 10, SEQ ID NO:11 и 12, SEQ ID NO:21 и 24, SEQ ID NO:22 и 24, SEQ ID NO:25 и 28, или SEQ ID NО:26 и 28; или

(к) нуклеотидная последовательность, которая может быть амплифицирована из библиотеки ДНК растения с помощью полимеразной цепной реакции с использованием пары праймеров, включающих первые 20 нуклеотидов и обратный комплемент последних 20 нуклеотидов кодирующей последовательности (КДП) SEQ ID NO: 3, 5, 7, 15, 17, 19, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67, 69, 71 или 73.

2. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1, дополнительно включающая активный в растении промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, описанной в одном из подпунктов (а)-(к).

3. Рекомбинантный вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по п.2.

4. Способ повышения устойчивости растений к болезням, включающий трансформацию растительных клеток молекулой нуклеиновой кислоты по п.2 и регенерацию растений, экспрессирующих эту молекулу нуклеиновой кислоты из указанных растительных клеток.

5. Способ по п.4, где системная приобретенная устойчивость возрастает у этих трансформированных растений.

6. Молекула нуклеиновой кислоты, представленная ПЦР-праймером, выбранным из группы, включающей SEQ ID NO:9-14, 21-28, 59 и 60.

7. Способ выделения гомолога NIM1, участвующего в каскаде трансдукции сигнала, который приводит к развитию системной приобретенной устойчивости у растения, предусматривающий амплификацию молекулы ДНК из библиотеки ДНК растения с помощью полимеразной цепной реакции с использованием пары праймеров, включающих первые 20 нуклеотидов и обратный комплемент последних 20 нуклеотидов кодирующей последовательности (КДП) SEQ ID NO:3, 5, 7, 15, 17, 19, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67, 69, 71 или 73, с использованием пары праймеров, представленных в виде SEQ ID NO:9 и 10, SEQ ID NO:11 и 12, SEQ ID NO:13 и 14, SEQ ID NO:21 и 24, SEQ ID NO:22 и 24, SEQ ID NO:21 и 23, SEQ ID NO:25 и 28, SEQ ID NO:26 и 28 или SEQ ID NO:59 и 60.

8. Способ по п.7, где библиотеку ДНК растения выбирают из библиотеки ДНК Nicotiana tabacum (табак), Lycopersicon esculentum (томаты), Brassica napus (масличный paпс), Arabidopsis thaliana, Beta vulgaris (сахарная свекла), Helianthus annuus (подсолнечник) и Solanum tuberosum (картофель).

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к развитию у растений устойчивости к широкому спектру болезней, включая явление системной приобретенной устойчивости (SAR). Более конкретно настоящее изобретение относится к идентификации, выделению и изучению гомологов гена NIM1 Arabidopsis, который участвует в каскаде трансдукции сигнала, обусловливающего системную приобретенную устойчивость растений.

Растения постоянно подвергаются воздействию широкого спектра патогенных организмов, включающих вирусы, бактерии, грибы и нематоды. Культурные растения являются особенно уязвимыми, поскольку их обычно выращивают в виде генетически однородных монокультур; потери при поражении болезнью могут быть серьезными. Однако большинство растений имеют собственные врожденные механизмы защиты от патогенных организмов. Естественная изменчивость по признаку устойчивости к фитопатогенам выявлена селекционерами растений и фитопатологами и использована при селекции многих культурных растениях. Эти естественные гены устойчивости к болезням часто обусловливают высокие уровни устойчивости или иммунитета по отношению к патогенам.

Системная приобретенная устойчивость (SAR) представляет собой один из компонентов комплексной системы растений, применяемой ими для защиты от патогенов (Hunt и Ryals, 1996; Ryals и др. 1996) (см. также патент US 5614395). SAR является особенно важным компонентом взаимосвязи растение-патоген, поскольку представляет собой индуцируемую патогеном системную устойчивость к широкому спектру вызывающих инфекции агентов, включая вирусы, бактерии и грибы. Когда путь трансдукции сигнала SAR блокируется, растения становятся более чувствительными к болезнетворным патогенам, они также становятся чувствительными к некоторым инфекционным агентам, которые в норме не являются болезнетворными (Gaffney и др., 1993; Delaney и др., 1994; Delaney и др., 1995; Delaney, 1997; Mauch-Mani и Slusarenko, 1996). Эти данные свидетельствуют о том, что путь трансдукции сигнала SAR имеет решающее значение для сохранения растений в здоровом состоянии.

В принципе, реакция растения, обусловливающая SAR, может быть разделена на две фазы. В начальной фазе распознается заражение патогеном и запускается сигнал, проходящий через флоэму к удаленным тканям. Этот системный сигнал воспринимается клетками-мишенями, реакция которых заключается в экспрессии как генов SAR, так и генов устойчивости к болезням. Фаза поддерживания SAR сохраняется в течение периода времени, составляющего от нескольких недель до всей жизни растения, в течение этого периода времени состояние растения сохраняется практически постоянным и у него поддерживается устойчивость к болезням (Ryals и др., 1996).

Для трансдукции сигнала SAR, вероятно, необходимо накопление салициловой кислоты (СК). В растениях, которые не могут накапливать СК в результате обработки специфическими ингибиторами, эпигенетической репрессии фенилаланинаммиаклиазы или трансгенной экспрессии салицилатгидроксилазы, которая специфично расщепляет СК, также не может индуцироваться ни экспрессия гена SAR, ни устойчивость к болезням (Gaffney и др., 1993; Delaney и др., 1994; Mauch-Mani и Slusarenko, 1996; Maher и др., 1994; Pallas и др., 1996). Хотя было высказано предположение, что СК может служить системным сигналом, однако известны и противоположные мнения, и к настоящему времени точно установлено только то, что, если не может происходить накопление СК, то трансдукция сигнала SAR блокируется (Pallas и др., 1996; Shulaev и др., 1995; Vernooij и др., 1994).

В настоящее время в качестве модельной системы для изучения SAR используются растения Arabidopsis (Uknes и др., 1992; Uknes, 1998; Cameron и др., 1994; Mauch-Mani и Slusarenko, 1994; Dempsey и Klessig, 1995). Было установлено, что SAR может активироваться у Arabidopsis как патогенами, так и химическими соединениями, такими как СК, 2,6-дихлоризоникотиновая кислота (ИНК) и S-метиловый эфир бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карботионовой кислоты (ВТН) (Uknes и др., 1992; Vernooij и др., 1995; Lawton и др., 1996). Обработка либо ИНК или ВТН, либо заражение патогеном приводит к согласованной индукции по меньшей мере трех генов связанного с патогенезом протеина (PR), а именно PR-1, PR-2 и PR-5, сопутствующих развитию устойчивости (Uknes и др., 1992, 1993). У табака, наиболее хорошо изученного вида, обработка патогеном или иммунизирующим соединением индуцирует экспрессию по меньшей мере 9 наборов генов (Ward и др., 1991). Трансгенные устойчивые к болезням растения были созданы трансформацией растений различными SAR-генами (патент US 5614395).

Был выделен целый ряд мутантов Arabidopsis, которые имели модифицированную трансдукцию сигнала SAR (Delaney, 1997). Первые из этих мутантов представляют собой так называемые lsd-мутанты (lesions simulating disease) [повреждения, напоминающие болезнь] и acd2-мутанты (accelerated cell death) [ускоренная гибель клеток] (Dietrich и др., 1994; Greenberg и др., 1994). Для всех этих мутантов характерно спонтанное образование на листьях некоторого количества некротических повреждений, увеличение уровней СК, накопление мРНК SAR-генов и выраженное увеличение устойчивости к болезням. Было выделено и охарактеризовано по меньшей мере 7 различных lsd-мутантов (Dietrich и др., 1994; Weymann и др., 1992). Другой интересный класс мутантов представлен cim-мутантами (constitutive immunity) [конститутивный иммунитет] (Lawton и др., 1993; см. также патент US 5792904 и международную заявку на патент РСТ WO 94/16077). Подобно Isd- и acd2-мутантам, cim-мутанты обладают повышенными содержанием СК, экспрессией гена SAR и устойчивостью, но в отличие от Isd- и асd2-мутантов для них не характерно образование заметных повреждений на листьях. cpr1 (constitutive expresser of PR genes) [конститутивный экспрессор PR-генов] может представлять собой тип cim-мутанта; однако поскольку для cpr1-мутанта не исключено присутствие на листьях микроскопических повреждений, то cpr1 может быть отнесен к типу lsd-мутанта (Bowling и др., 1994).

Также были выделены мутанты, у которых блокированы связанные с SAR сигналы. ndr1-мутант (non-race-specific disease resistance) [расонеспецифичная устойчивость к болезням] представляет собой мутант, на котором могут развиваться как штаммы Pseudomonas syringae, имеющие различные авирулентные гены, так и нормальные авирулентные изоляты Peronospora parasitica (Century и др., 1995). Вероятно, у этого мутанта блокированы начальные сигналы SAR. npr1-мутант (nonexpresser of PR genes) [неэкспрессирующий PR-гены] представляет собой мутант, который не может индуцировать экспрессию пути сигнала SAR после обработки ИНК (Сао и др., 1994). eds-мутанты (enhanced disease susceptibility) [повышенная чувствительность к болезням] были выделены на основе их способности поддерживать бактериальную инфекцию после инокуляции невысокой концентрацией бактерий (Glazebrook и др., 1996; Parker и др., 1996). Некоторые eds-мутанты фенотипически очень близки к npr1-мутантам и в настоящее время установлено, что eds5 и eds53 аллеломорфны npr1 (Glazebrook и др., 1996). nim1-мутант (noninducible immunity) [неиндуцибельный иммунитет] представляет собой мутант, который поддерживает рост Р. parasitica (т.е. возбудителя ложной мучнистой росы) после обработки ИНК (Delaney и др., 1995; патент US 5792904). Хотя nim1-мутанты могут накапливать СК после заражения патогеном, у них не может происходить индукция экспрессии гена SAR или развитие устойчивости к болезням, позволяющее предположить, что эта мутация блокирует путь метаболизма по ходу транскрипции СК. У nim1-мутантов также снижена способность реагировать на ИНК или ВТН, что позволяет предположить наличие места блокады по ходу транскрипции от места действия этих химических соединений (Delaney и др., 1995; Lawton и др., 1996).

Недавно было выделено и изучено два аллельных гена Arabidopsis, мутанты которых ответственны для фенотипы nim1 и npr1 соответственно (Ryals и др., 1997; Сао и др., 1997). Продукт гена NIM1 дикого типа участвует в каскаде трансдукции сигнала, приводящем к появлению у Arabidopsis как SAR, так и гена, ответственного за генетическую устойчивость (Ryals и др., 1997). Ryals с соавторами, 1997 также выделили пять дополнительных аллелей nim1, которые определяют широкий диапазон фенотипов от слабого уменьшения индуцированной химическим путем экспрессии гена PR-1 и устойчивости к фунгицидам до очень сильного ее ингибирования. Трансформация геном NIM1 дикого типа npr1-мутантов не только дополняет мутации, восстанавливая реакцию, приводящую к индукции SAR в отношении экспрессии PR-гена и устойчивости к болезням, но также придает трансгенным растениям большую устойчивость к заражению Р. syringae в отсутствии индукции SAR (Сао и др., 1997). В WO 98/06748 описано выделение NPR1 из Arabidopsis и его гомолога из Nicotiana glutinosa (см. также WO 97/49822, WO 98/26082 и WO 98/29537).

Несмотря на многочисленные исследования и применение сложных и обширных мероприятий, направленных на защиту урожая, включая генетическую трансформацию растений, потери от болезней ежегодно продолжают составлять миллиарды долларов. Следовательно, сохраняется потребность в разработке новых средств защиты сельскохозяйственных растений, базирующихся на более глубоком понимании генетической основы устойчивости растений к болезням. В частности, существует необходимость в идентификации, выделении и изучению гомологов гена NIM1 Arabidopsis из других видов растений.

В приведенном ниже описании изобретения могут применяться следующие понятия, значение которых определено ниже.

"Соединенный с/функционально связанный с": относится к двум последовательностям ДНК, которые связаны физически или функционально. Например, считается, что промоторная или регуляторная последовательность ДНК "связана с" последовательностью ДНК, кодирующей РНК или протеин, если две последовательности являются функционально связанными или расположены так, что регуляторная последовательность ДНК оказывает воздействие на уровень экспрессии кодирующей или структурной последовательности ДНК.

"Химерный ген": обозначает рекомбинантную последовательность ДНК, в которой промоторная или регуляторная последовательность ДНК функционально связана или соединена с последовательностью ДНК, которая кодирует мРНК или которая экспрессируется в виде протеина, так что регуляторная последовательность ДНК способна регулировать транскрипцию или экспрессию связанной с ней последовательности ДНК. Регуляторная последовательность ДНК химерного гена в норме не является функционально связанной с соединенной с ней последовательностью ДНК, как это происходит в естественных условиях.

"Кодирующая последовательность": обозначает нуклеотидную последовательность, которая транскрибируется с образованием РНК, такой как, например, мРНК, рРНК, тРНК, snPHK (М.я.РНК), смысловая РНК или антисмысловая РНК. Предпочтительно затем РНК транслируется в организме с образованием протеина.

"Комплементарный": относится к двум нуклеотидным последовательностям, которые включают антипараллельные нуклеотидные последовательности, обладающие способностью спариваться друг с другом с образованием водородных связей между комплементарными остатками оснований в антипараллельных нуклеотидных последовательностях.

"Экспрессия": относится к транскрипции и/или трансляции эндогенного гена или трансгена в растениях. В случае антисмысловых конструкций понятие "экспрессия" может относиться к транскрипции только антисмысловой ДНК.

"Кассета экспрессии": обозначает нуклеотидную последовательность, способную обеспечивать экспрессию конкретной нуклеотидной последовательности в соответствующей клетке-хозяине, которая включает промотор, функционально связанный с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, которая функционально связана с сигналами терминации. Она в норме также включает последовательности, необходимые для правильной трансляции нуклеотидной последовательности. Кассета экспрессии, включающая представляющую интерес нуклеотидную последовательность, может быть химерной, это означает, что по крайней мере один ее компонент является гетерологичным по отношению по крайней мере к одному из остальных компонентов. Кассета экспрессии также может представлять собой кассету, которая встречается в естественных условиях, но которая была получена в рекомбинантной форме, пригодной для гетерологичной экспрессии. Однако, как правило, кассета экспрессии является гетерологичной относительно хозяина, т.е. определенная последовательность ДНК кассеты экспрессии не встречается в естественных условиях в клетке-хозяине и должна быть интродуцирована в клетку-хозяина или в предка клетки-хозяина путем трансформации. Экспрессия нуклеотидной последовательности в кассете экспрессии может находиться под контролем конститутивного промотора или индуцибельного промотора, который инициирует транскрипцию только тогда, когда клетку-хозяина обрабатывают определенным внешним стимулом. В случае многоклеточного организма, такого как растение, промотор также может быть специфичным по отношению к определенной ткани или органу или стадии развития.

"Ген": обозначает определенную область внутри генома, которая помимо указанной выше кодирующей нуклеотидной последовательности содержит другие, прежде всего регуляторные нуклеотидные последовательности, ответственные за контроль экспрессии, т.е. за транскрипцию и трансляцию кодирующей области. Ген также может включать другие 5’-и 3’-нетранслируемые последовательности и терминирующие последовательности. Другими элементами, которые также могут присутствовать в гене, являются, например, интроны.

"Гетерологичная последовательность ДНК": понятия "гетерологичная последовательность ДНК", "экзогенный сегмент ДНК" или "гетерологичная нуклеиновая кислота" в контексте настоящего описания каждое из этих понятий относится к последовательности, полученной из источника, чужеродного по отношению к конкретной клетке-хозяину, или полученной из этого же источника, который модифицирован по сравнению с его исходной формой. Таким образом, гетерологичный ген в клетке-хозяине включает ген, являющийся эндогенным относительно конкретной клетки-хозяина, но который модифицирован, например, в результате применения перестановки ДНК. Понятие также включает не встречающиеся в естественных условиях множественные копии встречающейся в естественных условиях последовательности ДНК. Так, понятие относится к сегменту ДНК, который является чужеродным или гетерологичным относительно клетки или гомологичным клетке, но который находится в нуклеиновой кислоте клетки-хозяина в положении, в котором этот элемент в норме не присутствует. Экзогенные сегменты ДНК экспрессируются с образованием экзогенных полипептидов.

"Гомологичная последовательность ДНК": обозначает последовательность ДНК, которая в естественных условиях связана с клеткой-хозяином, в которую ее интродуцируют.

"Изокодонная": нуклеотидная последовательность является изокодонной относительно нуклеотидной последовательности, с которой проводится сравнение, когда нуклеотидная последовательность кодирует полипептид, имеющий такую же аминокислотную последовательность, что и полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, с которой проводится сравнение.

"Выделенная": в контексте настоящего описания выделенная молекула нуклеиновой кислоты или выделенный фермент обозначают молекулу нуклеиновой кислоты или фермент, которые благодаря человеку существуют вне их естественного окружения и, следовательно, не являются природными продуктами. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты или фермент могут существовать в очищенной форме или могут существовать в неестественном окружении, таком как, например, рекомбинантная клетка-хозяин.

"Минимальный промотор": обозначает элементы промотора, в частности ТАТА-элемент (ТАТА-бокс), которые являются неактивными или которые в значительной степени снижают промоторную активность в отсутствии активации против хода транскрипции. В присутствии пригодного фактора транскрипции минимальный промотор функционирует, обеспечивая транскрипцию.

"Нативный": обозначает ген, присутствующий в геноме нетрансформированной клетки.

"Встречающийся в естественных условиях": понятие встречающийся в естественных условиях применяется для описания объекта, который может быть обнаружен в природе, в отличие от объекта, искусственно созданного человеком. Например, протеин или нуклеотидная последовательность, присутствующие в организме (включая вирус), которые могут быть выделены из природного источника и которые не были специально модифицированы человеком в лабораторных условиях, называются встречающимися в естественных условиях.

NIM1: обозначает ген, описанный Ryals и др., 1997, который участвует в каскаде трансдукции сигнала, обусловливающего SAR.

NIM1: обозначает протеин, кодируемый геном NIM1.

"Нуклеиновая кислота": понятие "нуклеиновая кислота" относится к дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и их полимерам, имеющим либо одно-, либо двухцепочечную форму. Если не указано иное, то понятие включает нуклеотидные кислоты, включающие известные аналогии встречающихся в естественных условиях нуклеотидов, которые обладают сходными характеристиками связывания с нуклеиновой кислотой, с которой проводится сравнение, и которые метаболизируются аналогично тому, как этот происходит с встречающимися в естественных условиях нуклеотидами. Если не указано иное, то подразумевается, что конкретная нуклеотидная последовательность также включает ее консервативно модифицированные варианты (например, замены вырожденных кодонов) и комплементарные последовательности, а также специально указанную последовательность. В частности, замены вырожденных кодонов могут быть получены в результате создания последовательностей, в которых в третьем положении в одном или в нескольких выбранных (или во всех кодонах) произведена замена смешанным основанием и/или остатками дезоксиинозина (Batzer и др., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka и др., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini и др., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)). Понятия "нуклеиновая кислота" или "нуклеотидная последовательность" также могут использоваться взаимозаменяемо с понятиями ген, кДНК и мРНК, кодируемая геном. В контексте настоящего описания молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно представляет собой сегмент ДНК. Нуклеотиды обозначены с помощью их оснований с использованием следующих стандартных сокращений: аденин (А), цитозин (Ц), тимин (Т) и гуанин (Г).

"ОРС": обозначает открытую рамку считывания.

"Растение": обозначает любое целое растение.

"Растительная клетка": относится к структурной и физиологической единице растения, включающей протопласт и клеточную оболочку. Растительная клетка может находиться в форме выделенной отдельной клетки или культивируемой клетки или представлять собой часть высокоорганизованной единицы, такой как, например, ткань растения, орган растения или все растение.

"Культура растительных клеток": обозначает культуры единиц растения, таких как, например, протопласты, клетки в культуре клеток, клетки в тканях растения, пыльца, пыльцевые трубки, семяпочки, зародышевые мешки, зиготы и зародыши на различных стадиях развития.

"Растительный материал": относится к листьям, стеблям, корням, цветкам или частям цветков, плодам, пыльце, яйцеклеткам, зиготам, семенам, отводкам, культурам клеток или тканей или любой другой части или продукту растения.

"Орган растения": обозначает отдельную и четко структурно оформленную дифференцированную часть растения, такую как корень, стебель, лист, листовая почка или зародыш.

"Ткань растения": обозначает группу растительных клеток, организованных в структурную или функциональную единицу. Подразумевается любая ткань растения in planta или в культуре. Это понятие включает (но не ограничиваясь ими) целые растения, органы растений, семена растений, культуру ткани и любые группы растительных клеток, организованные в структурные и/или функциональные единицы. Применение этого понятия в сочетании с конкретным типом растительной ткани, как она определена выше, или по каким-то другим признакам подпадает под это определение, или вне зависимости от типа ткани, не подразумевает, что при этом исключается любой другой тип растительной ткани.

"Промотор": обозначает нетранслируемую последовательность ДНК, расположенную против хода транскрипции кодирующей области, которая содержит сайт связывания РНК-полимеразы II и инициирует транскрипцию ДНК. Промоторная область также может включать другие элементы, которые действуют в качестве регуляторов экспрессии гена.

"Протопласт": обозначает выделенную растительную клетку без клеточной оболочки или только с частью клеточной оболочки.

"Очищенный": понятие "очищенный" применительно к нуклеиновой кислоте или протеину обозначает, что нуклеиновая кислота или протеин практически лишены других клеточных компонентов, с которым они связаны в естественном состоянии. Предпочтительно они находятся в гомогенном состоянии, хотя также могут находиться либо в сухом виде, либо в виде водного раствора. Чистота и гомогенность, как правило, определяют с помощью методов аналитической химии, таких как электрофорез в полиакриламидном геле или жидкостная хроматография высокого разрешения. Главным образом, протеин, который присутствует в препарате, является практически очищенным. Понятие "очищенный" обозначает, что нуклеиновая кислота или протеин практически дают одну полосу в электрофоретическом геле. В частности, оно обозначает, что чистота нуклеиновой кислоты или протеина составляет по меньшей мере примерно 50%, более предпочтительно по меньшей мере примерно 85% и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 99%.

"Рекомбинантная молекула ДНК": обозначает комбинацию молекул ДНК, которые объединены друг с другом с помощью метода рекомбинантной ДНК.

"Регуляторные элементы": обозначают последовательности, принимающие участие в обеспечении экспрессии нуклеотидной последовательности. Регуляторные элементы включают промотор, функционально связанный с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, и сигналы терминации. Они также, как правило, включают последовательности, необходимые для правильной трансляции нуклеотидной последовательности.

"Селектируемый маркерный ген": обозначает ген, экспрессия которого в клетке растения придает клетке избирательное преимущество. Избирательное преимущество, которое имеют клетки, трансформированные селектируемым маркерным геном, может заключаться в их способности расти в присутствии отрицательного агента селекции, такого как антибиотик или гербицид, по сравнению с нетрансформированными клетками. Избирательное преимущество, которое имеют трансформированные клетки по сравнению с нетрансформированными клетками, может заключаться в их усиленной или вновь приобретенной способности использовать добавленное соединение в качестве питательного вещества, фактора роста или энергетического источника. Понятие "селектируемый маркерный ген" также относится к гену или к комбинации генов, экспрессия которых в растительной клетке придает клетке отрицательное или положительное избирательное преимущество.

"Существенное повышение": повышение ферментативной активности, превышающее допустимые пределы погрешности метода измерения, предпочтительно повышение активности примерно в 2 раза или более по сравнению с активностью фермента дикого типа в присутствии ингибитора, более предпочтительно превышение примерно в 5 или более раз и наиболее предпочтительно превышение примерно в 10 или более раз.

Понятия "идентичный" или процент "идентичности" в отношении двух или большего количества нуклеотидных или аминокислотных последовательностей обозначает, что две или большее количество последовательностей или подпоследовательностей являются одинаковыми или имеют определенный процент одинаковых аминокислотных остатков или нуклеотидов при сопоставлении и сравнительном анализе максимального соответствия, что оценивают с помощью одного из приведенных ниже алгоритмов сравнения последовательностей или путем визуальной оценки.

"Практически идентичная": фраза "практически идентичная" в отношении двух или большего количества нуклеотидных или аминокислотных последовательностей обозначает, что две или большее количество последовательностей или подпоследовательностей имеют по меньшей мере 60%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90-95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% идентичных аминокислотных остатков или нуклеотидов при сопоставлении и сравнительном анализе максимального соответствия, что оценивают с помощью одного из приведенных ниже алгоритмов сравнения последовательностей или путем визуальной оценки. Предпочтительно практическая идентичность характерна для части последовательностей, включающей по меньшей мере 50 остатков, предпочтительно включающей по меньшей мере 100 остатков и наиболее предпочтительно для последовательностей, в которых практически идентичны по меньшей мере примерно 150 остатков. Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления последовательности практически идентичны на всем протяжении кодирующих областей. Кроме того, практически идентичные нуклеотидные или аминокислотные последовательности имеют практически одинаковую функцию.

При сравнении последовательностей, как правило, одна из последовательностей является последовательностью, с которой проводится сравнение тестируемых последовательностей. При использовании алгоритма сравнения последовательностей в компьютер вводят тестируемую последовательность и последовательность, с которой производится сравнение, при необходимости указываются координаты подпоследовательности и задаются параметры программы, реализующей алгоритм сравнения последовательностей. Затем с помощью алгоритма сравнения последовательностей на основе заданных параметров вычисляется процент идентичности последовательностей для тестируемой(ых) последовательности(ей) по отношению к последовательности, с которой производится сравнение.

Оптимальный сравнительный анализ последовательностей может быть проведен, например, с помощью алгоритма локальной гомологии, описанного у Smith и Waterman, Adv. Appl. Math.2: 482 (1981), с помощью алгоритма сравнительного анализа гомологии, описанного у Needleman и Wunsch. J. Mol. Biol 48: 443 (1970), методом поиска сходства, описанного у Pearson и Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), с помощью компьютеризованных версий этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA, входящих в пакет программ Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Мэдисон, штат Висконсин), или путем визуальной оценки (см. общий метод у Ausubel и др., ниже).

Одним из примеров алгоритма, пригодного для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, является алгоритм BLAST, описанный у Altschul и др., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). Программное обеспечение для осуществления анализа с использованием алгоритма BLAST может быть предоставлено Национальным центром биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). В этом алгоритме сначала производится идентификация пар последовательности с высокими баллами (HSP) путем идентификации коротких "слов" длины W в рассматриваемой последовательности, которые или совпадают или удовлетворяют определенной положительной пороговой оценке (баллу) Т при сравнении со "словом" такой же длины в последовательности из базы данных. Т называется пороговой оценкой (баллом) близкого "слова" (Altschul и др., 1990). Эти исходные выборки близкого "слова" используются в качестве затравки для инициации поиска, предназначенного для нахождения включающих их более длинных HSP. Затем выборки "слова" удлиняются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока происходит увеличение кумулятивного (накопительного) балла при сравнительном анализе. Кумулятивные баллы для нуклеотидных последовательностей вычисляют с использованием параметров М (призовой балл за пару совпадающих остатков; всегда >0) и N (штрафной балл за несовпадающие остатки; всегда <0). Для аминокислотных последовательностей для вычисления кумулятивного балла используют матрицу баллов. Удлинение выборки "слова" в каждом направлении прекращается в том случае, если кумулятивный балл при сравнительном анализе снижается на величину Х от своего максимального достигнутого значения, если кумулятивный балл снижается до нуля или ниже из-за накопления одного или нескольких отрицательных баллов при сравнительном анализе остатков или если достигается конец какой-либо последовательности. Параметры алгоритма BLAST W, Т и Х определяют чувствительность и скорость сравнительного анализа. В программе BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) в качестве задаваемых по умолчанию параметров используются длина "слова" (W), равная 11, ожидание (Е), равное 10, предельное значение 100, М=5, N=-4, при этом производится сравнение обеих цепочек. Для аминокислотных последовательностей в программе BLASTP используются в качестве задаваемых по умолчанию параметров длина "слова" (W), равная 3, ожидание (Е), равное 10, и матрица баллов BLOSUM62 (см. Henikoff и Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)).

Помимо вычисления процента идентичности последовательностей алгоритм BLAST также производит статистический анализ сходства двух последовательностей (см., например, Karlin и Altschul, Proc. Nat’1. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Одним из критериев степени сходства, который позволяет получить алгоритм BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (P(N)), которая дает оценку вероятности, с которой может произойти случайным образом совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Например, считается, что тестируемая нуклеотидная последовательность является сходной с последовательностью, с которой производится сравнение, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестируемой нуклеотидной последовательности с нуклеотидной последовательностью, с которой производится сравнение, меньше приблизительно 0,1, более предпочтительно меньше приблизительно 0,01 и наиболее предпочтительно меньше приблизительно 0,001.

Другим доказательством того, что две нуклеотидные последовательности практически идентичны, является то, что две молекулы гибридизуются друг с другом в строгих условиях. Фраза "специфично гибридизуется с" относится к связыванию, образованию дуплекса или гибридизации молекулы только с определенной нуклеотидной последовательностью в строгих условиях, когда последовательность присутствует в комплексной смеси (например, общей клеточной) ДНК или РНК. "Практически связан(ы)" относится к комплементарной гибридизации между нуклеиновой кислотой-зондом и нуклеиновой кислотой-мишенью и подразумевает наличие небольшого количества ошибочных спариваний, которые могут найти соответствующее применение путем снижения строгости среды для гибридизации для достижения требуемого обнаружения последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.

"Строгие условия гибридизации" и "условия отмывки при строгой гибридизации" в контексте экспериментов по гибридизации нуклеиновых кислот, таких как Саузерн- и Нозерн-гибридизации, зависят от последовательности и являются разными при применении различных параметров окружающей среды. Для специфичной гибридизации более длинных последовательностей используются более высокие температуры. Подробным руководством по гибридизации нуклеиновых кислот является работа Tijssen (1993) "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes", часть I, глава 2: "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, New York. Как правило, выбирают очень строгие условия гибридизации и отмывки, при которых температура примерно на 5°С ниже, чем конечная температура плавления (Т_m) для конкретной последовательности при определенной ионной силе и значении рН. Как правило, при "строгих условиях" зонд должен гибридизоваться с подпоследовательностью-мишенью, но не гибридизоваться с другими последовательностями.

Т_m обозначает температуру (при определенной ионной силе и значении рН), при которой 50% последовательностей-мишеней гибридизуется с точно подобранным зондом. При выборе очень строгих условий гибридизации температура равна Т конкретного зонда. Примером строгих условий гибридизации на фильтре методом Саузерн- или Нозерн-блоттинга для гибридизации комплементарных нуклеиновых кислот, которые имеют более 100 комплементарных остатков, является применение 50%-ного формамида с 1 мг гепарина при 42°С, при осуществлении гибридизации в течение ночи. Примером очень строгих условий отмывки является применение 0,15М NaCl при 72°С в течение примерно 15 мин. Примером строгих условий отмывки является отмывка 0,2xSSC (0,2-кратного SSC) при 65°С в течение 15 мин (описание SSC-буфера см. у Sambrook, ниже). Часто отмывке в очень строгих условиях предшествует отмывка в расслабленных условиях для удаления фонового сигнала зонда. Примером отмывки в условиях средней жесткости для дуплексов, состоящих, например, более чем из 100 нуклеотидов, является применение 1×SSC при 45°С в течение 15 мин. Примером расслабленных условий отмывки для дуплексов, состоящих, например, более чем из 100 нуклеотидов, является применение 4-6×SSC при 40°С в течение 15 мин. Для более коротких зондов (например, состоящих примерно из 10-50 нуклеотидов), строгие условия, как правило, включают концентрации солей, соответствующие менее чем 1,0М концентрации ионов Na, как правило, примерно от 0,01 до 1,0М концентрации ионов Na (или других солей) при рН от 7,0 до 8,3, при этом температура, как правило, составляет по меньшей мере примерно 30°С.

Строгие условия также могут быть получены при добавлении дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Как правило, величина отношения сигнала к шуму, равная 2 (или выше) по сравнению с обнаруженной при применении неродственного зонда в конкретном опыте по гибридизации, свидетельствует о наличии специфической гибридизации. Нуклеиновые кислоты, которые не гибридизуются друг с другом в строгих условиях, еще являются практически идентичными, если протеины, которые они кодируют, являются практически идентичными. Это имеет место, например, в случае, когда копию нуклеиновой кислоты создают с использованием максимальной вырожденности кодонов, допускаемой генетическим кодом.

Ниже приведены примеры наборов условий гибридизации/отмывки, которые могут применяться для клона гомологичных нуклеотидных последовательностей, которые практически идентичны нуклеотидным последовательностям по настоящему изобретению, с которыми производится сравнение: нуклеотидная последовательность, с которой производится сравнение, предпочтительно гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, с которой проводится сравнение, в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М NaPO ₄, 1 мМ ЭДТК при 50°С с отмывкой 2×SSC, 0,1%-ным ДСН при 50°С, предпочтительно в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М NaPO₄, 1 мМ ЭДТК при 50°С с отмывкой 1×SSC, 0,1%-ным ДСН при 50°С, более предпочтительно в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М NaPО₄, 1 мМ ЭДТК при 50°С с отмывкой 0,5×SSC, 0,1%-ным ДСН при 50°С, еще более предпочтительно в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М NaPO₄, 1мМ ЭДТК при 50°С с отмывкой 0,1×SSC, 0,1%-ным ДСН при 50°С, и еще более предпочтительно в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М NaPO₄, 1 мМ ЭДТК при 50°С с отмывкой 0,1×SSC, 0,1%-ным ДСН при 65°С.

Еще одним доказательством того, что две нуклеотидные последовательности или протеины являются практически идентичными, является то, что протеин, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, является иммунологически перекрестно реактивным с протеином, кодируемым второй нуклеиновой кислотой, или специфично связывается с ним. Так, протеин, как правило, практически идентичен второму протеину, например, когда два протеина отличаются только консервативными заменами.

Фраза "специфично (или избирательно) связывается с антителом" или "специфично (или избирательно) иммунореактивен с" применительно к протеину или пептиду обозначает реакцию связывания, которая позволяет выявить наличие протеина в присутствии гетерологичной популяции протеинов и других биологических объектов. Так, в созданных для иммуноанализа условиях специфические антитела связываются с конкретными протеинами и не связываются со значительным количеством других протеинов, присутствующих в образце. Специфическое связывание с антителом в таких условиях может требовать наличие антитела, который выбирают с точки зрения его специфичности по отношению к определенному протеину. Например, могут быть отобраны антитела, которые вырабатываются на протеин, аминокислотная последовательность которого, кодируемая любой из нуклеотидных последовательностей по изобретению, для получения антител, обладающих специфичной иммунореактивностью по отношению к этому протеину, но не обладающих специфичной иммунореактивностью по отношению к другим протеинам за исключением полиморфных вариантов. Различные форматы иммуноанализа могут применяться для отбора моноклональных антител, обладающих специфичной иммунореактивностью по отношению к конкретному протеину. Например, твердофазный иммуноферментный анализ ELISA, Вестерн-блоттинг или иммуногистохимия обычно применяются для отбора моноклональных антител, обладающих специфичной иммунореактивностью по отношению к протеину (описание форматов иммуноанализов и условий, которые могут применяться для определения специфичной иммунореактивности, см. у Harlow и Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York "Harlow and Lane"). Как правило, уровень специфичной или избирательной реакции должен по меньшей мере в 2 раза превышать фоновой сигнал или шум и более предпочтительно превышать фоновой уровень в 10-100 раз.

Понятие "консервативно модифицированные вариации" конкретной нуклеотидной последовательности относится к тем нуклеотидным последовательностям, которые кодируют идентичные или практически идентичные аминокислотные последовательности, или в случае, когда нуклеотидная последовательность не кодирует аминокислотную последовательность, к практически идентичным последовательностям. Вследствие вырожденности генетического кода большое число функционально идентичных нуклеиновых кислот кодирует любой конкретный полипептид. Например, все кодоны CGT, CGC, CGA, CGG, AGA и AGG кодируют аминокислоту аргинин. В результате этого в любом положении, в котором аргинин кодируется определенным кодоном, этот кодон может быть заменен любым из соответствующих указанных кодонов без изменения кодируемого протеина. Такие вариации нуклеиновых кислот представляют собой "молчащие вариации", которые являются одним из видов "консервативно модифицированных вариаций". Каждая приведенная в настоящем описании нуклеотидная последовательность, которая кодирует протеин, если не указано иное, также включает все возможные молчащие вариации. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что каждый кодон нуклеиновой кислоты (за исключением ATG, который в норме представляет собой единственный кодон метионина) может быть модифицирован с помощью стандартных методов с получением функционально идентичной молекулы. Таким образом, при описании каждой указанной последовательности подразумеваются все "молчащие вариации" нуклеиновой кислоты, которая кодирует протеин.

Кроме того, специалисту в данной области должно быть очевидно, что отдельные замены, делеции или добавления, которые изменяют, добавляют или удаляют отдельную аминокислоту или небольшой процент аминокислот (как правило, менее 5%, более предпочтительно менее 1%) в кодируемой последовательности, представляют собой "консервативно модифицированные вариации", если изменения приводят к замене аминокислоты на химически сходную аминокислоту. Перечень консервативных замен, включающий функционально аналогичные аминокислоты, хорошо известен в данной области. Он включает 5 групп, в каждую из которых входят аминокислоты, которые могут применяться для консервативной замены друг друга: алифатические: глицин (G), аланин (А), валин (V), лейцин (L), изолейцин (I); ароматические: фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W); серусодеражащие: метионин (М), цистеин (С); основные: аргинин (R), лизин (К), гистидин (H); кислотные: аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (Е), аспарагин (N), глутамин (Q) (см. также Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company). Кроме того, отдельные замены, делеции или добавления, которые изменяют, добавляют или удаляют отдельную аминокислоту или небольшой процент аминокислот в кодируемой последовательности, также представляют собой "консервативно модифицированные вариации".

"Подпоследовательность": обозначает последовательность нуклеиновых кислот или аминокислот, которая включает часть более длинной последовательности нуклеиновых кислот или аминокислот (например, протеина) соответственно.

Нуклеиновая кислота является "удлиненной", когда в нуклеиновую кислоту включены дополнительные нуклеотиды (или другие аналогичные молекулы). Наиболее часто это происходит с помощью полимеразы (например, ДНК-полимеразы), например полимеразы, которая добавляет последовательности к 3’-концу нуклеиновой кислоты.

Две нуклеиновые кислоты являются "рекомбинантными", когда последовательности каждой из двух нуклеиновых кислот объединены в потомстве нуклеиновой кислоты. Две последовательности являются "непосредственно" рекомбинированными, когда обе нуклеиновых кислоты являются субстратами для рекомбинации. Две последовательности являются "опосредованно рекомбинированными", когда последовательности рекомбинируют с использованием промежуточного звена, такого олигонуклеотид-кроссовера. Для опосредуемой рекомбинации не более одной последовательности может являться истинным субстратом для рекомбинации, а в некоторых случаях ни одна из последовательностей не является субстратом для рекомбинации.

"Аффинность специфического связывания" между двумя молекулами, например между лигандом и рецептором, обозначает предпочтительное связывание одной молекулы с другой в смеси молекул. Связывание молекул может рассматриваться как специфическое, если аффинность связывания составляет от примерно 1×10⁴ М^-1 до примерно 1×10 ⁶ М^-1 или более.

"Трансформация": обозначает процесс интродукции гетерологичной ДНК в клетку-хозяина или организм.

"Трансформированный", "трансгенный" и "рекомбинантный": относится к организму-хозяину, такому как бактерия или растение, в который интродуцирована гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты может быть стабильно интегрирована в геном хозяина или молекула нуклеиновой кислоты также может присутствовать в виде внехромосомной молекулы. Такая внехромосомная молекула может обладать способностью к саморепликации. Следует понимать, что трансформированные клетки, ткани или растения включают не только конечный продукт процесса трансформации, но также и его трансгенное потомство. "Нетрансформированный", "нетрансгенный" или "нерекомбинантный": относятся к организму дикого типа, например бактерии или растению, который не содержит гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты.

Задача настоящего изобретения обусловлена указанной выше потребностью получения нескольких гомологов гена NIM1 Arabidopsis из других видов. В частности, в настоящем изобретении описано выделение из Nicotiana tabacum табак), Lycopersicon esculentum (томаты), Brassica napus (масличный paпс), Arabidopsis thaliana, Beta vulgaris (сахарная свекла), Helianthus annuus (подсолнечник) и Solanum tuberosum (картофель) гомологов гена NIM1, кодирующих протеины, которые вероятно участвуют в каскаде трансдукции сигнала, чувствительного к биологическим и химическим индукторам, что приводит к возникновению системной приобретенной устойчивости в растениях.

Таким образом, настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 16, 18, 20, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66, 68, 70, 72 или 74.

Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, которая включает SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 15. 17, 19, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67, 69, 71 или 73.

Согласно следующему варианту осуществления настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, которая включает нуклеотидную последовательность, содержащую область, состоящую по меньшей мере из 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 (предпочтительно 20) последовательных пар оснований, последовательность которой идентична области, состоящей по меньшей мере из 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 (предпочтительно 20) последовательных пар оснований, SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 15, 17, 19, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67, 69, 71 или 73.

Согласно еще одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая может быть амплифицирована из библиотеки ДНК Lycopersicon esculentum с использованием полимеразной цепной реакции с помощью пары праймеров, представленных в SEQ ID NO: 9 и 10, SEQ ID NO: 21 и 24, SEQ ID NO: 22 и 24, SEQ ID NO: 25 и 28, SEQ ID NO: 26 и 28 или SEQ ID NO: 59 и 60.

Согласно следующему варианту осуществления настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая может быть амплифицирована из библиотеки ДНК Beta vulgaris с использованием полимеразной цепной реакции с помощью пары праймеров, представленных в SEQ ID NO:22 и 24 или SEQ ID NO: 26 и 28.

Согласно следующему варианту осуществления настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая может быть амплифицирована из библиотеки ДНК Helianthus annuus с использованием полимеразной цепной реакции с помощью пары праймеров, представленных в SEQ ID NO: 26 и 28.

Согласно еще одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая может быть амплифицирована из библиотеки ДНК Solanum tuberosum с использованием полимеразной цепной реакции с помощью пары праймеров, представленных в SEQ ID NO: 21 и 24, SEQ ID NO: 21 и 23, SEQ ID NO: 22 и 24, SEQ ID NO: 25 и 28 или SEQ ID NO: 26 и 28.

Согласно еще одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая может быть амплифицирована из библиотеки ДНК Brassica napus с использованием полимеразной цепной реакции с помощью пары праймеров, представленных в SEQ ID NO: 9 и 10 или SEQ ID NO: 26 и 28.

Согласно следующему варианту осуществления настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая может быть амплифицирована из библиотеки ДНК Arabidopsis thaliana с использованием полимеразной цепной реакции с помощью пары праймеров, представленных в SEQ ID NO: 13 и 14, SEQ ID NO: 21 и 24 или SEQ ID NO: 22 и 24.

Согласно еще одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая может быть амплифицирована из библиотеки ДНК Nicotiana tabacum с использованием полимеразной цепной реакции с помощью пары праймеров, представленных в SEQ ID NO: 9 и 10, SEQ ID NO: 11 и 12, SEQ ID NO: 21 и 24, SEQ ID NO: 22 и 24, SEQ ID NO: 25 и 28 или SEQ ID NO: 26 и 28.

Согласно следующему варианту осуществления настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая может быть амплифицирована из библиотеки ДНК растения с использованием полимеразной цепной реакции с помощью пары праймеров, включающей первые 20 нуклеотидов и обратный комплемент последних 20 нуклеотидов кодирующей последовательности (КП) SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 15, 17, 19, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67, 69, 71 или 73.

Настоящее изобретение также относится к химерному гену, включающему активный в растениях промотор, функционально связанный с гомологом кодирующей последовательности гена NIM1 по настоящему изобретению, к рекомбинантному вектору, включающему такой химерный ген, где вектор обладает способностью стабильно трансформировать хозяина, а также к хозяину, стабильно трансформированному таким вектором. Предпочтительно хозяин представляет собой растение, относящееся к одному из следующих важных с агрономической точки зрения культур, такое как: рис, пшеница, ячмень, рожь, канола (масличный рапс), сахарный тростник, кукуруза, картофель, морковь, сладкий картофель, сахарная свекла, бобы, горох, цикорий, салат, капуста, цветная капуста, брокколи, турнепс, редис, шпинат, спаржа, лук, чеснок, баклажан, перец, сельдерей, тыква крупноплодная, тыква пепо, огурец, яблоня, груша, айва, дыня, слива, вишня, персик, нектарин, абрикос, земляника, виноград, малина, ежевика, ананас, авокадо, папайя, манго, банан, соя, табак, томаты и сорго. Настоящее изобретение также включает семенной материал растения по изобретению.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу повышения экспрессии гена SAR в растении путем экспрессии в растении химерного гена, который сам включает активный в растениях промотор, функционально связанный с гомологом кодирующей последовательности NIM1 по настоящему изобретению, причем уровни экспрессии кодируемого протеина в трансформированном растении выше, чем в растении дикого типа.

Настоящее изобретение также относится к способу повышения устойчивости к болезням у растения путем экспрессии в растении химерного гена, который сам включает активный в растениях промотор, функционально связанный с гомологом кодирующей последовательности NIM1 по настоящему изобретению, причем уровни экспрессии кодируемого протеина в трансформи-рованном растении выше, чем в растении дикого типа.

Кроме того, настоящее изобретение относится к ПЦР-праймеру, выбранному из группы, включающей SEQ ID NO: 9-14, 21-28, 59 и 60.

Настоящее изобретение также относится к способу выделения гомолога NIM1, участвующего в каскаде трансдукции сигнала, приводящего к развитию системной приобретенной устойчивости у растений, который предусматривает амплификацию молекулы ДНК из библиотеки ДНК растения с использованием полимеразной цепной реакции с помощью пары праймеров, включающей первые 20 нуклеотидов и обратный комплемент последних 20 нуклеотидов кодирующей последовательности (КДП) SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 15, 17, 19, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67, 69, 71 или 73, или с помощью пары праймеров, представленных в SEQ ID NO: 9 и 10, SEQ ID NO: 11 и 12, SEQ ID NO: 13 и 14, SEQ ID NO: 21 и 24, SEQ ID NO: 22 и 24, SEQ ID NO: 21 и 23, SEQ ID NO: 25 и 28, SEQ ID NO: 26 и 28 или SEQ ID NO: 59 и 60. Согласно предпочтительному варианту осуществления библиотека ДНК растения представляет собой библиотеку ДНК Nicotiana tabacum (табак), Lycopersicon esculentum (томаты), Brassica napus (масличный paпс), Arabidopsis thaliana, Beta vulgaris (сахарная свекла), Helianthus annuus (подсолнечник) и Solarium tuberosum (картофель).

Данные анализа методом Нозерн-блоттинга некоторых гомологов NIM1, представленных в настоящем описании, свидетельствуют о конститутивной экспрессии или ВТН-индуцибельности. Гомологи гена NIM1, представленные в настоящем описании, вероятно, кодируют протеины, участвующие в пути трансдукции сигнала, чувствительного к биологическим и химическим индукторам, что приводит к развитию системной приобретенной устойчивости в растениях. Настоящее изобретение также относится к трансгенной экспрессии таких гомологов NIM1 в растениях с целью повышения экспрессии гена SAR и повышения устойчивости к болезням.

Последовательности по изобретению могут быть выделены с помощью методов, описанных ниже в примерах, или с помощью ПЦР с использованием последовательностей, представленных в перечне последовательностей, в качестве основы для создания ПЦР-праймеров. Например, олигонуклеотиды, имеющие последовательность, состоящую примерно из первых и последних 20-25 последовательных нуклеотидов SEQ ID NO: 7 (например, нуклеотиды 1-20 и 1742-1761 SEQ ID NO: 7), могут применяться в качестве ПЦР-праймеров для амплификации последовательности кДНК (SEQ ID NO: 7) непосредственно из библиотеки кДНК растения-источника (Arabidopsis thaliana). Другие последовательности ДНК по изобретению также могут быть амплифицрованы с помощью ПЦР из библиотек кДНК или геномной ДНК соответствующих растений с использованием концов последовательностей ДНК, приведенных в перечне последовательностей, в качестве основы для ПЦР-праймеров.

Трансгенная экспрессия в растениях гомологов NIM1 по изобретению должна привести к иммунитету к широкому спектру фитопатогенов, которые включают (но не ограничиваясь ими) вирусы или вироиды, такие как вирус мозаики табака или огурца, вирус круговой пятнистости или вирус некроза, вирус курчавости листьев пеларгонии, вирус крапчатости красного клевера, вирус карликовости куста томата и подобные вирусы; грибы, например из класса Oomycete, такие как Phythophthora parasitica и Peronospora tabacina; бактерии, например, Pseudomonas syringae и Pseudomonas tabaci; насекомые, такие как тли, например, Myzus persicae; и чешуекрылые, например, Heliothus spp.; и нематоды, например, Meloidogyne incognitas. Векторы и способы по изобретению могут применяться для борьбы с многочисленными организмами, которые вызывают болезни кукурузы, включая (но не ограничиваясь ими) возбудителей ложной мучнистой росы, такие как Scleropthora macrospora, Sclerophthora rayissiae, Sclerospora graminicola, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Peronosclerospora sacchari и Peronosclerospora maydis; возбудителей ржавчин, таких как Puccinia sorphi, Puccinia polysora и Physopella zeae; и другие грибы, такие как Cercospora zeae-maydis, Colletotrichum graminicola, Fusarium monoliforme, Gibberella zeae, Exserohilum turcicum, Kabatiellu zeae, Erysiphe graminis, Septoria и Bipolaris maydis; и бактерии, такие как Erwinia stewartii.

Способы по настоящему изобретению могут применяться для придания устойчивости к болезням широкому спектру растений, включая голосеменные, однодольные и двудольные растения. Хотя устойчивость к болезням может придаваться любым растениям, входящим в указанные широкие классы, особенно ценными являются растения, которые относятся к важным с агрономической точки зрения культурам, таким как: рис, пшеница, ячмень, рожь, рапс, кукуруза, картофель, морковь, сладкий картофель, сахарная свекла, бобы, горох, цикорий, салат, капуста, цветная капуста, брокколи, турнепс, редис, шпинат, спаржа, лук, чеснок, баклажан, перец, сельдерей, тыква крупноплодная, тыква пепо, цуккини, огурец, яблоня, груша, айва, дыня, слива, вишня, персик, нектарин, абрикос, земляника, виноград, малина, ежевика, ананас, авокадо, папайя, манго, банан, соя, табак, томаты, сорго и сахарный тростник.

Гомолог кодирующей последовательности NIM1 по настоящему изобретению может быть встроен в кассету экспрессии, сконструированную для растений, с целью создания химерного гена по изобретению с помощью стандартных методов генной инженерии. Выбор специфичных регуляторных последовательностей, таких как промотор, сигнальная последовательность, 5’- и 3’-нетранслируемые последовательности и энхансер, способствует достижению требуемой схемы и уровня экспрессии в выбранном растении - хозяине, и известен в данной области. Полученная в результате молекула, содержащая отдельные элементы, связанные в соответствующей рамке считывания, может быть встроена в вектор, которым может быть трансформирована растительная клетка-хозяин.

Примеры промоторов, которые могут функционировать в растениях или растительных клетках (т.е. которые могут обеспечивать экспрессию связанных кодирующих последовательностей, таких как кодирующие последовательности гомологов NIM1 в растительных клетках) включают промоторы убикитина Arabidopsis и кукурузы; промоторы 19S или 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV) и двойные промоторы CaMV; промоторы актина риса; промоторы PR-1 табака, Arabidopsis или кукурузы; промоторы нопалинсинтазы; промоторы малой субъединицы рибулозобифосфаткарбоксилазы (ssuRUBISCO) и т.п. Особенно предпочтительным является промотор убикитина Arabidopsis. Промоторы сами могут быть модифицированы с помощью известных в данной области методов для того, чтобы управлять силой промотора с целью повышения экспрессии связанной кодирующей последовательностью. Предпочтительными промоторами для применения согласно изобретению являются промоторы, которые обеспечивают высокий уровень конститутивной экспрессии.

Сигнальные или транзитные пептиды могут быть слиты с гомологом кодирующей последовательности NIM1 в химерных конструкциях ДНК по изобретению для непосредственного транспорта экспрессируемого протеина к требуемому месту действия. Примеры сигнальных пептидов включают пептиды, которые в естественных условиях ассоциированы с растительными связанными с патогенезом протеинами PR-1, PR-2 и т.п. (см., например, Рауnе и др., 1988). Примеры транзитных пептидов включают транзитные пептиды хлоропласта, такие как описанные у Von Heijne и др., (1991), Mazur и др., (1987) и Vorst и др. (1988); и транзитные пептиды митохондрий, такие как описанные у Boutry и др., (1987). Они также включают последовательности, которые обеспечивают локализацию кодируемого протеина в различных клеточных компартментах, таких как вакуоли (см., например, Neuhaus и др., (1991) и Chrispeels (1991)).

Химерная(ые) конструкция(ии) ДНК по изобретению может(гут) содержать множественные копии промотора или множественные копии гомолога кодирующей последовательности NIM1 по настоящему изобретению. Кроме того, конструкция(ии) может(гут) включать кодирующие последовательности маркеров и кодирующие последовательности других пептидов, таких как сигнальные или транзитные пептиды, каждая из которых находится в молекуле ДНК в соответствующей рамке считывания с другими функционально активными элементами. Создание таких конструкций находится в компетенции специалиста в данной области.

Пригодные маркеры включают пептиды, обеспечивающие устойчивость к гербицидам, антибиотикам или лекарственным средствам, например устойчивость к ингибиторам протопорфириногеноксидазы, гигромицину, канамицину, G418, гентамицину, линкомицину, метотрексату, глифосату, фосфинотрицину или т.п. Эти маркеры могут применяться для того, чтобы отделить клетки, трансформированные химерными конструкциями ДНК по изобретению, от нетрансформированных клеток. Другими пригодными маркерами являются пептидные ферменты, которые могут быть легко выявлены с помощью реакций, которые могут быть визуализированы, например, с помощью реакции окрашивания, например, такие как люцифераза, -глюкуронидаза или -галактозидаза.

Химерные гены, сконструированные с целью экспрессии в растениях, например, представленные в настоящем описании, могут быть интродуцированы в растительную клетку многочисленными известными в данной области путями. Специалистам в данной области должно быть очевидно, что выбор метода может зависеть от типа растения (т.е. однодольное или двудольное) и/или органеллы (т.е. ядро, хлоропласт, митохондрия), которые являются мишенью для трансформации. Пригодные методы трансформации растительных клеток включают микроинъекцию (Crossway и др., 1986), электропорацию (Riggs и др., 1986); трансформацию, опосредуемую Agrobacterium (Hinchee и др. 1988); непосредственный перенос гена (Paszkowski и др., 1984), баллистическое введение частиц с помощью устройств, поставляемых фирмами Agracetus, Inc., Мэдисон, штат Висконсин и Dupont, Inc. Вилмингтон, штат Делавар (см., например, патент US 4945050; и у McCabe и др., 1988), а также см. у Weissinger и др. (1988); Sanford и др. (1987) (лук); Christou и др. (1988) (соя); McCabe и др. (1988) (соя); Datta и др. (1990) (рис); Klein и др. (1988) (кукуруза); Fromm и др. (1990) и Gordon-Kamm и др. (1990) (кукуруза); Svab и др. (1990) (хлоропласт табака); Gordon-Kamm и др. (1990) (кукуруза); Shimamoto и др. (1989) (рис); Christou и др. (1991) (рис); Datta и др. (1990) (рис); заявка на европейский патент ЕР 0332581 (ежа сборная и другие виды Pooideae); Vasil и др. (1993) (пшеница); Weeks и др. (1993) (пшеница); Wan и др. (1994) (ячмень); Jahne и др. (1994) (ячмень); Umbeck и др. (1987) (хлопчатник); Casas и др. (1993) (сорго); Somers и др. (1992) (овсы); Torbert и др. (1995) (овсы); Weeks и др. (1993) (пшеница); WO 94/13822 (пшеница) и Nehra и др. (1994) (пшеница). Наиболее предпочтительный ряд вариантов осуществления интродукции рекомбинантных молекул ДНК в растения кукурузы с помощью бомбардировки микроснарядами можно найти у Koziel и др. (1993); у Hill и др. (1995) и у Koziel и др. (1996). Дополнительным предпочтительным вариантом осуществления является метод трансформации протопласта кукурузы, описанный в ЕР 0292435.

После того как химерным геном, включающим гомолог кодирующей последовательности NIM1, трансформированы конкретные виды растений, он может быть размножен в этих видах или перенесен в другие сорта этих видов, прежде всего в сорта, имеющие коммерческое значение, с помощью традиционных методов селекции. Особенно предпочтительные растения по изобретению включают перечисленные выше агрономические важные культуры. Генетические особенности, созданные в описанных выше трансгенных семенах и растениях, передаются посредством полового размножения и вследствие этого могут поддерживаться и размножаться в потомстве растений.

ПРИМЕРЫ

Изобретение проиллюстрировано более детально с помощью подробно описанных процедур, способов получения и примеров. Примеры даны только с целью иллюстрации и не направлены на ограничение объема изобретения. Стандартные методы рекомбинантной ДНК и молекулярного клонирования, применяемые при создании настоящего изобретения, описаны у Sambrook и др., 1989; T.J.Silhavy, M.L.Berman и L.W.Enquist, 1984; и у Ausubel F.M. и др., 1987.

Выделение гомолога гена NIM1 Arabidopsis

Пример 1: Выделение гомолога NIM1 из Nicotiana tabacum

Плазмидную ДНК, полученную в результате массовой эксцизии фага из библиотеки кДНК табака, применяют в качестве матрицы для ПЦР, которую осуществляют с использованием следующих пар праймеров:5’-AGATTATTGTCAAGTCTAATG-3’ (SEQ ID NO:9)+5’-TTCCATGTACCTTTGCTTC-3’ (SEQ ID NO:10) и 5’-GCGGATCCATGGATAATAGTAGG-3’ (SEQ ID NO:11)+5’-GCGGATCCTATTTCCTAAAAGGG-3’ (SEQ ID NO:12). Предпочтительно используют следующие условия, при которых осуществляют циклы: 94°С в течение 1 мин; 40°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1,5 мин, и реакцию проводят предпочтительно в течение 40 циклов. ПЦР-продукты разгоняют на агарозных гелях, вырезают и клонируют в pCRII-TOPO (фирма Invitrogen).

Полноразмерная последовательность кДНК гомолога NIM1 табака приведена в SEQ ID NO: 1, а протеин, кодируемый этой последовательностью кДНК, представлен в SEQ ID NO:2. Гомолог NIM1 табака, включающий SEQ ID NO: 1, был депонирован в виде pNOV1206 в NRRL [Коллекция запатентованных культур службы сельскохозяйственных исследований (Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), 1815 Northern University Street, Пеория, штат Иллинойс 61604, США)] 17 августа 1998 г. под регистрационным номером NRRL B-30051.

Пример 2: Выделение гомолога NIM1 из Lycopersicon esculentum

Фазмиды выделяют из библиотек кДНК ZAPII томатов с использованием протокола фирмы Stratagene. Фазмидами (плазмидами) осуществляют массовую трансформацию штамма Е.coli XLl-Blue, используя 10 групп, каждая из которых включает примерно 80000 клонов, и ДНК экстрагируют из этих групп. Группы подвергают скринингу с помощью ПЦР на наличие гомологов NIM1, используя следующие праймеры: 5’-AGATTATTGTCAAGTCTAATG-3’ (SEQ ID NO: 9) и 5’-TTCCATGTACCTTTGCTTC-3’ (SEQ ID NO: 10).

Наличие гомолога NIM1 в последовательностях, амплифицированных из групп, подтверждают путем клонирования и секвенирования амплифицированных с использованием ПЦР фрагментов ДНК. Размер групп последовательно уменьшают и подвергают ПЦР-скринингу с использованием указанных выше праймеров на наличие гомолога NIM1 до тех пор, пока не получают один включающий гомолог клон. В случае, когда клон кДНК включает неполноразмерный ген, укороченный на 5’-конце, то для получения полноразмерной последовательности гена применяют метод 5’-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends - метод быстрой амплификации концов кДНК).

Полноразмерная последовательность кДНК этого гомолога NIM1 томатов приведена в SEQ ID NO: 3, а последовательность протеина, кодируемого этой кДНК, приведена в SEQ ID NO: 4. Гомолог NIM1 томатов, включающий SEQ ID NO: 3, был депонирован в виде pNOV1204 в NRRL [Коллекция запатентованных культур службы сельскохозяйственных исследований (Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), 1815 Northern University Street, Пеория, штат Иллинойс 61604, США)] 17 августа 1998 г. под регистрационным номером NRRL B-30050.

Пример 3: Выделение гомолога NIM1 из Brassica napus

Фазмиды выделяют из библиотек кДНК ZAPII Brassica napus с использованием протокола фирмы Stratagene. Фазмидами (плазмидами) осуществляют массовую трансформацию штамма Е. coli XLl-Blue, используя 10 групп, каждая из которых включает примерно 80000 клонов, и ДНК экстрагируют из этих групп. Группы подвергают скринингу с помощью ПЦР на наличие гомологов NIM1, используя следующие праймеры:

5’-AGATTATTGTCAAGTCTAATG-3’ (SEQ ID NO: 9) и

5’-TTCCATGTACCTTTGCTTC-3’ (SEQ ID NO: 10).

Наличие гомолога NIM1 в последовательностях, амплифицированных из групп, подтверждают путем клонирования и секвенирования амплифицированных с использованием ПЦР фрагментов ДНК. Размер групп последовательно уменьшают и подвергают ПЦР-скринингу с использованием указанных выше праймеров на наличие гомолога NIM1 до тех пор, пока не получают один включающий гомолог клон. В случае, когда клон кДНК включает неполноразмерный ген, укороченный на 5’-конце, то для получения полноразмерной последовательности гена применяют метод 5’-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends - метод быстрой амплификации концов кДНК).

Частичная последовательность кДНК этого гомолога NIM1 Brassica napus приведена в SEQ ID NO: 5, а последовательность протеина, кодируемого этой кДНК, приведена в SEQ ID NO: 6. Гомолог NIM1 Brassica napus, включающий SEQ ID NO: 3, был депонирован в виде pNOV1203 в NRRL [Коллекция запатентованных культур службы сельскохозяйственных исследований (Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), 1815 Northern University Street, Пеория, штат Иллинойс 61604, США)] 17 августа 1998 г. под регистрационным номером NRRL B-30049.

Пример 4: Выделение гомолога NIM1 Arabidopsis thaliana

Исследования, проведенные с помощью программы BLAST, с использованием в качестве последовательностей, с которыми проводится сравнение, аминокислотных последовательностей NIM1 Arabidopsis или томатов позволили выявить в GenBank клон В26306, который содержит геномную последовательность Arabidopsis из бактериальной искусственной хромосомы (ВАС) F18D8. Предсказано, что часть ВАС-последовательности кодирует протеин, обладающий значительным сходством (47%-ная идентичность аминокислотных последовательностей) с NIM1. Для областей последовательности F18D8 конструируют следующие праймеры:

5’-TCAAGGCCTTGGATTCAGATG-3’ (SEQ ID NO: 13) и

5’-ATTAACTGCGCTACGTCCGTC-3’ (SEQ ID NO: 14).

Праймеры применяют для осуществления ПЦР с использованием в качестве матрицы ДНК из библиотеки кДНК Arabidopsis, основой которой является pFL61. Предпочтительно используют следующие условия, при которых осуществляют циклы: 94°С в течение 30 с; 53°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с. Реакцию проводят предпочтительно в течение 40 циклов. Выявляют ПЦР-продукт предсказанного размера (290 пар оснований) и клон кДНК, соответствующий Р1808-праймерам, выделяют из библиотеки кДНК путем последовательной очистки, осуществляя пересевы все меньших количеств библиотеки в Е.coli и повторно определяя с помощью ПЦР присутствие клона. В конце концов получают и секвенируют индивидуальный позитивный клон. Последовательность клона подтверждает присутствие открытой рамки считывания, обладающей существенной гомологией с NIM1.

Полноразмерная последовательность кДНК этого гомолога NIM1 Arabidopsis thaliana приведена в SEQ ID NO: 7, последовательность протеина, кодируемого этой последовательностью кДНК, приведена в SEQ ID NO: 8. Гомолог NIM1 Arabidopsis thaliana, включающий SEQ ID NO: 7, был депонирован в виде AtNMLc5 в Е.coli в NRRL [Коллекция запатентованных культур службы сельскохозяйственных исследований (Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), 1815 Northern University Street, Пеория, штат Иллинойс 61604, США)] 25 мая 1999 г. под регистрационным номером NRRL B-30139.

Пример 5: Создание вырожденных праймеров

Помимо гена NIM1 (Ryals и др., 1997) и подобного NIM гена, описанного выше в примере 4 (AtNMLc5 -SEQ ID NO:7), Arabidopsis thaliana содержит три другие NIМ-подобные (NML) геномные последовательности: AtNMLc2 (SEQ ID NO: 15), AtNMLc4-1 (SEQ ID NO: 17) и AtNMLc4-2 (SEQ ID NO: 19), где знаком с [№] обозначен номер хромосомы, на которой локализован конкретный ген NML. С помощью программы, предназначенной для сравнительного анализа многих последовательностей, GCG Seqweb (Pretty, Wisconsin Genetics Computer Group), проведен сравнительный анализ последовательностей NIM1 из Arabidopsis thaliana (Ryals и др., 1997), Nicotiana tabacum (пример 1-SEQ ID NO: 1) и Lycopersicon esculentum (пример 2 - SEQ ID NO: 3), а также последовательностей NML из Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 7, 15, 17 и 19). На основе этого сравнительного анализа выявлены 3 области, достаточно консервативные для того, чтобы конструировать вырожденные ПЦР-праймеры для ПЦР-амплификации гомологов NIM1 из других видов культурных растений, таких как сахарная свекла, подсолнечник, томаты и канола (масличный рапс). Праймеры, сконструированные на основе этих консервативных областей, приведены ниже в таблице 1. Праймеры NIM 1(A-D) создают с использованием набора только генов NIM1 из Arabidopsis thaliana (Ryals и др., 1997), Nicotiana tabacum (пример 1 - SEQ ID NO: 1) и Lycopersicon esculentum (пример 2 - SEQ ID NO: 3). Праймеры NIM 2(A-D) создают с использованием набора из этих трех последовательностей в сочетании с четырьмя последовательностями NML из Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 7, 15, 17 и 19). Праймеры предпочтительно синтезируют с помощью фирмы Genosys Biotechnologies, Inc. (Вудлэндс, штат Техас). Места вырожденности обозначены в таблице 1 путем указывания более одного основания в одном сайте олигонуклеотида. "Ориентация" обозначает направленность праймера к 3’-концу (по ходу транскрипции) или 5’-концу (против хода транскрипции) кДНК.

Пример 6: ПЦР-амплификация NIМ-подобных фрагментов ДНК из сельскохозяйственных культур

NIM-подобные фрагменты ДНК амплифицируют из Arabidopsis, томатов, табака, сахарной свеклы, подсолнечника, картофеля и канолы (масличный рапс), используя в качестве матриц либо геномную ДНК, либо кДНК. Применяемые комбинации праймеров и ожидаемые размеры фрагментов приведены ниже в таблице 2.

Вырожденные ПЦР-праймеры предпочтительно используют совместной готовыми к применению гранулами для ПЦР (Ready-To-Go PCR Beads) (фирма Amersham, Пискатавей, штат Нью-Джерси) с использованием системы GeneAmp PCR System 9700 (фирма РЕ Applied Biosystems, Фостер Сити, Калифорния). Для каждой реакции используют от 20 до 40 нг геномной ДНК или 5-10 нг кДНК, и каждый праймер в конечной концентрации 0,8 мкМ. Предпочтительно используют следующие условия, при которых осуществляют ПЦР: 94°С в течение 1 мин; 3 цикла [94°С в течение 30 с; 37°С в течение 30 с; 72°С в течение 2 мин]; 35 циклов [94°С в течение 30 с; 60°С в течение 30 с; 72°С в течение 2 мин]; 72°С в течение 7 мин; температура поддерживается на уровне 4°С. Продукты реакции анализируют на 2%-ных агарозных гелях и фрагменты ДНК, имеющие требуемый размер, вырезают. Фрагменты ДНК выделяют из агрозных полос, используя, например, набор Geneclean HI (BIO 101, Inc., Карлсбад, штат Калифорния), а для клонирования применяют, например, набор ТОРО ТА Cloning (фирма Invitrogen Corporation, Карлсбад, штат Калифорния). Плазмиды выделяют, используя, например, систему CONCERT Rapid Plasmid Miniprep System (фирма Life Technologies, Inc., Роквилл, штат Мэриленд), и секвенируют с помощью стандартных протоколов.

NIМ-подобные фрагменты ДНК получают из всех целевых видов растений и во многих случаях выделяют множество уникальных NIM-подобных последовательностей. В таблице 3 подробно описаны выделенные NIM-подобные фрагменты.

На основе этих результатов с помощью описанных выше вырожденных ПЦР-праймеров можно амплифицировать NIM-подобные фрагменты из широкого разнообразия видов растений. В частности, комбинация праймеров NIM 2B/NIM 2D обеспечивает успешную амплификацию при использовании в качестве матрицы кДНК из всех представляющих интерес видов. Для получения продукта особенно предпочтительно применение Ready-To-Go PCR Beads. Кроме того, использование кДНК в качестве матрицы предпочтительно для всех образцов кроме Arabidopsis, томатов и сахарной свеклы, в этих случаях для успешной амплификации достаточно геномной ДНК.

Пример 7: Дополнительные вырожденные праймеры

Новую пару вырожденных праймеров создают на основе сравнительного анализа последовательностей четырех фрагментов из табака (SEQ ID NO: 29, 31, 33 и 35) последовательности из томатов (SEQ ID NO: 37) и применяют для выяснения вопроса, содержатся ли также в томатах аналогичные NIM-подобные последовательности, которые не амплифицируются с помощью вырожденных праймеров, перечисленных в таблице 1. Праймеры, сконструированные из этих фрагментов, приведены ниже в таблице 4, и они предпочтительно были синтезированы фирмой Genosys Biotechnologies, Inc. (Вудлэндс, штат Техас). Места вырожденности обозначены в таблице 4 путем указывания более одного основания в одном сайте олигонуклеотида. "Ориентация" обозначает направленность праймера к 3’-концу (по ходу транскрипции) или 5’-концу (против хода транскрипции) кДНК.

ПЦР на основе вырожденных праймеров осуществляют согласно описанному выше методу, используя кДНК томатов, и перспективные продукты клонируют и секвенируют. Анализ последовательностей доказал наличие двух классов NIM-подобных фрагментов: первых из них идентичен последовательности томатов, приведенной в SEQ ID NO: 37, а второй является уникальным для томатов и на 88% идентичен последовательностям табака, приведенным в SEQ ID NO: 31 и 33. Последовательность этой новой последовательности томатов представлена в SEQ ID NO: 61.

Пример 8: Полноразмерные NIM-подобные кДНК

Соответствующие последовательности кДНК, расположенные против хода и по ходу транскрипции относительно NIМ-подобных ПЦР-фрагментов, предпочтительно получают с помощью RACE-ПЦР, используя набор SMART RACE cDNA Amplification (фирма Clontech, Пало Альто, штат Калифорния). Предпочтительно все 5’- или 3’-концы по меньшей мере трех независимых RACE-продуктов секвенируют для того, чтобы устранить связанные с ПЦР ошибки. Полученные в результате полноразмерные гомологичные последовательности кДНК NIM1 сахарной свеклы, подсолнечника Б и табака Б, которые соответствуют NIM-подобным ПЦР-фрагментам, представленным в SEQ ID NО: 39, 43 и 31, приведены в виде SEQ ID NO: 63, 65 и 73 соответственно.

NIM-подобные кДНК Arabidopsis thaliana, которые соответствуют NIM-подобным геномным последовательностям AtNMLc2 (SEQ ID NO: 15), AtNMLc4-1 (SEQ ID NO: 17) и AtNMLc4-2 (SEQ ID NO: 19), предпочтительно клонируют с помощью ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР). Общую РНК Arabidopsis thaliana подвергают обратной транскрипции, используя олиго-дТ-праймер. Полученную в результате первую цепь кДНК амплифицируют с помощью ПЦР, используя специфичные смысловой и антисмысловой олигонуклеотидные праймеры, созданные на основе 5’- и 3’-концов кодирующей области каждой геномной последовательности (SEQ ID NO:15, 17 и 19). ПЦР-фрагменты предсказанного размера клонируют в векторе и секвениругот для подтверждения того, что эти клоны кДНК соответствуют NIM-подобным геномным последовательностям. Последовательность кДНК, соответствующая NIM-подобной геномной последовательности AtNMLc2 (SEQ ID NO: 15), представлена в виде SEQ ID NO: 67; полноразмерная последовательность кДНК, соответствующая NIM-подобной геномной последовательности AtNMLc4-1 (SEQ ID NO: 17), представлена в виде SEQ ID NО: 69; а полноразмерная последовательность кДНК, соответствующая NIМ-подобной геномной последовательности AtNMLc4-2 (SEQ ID NO: 19), представлена в виде SEQ ID NO: 71.

Пример 9: Анализ методом Нозерн-блоттинга

Анализ методом Нозерн-блоттинга свидетельствует о том, что экспрессия NIM-подобного клона сахарной свеклы (SEQ ID NO: 39 и 63) повышается в 3-7 раз после обработки 100 мкМ или 300 мкМ ВТН (S-метиловый эфир бензо(1,2,3)тиадиазол-7-карботионовой кислоты). Кроме того, анализ методом Нозерн-блоттинга свидетельствует о том, что экспрессия NIМ-подобного клона подсолнечника A (SEQ ID NO: 41) является конститутивной. Кроме того, по данным Нозерн-блоттинга экспрессия NIМ-подобного клона подсолнечника Б (SEQ ID NO: 43 и 65) повышается в 2 раза после обработки 100 мкМ или 3000 мкМ ВТН.

II. Экспрессия последовательностей генов по изобретению в растениях

Гомологи NIM1 по настоящему изобретению могут быть включены в растительные клетки с помощью общепринятой методики рекомбинантной ДНК. Как правило, она включает встраивание кодирующей последовательности по изобретению в систему экспрессии, для которой кодирующая последовательность является гетерологичной (т.е. не присутствует в норме), используя стандартные методы клонирования, известные в данной области. Вектор содержит необходимые элементы для транскрипции и трансляции встроенных кодирующих последовательностей протеинов. Может применяться широкое разнообразие векторных систем, известных в данной области, таких как плазмиды, бактериофаги и другие модифицированные вирусы. Пригодные векторы включают (но не ограничиваясь ими) вирусные векторы, такие как системы на основе лямбда вектора gtll, gtl0 и Charon 4; плазмидные векторы, такие как рВI121, pBR322, pACYCl77, pACYC184, серии pAR, рКК223-3, pUC8, pUC9, pUC18, pUCl9, pLG339, pRK290, pKC37, pKC101, pCDNAII; и другие аналогичные системы. Компоненты экспрессионных систем также могут быть модифицированы с целью повышения уровня экспрессии. Например, могут применяться усеченные последовательности, нуклеотидные замены или другие модификации. Экспрессионные системы, представленные в настоящем описании, могут применяться для трансформации вирусом клетки любого культурного растения в соответствующих условиях. Трансформированные клетки могут быть регенерированы с получением целых растений, т.е. трансгенных растений, в которых гомологи NIM1 обусловливают увеличение уровня экспрессии гена SAR и повышение устойчивости к болезням.

Пример 10: Конструирование растительных кассет экспрессии

Кодирующие последовательности, предназначенные для экспрессии в трансгенных растениях, сначала объединяют в кассеты экспрессии за пригодным промотором, обладающим способностью экспрессироваться в растениях. Кассеты экспрессии также могут включать любые другие последовательности, необходимые или выбранные для экспрессии трансгена. Такие последовательности включают (но не ограничиваясь ими) терминаторы транскрипции, чужеродные последовательности, предназначенные для усиления экспрессии, такие как интроны, витальные последовательности и последовательности, предназначенные для направленного переноса генного продукта в конкретные органеллы и клеточные компартменты. После этого такие кассеты экспрессии легко могут быть перенесены в растительные трансформирующие векторы согласно описанному ниже методу. Далее приведено описание различных компонентов типичных кассет экспрессии.

1. Промоторы

Выбор промотора, применяемого в кассетах экспрессии, определяет пространственную и временную схему экспрессии трансгена в трансгенном растении. Выбранные промоторы позволяют осуществлять экспрессию трансгенов в определенных типах клеток (таких как эпидермальные клетки листьев, мезофильные клетки, клетки коры корня) или в определенных тканях или органах (например, в корнях, листьях или цветках), и этот выбор зависит от требуемого места накопления генного продукта. В альтернативном варианте выбранный промотор может обеспечивать экспрессию гена при различных условиях индуцирования. Промоторы могут различаться по своей силе, т.е. способности обеспечивать транскрипцию. В зависимости от используемой системы клетки-хозяина может применяться любой из многочисленных пригодных промоторов, включая нативный промотор гена. Ниже приведены примеры промоторов, которые могут использоваться в кассетах экспрессии, не ограничивающие объема изобретения.

а. Конститутивная экспрессия: промотор убикитина

Убикитин представляет собой другой генный продукт, известный способностью накапливаться во многих типах клеток, и его промотор клонировали из нескольких видов для применения в трансгенных растениях (например, в подсолнечнике - Binet и др., 1991, в кукурузе - Christensen и др., 1989 и в Arabidopsis - Norris и др., 1993). Промотор гена убикитина кукурузы исследовали в трансгенных системах однодольных растений, и его последовательность и векторы, сконструированные для трансформации однодольных, описаны в опубликованном патенте ЕР 0342926 (на имя фирмы Lubrizol), включенном в настоящее описание в качестве ссылки. Кроме того, у Taylor и др. (1993) описан вектор (рАНС25), который содержит промотор убикитина кукурузы и первый интрон, и отмечена его высокая активность в клеточных суспензиях многочисленных однодольных растений при введении с помощью бомбардировки микроснарядами. Промотор убикитина Arabidopsis является особенно предпочтительным для применения с гомологами NIM1 по настоящему изобретению. Промотор убикитина пригоден для экспрессии гена в трансгенных растениях, как в однодольных, так и в двудольных. Пригодные векторы являются производными вектора рАНС25 или любых трансформирующих векторов, представленных в настоящем описании, модифицированных путем встраивания соответствующего промотора убикитина и/или интронных последовательностей.

б. Конститутивная экспрессия, промотор 35S СаМV

Конструкция плазмиды pCGN1761 описана в опубликованной заявке на патент ЕР 0392225 (пример 23). Плазмида pCGN1761 содержит "двойной" промотор 35S и терминатор транскрипции tml с уникальным сайтом EcoRI между промотором и терминатором и имеет каркас pUC-типа. Конструируют плазмиду, являющуюся производной pCGN1761, которая несет модифицированный полилинкер, включающий сайты NotI и Xhol в дополнение к существующему сайту EcoRI. Эту производную плазмиду обозначают как pCGN1761ENX. pCGN1761ENX может применяться для клонирования последовательностей кДНК или последовательностей гена (включая последовательности микробных ORF) внутри ее полилинкера с целью их экспрессии в трангенных растениях под контролем промотора 35S. Полная кассета такой конструкции, включающая промотор 35S-кодирующую последовательность-терминатор tml, может быть отщеплена в сайтах HindIII, SphI, SalI и XbaI на 5’-конце относительно промотора и сайтов XbaI, BamHI и BglI на 3’-конце относительно терминатора для переноса в трансформирующие векторы, такие как описаны выше. Кроме того, фрагмент двойного промотора 35S может быть удален путем 5’-отщепления с помощью HindIII, SphI, SalI, XbaI или PslI, на 3’-конце в любых сайтах рестрикции полилинкера (EcoRI, NotI или XhoI) для замены на другой промотор. При необходимости вокруг клонирующих сайтов могут быть сделаны модификации путем встраивания последовательностей, которые могут усиливать трансляцию. Это особенно предпочтительно в тех случаях, когда требуется сверхэкспрессия. Например, pCGN1761ENX может быть модифицирована путем оптимизации сайта инициации трансляции согласно методу, описанному в примере 37 патента US 5639949.

в. Конститутивная экспрессия, промотор актина

Известно несколько изоформ актина, экспрессируемых в большинстве типов клеток, и, следовательно, промотор актина представляет собой хороший выбор в качестве конститутивного промотора. В частности, был клонирован и охарактеризован промотор гена риса Actl (McElroy и др., 1990). Установлено, что фрагмент промотора длиной 1,3 т.п.н. содержит все регуляторные элементы, необходимые для экспрессии в протопластах риса. Кроме того, были сконструированы многочисленные векторы экспрессии, включающие промотор Actl, специально для применения в однодольных растениях (McElroy и др., 1991). Они включают интрон 1 Actl, 5’-фланкирующую последовательность Adhl и интрон 1 Adhl (из гена алкогольдегидрогеназы кукурузы) и последовательность из промотора 35S CaMV. Проявившие наибольшую экспрессию векторы представляли собой слияния 35S и интрона Actl или 5’-фланкирующей последовательности Adhl и интрона Actl. Оптимизация последовательностей, смежных с инициирующим кодоном ATG (репортерный ген GUS), также усиливает экспрессию. Промотор кассет экспрессии, описанный у (McElroy и др., 1991), может быть легко модифицирован для экспрессии гена, и он особенно пригоден для использования в однодольных растениях-хозяевах. Например, фрагменты, содержащие промотор, могут быть удалены из конструкций McElroy и применены для замены двойного промотора 35S в pCGN1761ENX, которая после этого становится пригодной для встраивания специфичных последовательностей гена. Слитые гены, сконструированные таким образом, затем могут быть перенесены в соответствующие трансформирующие векторы. В другом научном отчете сообщается, что промотор риса Actl со своим первым интроном также обусловливает высокий уровень экспрессии в культивируемых клетках ячменя (Chibbar и др., 1993).

г. Индуцибельная экспрессия, промотор PR-la

Двойной промотор 35S в pCGN1761ENX может быть заменен любым другим выбранным промотором, который обеспечивает высокий уровень экспрессии. Например, двойной промотор 35S может быть заменен одним из химически регулируемых промоторов, которые описаны в патенте US 5614395. Выбранный промотор предпочтительно отщепляют из его источника с помощью рестриктаз, но в альтернативном варианте он может быть амплифицирован с помощью ПЦР с использованием праймеров, несущих соответствующие терминирующие сайты рестрикции. После ПЦР-амплификации промотор должен быть ресеквенирован с целью проверки ошибок амплификации после клонирования амплифицированного промотора в векторе-мишени. Химически/патогеном регулируемый промотор PR-la табака выделяют из плазмиды рСIВ1004 (касательно конструирования см. пример 21 описания патента ЕР 0332104) и переносят в плазмиду pCGN1761ENX (Ukness и др., 1992). Плазмиду рСIВ1004 расщепляют с помощью NcoI и полученный в результате 3’-выступающий конец линеаризованного фрагмента "затупляют" путем обработки ДНК-полимеразой фага Т4. Затем фрагмент расщепляют с помощью HindIII и полученный в результате фрагмент, содержащий промотор PR-1a, подвергают очистке с помощью геля и клонируют в pCGN1761ENX, из которой удален двойной промотор 35S. Это осуществляют путем расщепления с помощью XhoI и "затупления" конца с помощью полимеразы фага Т4, с последующим расщеплением с помощью HindIII и выделением более крупного фрагмента, содержащего вектор-терминатор, в котором клонируют фрагмент промотора рСIВ1004. Это позволяет получить вектор, являющийся производным pCGN1761ENX, который содержит промотор PR-la и терминатор tml и встроенный полилинкер с уникальными сайтами EcoRI и NotI. Выбранная кодирующая последовательность может быть встроена в этот вектор, и продукты слияния (т.е. промотор-ген-терминатор) затем могут быть перенесены в любой выбранный трансформирующий вектор, включая векторы, приведенные ниже. Различные химические регуляторы могут применяться для индуцирования экспрессии кодирующей последовательности в растениях, трансформированных согласно настоящему изобретению, в том числе производные бензотиадиазола, изоникотиновой кислоты и салициловой кислоты, описанные в патентах US 5523311 и 5614395.

д. Индуцибельная экспрессия, промотор, индуцируемый этанолом

Для обеспечения индуцибельной экспрессии кодирующей последовательности по настоящему изобретению также может применяться промотор, индуцируемый определенными спиртами или кетонами, например этанолом.

Таким промотором является, например, промотор гена alcA Aspergillus nidulans (Caddick и др., 1998). В A. nidulans ген alcA кодирует алкогольдегидрогеназу I, экспрессия которой регулируется факторами транскрипции AlcR в присутствии химического индуктора. Для целей настоящего изобретения кодирующие последовательности CAT в плазмиде ра1сА:САТ, включающей последовательность промотора гена alcA, слитую с минимальным промотором 35S (Caddick и др., 1998), заменяют кодирующей последовательностью по настоящему изобретению, получая кассету экспрессии, содержащую кодирующую последовательность, находящуюся под контролем промотора гена alcA. Это может быть осуществлено с помощью хорошо известных в данной области методов.

е. Индуцибельная экспрессия, промотор, индуцируемый глюкокортикоидом

Также может рассматриваться индукция экспрессии гомолога NIM1 по настоящему изобретению с использованием систем, основанных на стероидных гормонах. Например, можно использовать систему индукции, опосредуемую глюкокортикоидом (Aoyama и Chua, 1997), и индуцировать экспрессию гена обработкой глюкокортикоидом, например синтетическим глюкокортикоидом, предпочтительно дексаметазоном, предпочтительно в концентрации, находящейся в диапазоне от 0,1 мМ до 1 мМ, более предпочтительно в диапазоне от 10 мМ до 100 мМ. Для целей настоящего изобретения последовательности гена люциферазы заменяют кодирующей последовательностью гена гомолога NIM1, конструируя кассету экспрессии, содержащую кодирующую последовательностью гена гомолога NIM1, находящуюся под контролем шести копий GAL4, расположенных против хода транскрипции относительно активирующих последовательностей, слитых с минимальным промотором 35S. Это осуществляют с помощью методов, хорошо известных в данной области.

Трансактивирующий фактор включает ДНК-связывающий домен GAL4 (Keegan и др., 1986), слитый с трансактивирующим доменом протеина вируса герпеса VP16 (Triezenberg и др., 1988), слитым с гормон-связывающим доменом рецептора глюкокортикоида крысы (Picard и др., 1988). Экспрессия слитого протеина контролируется любым известным в данной области промотором, пригодным для экспрессии в растениях. Эту кассету экспрессии, содержащую кодирующую последовательностью гена гомолога NIM1, слитую с конструкцией 6×GАL4/минимальный промотор, встраивают в растение. Таким образом обеспечивают специфичность слитого протеина в отношении ткани или органа, что приводит к индуцибельной экспрессии гомолога NIM1 специфическим в отношении ткани или органа образом.

ж. Специфичная для корня экспрессия

Другой схемой экспрессии гена является экспрессия в корне. Пригодным промотором для экспрессии в корне является промотор, описанный de Framound (1991), а также в опубликованной заявке на патент ЕР 0452269. Этот промотор переносят в пригодный вектор, такой как pCGN1761ENX, для встраивания выбранного гена и последующего переноса полной кассеты промотор-ген-терминатор в представляющий интерес трансформирующий вектор.

з. Промоторы, индуцируемые ранением

Индуцируемые ранением промоторы также могут применяться для экспрессии гена. Описаны многочисленные такие промоторы (см., например, у Хu и др., 1993; Logemann и др., 1989; Rohrmeier и Lehle, 1993; Firek и др., 1993); Warner и др., 1993), и они все пригодны для применения в соответствии с настоящим изобретением. Logemann с соавторами описали последовательности, расположенные против хода транскрипции по отношению к 5’-концу гена wunl двудольного растения - картофеля. Хu с соавторами установили, что индуцируемый ранением промотор из двудольного растения - картофеля (pin2) oбладает активностью в однодольном растении - рисе. Кроме того, Rohrmeier и Lehle описали клонирование кДНК Wipl кукурузы, которая индуцируется ранением и которую можно применять для выделения родственного промотора, используя стандартные методы. Аналогично этому Firek с соавторами и Warmer с соавторами описали индуцируемый ранением ген из однодольного растения Asparagus officinalis, который локально экспрессируется в месте ранения и в местах внедрения патогена. Используя методы клонирования, хорошо известные в данной области, эти промоторы могут быть перенесены в пригодные векторы, слиты с генами и применены для экспрессии этих генов в местах повреждения растения ранением.

и. Предпочтительная для сердцевины экспрессия

В заявке на патент WO 93/07278 описано выделение гена trpA кукурузы, который предпочтителен для экспрессии в клетках сердцевины. Представлены последовательность гена и промотор, расположенные от начала транскрипции до нуклеотида в положении - 1726. С использованием стандартных методов молекулярной биологии этот промотор или его части могут быть перенесены в такой вектор, как pCGN1761, в котором он может заменить промотор 35S и применяться для обеспечения экспрессии чужеродного гена предпочтительным для сердцевины образом. В сущности фрагменты, содержащие предпочтительный для сердцевины промотор или его части, могут быть перенесены в любой вектор 30 и модифицированы для применения в трансгенных растениях.

к. Специфичная для листьев экспрессия

Ген кукурузы, кодирующий фосфоенолкарбоксилазу (РЕРС), описан Hudspeth и Grula (1989). С использованием стандартных методов молекулярной биологии промотор этого гена может быть использован для обеспечения экспрессии любого гена в трансгенных растениях специфическим в отношении листьев образом.

л. Специфичная для пыльцы экспрессия

В заявке на патент WO 93/07278 описано выделение гена кальций-зависимой протеинкиназы (CDPK) кукурузы, который экспрессируется в клетках пыльцы. Последовательность гена и промотора простирается до положения 1400 пар оснований от сайта инициации транскрипции. С использованием стандартных методов молекулярной биологии этот промотор или его части могут быть перенесены в вектор, такой как pCGN1761, где им можно заменить промотор 35S, и он может быть использован для обеспечения экспрессии гомолога NIM1 по настоящему изобретению специфическим в отношении пыльцы образом.

2. Терминаторы транскрипции

Для применения в кассетах экспрессии пригодно широкое разнообразие терминаторов транскрипции. Они ответственны за прекращение транскрипции за трансгеном и за его правильное полиаденилирование. Соответствующие терминаторы транскрипции представляют собой терминаторы, для которых известно, что они обладают способностью функционировать в растениях и они включают терминатор 35S CaMV, терминатор tml, терминатор нопалинсинтазы, терминатор Е9 rbcS гороха. Они могут применяться как в однодольных, так и в двудольных растениях. Кроме того, могут применяться нативные терминаторы транскрипции генов.

3. Последовательности для усиления или регуляции экспрессии

Известны многочисленные последовательности, усиливающие экспрессию единицы транскрипции гена, и эти последовательности могут применяться в сочетании с генами по настоящему изобретению для усиления их экспрессии в трансгенных растениях.

Установлено, что различные интронные последовательности усиливают экспрессию, прежде всего в клетках однодольных растений. Например, установлено, что интроны гена Adhl кукурузы при интродукции в клетки кукурузы значительно усиливают экспрессию гена дикого типа под контролем родственного промотора. Установлено, что интрон 1 является особенно эффективным и усиливает экспрессию в гибридных конструкциях при слиянии с геном хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (Callis и др., 1987). В этой же экспериментальной системе интрон гена bronzel кукурузы проявляет аналогичное действие по отношению к усилению экспрессии. Последовательности интрона включают обычным способом в растительные трансформирующие векторы, обычно в составе нетранслируемой лидерной последовательности.

Также известно большое количество нетранслируемых лидерных последовательностей, происходящих из вирусов, которые усиливают экспрессию и которые особенно эффективны в клетках двудольных растений. В частности, установлено, что лидерные последовательности из вируса табачной мозаики (TMV, "-последовательность"), из вируса хлорозной пятнистости кукурузы (MCMV) и из вируса мозаики люцерны (AMV) эффективно усиливают экспрессию (см., например, у Gallie и др., 1987; Skuzeski и др., 1990).

4. Направленный перенос генного продукта в клетку

У растений известны различные механизмы направленного переноса генных продуктов, и последовательности, контролирующие функционирование этих механизмов, охарактеризованы весьма подробно. Например, направленный перенос генных продуктов в хлоропласт контролируется сигнальной последовательностью, обнаруженной на N-конце различных протеинов, которая отщепляется во время импорта к хлоропласту, в результате чего получается зрелый протеин (см., например, у Comai и др., 1988). Эти сигнальные последовательности могут быть слиты с гетерологичными генными продуктами для осуществления эффективного импорта гетерологичных продуктов в хлоропласт (van den Broeck и др., 1985). ДНК, кодирующая соответствующие сигнальные последовательности, может быть выделена из 5’-конца кДНК, кодирующих протеин RUBISCO, протеин CAB, фермент EPSP-синтазу, протеин GS2 и целый ряд других протеинов, для которых известно, что они локализованы в хлоропласте (см. также раздел, озаглавленный "Экспрессия при направленном переносе в хлоропласт" в примере 37 патента US 5639949).

Другие генные продукты локализованы в других органеллах, таких как митохондрия и пероксисома (см., например, у Unger и др., 1989). кДНК, кодирующие эти продукты, также могут быть подвергнуты воздействиям для осуществления направленного переноса гетерологичных генных продуктов в эти органеллы. Примерами таких последовательностей являются кодируемые ядерной ДНК АТФазы и специфичные для митохондрий изоформы аспартат-аминотрансферазы. Направленный перенос в клеточные протеиновые тельца был описан у Rogers и др. (1985).

Кроме того, были охарактеризованы последовательности, приводящие к направленному переносу генных продуктов в другие клеточные компартменты. N-концевые последовательности ответственны за направленный перенос в эндоплазматический ретикулум (ЭР), апопласт и за внеклеточную секрецию из алейронных клеток (Koehler и Но, 1990). Кроме того, N-концевые последовательности в сочетании с С-концевыми последовательностями ответственны за направленный перенос генных продуктов в вакуоли (Shinshi и др., 1990).

Путем слияния описанных выше соответствующих направляющих последовательностей с представляющими интерес трансгенными последовательностями можно направлять трансгенный продукт в любую органеллу или любой компартмент клетки. Для направленного переноса, например, в хлоропласт сигнальную последовательность хлоропласта гена RUBISCO, гена CAB, гена EPSP-синтазы или гена GS2 сливают в рамке считывания с N-концевым кодоном ATG трансгена. Выбранная сигнальная последовательность должна включать известный сайт расщепления, и при конструировании гибридов следует учитывать любые аминокислоты, расположенные за сайтом расщепления, которые необходимы для расщепления. В некоторых случаях это требование может быть удовлетворено путем добавления небольшого количества аминокислот между сайтом расщепления и ATG трансгена или в альтернативном варианте путем замещения нескольких аминокислот внутри последовательности трансгена. Гибриды, сконструированные для импорта в хлоропласт, могут быть оценены в отношении эффективности поглощения хлоропластом путем трансляции in vitro транскрибируемых in vitro конструкций с последующим поглощением in vitro хлоропластом с использованием методов, описанных у Bartlett и др. (1982) и у Wasmann и др. (1986). Эти методы конструирования хорошо известны в данной области и одинаково пригодны как для митохондрий, так и для пероксисом.

Вышеописанные механизмы направленного переноса в клетку могут быть использованы не только в сочетании с их родственными промоторами, но также и с гетерологичными промоторами для того, чтобы осуществлять специфический целевой направленный перенос при регуляции транскрипции промотором, который имеет схему экспрессии, отличную от схемы экспрессии промотора, от которого исходит сигнал направленного переноса.

Пример 11: Конструирование растительных трансформирующих векторов

Специалистам в данной области известны многочисленные трансформирующие векторы, пригодные для трансформации растений, и гены по настоящему изобретению могут применяться в сочетании с любым из таких векторов. Выбор вектора зависит от предпочтительного метода трансформации и от видов-мишеней, предназначенных для трансформации. Для определенных видов-мишеней предпочтительными могут оказаться различные маркеры для селекции по признаку устойчивости к антибиотику или гербициду. Обычно применяемые для трансформации селектируемые маркеры включают ген nptII, который обусловливает устойчивость к канамицину и родственным антибиотикам (Messing и Vierra, 1982; Bevan и др., 1983), ген bar, обусловливающий устойчивость к гербициду фосфинотрицину (White и др., 1990; Spencer и др., 1990), ген hрН, обусловливающий устойчивость к антибиотику гигромицину (Blochinger и Diggelmann, 1984), и ген dhfr, который обусловливает устойчивость к метотрексату (Bourouis и др., 1983), и ген EPSPS, обусловливающий устойчивость к глифосату (патенты US 4940935 и 5188642).

1. Конструирование векторов, пригодных для трансформации с помощью Agrobacterium

Для трансформации с использованием Agrobacterium tumefaciens пригодны многочисленные векторы. Они обычно несут по крайней мере одну пограничную последовательность Т-ДНК и включают такие векторы, как pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res., (1984)) и pXYZ. Ниже описано конструирование двух типичных векторов, пригодных для трансформации с использованием Agrobacterium.

a. pCIB200 и pCIB2001

Бинарные векторы рСIВ200 и рСIВ2001 применяют для конструирования рекомбинантных векторов, предназначенных для совместного использования с Agrobacterium, и их конструируют следующим образом. Создают pTJS75kan путем расщепления pTJS75 (Schmidhauser и Helinski, 1985) с помощью NarI, что позволяет вырезать ген устойчивости к тетрациклину, с последующим встраиванием фрагмента АссI из плазмиды pUC4K, несущей NPTII (Messing и Vierra, 1982; Bevan и др., 1983; McBridge и др., 1990). Линкеры XhoI лигируют с EcoRV-фрагментом рСIВ7, содержащим левую и правую пограничные последовательности Т-ДНК, селектируемый в растении химерный ген nos/nptII и полилинкер pUC (Rothstein и др., 1987), и клонируют расщепленный с помощью XhoI фрагмент в плазмиде pTJS75, расщепленной с помощью SalI, создавая рСIВ200 (см. также ЕР 0332104, пример 19). Вектор рСIВ200 содержит в полилинкере следующие уникальные сайты рестрикции: EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI и SalI. Вектор рСIВ2001 является производным рСIВ200, и его создают путем инсерции в полилинкер дополнительных сайтов рестрикции. Уникальными сайтами рестрикции в полилинкере вектора рСIВ2001 являются EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI, SalI, MluI, BclI, AvrII, ApaI, HpaI и StuI. В дополнение к тому, что рСIВ2001 содержит эти уникальные сайты рестрикции, он также содержит ген для отбора трансформированных канамицином растений и бактерий, левую и правую пограничные последовательности Т-ДНК для опосредуемой Agrobacterium трансформации, функцию trfA, являющуюся производной RK2, для мобилизации между Е.coli и другими хозяевами, и функции OriT и OriV, также являющиеся производными RK2. Полилинкер рСIВ2001 пригоден для клонирования растительных кассет экспрессии, содержащих их собственные регуляторные сигналы.

б. Вектор pCIB10 и его производные, отобранные по признаку устойчивости к гигромицину

Бинарный вектор pCIB10 содержит ген, обусловливающий устойчивость к канамицину в растениях, правую и левую пограничные последовательности Т-ДНК и включает последовательности из плазмиды pRK252 с широким спектром хозяев, что позволяет осуществлять ее репликацию как в Е. coli, так и в Agrobacterium. Его конструкция описана у Rothstein и др. (1987). У Gritz с соавторами (1983) описаны различные сконструированные производные pCIB10, которые включают ген фосфотрансферазы, обусловливающий устойчивость к гигромицину В. Эти производные дают возможность осуществлять селекцию клеток трансгенных растений либо только по признаку устойчивости к гигромицину (рСIВ743), либо по признаку устойчивости к гигромицину и канамицину (рСIВ715, рСIВ717).

2. Векторы, пригодные для трансформации без использования Agrobacterium

Трансформация без использования Agrobacterium tumefaciens дает возможность обойти требование наличия последовательностей Т-ДНК в выбранном трансформирующем векторе, и, следовательно, векторы, в которых отсутствуют эти последовательности, могут быть использованы в дополнение к векторам, таким как описанные выше, которые содержат последовательности Т-ДНК. Методы трансформации, которые не основаны на использовании Agrobacterium, включают трансформацию с помощью бомбардировки частицами, поглощение протопластом (например, с помощью ПЭГ и электропорации) и микроинъекцию. Выбор вектора в значительной степени зависит от выбора предпочтительных видов, подлежащих трансформации. Ниже описано конструирование некоторых типичных векторов, пригодных для трансформации без использования Agrobacterium.

a. pCIB3064

рСIВ3064 представляет собой вектор, являющийся производным pUC, пригодный для методов прямого переноса гена в сочетании с селекцией в отношении гербицида basta (или фосфинотрицина). Плазмида рСIВ246 включает промотор 35S CaMV, функционально связанный с геном GUS Е.coli, и терминатор транскрипции 35S CaMV, и она описана в опубликованной заявке РСТ WO 93/07278. Промотор 35S этого вектора содержит две ATG последовательности на 5’-конце относительно сайта инициации. Эти сайты подвергают мутации с использованием стандартных методов ПЦР таким образом, чтобы удалить обе ATG и образовать сайты рестрикции SspI и PvuII. Новые сайты рестрикции находятся на расстоянии 96 и 37 пар оснований от уникального сайта SalI и на расстоянии 101 и 42 пары оснований от действительного сайта инициации. Образовавшееся производное плазмиды рСIВ246 обозначили как рСIВ3025. Затем ген GUS вырезают из рСIВ3025 путем расщепления с помощью SalI и SacI, концы затупляют и повторно лигируют, получая плазмиду pCIB3060. Плазмиду рJIТ82 получают из John Innes Center, Norwich, и вырезают фрагмент SmaI длиной 400 пар оснований, содержащий ген bar из Streptomyces viridochromogenes, и встраивают в сайт HpaI плазмиды pCIB3060 (Thompson и др., 1987). Это позволяет получить плазмиду pCIB3064, содержащую ген bar, находящийся под контролем промотора 35S CaMV и терминатора для селекции по признаку устойчивости к гербициду, ген обусловливающий устойчивость к ампициллину (для селекции в Е.coli), и полилинкер с уникальными сайтами SphI, PstI, HindIII и BamHI. Этот вектор пригоден для клонирования растительных кассет экспрессии, содержащих их собственные регуляторные сигналы.

б. pSOG19 и pSOG35

pSOG35 представляет собой трансформирующий вектор, в котором в качестве селектируемого маркера присутствует ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) Е. coli, обусловливающий устойчивость к метотрексату. Для амплификации промотора 35S (~800 пар оснований), интрона 6 гена Adhl кукурузы (~550 пар оснований) и фрагмента длиной 18 пар оснований нетранслированной лидерной последовательности GUS из плазмиды pSOG10 применяют ПЦР. Фрагмент длиной 250 пар оснований, кодирующий ген дигидрофолатредуктазы типа II Е. coli, также амплифицируют с помощью ПЦР и эти два ПЦР-фрагмента объединяют с фрагментом SacI-PstI из рВI221 (фирмы Clontech), который содержит основу вектора pUC19 и терминатор нопалинсинтазы. Сборка этих фрагментов позволяет получить плазмиду pSOG19, содержащую промотор 35S в слиянии с последовательностью интрона 6, лидером GUS, геном DHFR и терминатором нопалинсинтазы. Замена лидера GUS в pSOG19 на лидерную последовательность вируса хлорозной мозаики кукурузы (MCMV) позволяет получить вектор pSOG35, pSOG19 и pSOG35 несут ген pUC, обусловливающий устойчивость к ампициллину, и имеют сайты HindIII, SphI, PstI и EcoRI, пригодные для клонирования чужеродных последовательностей.

Пример 12: Трансформация

После того как представляющая интерес последовательность гена клонирована в экспрессионной системе, ей трансформируют растительную клетку. Методы трансформации и регенерации растений хорошо известны в данной области. Например, для введения чужеродной ДНК, а также для непосредственного поглощения ДНК, введения с помощью липосом, электропорации, микроинъекции и с помощью микроснарядов, используют Ti-плазмиды. Кроме того, для трансформации растительных клеток могут быть использованы бактерии рода Agrobacterium. Ниже описаны репрезентативные методы трансформации как двудольных, так и однодольных растений, а также репрезентативный метод трансформации пластид.

Пример 13

1. Трансформация двудольных растении

Методы трансформации двудольных растений хорошо известны в данной области и включают методы, основанные на применении Agrobacterium, и методы, для которых не требуется использовать Agrobacterium. Методы, для которых не требуются Agrobacterium, включают поглощение экзогенного генетического материала непосредственно протопластами или клетками. Это может быть осуществлено путем поглощения, опосредованного ПЭГ, или электропорацией, введения с помощью бомбардировки частицами, или путем микроинъекции. Примеры этих методов описаны у Paszkowski и др., 1984; Potrykus и др., 1985; Reich и др., 1986 и у Klein и др., 1987. В каждом случае трансформированные клетки регенерируют до целых растений, используя стандартные методы, известные в данной области.

Трансформация, опосредуемая Agrobacterium, является предпочтительным методом трансформации двудольных вследствие высокой эффективности трансформации при использовании этого метода и его широкой применимости для целого ряда различных видов. Трансформация с помощью Agrobacterium обычно включает перенос бинарного вектора, несущего представляющую интерес чужеродную ДНК (например, рСIВ200 или рСIВ2001), в пригодный штамм Agrobacterium, который может зависеть от комплемента vir-генов штамма Agrobacterium-хозяина и которые могут располагаться либо на корезидентной Ti-плазмиде, либо на хромосоме (например, штамм CIB542 для рСIВ200 и pCIB2001 (Uknes и др., 1993). Перенос рекомбинантного бинарного вектора в Agrobacterium производят путем трехродительского скрещивания с использованием Е.coli, несущей рекомбинантный бинарный вектор, штамма-хелпера Е.coli, несущего плазмиду, такую как pRK2031, и который способен мобилизировать рекомбинантный бинарный вектор к направленному переносу в штамм-мишень Agrobacterium. В альтернативном варианте рекомбинантный бинарный вектор может быть перенесен в Agrobacterium с помощью ДНК-трансформации ( и Willmitzer, 1988).

Трансформация видов растений-мишеней с помощью рекомбинантной Agrobacterium обычно включает совместное культивирование Agrobacterium с эксплантатами растения и выполняется в соответствии с протоколами, хорошо известными в данной области. Трансформированную ткань регенерируют на селектируемой среде, содержащей маркер для селекции по признаку устойчивости к антибиотику или гербициду, расположенный между пограничными последовательностями Т-ДНК бинарной плазмиды.

Другой метод трансформации клеток растения геном основан на введении инертных или обладающих биологической активностью частиц в ткани или клетки растения. Этот метод описан в патентах US 4945050, 5036006 и 5100792. Обычно этот метод состоит во введении инертных или обладающих биологической активностью частиц в клетки в условиях, позволяющих им проникнуть через внешнюю оболочку клетки и осуществить встраивание вовнутрь нее. Если используются инертные частицы, то вектор может быть введен в клетку путем нанесения на частицы вектора, содержащего целевой ген. В альтернативном варианте клетка-мишень может быть окружена вектором таким образом, что этот вектор переносится внутрь клетки следом за частицей. Для введения внутрь ткани клетки растения также могут использоваться биологически активные частицы (например, высушенные клетки дрожжей, высушенные бактерии или бактериофаги, каждая(ый) из которых содержит ДНК, предназначенную для введения).

2. Трансформация однодольных растений

Трансформация большинства однодольных видов растений в настоящее время также стала традиционной. Предпочтительные методы включают прямой перенос генов в протопласты с использованием методов на основе ПЭГ или электропорации и бомбардировки частицами ткани каллюса. Трансформации могут быть осуществлены с одиночными видами ДНК или с множественными видами ДНК (т.е. котрансформация), и оба эти метода пригодны для использования по настоящему изобретению. Преимущество котрансформации может состоять в том, что она не требует полной векторной конструкции и дает возможность получать трансгенные растения с несцепленными локусами для представляющего интерес гена и селектируемого маркера, что позволяет удалить селектируемый маркер в последующих поколениях, если это представляется необходимым. Однако недостатком применения метода котрансформации является то, что частота, с которой разные виды ДНК интегрируются в геном, составляет менее 100% (Schocher и др., 1986).

В заявках на патенты ЕР 0292435, ЕР 0392225 и WO 93/072778 описаны методики получения каллюса и протопластов элитной инбредной линии кукурузы, трансформации протопластов с использованием ПЭГ или электропорации и регенерации растений кукурузы из трансформированных протопластов. Gordon-Kamm и др. (1990) и Fromm и др. (1990) описали методы трансформации линии кукурузы, полученной из линии А188, с использованием бомбардировки частицами. Методы трансформации элитных инбредных линий кукурузы путем бомбардировки частицами также описаны в WO 93/07278 и у Koziel с соавторами (1993). Этот метод включает использование незрелых зародышей кукурузы длиной 1,5-2,5 мм, вырезанных из початка кукурузы через 14-15 дней после опыления, и устройства для бомбардировки типа PDS-1000He Biolistics.

Трансформация риса также может быть осуществлена с использованием методов прямого переноса гена с использованием протопластов или бомбардировки частицами. Опосредуемая протопластом трансформация описана для японских и индийских типов риса (Zhang и др., 1988; Shimamoto и др., 1989; Datta и др., 1990). Оба типа риса также трансформируют стандартными методами c использованием бомбардировки частицами (Christou и др., 1991). Кроме того, в WP 93/21335 описаны методы трансформации риса с помощью электропорации.

В заявке на патент ЕР 0332581 описаны методы получения, трансформации и регенерации протопластов растений сем. мятликовых (Pooideae). Эти методы дают возможность трансформировать ежу (Dactylis spp.) и пшеницу. Кроме того, у Vasil с соавторами (1992) описана трансформация пшеницы с использованием бомбардировки частицами клеток каллюса типа С с продолжительным временем регенерации, и также у Vasil с соавторами (1993) и у Weekes с соавторами (1993) описана трансформация с использованием бомбардировки частицами незрелых зародышей и незрелого каллюса эмбрионального происхождения. Однако предпочтительный метод трансформации пшеницы включает трансформацию пшеницы путем бомбардировки частицами незрелых зародышей, и для него требуется наличие либо стадии высокого содержания сахарозы или высокого содержания мальтозы, предшествующей введению гена. До бомбардировки любое количество зародышей (длиной 0,75-1 мм) высевают в MS-среду с добавлением 3% сахарозы (Murashige и Skoog, 1962) и 3 мг/л 2,4-Д (дихлорфеноксиуксусная кислота) для индукции соматических зародышей, которым дают возможность развиваться в темноте. В назначенный день бомбардировки зародыши удаляют из среды для индукции и помещают в осмотикум (т.е. в среду для индукции с добавлением сахарозы или мальтозы в нужной концентрации, обычно 15%). Зародышам дают возможность пройти плазмолиз в течение 2-3 ч и затем подвергают бомбардировке. В одной чашке-мишени обычно используют по 20 зародышей, хотя это количество не имеет решающего значения. Соответствующую несущую ген плазмиду (такую как рСIВ3064 или pSG35) осаждают на золотые частицы размером порядка микрона, используя стандартные методы. Каждую чашку с зародышами обстреливают с помощью устройства на основе гелия DuPont Biolistics® при давлении залпа ~1000 фунтов/кв.дюйм и стандартного экрана с размером пор 80 меш. После бомбардировки зародыши помещают обратно в темноту для восстановления в течение приблизительно 24 ч (все еще в осмотикуме). Через 24 ч зародыши удаляют из осмотикума и помещают назад в среду для индукции, где они остаются в течение приблизительно месяца до регенерации. Приблизительно через один месяц эксплантаты зародышей с развивающимся эмбриогенным каллюсом переносят в среду для регенерации (MS + 1 мг/л НИК, 5 мг/л ГК (гибереллиновая кислота), содержащую, кроме того, соответствующий селектирующий агент (10 мг/л баста в случае рСIВ3064 и 2 мг/л метотрексата в случае pSOG35). Спустя приблизительно один месяц развившиеся ростки переносят в более крупные стерильные контейнеры, известные как "GA7s", содержащие MS с половинной крепостью, 2% сахарозы и такую же концентрацию селектирующего агента.

Также описана трансформация однодольных растений с использованием Agrobacterium (см. WP 94/00977 и патент US 5591616).

III. Селекция и производство семян

Растения, получаемые путем трансформации геном по настоящему изобретению, могут относиться к любому из широкого разнообразия видов растений, включая однодольные и двудольные растения; однако предпочтительно растения, используемые в способе по изобретению, выбирают из приведенного выше списка важных с агрономической точки зрения целевых культур. Способность к экспрессии гена по настоящему изобретению в сочетании с другими характеристиками, важными с точки зрения продуктивности и качества, может быть придана линиям растений с помощью селекции. Принципы и методы селекции являются известными в данной области (см., например, у Welsh J.R. (1981); Wood D.R. (ред.) (1983); Mayo O. (1987); Singh D.P.(1986) и у Wricke и Weber (1986)).

Генетические особенности, сконструированные в описанных выше трансгенных семенах и растениях, передаются с помощью полового размножения или вегетативного роста и, таким образом, могут сохраняться и передаваться по наследству потомству растений. Обычно указанное сохранение и передачу потомству осуществляют с использованием известных сельскохозяйственных методов, разработанных для конкретных целей, таких как обработка почвы, посев или сбор урожая. Также могут применяться специализированные способы, такие как гидропоника или выращивание в закрытом грунте. Поскольку выращиваемые культурные растения подвержены нападению и повреждениям, которые вызываются насекомыми или инфекциями, а также подвержены конкуренции со стороны сорных растений, для улучшения урожая проводят мероприятия по борьбе с сорняками, болезнями растений, насекомыми, нематодами и другими вредными факторами. Они включают механические методы, такие как обработка почвы или удаление сорняков и зараженных растений, а также применение средств защиты растений, таких как гербициды, фунгициды, гаметоциды, нематоциды, регуляторы роста, агенты, способствующие созреванию, и инсектициды.

Кроме того, дающие преимущества генетические особенности трансгенных растений и семян по изобретению могут быть использованы при селекции растений с целью выведения растений с улучшенными свойствами, такими как толерантность к вредителям, гербицидам или стрессу, с улучшенной питательной ценностью, повышенной урожайностью или улучшенным строением, способствующим уменьшению потерь от полегания или осыпания. Для различных стадий селекции характерно целенаправленное вмешательство человека, такое как отбор линий, подлежащих скрещиванию, непосредственное опыление родительских линий или отбор соответствующего потомства растений. В зависимости от требуемых свойств выбирают различные методы селекции. Соответствующие методы хорошо известны в данной области и включают (но не ограничиваясь ими) гибридизацию, инбридинг, возвратное скрещивание, многолинейное скрещивание, смешивание сортов, межвидовую гибридизацию, методы анэуплодии и т.д. Методы гибридизации также включают стерилизацию растений с целью получения мужских или женских стерильных растений с помощью механических, химических или биохимических способов. Перекрестное опыление мужского стерильного растения пыльцой различных линий гарантирует, что геном мужского стерильного, но фертильного женского растения будет равным образом приобретать свойства обеих родительских линий. Таким образом, трансгенные семена и растения по настоящему изобретению могут применяться для селекции улучшенных линий растений, что, например, позволяет увеличить эффективность обычных методов, таких как обработка гербицидом или пестицидом, или дает возможность обойтись без этих методов благодаря модифицированным генетическим особенностям этих растений. Кроме того, могут быть получены новые культурные растения с улучшенной толерантностью к стрессу благодаря оптимизации генетического "аппарата", что позволяет получить урожай продуктов лучшего качества по сравнению с продуктами, полученными от растений, которые не обладают способностью сопротивляться аналогичным вредным условиям в процессе их развития.

Пример 14: Производство семян

При производстве семян качество прорастания и однородность семян являются важными характеристиками продукта, в то время как качество прорастания и однородность семян, собираемых и продаваемых фермером, не являются важными. Поскольку трудно выращивать культурное растение вне контакта с семенами другого культурного и сорного растения, для борьбы с передающимися с семенами болезнями и для получения семян с хорошим прорастанием производителями, занимающимися выращиванием, кондиционированием и продажей чистых семян, разработаны довольно обширные и целенаправленные способы производства семян. Так, обычно фермер практикует покупку сертифицированного семенного материала, удовлетворяющего определенным стандартам качества, вместо того, чтобы использовать семенной материал, полученный от его собственной культуры. Материал для размножения, который используют в качестве семенного материала, обычно обрабатывают защитным покрытием, включающим гербициды, инсектициды, фунгициды, бактерициды, нематоциды, моллюскициды или их смеси. Обычно применяемые защитные покрытия включают такие соединения, как каптан, карбоксин, тирам (TMTD®), металаксил (Apron®) и пиримифосметил (Actellic®). При необходимости эти соединения изготавливают в виде препаративных форм вместе с дополнительными носителями, поверхностно-активными веществами или способствующими нанесению адъювантами, обычно применяемыми в области препаративных форм, для защиты от повреждения, вызванного бактериями, грибами или насекомыми-вредителями. Защитные покрытия могут быть нанесены путем пропитывания материала для размножения жидкой композицией или путем покрытия объединенной влажной или сухой композицией. Также возможны другие способы нанесения, такие как обработка почек или плодов.

Еще одним предметом изобретения являются новые сельскохозяйственные способы, такие как приведенные выше методики, для которых характерно применение трансгенных растений, трансгенного растительного материала или трансгенных семян по настоящему изобретению.

Семена могут быть помещены в мешок, контейнер или сосуд, сделанные из пригодного упаковочного материала, мешок или контейнер должны иметь возможность закрываться для сохранности семян. Мешок, контейнер или сосуд могут быть предназначены либо для кратковременного, либо продолжительного хранения семян, либо для того и для другого одновременно. Примеры пригодного упаковочного материала включают бумагу, такую как крафт-бумага, жесткий или гибкий пластик или иной полимерный материал, стекло или металл. Предпочтительно, чтобы мешок, контейнер или сосуд состояли из нескольких слоев упаковочных материалов одного и того же типа или различных типов. В одном из вариантов осуществления мешок, контейнер или сосуд изготавливают таким образом, чтобы исключить или ограничить контакт семян с водой или влагой. В одном примере мешок, контейнер или сосуд запечатывают, например запечатывают с помощью нагрева, для того чтобы воспрепятствовать проникновению воды или влаги. В другом варианте между слоями упаковочного материала или на них помещают абсорбирующие воду материалы. Еще в одном варианте осуществления мешок, контейнер, или сосуд, или упаковочный материал, из которого он состоит, обрабатывают для того, чтобы ограничить, подавить или предупредить заражение болезнью, загрязнение или другие вредные факторы, возникающие при хранении или транспортировке семян. Примером такой обработки является стерилизация, например, с помощью химических средств или путем облучения. Под объем настоящего изобретения подпадает мешок, предназначенный для коммерческого использования, содержащий семена трансгенного растения, несущие ген по настоящему изобретению, который экспрессируется в трансформированном растении с более высоким уровнем, чем в растении дикого типа, вместе с пригодным носителем и с инструкцией по применению для обеспечения устойчивости растений к широкому спектру болезней.

IV. Оценка устойчивости к болезням

Устойчивость к болезням оценивают с помощью методов, хорошо известных в данной области (см. Uknes и др. (1993); и др. (1996); Alexander и др. (1993)). Ниже в качестве примера описано несколько репрезентативных опытов по оценке устойчивости к болезням.

Пример 15: Оценка устойчивости к Phytophthora parasitica (возбудитель фитофтороза)

Анализ устойчивости к возбудителю фитофтороза Phythophthora parasitica проводят на 6-недельных растениях, выращенных согласно методу, описанному у Alexander и др. (1993). Растения поливают водой, дают хорошо высохнуть и затем инокулируют путем внесения в почву 10 мл суспензии спорангиев (300 спорангиев/мл). Инокулированные растения выдерживают в теплице, поддерживая дневную температуру на уровне 23-25°С, а ночную температуру на уровне 20-22°С. Для оценки используют следующие показатели увядания: 0 обозначает отсутствие симптомов; 1 обозначает появление некоторых симптомов увядания, сопровождающихся понижением упругости; 2 обозначает наличие выраженных симптомов увядания, но без признаков гниения или остановки в росте; 3 обозначает наличие выраженных симптомов увядания с остановкой в росте, но без выраженного гниения стебля; 4 обозначает сильное увядание с видимым гниением стебля и некоторым повреждением корневой системы; 5 обозначает те же признаки, что и для показателя 4, но относится к растениям, которые близки к гибели или уже погибли, для которых характерно серьезное уменьшение корневой системы. Все исследования проводят на растениях, выбранных вслепую и сгруппированных случайным образом.

Пример 16: Анализ устойчивости к Pseudomonas syringae

Pseudomonas syringae pv. tabaci, штамм №551 вносят путем инъекции в два нижних листа нескольких 6-7-недельных растений в концентрации 1×10 или 3×10⁶ на мл воды. В каждый момент времени анализируют по 6 отдельных растений. Степень поражения растений Pseudomonas Tabaci оценивают по 5-ти балльной шкале серьезности заболевания, где 5 обозначает 100%-ную гибель ткани, 0 обозначает отсутствие симптомов. Каждый день проводят анализ данных с помощью t-критерия (наименьшая значимая разность, НЗР) и группируют в соответствии со средним баллом степени поражения болезнью. Данные в пределах одной группы, полученные в один и тот же день эксперимента, не считаются статистически различными.

Пример 17: Анализ устойчивости к Cercospora nicotianae

Суспензию спор Cercospora nicotianae (ATCC №18366) (100000-150000 спор на мл) наносят на поверхность листьев путем опрыскивания до полного увлажнения. Растения выдерживают в условиях 100%-ной влажности в течение 5 дней. После чего растения подвергают мелкокапельному дождеванию 5-10 раз в день. В каждый момент времени анализируют по 6 отдельных растений. Степень поражения растений Cercospora nicotianae оцениванию по проценту листовой поверхности, на которой обнаружены симптомы заболевания. Каждый день проводят анализ данных с помощью t-критерия (наименьшая значимая разность, НЗР) и группируют в соответствии со средним баллом степени поражения болезнью. Данные в пределах одной группы, полученные в один и тот же день эксперимента, не считаются статистически различными.

Пример 18: Анализ устойчивости к Peronospora parasitica

Анализ устойчивости к Peronospora parasitica проводят на растениях согласно методу, описанному у Uknes и др. (1993). Растения инокулируют совместимым изолятом Р. parasitica путем опрыскивания суспензией конидиев (примерно 5×10⁴ /мл). Инокулированные растения инкубируют во влажных условиях при 17°С в вегетационной камере с световым циклом 14 ч день/10 ч ночь. Растения оценивают на наличие конидиофоров в течение 3-14 дней после инокуляции, предпочтительно 7-12 дней. Кроме того, для каждого режима обработки случайным образом отбирают несколько растений и окрашивают лактофенол-трипановым синим (Keogh и др. (1980)) для микроскопического обследования.

Приведенные выше варианты осуществления даны с целью иллюстрации. Как должно быть очевидно специалисту в данной области, настоящее изобретение может включать многочисленные вариации. Все такие очевидные и предсказуемые вариации подпадают под объем формулы изобретения.

Краткое описание последовательностей, приведенных в перечне последовательностей

SEQ ID NO: 1 - Полноразмерная последовательность кДНК гомолога NIM1 из Nicotiana tabacum.

SEQ ID NO: 2 - Последовательность протеина гомолога NIM1 Nicotiana tabacum, кодируемая SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 3 - Полноразмерная последовательность кДНК гомолога NIM1 из Lycopersicon esculentum.

SEQ ID NO: 4 - Последовательность протеина гомолога NIM1 Lycopersicon esculentum, кодируемая SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 5 - Частичная последовательность кДНК гомолога NIM1 из Brassica napus.

SEQ ID NO: 6 - Частичная последовательность протеина гомолога NIM1 Brassica napus, кодируемая SEQ ID NO: 5.

SEQ ID NO: 7 - Полноразмерная последовательность кДНК гомолога NIM1 (AtNMLcS) из Arabidopsis thaliana.

SEQ ID NO: 8 - Полноразмерная последовательность протеина гомолога NIM1 AtNMLc5 Arabidopsis thaliana, кодируемая SEQ ID NO: 7.

SEQ ID NO: 9-14 - Олигонуклеотидные праймеры, применяемые в примерах 1-4.

SEQ ID NO: 15 - Последовательность геномной ДНК гомолога NIM1 (AtNMLc2) из Arabidopsis thaliana.

SEQ ID NO: 16 - Последовательность протеина гомолога NIM1 AtNMLc2 Arabidopsis thaliana, кодируемая SEQ ID NO: 15.

SEQ ID NO: 17 - Последовательность геномной ДНК гомолога NIM1 (AtNMLc4-l) из Arabidopsis thaliana.

SEQ ID NO: 18 - Последовательность протеина гомолога NIM1 AtNMLc4-l Arabidopsis thaliana, кодируемая SEQ ID NO: 17.

SEQ ID NO: 19 - Последовательность геномной ДНК гомолога NIM1 (AtNMLc4-2) из Arabidopsis thaliana.

SEQ ID NO: 20 - Последовательность протеина гомолога NIM1 AtNMLc4-2 Arabidopsis thaliana, кодируемая SEQ ID NO: 19.

SEQ ID NO: 21 - ПЦР-праймер NIM 1A.

SEQ ID NO: 22 - ПЦР-праймер NIM 1B.

SEQ ID NO: 23 - ПЦР-праймер NIM 1C.

SEQ ID NO: 24 - ПЦР-праймер NIM 1D.

SEQ ID NO: 25 - ПЦР-праймер NIM 2A.

SEQ ID NO: 26 - ПЦР-праймер NIM 2B.

SEQ ID NO: 27 - ПЦР-праймер NIM 2C.

SEQ ID NO: 28 - ПЦР-праймер NIM 2D.

SEQ ID NO: 29 - NIM-подобный фрагмент ДНК длиной 659 пар оснований, амплифицированный из Nicotiana tabacum (табак А), который является консенсусным для 36 последовательностей, и его последовательность на 67% идентична последовательности, гена NIM1 Arabidopsis thaliana.

SEQ ID NO: 30 - Последовательность протеина, кодируемая SEQ ID NO: 29.

SEQ ID NO: 31 - NIM-подобный фрагмент ДНК длиной 498 пар оснований, амплифицированный из Nicotiana tabacum (табак Б), который является консенсусным для 2 последовательностей, и его последовательность на 62% идентична последовательности гена NIM1 Arabidopsis thaliana.

SEQ ID NO: 32 - Последовательность протеина, кодируемая SEQ ID NO: 31.

SEQ ID NO: 33 - NIM-подобный фрагмент ДНК длиной 498 пар оснований, амплифицированный из Nicotiana tabacum (табак Б), который является консенсусным для 3 последовательностей, и его последовательность на 63% идентична последовательности гена NIM1 Arabidopsis thaliana.

SEQ ID NO: 34 - Последовательность протеина, кодируемая SEQ ID NО: 33.

SEQ ID NO: 35 - NIM-подобный фрагмент ДНК длиной 399 пар оснований, амплифицированный из Nicotiana tabacum (табак Г), последовательность которого на 59% идентична последовательности гена NIM1 Arabidopsis thaliana.

SEQ ID NO: 36 - Последовательность протеина, кодируемая SEQ ID NO: 35.

SEQ ID NO: 37 - NIM-подобный фрагмент ДНК длиной 498 пар оснований, амплифицированный из Lycopersicon esculentum (томат А), который является консенсусным для 8 последовательностей, и его последовательность на 67% идентична последовательности гена NIM1 Arabidopsis thaliana.

SEQ ID NO: 38 - Последовательность протеина, кодируемая SEQ ID NO: 37.

SEQ ID NO:39 - NIM-подобный фрагмент ДНК длиной 498 пар оснований, амплифицированный из Beta vulgaris (сахарная свекла), который является консенсусным для 24 последовательностей, и его последовательность на 66% идентична последовательности гена NIM1 Arabidopsis thaliana.

SEQ ID NO: 40 - Последовательность протеина, кодируемая SEQ ID NO: 39.

SEQ ID NO: 41 - NIM-подобный фрагмент ДНК длиной 498 пар оснований, амплифицированный из Helianthus annuus (подсолнечник А), который является консенсусным для 9 последовательностей, и его последовательность на 61% идентична последовательности гена NIM1 Arabidopsis thaliana.

SEQ ID NO: 42 - Последовательность протеина, кодируемая SEQ ID NO: 41.

SEQ ID NO: 43 - NIM-подобный фрагмент ДНК длиной 498 пар оснований, амплифицированный из Helianthus annuus (подсолнечник Б), который является консенсусным для 10 последовательностей, и его последовательность на 59% идентична последовательности гена NIM1 Arabidopsis thaliana.

SEQ ID NO: 44 - Последовательность протеина, кодируемая SEQ ID NО: 43.

SEQ ID NO: 45 - NIM-подобный фрагмент ДНК длиной 653 пары оснований, амплифицированный из Solanum tuberosum (картофель А), который является консенсусным для 15 последовательностей, и его последовательность на 68% идентична последовательности гена NIM1 Arabidopsis thaliana.

SEQ ID NO: 46 - Последовательность протеина, кодируемая SEQ ID NO: 45.

SEQ ID NO: 47 - NIM-подобный фрагмент ДНК длиной 498 пар оснований, амплифицированный из Solanum tuberosum (картофель Б), который является консенсусным для 3 последовательностей, и его последовательность на 61% идентична последовательности гена NIM1 Arabidopsis thaliana.

SEQ ID NO: 48 - Последовательность протеина, кодируемая SEQ ID NO: 47.

SEQ ID NO: 49 - NIM-подобный фрагмент ДНК длиной 477 пар оснований, амплифицированный из Solanum tuberosum (картофель В), который является консенсусным для 2 последовательностей, и его последовательность на 62% идентична последовательности гена NIM1 Arabidopsis thaliana.

SEQ ID NO: 50 - Последовательность протеина, кодируемая SEQ ID NO: 49.

SEQ ID NO: 51 - NIM-подобный фрагмент ДНК длиной 501 пара оснований, амплифицированный из Brassica napus (масличный рапс А), который является консенсусным для 5 последовательностей, и его последовательность на 59% идентична последовательности гена NIM1 Arabidopsis thaliana.

SEQ ID NO: 52 - Последовательность протеина, кодируемая SEQ ID NO: 51.

SEQ ID NO: 53 - NIM-подобный фрагмент ДНК длиной 501 пара оснований, амплифицированный из Brassica napus (масличный рапс Б), который является консенсусным для 5 последовательностей, и его последовательность на 58% идентична последовательности гена NIM1 Arabidopsis thaliana.

SEQ ID NO: 54 - Последовательность протеина, кодируемая SEQ ID NO: 53.

SEQ ID NO: 55 - NIМ-подобный фрагмент ДНК длиной 498 пар оснований, амплифицированный из Brassica napus (масличный рапс В), последовательность которого на 56% идентична последовательности гена NIM1 Arabidopsis thaliana.

SEQ ID NO: 56 - Последовательность протеина, кодируемая SEQ ID NO: 55.

SEQ ID NO:57 - NIМ-подобный фрагмент ДНК длиной 498 пар оснований, амплифицированный из Brassica napus (масличный рапс Г), последовательность которого на 73% идентична последовательности гена NIM1 Arabidopsis thaliana.

SEQ ID NO: 58 - Последовательность протеина, кодируемая SEQ ID NO: 57.

SEQ ID NO: 59 - ПЦР-праймер NIM 3А.

SEQ ID NO: 60 - ПЦР-праймер NIM 3B.

SEQ ID NO: 61 - NIМ-подобный фрагмент ДНК длиной 148 пар оснований, амплифицированный из Lycopersicon esculentum (томат Б), который является консенсусным для 3 последовательностей, и его последовательность на 72% идентична последовательности гена NIM1 Arabidopsis thaliana.

SEQ ID NO: 62 - Последовательность протеина, кодируемая SEQ ID NO: 61.

SEQ ID NO: 63 - Полноразмерная последовательность кДНК гомолога NIM1 из Beta vulgaris (сахарная свекла), которая соответствует ПЦР-фрагменту, представленному в SEQ ID NO: 39.

SEQ ID NO: 64 - Последовательность протеина гомолога NIM1 сахарной свеклы, кодируемая SEQ ID NO: 62.

SEQ ID NO: 65 - Полноразмерная последовательность кДНК гомолога NIM1 из Helianthus annuus (подсолнечник Б), которая соответствует ПЦР-фрагменту, представленному в SEQ ID NO: 43.

SEQ ID NO: 66 - Последовательность протеина гомолога NIM1 Helianthus annuus, кодируемая SEQ ID NO: 65.

SEQ ID NO: 67 - Последовательность кДНК, которая соответствует NIM-подобной геномной последовательности AtNMLc2 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 15).

SEQ ID NO: 68 - Последовательность протеина, кодируемая SEQ ID NO: 67.

SEQ ID NO: 69 - Последовательность кДНК, которая соответствует NIM-подобной геномной последовательности AtNMLc4-l Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 17).

SEQ ID NO: 70 - Последовательность протеина, кодируемая SEQ ID NО: 69.

SEQ ID NO: 71 - Последовательность кДНК, которая соответствует NIM-подобной геномной последовательности AtNMLc4-2 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 19).

SEQ ID NO: 72 - Последовательность протеина, кодируемая SEQ ID NO: 71.

SEQ ID NO: 73 - Полноразмерная последовательность кДНК гомолога NIM1 из Nicotiana tabacum (табак Б), которая соответствует ПЦР-фрагменту, представленному в SEQ ID NO: 31.

SEQ ID NO: 74 - Последовательность протеина гомолога NIM1 Nicotiana tabacum, кодируемая SEQ ID NO: 73.

ДЕПОНИРОВАНИЕ

Следующие продукты были депонированы в Коллекции запатентованных культур службы сельскохозяйственных исследований (NRRL), 1815 Northern University Street, Пеория, штат Иллинойс 61604, США) в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонированных микроорганизмов для целей процедуры патентования. Все ограничения по доступности депонированных продуктов должны быть необратимым образом устранены после выдачи патента.

ССЫЛКИ

Приведенные в настоящем описании ссылки отражают современный уровень техники. Каждая из приведенных ниже ссылок включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Патент US №4940935

Патент US №4945050

Патент US №5036006

Патент US №5100792

Патент US №5188642

Патент US №5523311

Патент US №5591616

Патент US №5614395

Патент US №5639949

Патент US №5792904

ЕР 0292435 ЕР 0332104

ЕР 0332581

ЕР 0342926

ЕР 0392225

ЕР 0452269

Международная заявка на патент РСТ WO 93/07278

Международная заявка на патент РСТ WO 93/21335

Международная заявка на патент РСТ WO 94/00977

Международная заявка на патент РСТ WO 94/13822

Международная заявка на патент РСТ WO 94/16077

Международная заявка на патент РСТ WO 97/49822

Международная заявка на патент WO 98/06748

Международная заявка на патент WO 98/26082

Международная заявка на патент WO 98/29537

Alexander и др. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7327-7331 (1993)

Aoyama и Chua. The Plant Journal 11: 605-612 (1997)

Ausubel P.M. и др. Current Protocols in Molecular Biology, изд. Greene Publishing

Assoc. and Wiley-Interscience (1987)

Bartlett и др. В: Edelmann и др. (Eds.) Methods in Chloroplast Molecular Biology,

Elsevier pp 1081-1091 (1982)

Bevan и др. Nature 304:184-187 (1983)

Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)

Bi и др. Plant J. 8: 235-245 (1995)

Binet и др. Plant Science 79: 87-94 (1991)

Blochinger и Diggelmann. Mol Cell. Biol. 4: 2929-2931

Bourouis и др. ЕМВО J. 2(7): 1099-1104 (1983)

Boutry и др. Nature 328:340-342 (1987)

Caddick и др. Nat. Biotechnol 16:177-180 (1998)

Callis и др. Genes Develop. 1: 1183-1200 (1987)

Cameron и др. Plant J. 5: 715-725 (1994)

Сао и др. Plant Cell 6, 1583-1592 (1994)

Сао и др. Cell 88: 57-63 (1997)

Casas и др. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11212-11216 (1993)

Century и др. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6597-6601 (1995)

Chibbar и др. Plant Cell Rep. 12: 506-509 (1993)

Chrispeels. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 21-53 (1991)

Christou и др. Plant Physiol. 87:671-674 (1988)

Christou и др. Biotechnology 9: 957-962 (1991)

Christensen и др. Plant Molec. Biol. 12: 619-632 (1989)

Comai и др. J. Biol. Chem. 263: 15104-15109 (1988)

Crossway и др. BioTechniques 4:320-334 (1986)

Datta и др. Biotechnology 8: 736-740 (1990)

de Framond. FEBS 290: 103-106 (1991)

Delaney и др. Science 266: 1247-1250 (1994)

Delaney и др. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6602-6606 (1995)

Dempsey and Klessig, Bulletin de L’Institut Pasteur 93: 167-186 (1995)

Dietrich и др. Cell 77: 565-577 (1994)

Firek и др. Plant Molec. Biol. 22: 129-142 (1993)

Fromm и др. Biotechnology 8: 833-839 (1990)

Gaffney и др. Science 261: 754-756 (1993)

Galliе и др. Nucl. Acids Res. 15: 8693-8711 (1987)

Glazebrook и др. Genetics 143: 973-982 (1996)

Gordon-Kamm и др. Plant Cell 2: 603-618 (1990)

Gordon-Kamm и др. В: "Transgenic Plants", том. 2, стр.21-33, изд. Academic Press (1993)

и др. Plant Cell 8:629-643 (1996)

Greenberg и др. Cell 77: 551-563 (1994)

Gritz и др. Gene 25: 179-188 (1983)

Hayashimoto и др. Plant Physiol. 93: 857-863 (1990)

Нill и др. Euphytica 85: 119-123 (1995)

Hinchee и др. Biotechnology 6:915-921 (1988)

и Willmitzer. Nucl. Acids Res. 16: 9877 (1988)

Hudspeth и Grula. Plant Molec. Biol. 12: 579-589 (1989)

Hunt и Ryals. Crit. Rev. in Plant Sci. 15: 583-606 (1996)

Innis и др. PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications (ред.), Academic Press (1990)

Ishida и др. Nature Biotechnology 14: 745-750 (1996)

Jahne и др. Theor. Appl. Genet. 89: 525-533 (1994)

Keegan и др. Science 231: 699-704 (1986)

Keogh и др. Trans. Br. Mycol. Soc. 74: 329-333 (1980)

Klein и др. Nature 327: 70-73 (1987)

Klein и др. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4305-4309 (1988)

Klein и др. Вio/Technology 6: 559-563 (1988)

Klein и др. Plant Physiol. 91: 440-444 (1988)

Koziel и др. Biotechnology 11: 194-200 (1993)

Koziel и др. Annals of the New York Academy of Sciences 792: 164-171 (1996)

Lawton и др. "The molecular biology of systemic aquired resistance". В: Mechanisms of Defence Responses in Plants, B. Fritig и М. Legrand, (ред.) (Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publishers), стр.422-432 (1993)

Lawton и др. Plant J. 10: 71-82 (1996)

Logemann и др. Plant Cell 1: 151-158 (1989)

Maher и др. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7802-7806 (1994)

Mauch-Mani и Slusarenko. Mol. Plant-Microbe Interact. 7: 378-383 (1994)

Mauch-Mani и Slusarenko. Plant Cell 8: 203-212 (1996)

Mayo О. The Theory of Plant Breeding, 2-е изд., Clarendon Press, Oxford (1987)

Mazur и др. Plant Physiol. 85: 1110 (1987)

McBride и др. Plant Molecular Biology 14: 266-276 (1990)

McCabe и др. Biotechnology 6: 923-926 (1988)

McElroy и др. Plant Cell 2: 163-171 (1990)

McElroy и др. Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991)

Messing и Vierra. Gene 19: 259-268 (1982)

Murashiga и Skoog. Physiologia Plantarum 15: 473-497 (1962)

Nehra и др. The Plant Journal 5: 285-297 (1994)

Neuhaus и др. Рrос. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10362-10366 (1991)

Norris и др. Plant Mol. Biol. 21: 895-906 (1993)

Pallas и др. Plant J. 10: 281-293 (1996)

Parker и др. Plant Cell 8: 2033-2046 (1996)

Paszkowski и др. ЕМВО J. 3: 2717-2722 (1984)

Payne и др. Plant Mol. Biol. 11:89-94 (1988)

Picard и др. Cell 54: 1073-1080 (1988)

Potrykus и др. Mol. Gen. Genet. 199: 169-177 (1985)

Reich и др. Biotechnology 4: 1001-1004 (1986)

Riggs и др. Рrос. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606 (1986)

Rogers и др. Рrос. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6512-6516 (1985)

Rohrmeier и Lehle. Plant Molec. Biol. 22: 783-792 (1993)

Rothstein и др. Gene 53: 153-161 (1987)

Ryals и др. Plant Cell 8: 1809-1819 (1996)

Ryals и др. Plant Cell 9: 425-439 (1997)

Sambrook и др. Molecular Cloning, (ред.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)

Sanford и др. Particulate Science and Technology 5: 27-37 (1987)

Schmidhauser и Helinski. J. Bacteriol. 164: 446-455 (1985)

Schocher и др. Biotechnology 4: 1093-1096 (1986)

Shimamoto и др. Nature. 338: 274-277 (1989)

Shinshi и др. Plant Molec. Biol. 14: 357-368 (1990)

Shulaev и др. Plant Cell 7: 1691-1701 (1995)

Silhavy и др. Experiments with Gene Fusions, (ред.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1984)

Singh D.P. Breeding for Resistance to Diseases and Insect Pests, Springer-Verlag, NY (1986)

Skuzeski и др. Plant Molec. Biol. 15: 65-79 (1990)

Somers и др. Вio/Technology 10: 1589-1594 (1992)

Spencer и др. Theor. Appl. Genet. 79: 625-631 (1990)

Stanford и др. Mol. Gen. Genet. 215: 200-208 (1989)

Svab и др. Рrос.Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530 (1990)

Taylor и др. Plant Cell Rep. 12: 491-495 (1993)

Thompson и др. ЕМВО J. 6: 2519-2523 (1987)

Torbert и др. Plant Cell Reports 14: 635-640 (1995)

Triezenberg и др. Genes Devel. 2: 718-729 (1988)

Uknes и др. Plant Cell 4: 645-656 (1992)

Uknes и др. Plant Cell 5: 159-169 (1993)

Uknes и др. Molecular Plant Microbe Interactions 6: 680-685 (1993)

Uknes и др. Mol. Plant-Microbe Interact. 6: 692-698 (1993)

Umbeck и др. Bio/Technology 5: 263-266 (1987)

Unger и др. Plant Molec. Biol. 13: 411-418 (1989)

Van den Broeck и др. Nature 313: 358-363 (1985)

Vasil и др. Biotechnology 10: 667-674 (1992)

Vasil и др. Biotechnology 11: 1553-1558 (1993)

Vernooij и др. Plant Cell 6: 959-965 (1994)

Vernooij и др. Mol. Plant-Microbe Interact. 8: 228-234 (1995)

Von Heijne и др. Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126 (1991)

Vorst и др. Gene 65: 59 (1988)

Wan и др. Plant Physiol. 104: 37-48 (1994)

Ward и др. Plant Cell 3: 1085-1094 (1991)

Warner и др. Plant J. 3: 191-201 (1993)

Wasmann и др. Mol. Gen. Genet. 205: 446-453 (1986)

Weeks и др. Plant Physiol. 102: 1077-1084 (1993)

Weissinger и др. Annual Rev. Genet. 22: 421-477 (1988)

Welsh J.R. Fundamentals of Plant Genetics and Breeding, John Wiley & Sons, NY (1981)

Weymann и др. Plant Cell 7: 2013-2022 (1995)

White и др. Nucl. Acids Res. 18: 1062 (1990)

Wood D.R. (Ed.) Crop Breeding, American Society of Agronomy Madison, Wisconsin (1983)

Wricke and Weber. Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding, Walter de Gruyter and Co., Berlin (1986)

Xu и др. Plant Molec. Biol. 22: 573-588 (1993)

Zhang и др. Plant Cell Rep. 7: 379-384 (1988)