производные 2-н-1-бензопиран-2-она, проявляющие антикальциевую активность

Формула изобретения

Производные 2-Н-1-бензопиран-2-она общей формулы I

где R=-СН₃, R₁=-NH-(CH₂ )₂-Br (1);

R=-СН₃, R₁=-NH-(СН ₂)₃-Cl (2);

R=-O-(CH₂) ₂-Br, R₁=-H (7);

R=-O-(СН₂ )₃-Сl, R₁=-H (8);

R=-H, R₁ =-O-(CH₂)₂-SH (10);

R=-H, R₁ =-O-(CH₂)₂-NH₂ (11);

R=-СН₃, R₁=-O-(CH₂)₂ -NH₂ (12);

R=-H, R₁=-O-(CH ₂)₂-O-(CH₂)₂-OH (14);

проявляющие антикальциевую активность.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к новым химическим соединениям гетероциклического ряда, а именно производным 2-Н-1-бензопиран-2-она общей формулы I

где R=-СН₃, R₁=-NH-(CH₂ )₂-Br(1); R=-СН₃, R₁=-NH-(СН ₂)₃-Cl (2);

R=-СН₃, R ₁=-О-(СН₂)₂-Вr(3); R=-СН₃ , R₁=-О-(СН₂)₃-Cl (4);

R=-H, R₁=-O-(CH₂)₂-Br(5); R=-H, R₁=-О-(СН₂)₃-Cl (6);

R=-О-(СН ₂)₂-Вr, R₁=-Н (7); R=-О-(СН ₂)₃-Cl, R₁=-Н (8);

R=-H, R ₁=-О-(СН₂)₂-ОН (9); R=-H, R₁ =-O-(CH₂)₂-SH (10);

R=-H, R ₁=-O-(CH₂)₂-NH₂ (11); R=-СН₃, R₁=-O-(CH₂)₂ -NH₂ (12);

R=-СН₃, R₁=-O-(CH ₂)₂-О-(СН₂)₂-ОН (13);

R=-Н, R₁=-О-(СН₂)₂-О-(СН ₂)₂-ОН (14);

которые обладают различной степени антикальциевой активностью и могут найти применение в медицинской практике при лечении сердечно-сосудистых заболеваний.

В медицинской практике при лечении сердечно-сосудистых недостаточностей часто применяют ряд препаратов: финоптин, различные лекарственные формы нифедипина, дилтиазем, амлодипин и др., обладающих короткой и пролонгированной антикальциевой активностью (Машковский М.Д. Лекарственные средства. – 2000. - T.1. - С.413-415; Кулешова Э.В. Антагонисты кальция и их роль при лечении заболеваний сердечно-сосудистой системы. - 2002. - часть 1 и 2).

Однако перечисленные выше препараты обладают большой частотой побочных эффектов, в частности финоптин до 10%, а нифедипин до 30%, проявляющихся в виде отечности голеней, гипотонии, изменения частоты сердечных сокращений и др. Кроме того, за последние годы отмечено, что использование коротко действующих дигидропиридинов, особенно нифедипина, может увеличивать риск развития злокачественных опухолей, инфаркта миокарда и смерти у больных артериальной гипертонией (Кулешова Э.В. Антагонисты кальция и их роль при лечении заболеваний сердечно-сосудистой системы. - 2002. - часть 1 и 2; Furberg C.D., Psaty В.M, Meyer J.V. Circulation. - 1995. - V.92. - P.1326-1331; Psaty В.М., Heckbert S.R., Koepsell Т.D. et al. JAMA. - 1995. - V.274. - P.620-625; Pahor M., Psaty B.M., Alderman M.H. et al. Lancet. - 2000. - Dec. 9. - 356 (9246):1970-4). В опытах на животных также была установлена эмбриотоксичность дилтиазема и большинства антагонистов 1,4-дигидропиридинового ряда. При длительной терапии дилтиаземом, нифедипином и фелодипином в ранние сроки беременности описаны случаи внутриутробной гибели плода и аномалии развития скелета у новорожденных. Поэтому дилтиазем и все 1,4-дигидропиридиновые производные первого и второго поколения противопоказаны в любые сроки беременности (Svensson A. Clin. Exp. Hypertension. - 1993. - V.15. - Р.1353-1361; Lowe S.A., Rubin P.С. J. Hypertension. - 1992. - V.10. - Р.201-207).

В связи с вышеизложенным синтез и исследование новых антагонистов ионов кальция из других групп гетероциклических соединений (не 1,4-дигидропиридинового ряда) является весьма актуальной для практической медицины, особенно для клинической кардиологии.

Наиболее близким по структуре, физико-химическим и фармакологическим свойствам к заявляемой группе соединений является 7,7'-этилендиокси-2-Н-1-бензопиран-2,2'-дион-диуманкал (15), ранее синтезированный и запатентованный нами в России как антиишемическое средство (Абышев А.З., Денисенко П.П., Пухов М.П. Патент России №1836086; Абышев А.З., Дьячук Г.И. Патент России №2155036; Абышев А.З., Агаев Э.М., Марищенко О.В. Патент России №2187303).

диуманкал-7,7'-этилендиокси-2-Н-1-бензопиран-2,2' -дион (15)

Данное соединение одобрено Фармакологическим Государственным комитетом МЗ РФ (протокол №10 от 27.06.96), и приказом Министра здравоохранения разрешен к применению в медицинской практике в виде таблеток по 0,01 г [Анкардин (диуманкал) - forte] для лечения ишемической болезни сердца у взрослых (приказ №202 от 14.07.97).

Таким образом, в процессе проведенных многолетних исследований среди кислородсодержащих гетероциклических соединений нами впервые обнаружено вещество - диуманкал (15), обладающий антикальциевой активностью и отличающиеся от антагонистов кальция фенилалкиламнового и 1,4-дигидропиридинового рядов более высокой активностью (30 мг/сут.), терапевтической широтой (25000) и низкой токсичностью (LD₅₀= 2500 мг/кг).

Следует отметить, что представитель фенилалкиламинов - финоптин активен в дозах 240-480 мг/сут., 1,4-дигидропиридинов - нифедипин - 30-60 мг/сут. и бензотиазепинов - дилтиазем - 240-360 мг/сут.

Целью настоящего изобретения является поиск новых соединений ряда 2-Н-1-бензопиран-2-она - аналогов диуманкала, обладающих более выраженной антикальциевой активностью и безопасностью, чем соединения, применяющиеся в медицинской практике, а именно фенилалкиламины, 1,4-дигидропиридины и бензотиазепины.

Указанная цель достигается синтезом и исследованием антикальциевых свойств ранее не известных соединений ряда 2-Н-1-бензопиран-2-она - аналогов диуманкала (15),

К настоящему времени синтезировано большое число аналогичных соединений, и для многих из них изучены физико-химические и фармакологические свойства. Поэтому данное изобретение иллюстрируется следующими конкретными примерами синтеза и исследования антикальциевой активности некоторых из них.

Пример 1. Общая методика синтеза амино-, тио- или оксиалкилных производных 2-Н-1 -бензопиран-2-она

А. В трехгорлую круглодонную колбу вместимостью 300 мл, снабженную механической мешалкой, обратным холодильником с хлоркальциевой трубкой и капельной воронкой, помещают 150 мл этиленгликоля (ЭГ) или диметилформамида (ДМФА), соответствующие навески 4-окси-, 7-окси-, 4-метил-7-окси-, 4-метил-7-амино- или 4,6-диметил-7-амино-бензопиран-2-она и углекислого калия. Реакционную смесь нагревают на масляной бане (от 80°С до 110°С) при постоянном перемешивании в течение 2 часов. После растворения навесок соединений добавляют по каплям соответствующие количества 1,2-дибромэтана, 1-бром-3-хлорпропана*, 1-хлор-2-аминоэтана или 1-хлор-2-меркаптоэтана и смесь продолжают нагревать при перемешивании еще 16 часов, после чего охлаждают до комнатной температуры и добавляют воду. Образовавшиеся кристаллы отфильтровывают, тщательно промывают водой и остаток перекристаллизовывают из различных растворителей. При этом получают индивидуальные соединения - 15, 16, 18, 21, 22, 24, 28, 30, физико-химические показатели которых представлены в табл.1.

*Так же были синтезированы бром- или хлоралкилпроизводные, содержащие в боковой цепи от 4 до 6 углеродных атомов.

Б. Маточные растворы концентрируют под вакуумом и наносят на колонку (3×80 см), заполненной силикагелем L 100/250. Элюирование проводят петролейным эфиром (т. кип. 40-70°С), смесью последнего с хлороформом и хлороформом, собирая фракции по 100 мл. После концентрирования фракций и перекристаллизации выпавших остатков из соответствующих растворителей получают соединения 1-14 в индивидуальном виде. Их физико-химические показатели также представлены в табл.1.

Пример 2. Общая методика синтеза комбинированных соединений 17, 19, 20, 23, 25-27,29, 31-36.

В. В двухгорлую круглодонную колбу вместимостью 250 мл, снабженную механической мешалкой, обратным холодильником с хлоркальциевой трубкой, помещают 100 мл ДМФА, соответствующие навески 4-окси-, 7-окси-, 4-метил-7-аминоэтил-, 4,6-диметил-7-амино- или 6-глюкозил-7-окси-бензопиран-2-она и углекислого калия. Реакционную смесь нагревают на масляной бане (от 80°С до 110°С) при постоянном перемешивании в течение 2 часов. После растворения навесок соединений добавляют соответствующие навески 7-(2'-бромэтилокси)-, 4-метил-7-(2'-бромэтилокси)- или 4-метил-7-(2'-бромэтиламино)-бензопиран-2-она и смесь продолжают нагревать при перемешивании еще 5 часов, после чего охлаждают до комнатной температуры и добавляют воду. Образовавшиеся кристаллы отфильтровывают, тщательно промывают водой и остаток перекристаллизовывают из различных растворителей. При этом получают индивидуальные соединения - 17, 19, 20, 23, 25-27, физико-химические показатели которых представлены в табл.1.

Г. Соединения 28-36 также синтезированы в условиях В при взаимодействии соответствующих 7-(2'-оксиэтилокси)-, 7-(2’-сульфогидроэтилокси)- или 7-(2'-аминоэтилокси)-производных бензопиран-2-она или 4-метил-бензопиран-2-она с 7-(2'-бромэтилокси)- или 4-метил-7-(2’ бромэтилокси)-бензопиран-2-оном. Их физико-химические показатели представлены в табл.1.

Пример 3. Определение антикальциевой активности синтезированных соединений.

В связи с тем что многие антагонисты кальция (АК) наиболее часто применяются как противоаритмические средства, в нашей работе был использован ряд аритмий различного генеза. В частности, первичный скрининг исследуемых групп соединений проводили на мышах с использованием модели хлоридкальциевой аритмии. При введении избытка хлористого кальция аритмия проявляется в виде фибриляции, трепетания желудочков с последующей остановкой сердца. В данном эксперименте использовалась доза хлористого кальция 330 мг/кг, который вводили внутривенно (в/в), вызывающая 100% гибель мышей в течение первых 20-40 с. Изучаемые соединения вводили внутрибрюшинно за 2, 5 и 15 мин до в/в введения хлористого кальция. В качестве препаратов сравнения использовали верапамил, дилтиазем и нифедипин, при этом фиксировали величину ЕD₅₀ по тесту выживаемости мышей.

Данные, представленные в табл.2, показывают, что ED₅₀ для верапамила составляет 10 мг/кг, дилтиазема - менее 0,1 мг/кг, а нифедипин в исследованных дозах давал небольшую защиту от избытка ионов кальция. ED₅₀ для некоторых исследуемых соединений составляло, например, для АК-5 менее 0,01 мг/кг, АК-3 и АК-15 0,1 мг/кг, АК-13 1,0 мг/кг, АК-17 10,0 мг/кг и др. Также было определено LD₅₀ изучаемых соединений, при этом обращает на себя внимание тот факт, что большинство рассматриваемых соединений оказались мало токсичными.

Сопоставление приведенных в табл.2 показателей (ED₅₀/LD₅₀) показывают, что широта терапевтического действия многих синтезированных аналогов диуманкала (15) значительна и превосходит таковую известных антагонистов кальция. Кроме того, из представленных в табл.2 данных также видно, что на хлоридкальциевой модели аритмии защитный индекс ряда веществ (АК-6, 20, 22, 25 и др.) превосходят таковой известных АК - верапамила и дилтиазема. При этом наибольшая активность действия отмечена у соединения АК-22.

Анализ полученных данных показывает, что, независимо от происхождения и способа синтеза 4- или 7-монозамещенные, 4,7-дизамещенные или димерные производные 2-Н-1-бензопиран-2-она, соединенные между собой в положениях -7,7' различными алкильными или аминоалкильными радикалами, оказались практически нетоксичными. 5 и 7-алкил- или алкилгалогенопроизводные 2-Н-1-бензопиран-2-она и их аналоги имеют LD₅₀ около 800 мг/кг, а 4-окси- или 4-метил-2-Н-1-бензопиран-2-оны - 1000 мг/кг.

Дальнейшее изучение наиболее эффективных соединений проводили и на других моделях экспериментальных аритмий, вызванных различными фармакологическими препаратами, но в сравнении, в основном, с верапамилом.

Так, было показано, что вводимый интактным мышам питуитрин (1 мг/кг) вызывает аритмии и нарушение проводимости в 100% случаев (см. табл.3). Верапамил (10 мг/кг), введенный за 30 мин до в/в инъекции питуитрина, не устранял аритмию, но купировал нарушения проводимости у 50% животных, тогда как из числа синтезированных новых соединений АК-26 и 34 (1 мг/кг), как и верапамил, предупреждали нарушения проводимости у 60% и 30% мышей, и, кроме того, в 35% и 20% случаев купировали развитие аритмии.

В генезе строфантиновой аритмии лежат процессы нарушения проницаемости клеточных мембран для ионов К⁺ и Са²⁺. При введении строфантина в дозе 0,06 мг/кг у 100% мышей наблюдается аритмия, у 80% нарушения проводимости и отмечается гибель 30% животных (см. табл.4). Верапамил (10 мг/кг), введенный за 30 мин до в/в инъекции строфантина, предупреждал гибель животных, появление аритмий и нарушение проводимости. Практически все исследуемые соединения предупреждали гибель животных, причем оказывали действие, подобное верапамилу, но в меньшей дозе.

Из данных, представленных в табл.2-4, вытекает, что противоаритмическая активность главным образом выражена у 2-Н-1-бензопиран-2-онов, замещенных только в положении 7 (диуманкал и его аналоги), причем наиболее активными среди них являются вещества, содержащие между двумя бензопирановыми циклами не более двух оксиметиленовых групп.

Исходя из вышеприведенных данных, можно заключить, что биологическая активность синтезированных производных 2-Н-1-бензопиран-2-она существенно зависит от строения и расположения боковых цепей (алкильных, оксиалкильных галогеноалкильных).

Немаловажную роль играет также и наличие в структуре 2-Н-1-бензопиран-2-она сопряженной системы -СН=СН- в -пирановом цикле, однако последняя, по-видимому, не является решающим фактором, так как незамещенный 2-Н-1-бензопиран-2-он и его 3-карбокси- и 4-окси-производные, содержащие в своих молекулах эту систему, менее активны, чем другие изучаемые соединения данного ряда.

Таким образом, полученные результаты показывают, что исследуемые производные 2-Н-1-бензопиран-2-она, т.е. аналоги диуманкала, по своему механизму действия могут быть отнесены к группе новых поколений антагонистов ионов кальция, что в дальнейшем было подтверждено нами с использованием различных методических приемов.

1. Данные, представленные в табл.5, показывают, что наиболее значимое ингибирование включения ⁴⁵Са в нервные клетки головного мозга крыс наблюдается при действии диуманкала (АК-15), АК-27 и АК-28, в то время как при введении верапамила значимый эффект отмечается в дозе, отличающейся на порядок.

2. Избирательное действие производных 2-Н-1-бензопиран-2-она, в частности диуманкала (АК-15) и его аналогов, на пул ионов кальция в нервных терминалях нами было установлено с использованием пироантимонатного метода выявления гранул кальция. Полученные результаты показали, что избыток ионов кальция, возникающий в нервных терминалях при действии судорожного агента норборнана, устраняется введением диуманкала (см. чертеж).

Таким образом, впервые установлено, что исследуемая группа соединений, как антагонисты ионов кальция, активно влияют не только на проводимость потенциал зависимых кальциевых каналов L-типа, но и проявляют выраженную чувствительность в отношении каналов N- и Т-типа, широко представленных в центральной нервной системе и в ганглиях.

3. Способность некоторых изученных производных 2-Н-1-бенопиран-2-она (АК-15, 18, 20, 31, 33, 36 и др.) ингибировать ток ионов кальция через мембраны также была установлена при регистрации кинетики кальциевых каналов на изолированных нейронах моллюска.

При выполнении данного раздела работы объектом исследования были выбраны нейроны брюхоногого моллюска - прудовика большого (Lymnaea stagnalis), так как ионные мембранные механизмы электрогенеза и закономерности функционирования трансмембранных ионных каналов нейронов моллюсков принципиально сходны с таковыми у нейронов других животных, в том числе и млекопитающих. Возможность выделения изолированных нервных клеток, их большие размеры, длительное функционирование в опытах (до 1,5 ч), позволяют подробно изучать механизмы генерации электрических потенциалов, а также электрические явления на уровне потенциал зависимых ионных каналов возбудимой мембраны при действии фармакологических агентов.

Для измерения трансмембранных ионных токов применялся метод внутриклеточной перфузии изолированных нейронов и фиксации мембранного потенциала (МП). Этот метод позволяет осуществить полную замену внутриклеточной среды в изолированных клетках путем диализа через разрушенный участок поверхностной мембраны, контролировать и произвольно изменять все концентрационные градиенты на мембране изолированной клетки, действовать фармакологическими препаратами в различных концентрациях на обе стороны мембраны, а также измерять трансмембранные ионные токи в условиях фиксации потенциала без применения микроэлектродов.

Для дифференциации ионных токов применяли среды с различным ионным составом, а также использовали явление различной потенциал зависимости ионных токов. Все исследуемые вещества добавляли в наружные (перфузирующие) растворы в возрастающих концентрациях от 0,0001 до 10000 мкМ/л.

Выделение чистых ионных токов со стабильными их параметрами, которые принимались за исходные значения (до действия вещества), происходило через 3-5 мин после полной замены соответствующих растворов. На экране осциллографа при этом в момент подачи тестирующего импульса появлялся изолированный ток с характерной фазой инактивации.

В наших исследованиях было обнаружено, что все исследуемые соединения при внеклеточном приложении снижали амплитуду как входящих, так и выходящих ионных токов. Этот эффект был дозозависимым. По мере увеличения концентрации изучаемых веществ наблюдалось все более сильное угнетение трансмембранных изолированных ионных токов.

Полученные результаты представлены в табл.6 и 7.

Для подтверждения относительного избирательного влияния изученных соединений на входящие кальциевые токи нами были получены расчетные величины эффективных концентраций 50% подавления (EC₅₀) трансмембранных ионных токов.

Проведенные сопоставления величин EC₅₀ показали, что для 50% подавления кальциевого тока необходимы наименьшие концентрации исследуемых веществ. На основании этих данных нами были получены ряды активности изученных соединений в отношении каждого ионного тока.

По степени подавления кальциевых токов данные соединения можно расположить в следующем порядке:

АК-20>ДИУМАНКАЛ>ВЕРАПАМИЛ>АК-36>АК-31>АК-33>АК-18.

Такой же характер расположения наблюдается и в отношении натриевого тока.

Данные литературы (Крутецкая З.И., Лонский А.В. Биофизика мембран. - С.Петербург. - 1994. - 206 с.; Костерин С.А. Транспорт кальция в гладких мышцах. - Киев. - “Наукова думка”. - 1990. - 216 с.) свидетельствуют, что потенциал зависимые каналы различных типов имеют сходную молекулярную структуру. Это, по нашему мнению, и объясняет схожую динамику в действии изучаемых веществ, однако расчет эффективных концентраций 50% подавления демонстрирует, что 50% подавление натриевого тока наблюдается при концентрациях, превышающих таковые для кальция в 8,5 и более раз. Эти данные позволяют сделать вывод, что исследованные соединения проявляют более избирательную активность в отношении входящего кальциевого тока по сравнению с остальными токами (входящим натриевым и выходящими калиевыми). Это не является правомочным по отношению к соединениям АК-18 и АК-31, у которых разница ЕС₅₀ между кальциевым и натриевым токами составляет 1,02 и 1,59, соответственно.

Таким образом, наиболее вероятными путями реализации действия исследованных соединений можно считать прямую блокаду у входных ворот медленных кальциевых каналов, конкуренцию с Са²⁺ за активные центры этих ворот, деформацию всей структуры кальций-транспортного канала, препятствующую нормальному прохождению через них Са²⁺, неспецифические свойства стабилизировать клеточную мембрану.

Нельзя также отвергать возможность взаимодействия исследованных веществ с воротными механизмами каналов, так как снижение ионных токов возможно также по причине уменьшения времени открытого состояния отдельных каналов или уменьшения частоты их открывания. Об этом может свидетельствовать факт изменения кинетики кальциевого трансмембранного ионного тока под влиянием соединения АК-20. Поскольку скорость активации или инактивации ионных токов определяется, прежде всего, степенью функциональной активности соответствующих воротных структур (активационных m-ворот или инактивационных h-ворот) ионных каналов, то не исключена возможность взаимодействия этого соединения непосредственно с воротными частицами кальциевых каналов. Под влиянием остальных исследованных соединений кинетика исследуемых трансмембранных ионных токов практически не менялась во всем диапазоне концентраций (см. табл.6 и 7).

Несмотря на такой сложный и неоднозначный характер взаимоотношений между трансмембранными ионными токами, тем не менее можно сделать вывод, что ведущим механизмом действия изученных соединений является блокада входа Са²⁺ в клетку по медленным кальциевым каналам, т.е. изученные соединения действительно принадлежат к группе антагонистов ионов кальция нового поколения.

Таким образом, на основании представленных экспериментальных данных нами был подтвержден факт открытия абсолютно самостоятельного класса антагонистов ионов кальция нового поколения из ряда производных 2-Н-1-бензопиран-2-она, активно влияющих на проводимость потенциал зависимых кальциевых каналов не только L-типа, широко представленных в мышцах сердце и сосудов, но и N- и Т-типа, наиболее широко распространенных в центральной нервной системе и ганглиях. Следует особо подчеркнуть, что известные антагонисты ионов кальция фенилалкильного, 1,4-дигидропиридинового и бензо-тиазепинового рядов таким широким спектром действия не обладают.