линейные сополимеры циклодекстрина

Формула изобретения

1. Водорастворимый линейный сополимер циклодекстрина, полученный способом, включающим а) получение, по крайней мере, одного предшественника циклодекстринового мономера, позволяющего проводить полимеризацию только в двух положениях; б) взаимодействие предшественника циклодекстринового мономера с соединением, содержащим две функциональные группы, через которые может быть осуществлено связывание предшественников циклодекстринового мономера, в результате чего получают водорастворимый линейный циклодекстриновый сополимер, включающий повторяющиеся элементарные звенья формулы Ia, Ib или оба звена:

где С представляет собой замещенный или незамещенный циклодекстриновый мономер;

А представляет собой сомономер, связанный с циклодекстрином С.

2. Водорастворимый линейный сополимер циклодекстрина, содержащий циклодекстриновые фрагменты в качестве составной части его главной цепи сополимера, включающий повторяющиеся элементарные звенья формулы Ia, Ib или оба звена:

где С представляет собой замещенный или незамещенный циклодекстриновый мономер;

А представляет собой сомономер, связанный с циклодекстрином С.

3. Сополимер по любому из пп.1-2, где циклодекстриновые фрагменты или циклодекстриновые мономеры одинаковы по всему полимеру.

4. Сополимер по любому из пп.1-2, где циклодекстриновые фрагменты или циклодекстриновые мономеры содержат, по крайней мере, два различных циклодекстриновых фрагмента.

5. Сополимер по п.4, где, по крайней мере, несколько циклодекстриновых фрагментов или циклодекстриновых мономеров являются замещенными.

6. Сополимер по п.5, где, по крайней мере, один циклодекстриновый мономер или фрагмент замещен лигандом, способным связать сополимер с клеткой.

7. Сополимер по п.1 или 2, где циклодекстриновые фрагменты или циклодекстриновые мономеры представляют собой

-, -, -циклодекстрины или их сочетание.

8. Сополимер по п.7, где циклодекстриновые

фрагменты или циклодекстриновые мономеры независимо выбраны из группы, включающей 6^А,6^В-деокси--циклодекстрин, 6^А,6^С-деокси--циклодекстрин, 6^А,6^D-деокси--циклодекстрин, 6^А,6^В-деокси--циклодекстрин, 6^А,6^С-деокси--цикло-декстрин 6^А,6^D-деокси--циклодекстрин, 6^А,6^В-деокси--циклодекстрин, 6^А,6^С-деокси--циклодекстрин, 6^А,6^D-деокси--циклодекстрин, 6^А,6^Е-деокси--циклодекстрин.

9. Сополимер по п.1 или 2, где указанные циклодекстриновые фрагменты или циклодекстриновые мономеры содержат оксидированные циклодекстриновые мономеры, имеющие общую формулу (III)

где р = 5-7.

10. Сополимер циклодекстрина по п.9, где указанные оксидированные циклодекстриновые фрагменты или циклодекстриновые мономеры включают фрагменты, выбранные из 2 ^А,3^А-деокси-2^А,3^А -дигидро--циклодекстрина, 2^А,3^А-деокси-2^А,3^А -дигидро--циклодекстрина, 2^А,3^А-деокси-2^А,3^А -дигидро--циклодекстрина.

11. Сополимер по п.1, где сомономер выбирают из:

-HNC(O)(CH₂)_xC(O)NH-, -HNC(O)(CH₂ )_xSS(CH₂)_xC(O)NH-,

- ⁺H₂N(CH₂)_xSS(CH₂ )_xNH⁺₂-, -HNC(O)(CH₂ CH₂O)_xCH₂CH₂C(O)NH-,

-HNNHC(O)(CH₂CH₂O)_xCH ₂CH₂C(O)NHNH-,

-⁺H ₂NCH₂(CH₂CH₂O)_x CH₂CH₂CH₂NH⁺ ₂-,

-HNC(O)(CH₂CH₂O)_x CH₂CH₂SS(CH₂CH₂O) _xCH₂CH₂C(O)NH-,

-HNC(NH ⁺₂)(CH₂CH₂O) _xCH₂CH₂C(NH⁺₂ )NH-,

-SCH₂CH₂NHC(NH⁺ ₂)(CH₂)_xC(NH⁺₂ )NHCH₂CH₂S-,

-SCH₂CH ₂NHC(NH⁺₂)(CH₂)_x SS(CH₂)_xC(NH⁺₂)NHCH ₂CH₂S-,

-SCH₂CH₂ NHC(NH⁺₂)CH₂CH₂(OCH ₂CH₂)_xC(NH⁺₂ )NHCH₂CH₂S-,

и

где x = 1-50 и y+z=x.

12. Сополимер по п.1, где сомономеры содержат биоразлагаемые или кислотно-лабильные связующие.

13. Сополимер по п.1 или 2, где сополимер сшит с другим полимером.

14. Сополимер по п.13, где по меньшей мере один лиганд связан с сополимером.

15. Сополимер по п.1 или 2, где по меньшей мере один лиганд связан с сополимером.

16. Сополимер по п.1 или 2, где по меньшей мере один циклодекстриновый фрагмент или мономер оксидирован.

17. Сополимер по п.16, где циклодекстриновый фрагмент представляет собой -, -, -циклодекстрин или их сочетание.

18. Сополимер по п.16, где сополимер сшит с другим полимером.

19. Сополимер по п. 18, где по меньшей мере один лиганд связан с оксидированным сополимером.

20. Сополимер по п. 16, где по меньшей мере один лиганд связан с сополимером.

21. Сополимер по п.1 или 2, где в основном все циклодекстриновые фрагменты оксидированы.

22. Сополимер по п.1 или 2, где все циклодекстриновые фрагменты оксидированы.

23. Терапевтическая композиция, включающая сополимер по любому из предшествующих пунктов и эффективное количество терапевтического агента.

24. Композиция, включающая а) первый сополимер по п. 16 и (б) второй водорастворимый линейный сополимер циклодекстрина, включающий циклодекстриновые фрагменты, как составную часть его главной сополимерной цепи.

25. Композиция по п.24, где по меньшей мере один из указанного первого сополимера и указанного второго сополимера является сшитым с другим полимером.

26. Композиция по п.25, где по меньшей мере один лиганд связан по меньшей мере с одним из указанных первого и второго сополимеров.

27. Композиция по п.24, где по меньшей мере один лиганд связан по меньшей мере с одним из указанных первого и второго сополимеров.

28. Терапевтическая композиция, включающая циклодекстриновую композицию по любому из пп.24-27 и эффективное количество терапевтического агента.

29. Способ получения водорастворимого линейного сополимера циклодекстрина, включающий следующие стадии: а) получение по меньшей мере одного предшественника циклодекстринового мономера, который позволяет проводить полимеризацию только в двух положениях; б) взаимодействие предшественника циклодекстринового мономера с соединением, содержащим две функциональные группы, посредством которых осуществляется связь предшественников циклодекстринового мономера, в результате чего получают водорастворимый линейный циклодекстриновый сополимер, включающий повторяющиеся элементарные звенья формулы Ia, Ib или оба звена:

где С представляет собой замещенный или незамещенный циклодекстриновый мономер;

А представляет собой сомономер, связанный с циклодекстрином С.

30. Способ по п. 29, где указанный предшественник циклодекстринового мономера является предшественником дийодированного циклодекстринового мономера формулы IVa, IVb, IVc или их смесью:

31. Способ по п.29, где указанный предшественник циклодекстринового мономера представляет собой -, -, -циклодекстрин или их сочетание.

32. Способ по п.29, где указанный предшественник циклодекстринового мономера выбран из группы, включающей: 6 ^А,6^В-деокси--циклодекстрин, 6^А,6^С-деокси--циклодекстрин, 6^А,6^D-деокси--циклодекстрин, 6^А,6^В-деокси--циклодекстрин, 6^А,6^С-деокси--циклодекстрин, 6^А,6^D-деокси--циклодекстрин, 6^А,6^В-деокси--циклодекстрин, 6^А,6^С-деокси--циклодекстрин, 6^А,6^D-деокси--циклодекстрин, 6^А,6^Е-деокси--циклодекстрин.

33. Способ по п.29, где указанный предшественник циклодекстринового мономера имеет общую формулу (III)

где р = 5.

34. Способ по п.33, где указанный предшественник циклодекстринового мономера выбран из группы, включающей 2 ^А,3^А-деокси-2^А,3^А-дигидро--циклодекстрин, 2^А,3^А-деокси-2^А,3^А -дигидро--циклодекстрин, 2^А,3 ^А-деокси-2^А,3^А -дигидро--циклодекстрин.

35. Способ по п.29, где соединение, содержащее две функциональные группы, выбирают из группы, включающей

-HNC(O)(CH₂ )_xC(O)NH-, -HNC(O)(CH₂)_x SS(CH₂)_xC(O)NH-, -⁺H₂ N(CH₂)_xSS(CH₂)_xNH ⁺₂, -HNC(O)(CH₂CH₂ O)_xCH₂CH₂C(O)NH-, -HNNHC(O)(CH ₂CH₂O)_xCH₂CH ₂C(O)NHNH-,

-⁺H₂NCH₂ (CH₂CH₂O)_xCH₂CH ₂CH₂NH⁺₂-,

-NC(O)(CH ₂CH₂O)_xCH₂CH ₂SS(CH₂CH₂O)_xCH₂ CH₂C(O)NH-, -HNC(NH⁺₂)(CH ₂CH₂О)_хCH₂CH₂ C(NH⁺₂)NH-, -SCH₂CH₂ NHC(NH⁺₂)(CH₂)_xC(NH ⁺₂)NHCH₂CH₂S-,

-SCH₂CH₂NHC(NH⁺₂ )(CH₂)_хSS(CH₂)_xC(NH ⁺₂)NHCH₂CH₂S-,

-SCH₂CH₂NHC(NH⁺₂ )CH₂CH₂(OCH₂CH₂) _xC(NH⁺₂)NHCH₂CH₂ CH₂S-

или

где х = 1-50 и y+z=x.

36. Способ по п.29, включающий дополнительную стадию взаимодействия указанного сополимера с лигандом с образованием линейного сополимера, содержащего по меньшей мере один лиганд, связанный с сополимером.

37. Способ по п.30, включающий дополнительную стадию аминирования указанного предшественника дийодированного циклодекстринового мономера с образованием предшественника диаминированного циклодекстринового мономера и полимеризацию указанного предшественника диаминированного циклодекстринового мономера с образованием указанного сополимера.

38. Способ по п.37, где указанный предшественник диаминированного циклодекстринового мономера является мономером, имеющим формулы Va, Vb, или Vc, или их смесью:

39. Способ по п.37, где указанный предшественник диаминированного циклодекстринового мономера является мономером формулы Vd, Ve, или Vf или их смесью:

40. Способ получения сополимера, включающий стадию восстановления линейного сополимера оксидированного циклодекстрина при условии, что указанный линейный сополимер оксидированного циклодекстрина не содержит способный к восстановлению сомономер А.

41. Способ получения сополимера, включающий стадию оксидирования сополимера по п. 1 или 2.

42. Способ по п.41, включающий дополнительную стадию взаимодействия указанного сополимера с лигандом с образованием сополимера, содержащего по меньшей мере один лиганд, связанный с сополимером.

43. Способ получения сополимера, включающий следующие стадии:

(а) йодирование предшественника оксидированного циклодекстринового мономера с образованием предшественника оксидированного дийодированного циклодекстринового мономера формулы VIIa, VIIb, VIIc или их смеси:

(b) взаимодействие указанного предшественника оксидированного дийодированного циклодекстринового мономера с предшественником сомономера А с образованием линейного сополимера оксидированного циклодекстрина.

44. Способ по п.43, включающий дополнительную стадию взаимодействия указанного линейного сополимера оксидированного циклодекстрина с лигандом с образованием линейного сополимера оксидированного циклодекстрина, содержащего по меньшей мере один лиганд, связанный с сополимером.

45. Способ получения сополимера, включающий стадии (а) аминирования предшественника оксидированного дийодированного циклодекстринового мономера с образованием предшественника окисленного диаминированного циклодекстринового мономера формулы VIIIa, VIIIb, VIIIc или их смеси:

(b) взаимодействие указанного предшественника оксидированного диаминированного циклодекстринового мономера с предшественником сомономера А с образованием линейного сополимера оксидированного циклодекстрина.

46. Способ получения сополимера, включающий стадии (а) аминирования предшественника оксидированного дийодированного циклодекстринового мономера с получением предшественника оксидированного диаминированного циклодекстринового мономера формулы IXa, IХb, IХc или их смеси:

(b) взаимодействие указанного предшественника оксидированного диаминированного циклодекстринового мономера с предшественником сомономера А с образованием линейного сополимера оксидированного циклодекстрина.

47. Способ получения сшитого сополимера циклодекстрина, включающий взаимодействие сополимера по п. 1 или 2 со вторым сополимером в присутствии сшивающего агента.

48. Способ по п.47, где указанным вторым сополимером является линейный сополимер циклодекстрина или линейный сополимер оксидированного циклодекстрина.

49. Способ доставки терапевтического агента пациенту, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества терапевтической композиции по п.23.

50. Способ доставки терапевтического агента пациенту, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества терапевтической композиции по п.28.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения

Изобретение относится к линейным сополимерам циклодекстрина и линейным сополимерам окисленного циклодекстрина. Указанные сополимеры соответственно содержат циклодекстриновый фрагмент, неокисленный или окисленный, в качестве мономерного элементарного звена, которое внедрено в главную цепь сополимера. Изобретение также относится к способам получения линейных сополимеров циклодекстрина и линейных сополимеров окисленного циклодекстрина. Такие сополимеры циклодекстрина могут использоваться в качестве носителя доставки различных терапевтических средств.

Описание известного уровня техники

Циклодекстрины представляют собой циклические полисахариды, содержащие элементарные звенья природной D(+)-глюкопиранозы в -(1,4)соединении. Наиболее распространенными циклодекстринами являются альфа ()-циклодекстрины, бета ()-циклодекстрины и гамма ()-циклодекстрины, которые содержат соответственно шесть, семь или восемь звеньев глюкопиранозы. Циклическая структура циклодекстрина по форме подобна торусу или тороидальному кольцу, имеющему внутреннюю неполярную или гидрофобную полость, и на одной стороне циклодекстринового торуса расположены вторичные гидроксильные группы, а на другой стороне расположены первичные гидроксильные группы. Таким образом, используя в качестве образца ()-циклодекстрин, циклодекстрин зачастую представляют схематически следующим образом:

Сторона, на которой расположены вторичные гидроксильные группы, имеет больший диаметр по сравнению со стороной, на которой расположены первичные гидроксильные группы. Гидрофобная природа внутренней полости циклодекстрина дает возможность включать в нее различные соединения. (Comprehensive Supramolecular Chemistry, Volume 3, J.L. Atwood et al., eds., Pergamon Press (1996); Т. Cserhati, Analytical Biochemistry, 225:328-332 (1995); Husain et al., Applied Spectroscopy, 46:652-658 (1992); FR 2665169).

Циклодекстрины использовались ранее в качестве носителя доставки различных терапевтических соединений посредством образования комплексов включения с различными лекарственными средствами, которые могут вписываться в гидрофобную полость циклодекстрина, или посредством образования нековалентных ассоциированных комплексов с другими биологически активными молекулами, такими как олигонуклеотиды и их производные. Например, в патенте США 4727064 описываются фармацевтические препараты, состоящие из лекарственного средства с по существу низкой растворимостью в воде и аморфной водорастворимой смеси на основе циклодекстрина. Лекарственное средство образует комплекс включения с циклодекстринами указанной смеси. В патенте США 5691316 описывается циклодекстриновая система доставки олигонуклиотидов в клетки. В такой системе олигонуклеотид с помощью нековалентной связи связан с циклодекстрином в комплекс или, альтернативно, олигонуклеотид посредством ковалентной связи может связываться с адамантином, который, в свою очередь, нековалентно ассоциирован с циклодекстрином.

Известны также различные полимеры, содержащие циклодекстрин, и способы их получения. (Comprehensive Supramolecular Chemistry, Volume 3, J.L. Atwood et al., eds., Pergamon Press (1996)). Способ получения полимера, содержащего иммобилизованный циклодекстрин, описан в патенте США 5608015. Согласно этому способу производное циклодекстрина подвергается взаимодействию с мономерным хлорангидридом ,-ненасыщенной кислоты или его производным, либо с ,-ненасыщенной кислотой или ее производным, содержащим на конце изоцианатную группу или производную изоционатной группы. Производное циклодекстрина получают взаимодействием циклодекстрина с такими соединениями, как галогенангидриды карбоновых кислот и ангидриды кислот. Образующийся полимер содержит циклодекстриновые элементарные звенья в виде боковых цепей, отходящих от главной цепи макромолекулы линейного полимера.

В патенте США 5276088 описывается способ синтеза полимеров, содержащих циклодекстрин, посредством взаимодействия поливинилового спирта или целлюлозы или ее производных с производными циклодекстрина или совместной полимеризацией производного циклодекстрина с винилацетатом или метилметакрилатом. И снова полученный полимер содержит циклодекстриновый фрагмент в виде бокового фрагмента, отходящего от главной цепи полимера.

Способные разлагаться биологическим способом полимерные агрегаты с надмолекулярной структурой описаны в публикации WO 96/09073 A1. Агрегат включает ряд циклических соединений, несущих лекарственное средство, которые получены связыванием лекарственного средства с -, - или -циклодекстрином и последующим “нанизыванием” соединений состава “лекарственное средство/циклодекстрин” вдоль цепи линейного полимера, содержащего биоразлагаемые фрагменты, присоединенные к обоим его концам. Такой агрегат, как сообщается, способен высвобождать лекарственное средство в ответ на специфическое биологическое разложение, имеющее место при заболевании. Эти агрегаты обычно называют циклодекстриновыми полимерами “в виде ожерелья”.

Однако еще существует потребность в линейных полициклодекстринах, в которых циклодекстриновый фрагмент является частью главной цепи, а не боковым фрагментом, исходящим от главной цепи, и в способе их получения.

Краткое описание изобретения

Данное изобретение удовлетворяет эту потребность и предоставляет линейные сополимеры циклодекстрина. Такие линейные сополимеры циклодекстрина содержат повторяющееся элементарное звено формул Ia, Ib или их сочетание:

Изобретение предоставляет также способы получения линейных сополимеров циклодекстрина. Один такой способ включает совместную полимеризацию исходного циклодекстринового мономера, дизамещенного одинаковыми или разными уходящими группами, и исходного сомономера А, способного замещать уходящую группу. Другой такой способ включает йодирование исходного циклодекстринового мономера с получением исходного дийодированного циклодекстринового мономера и последующую совместную полимеризацию исходного дийодированного циклодекстринового мономера с исходным сомономером А для получения линейного сополимера циклодекстрина. Еще один способ включает йодирование исходного циклодекстринового мономера с образованием исходного дийодированного циклодекстринового мономера, аминирование исходного дийодированного мономера для получения исходного диаминированного циклодекстринового мономера и последующую совместную полимеризацию исходного диаминированного циклодекстринового мономера с исходным сомономером А для получения линейного сополимера циклодекстрина. Еще один способ включает восстановление линейного сополимера окисленного циклодекстрина до линейного сополимера циклодекстрина.

Изобретение также предоставляет линейный сополимер окисленного циклодекстрина. Линейный сополимер окисленного циклодекстрина представляет собой линейный сополимер циклодекстрина, который включает по меньшей мере один фрагмент окисленного циклодекстрина формулы VIa или VIb:

Каждый циклодекстриновый фрагмент линейного сополимера циклодекстрина изобретения может быть окислен таким образом, чтобы получить линейный сополимер окисленного циклодекстрина, содержащий повторяющееся элементарное звено формулы VIa, VIb или их сочетание.

Изобретение также предоставляет способ получения линейного сополимера окисленного циклодекстрина. Один такой способ включает окисление линейного сополимера циклодекстрина таким образом, чтобы по меньшей мере один циклодекстриновый мономер являлся окисленным. Другие способы включают совместную полимеризацию исходного окисленного циклодекстринового мономера с исходным сомономером А.

Изобретение, кроме того, предоставляет линейный сополимер циклодекстрина или линейный сополимер окисленного циклодекстрина, привитой на субстрат, и способ его получения. Изобретение также предоставляет линейный сополимер циклодекстрина или линейный сополимер окисленного циклодекстрина, сшитый с другим полимером, и способ его получения. Способ получения сшитых полимеров циклодекстрина включает взаимодействие линейного сополимера циклодекстрина или линейного сополимера окисленного циклодекстрина с полимером в присутствии сшивающего агента.

Изобретение предоставляет линейный сополимер циклодекстрина или линейный сополимер окисленного декстрина, содержащий по меньшей мере один лиганд, связанный с сополимером циклодекстрина. Лиганд может быть связан либо с циклодекстриновым фрагментом или либо с фрагментом сомономера А.

Изобретение также предоставляет циклодекстриновую композицию, содержащую по меньшей мере один линейный сополимер циклодекстрина данного изобретения и по меньшей мере один линейный сополимер окисленного циклодекстрина данного изобретения. Изобретение предоставляет также терапевтические композиции, содержащие терапевтическое средство и линейный сополимер циклодекстрина и/или линейный сополимер окисленного циклодекстрина данного изобретения. Способ лечения посредством введения терапевтически эффективного количества терапевтической композиции изобретения также описан.

Подробное описание изобретения

Одно воплощение изобретения представляет собой линейный сополимер циклодекстрина. Линейный сополимер циклодекстрина представляет собой полимер, содержащий циклодекстриновые фрагменты в качестве составной части главной цепи макромолекулы полимера. Ранее циклодекстриновые фрагменты не являлись частями главной цепи макромолекулы полимера, а отходили от главной цепи макромолекулы полимера как боковые фрагменты. Согласно данному изобретению линейный сополимер циклодекстрина содержит повторяющееся элементарное звено формулы Ia, Ib или их сочетание:

В формулах Iа и Ib С представляет собой замещенный или незамещенный циклодекстриновый мономер, А представляет собой сомономер, связанный, например ковалентно связанный, с циклодекстрином С. Полимеризация исходного циклодекстринового мономера С с исходным сомономером А приводит к линейному сополимеру циклодекстрина данного изобретения. В пределах одного линейного сополимера циклодекстрина данного изобретения элементарное звено циклодекстринового мономера С может быть одинаковым или разным, и, аналогично, сомономер А может быть одинаковым или разным.

Предшественник циклодекстринового мономера может представлять собой любой циклодекстрин или его производное, известное в данной области. Как описано выше, циклодекстрин определяется как циклический полисахарид, в большинстве случаев содержащий от шести до восьми элементарных звеньев существующих в природе D(+)-глюкопираноз в -(1,4)связи. Предпочтительно предшественник циклодекстринового мономера представляет собой циклодекстрин, содержащий шесть, семь и восемь глюкозных элементарных звеньев, то есть соответственно альфа ()-циклодекстрин, бета ()-циклодекстрин и гамма ()-циклодекстрин. Производное циклодекстрина может представлять собой любой известный замещенный циклодекстрин, в котором заместитель не влияет на совместную полимеризацию с предшественником сомономера А, как описано выше. Согласно изобретению производное циклодекстрина может быть нейтральным, катионным или анионным. Примеры подходящих заместителей включают, но без ограничения, гидроксиалкильные группы, такие как, например, гидроксипропил, гидроксиэтил; простые эфирные группы, такие как, например, группы простого дигидроксипропилового эфира, простого метилгидроксиэтилового эфира, простого этилгидроксиэтилового эфира и простого этилгидроксипропилового эфира; алкильные группы, такие как, например, метил; сахариды, такие как, например, глюкозил и мальтозил; кислотные группы, такие как, например, группы карбоновых кислот, фосфорных кислот, фосфиновых кислот, фосфоновых кислот, фосфорных кислот, тиофосфоновых кислот, тиофосфоновой кислоты и сульфоновых кислот; имидазольные группы и сульфатные группы.

Кроме того, предшественник циклодекстринового мономера может быть химически модифицированным (например, галогенированным, аминированным) для способствования или влияния на полимеризацию предшественника циклодекстринового мономера с предшественником сомономера А, как описано ниже. Химическая модификация предшественника циклодекстринового мономера позволяет проводить полимеризацию только в двух положениях на каждом циклодекстриновом фрагменте, то есть получать бифункциональный циклодекстриновый фрагмент. Схема нумерации С1-С6 положений каждого кольца глюкопиранозы является следующей:

В предпочтительном воплощении полимеризация осуществляется по любым двум из С2, С3 или С6 положениям циклодекстринового фрагмента, включая их сочетания. Например, один предшественник циклодекстринового мономера может полимеризоваться по двум С6 положениям, в то время как другой предшественник циклодекстринового мономера может полимеризоваться в положениях С2 и С6 циклодекстринового фрагмента. В случае -цикло-декстрина схема записи относительного положения каждого кольца глюкопиранозы в циклодекстрине будет следующей:

В предпочтительном воплощении линейного сополимера циклодекстрина данного изобретения циклодекстриновый мономер С имеет следующую общую формулу (II):

В формуле (II) n и m представляют собой целые числа, которые в сумме с двумя глюкопиранозовыми кольцами определяют общее количество элементарных звеньев глюкопиранозы в циклодекстриновом мономере. Формула (II) представляет циклодекстриновый мономер, который способен подвергаться полимеризации в двух С6 положениях на циклодекстриновом элементарном звене. Примеры циклодекстриновых мономеров формулы (II) включают, но без ограничения, 6^A,6^B -деокси--циклодекстрин (n=0, m=4), 6^A,6^C-деокси--циклодекстрин (n=1, m=3), 6^A,6^D-деокси--циклодекстрин (n=2, m=2), 6^A,6^B-дeoкcи--циклoдeкcтpин (n=0, m=5), 6^A,6^C-дeoкcи--циклoдeкcтpин (n=1, m=4), 6^A,6^D-деокси--циклодекстрин (n=2, m=3), 6^A,6^B-деокси--циклодекстрин (n=0, m=6), 6^A,6^C-деокси--циклодекстрин (n=1, m=5), 6^A,6^D-деокси--циклодекстрин (n=2, m=4), 6^A,6^E-дeoкcи--циклoдeкcтpин (n=3, m=3). В другом предпочтительном воплощении линейного сополимера циклодекстрина данного изобретения циклодекстриновое элементарное звено мономера С имеет следующую общую формулу (III):

где р=5-7. В формуле (III) одно из элементарных звеньев D(+)-глюкопиранозы циклодекстринового мономера подвергается раскрытию цикла для проведения полимеризации в положение С2 и С3 циклодекстринового элементарного звена. Циклодекстриновые мономеры формулы (III) коммерчески доступны от Carbomer of Westborough, MA. Примеры циклодекстриновых мономеров формулы (III) включают, но без ограничения, 2^A,3^A-деокси-2^A,3^A -дигидро--циклодекстрин, 2^A,3^A-дeoкcи-2^A,3^A -дигидро--циклодекстрин, 2^A,3^A-деокси-2^A,3^A -дигидро--циклодекстрин, которые обычно называют соответственно 2,3-деокси--циклодекстрин, 2,3-деокси--циклодекстрин и 2,3-деокси--циклодекстрин.

Предшественник сомономера А может представлять собой любое соединение с прямой или разветвленной цепью, симметричное или асимметричное, которое в результате взаимодействия с предшественником циклодекстринового мономера, как описано выше, соединяет два циклодекстриновых мономера. Предпочтительно предшественник сомономера А представляет собой соединение, содержащее по меньшей мере две функциональные группы, через которые может быть осуществлена реакция и, следовательно, связывание циклодекстриновых мономеров. Примеры возможных функциональных групп, которые могут быть одинаковыми или разными, располагаться на конце или в середине молекулы каждого исходного сомономера А, включают, но без ограничения, аминогруппу, кислотную группу, группу сложного эфира, имидазольнную группу или группу ацилгалогенида и их производные. В предпочтительном воплощении две функциональные группы являются одинаковыми и концевыми. В результате сополимеризации предшественника сомономера А с предшественником циклодекстринового мономера могут связываться вместе два циклодекстриновых мономера посредством соединения первичных гидроксильных групп одного циклодекстринового мономера с первичными гидроксильными группами другого циклодекстринового мономера, посредством соединения вторичных гидроксильных групп одного циклодекстринового мономера с вторичными гидроксильными группами другого циклодекстринового мономера или посредством соединения первичных гидроксильных групп одного циклодекстринового мономера с вторичными гироксильными группами другого циклодекстринового мономера. Соответственно, сочетания таких химических связей могут существовать в конечном сополимере.

Как предшественник сомономера А, так и сомономер А конечного сополимера может быть нейтральным, катионным (например, содержащим протонированные группы, такие как, например, четвертичные аммониевые группы) или анионным (например, содержащим депротонированные группы, такие как, например, сульфатная, фосфатная или карбоксилатная анионные группы). Заряд сомономера А сополимера может регулироваться посредством регулирования рН. Примеры подходящих предшественников сомономера А включают, но без ограничения, цистамин, 1,6-диаминогексан, диимидазол, дитиоимидазол, спермин, дитиоспермин, дигистидин, дитиогистидин, сукцинимид (например, дитиобис(сукцинимидилпропионат) (DSP) и дисукцинимидилсуберат (DSS)) и имидаты (например, диметил 3,3'-дитиобиспропионимидат (DTBP)). Сополимеризация предшественника сомономера А с предшественником циклодекстринового мономера приводит к получению линейного сополимера циклодекстрина данного изобретения, содержащего связи сомономера А следующих общих формул:

-HNC(O)(CH₂)_xC(O)NH-, -HNC(O)(CH₂ )_xSS(СН₂)_хС(О)NH-,

- ⁺Н₂N(СH₂)_хSS(СН₂ )_хNH⁺₂, -HNC(O)(СН₂ СН₂О)_xСН₂СН₂С(О)NH-,

-HNNHC(О)(СН₂СН₂O)_хСН ₂СН₂С(О)NHNH-,

-⁺H ₂NCH₂(CH₂CH₂O)_x CH₂CH₂CH₂NH⁺ ₂-,

-NC(О)(CH₂CH₂O)_x CH₂CH₂SS(СН₂СН₂О) _хСН₂СН₂С(О)NH-,

-HNC(NH ⁺₂)(CH₂CH₂O) _xCH₂CH₂C(NH⁺₂ )NH-,

-SCH₂CH₂NHC(NH⁺ ₂)(CH₂)_xC(NH⁺₂ )NHCH₂CH₂S-,

-SCH₂CH ₂NHC(NH⁺₂)(CH₂)_x SS(CH₂)_xC(NH⁺₂)NHCH ₂CH₂S-,

-SCH₂CH₂ NHC(NH⁺₂)CH₂CH₂(OCH ₂CH₂)_xC(NH⁺₂ )NHCH₂CH₂CH₂S-

В приведенных выше формулах х=1-50 и y+z=x. Предпочтительно х=1-30. Более предпочтительно х=1-20. В предпочтительном воплощении сомономер А способен разлагаться биологическим способом или является кислотно-лабильным. Кроме того, в предпочтительном воплощении исходный сомономер А и, следовательно, сомономер А может быть селективно выбран для целевого применения. Например, для доставки терапевтических средств с небольшими молекулами наличие заряда в полимере может быть необязательно, и сомономер А может представлять собой полиэтиленгликолевую группу.

Линейный сополимер циклодекстрина данного изобретения может быть модифицирован по меньшей мере одним лигандом, присоединенным к сополимеру циклодекстрина. Лиганд может присоединяться к сополимеру циклодекстрина через циклодекстриновый мономер С или сомономер А. Предпочтительно лиганд присоединяется по меньшей мере к одному циклодекстриновому фрагменту линейного сополимера циклодекстрина. Предпочтительно лиганд позволяет линейному сополимеру циклодекстрина достигать клетки и соединяться с ней. Если к линейному сополимеру циклодекстрина изобретения присоединено несколько лигандов, которые могут быть одинаковыми или разными, дополнительный лиганд или лиганды могут присоединяться к одинаковым или разным циклодекстриновым фрагментам или к одинаковым или разным сомономерам А сополимера.

Примеры подходящих лигандов включают, но без ограничения, витамины (например, фолиевую кислоту), белки (например, трансферрин и моноклональные антитела) и полисахариды. Лиганд будет изменяться в зависимости от типа целевой доставки. Например, рецептор-проводимая доставка может достигаться посредством, но без ограничения, применения лиганда фолиевой кислоты, в то время как доставка антисмысловых олигонуклеотидов может достигаться посредством применения, но без ограничения, трансферринового лиганда. Лиганд может присоединяться к сополимеру изобретения известными способами.

Другим воплощением изобретения является способ получения линейного сополимера циклодекстрина. Согласно изобретению, сополимер линейного циклодекстрина изобретения может быть получен совместной полимеризацией предшественника циклодекстринового мономера, дизамещенного подходящими уходящими группами, с предшественником сомономера А, который способен замещать уходящие группы. Уходящие группы, которые могут быть одинаковыми или разными, могут представлять собой любую уходящую группу, известную в данной области, которая может подвергаться замещению в процессе совместной полимеризации с предшественником сомономера А. В предпочтительном воплощении линейный сополимер циклодекстрина может быть получен йодированием предшественника циклодекстринового мономера с получением предшественника дийодированного циклодекстринового мономера и совместной полимеризацией предшественника дийодированного циклодекстринового мономера с предшественником сомономера А с получением линейного сополимера циклодекстрина, содержащего повторяющееся элементарное звено формулы Ia, Ib или их сочетание, которые описаны выше. В предпочтительном воплощении способа получения линейного сополимера циклодекстрина данного изобретения йодирование предшественника циклодекстринового мономера, как описано выше, проводится с получением дийодированного предшественника циклодекстринового мономера формулы IVa, IVb, IVc или их смеси:

Дийодированный циклодекстрин может быть получен любыми известными методами. (Tabushi et al., J. Am. Chem. 106, 5267-5270 (1984); Tabushi et al., J. Am. Chem. 106, 4580-4584 (1984)). Например, -циклодекстрин может подвергаться взаимодействию с бифенил-4,4'-дисульфонилхлоридом в присутствии безводного пиридина с образованием -циклодекстрина, блокированного бифенил-4,4'-дисульфониилхлоридом, который затем может подвергаться взаимодействию с йодидом калия с получением дийод--циклодекстрина. Предшественник циклодекстринового мономера йодируется только в двух положениях. Посредством сополимеризации дийодированного предшественника циклодекстринового мономера с предшественником сомономера А, как описано выше, может быть получен линейный полимер циклодекстрина, содержащий повторяющееся звено формулы Ia, Ib или их сочетания, что также описано выше. Если это приемлемо, то йод или йодные группы могут замещаться другими известными уходящими группами.

Кроме того, согласно изобретению йодные группы или другая подходящая уходящая группа могут(жет) замещаться группой, которая позволяет взаимодействовать с предшественником сомономера А, как описано выше. Например, предшественник дийодированного циклодекстринового мономера формулы IVa, IVb, IVc или их смесь может подвергаться реакции аминирования с образованием предшественника диаминированного циклодекстринового мономера формулы Va, Vb, Vc или их смеси:

Предшественник диаминированного циклодекстринового мономера может быть получен любым известным способом. (Tabushi et al. Tetrahedron Lett. 18:1527-1530 (1977); Mungall et al., J. Org. Chem. 1659-1662 (1975)). Например, дийод--циклодекстрин может подвергаться взаимодействию с азидом натрия и затем восстанавливаться с образованием диамино--циклодекстрина.

Предшественник циклодекстринового мономера аминируется только в двух положениях. Предшественник диаминированного циклодекстринового мономера может затем подвергаться сополимеризации с предшественником мономера А, как описано выше, для получения линейного сополимера циклодекстрина, содержащего повторяющееся элементарное звено формулы Ia, Ib или их сочетание, что также описано выше. Однако аминофункциональность диаминированного предшественника циклодекстринового мономера необязательно присоединяется непосредственного к циклодекстриновому фрагменту. Альтернативно, аминофункциональность может вводиться посредством замещения атома йода или других подходящих уходящих групп предшественника циклодекстринового мономера фрагментами, содержащими аминогруппу, такими как, например, -SCH ₂ CH₂NH₂, с образованием предшественника диаминированного циклодекстринового мономера формулы Vd, Ve, Vf или их смеси.

Линейный сополимер циклодекстрина данного изобретения также может быть получен восстановлением линейного окисленного сополимера циклодекстрина данного изобретения, как описано ниже. Этот способ может осуществляться, если сомономер А не содержит фрагмента, способного подвергаться восстановлению, или группы, такой как, например, дисульфидный мостик.

Согласно данному изобретению линейный сополимер циклодекстрина по данному изобретению может подвергаться окислению таким образом, чтобы вводить, по меньшей мере, один мономер окисленного циклодекстрина в сополимер так, чтобы мономер окисленного циклодекстрина являлся составной частью главной цепи макромолекулы полимера. Линейный сополимер циклодекстрина, который содержит по меньшей мере один мономер окисленного циклодекстрина, называется линейным сополимером окисленного циклодекстрина. Циклодекстриновый мономер может быть окислен либо на стороне вторичных гидроксильных групп либо на стороне первичных гидроксильных групп циклодекстринового фрагмента.

Если в линейном сополимере окисленного циклодекстрина изобретения присутствует несколько мономеров окисленного циклодекстрина, то могут присутствовать одинаковые или разные мономеры циклодекстрина, окисленные на стороне первичных гидроксильных групп или вторичных гидроксильных групп, либо на обеих сторонах. Например, линейный сополимер окисленного циклодекстрина с окисленными вторичными гидроксильными группами содержит, например, по меньшей мере одно элементарное звено формулы VIa или VIb:

В формулах VIa и VIb С представляет собой замещенный или незамещенный мономер окисленного циклодекстрина, и А представляет собой сомономер, соединенный, например, ковалентой связью с окисленным циклодекстрином С. Кроме того, в формулах VIa и VIb окисление вторичных гидроксильных групп приводит к раскрытию кольца циклодекстринового фрагмента и образованию альдегидных групп.

Линейный сополимер окисленного циклодекстрина может быть получен окислением линейного сополимера циклодекстрина, как описано выше. Окисление линейного сополимера циклодекстрина может проводиться с помощью известных методов окисления. (Hisamatsu et al., Starch 44:188-191 (1992)). Предпочтительно используется такой окислитель, как, например, периодат натрия. Квалифицированному специалисту понятно, что в стандартных условиях окисления степень окисления из расчета на полимер может изменяться или может быть изменена. Таким образом, в одном воплощении изобретения линейный окисленный сополимер данного изобретения может содержать один мономер окисленного циклодекстрина. В другом воплощении по существу все или все циклодекстриновые мономеры сополимера будут окисленными.

Другой способ получения линейного сополимера окисленного циклодекстрина изобретения включает окисление исходного дийодированного или диаминированного мономера циклодекстрина, как описано выше, с образованием исходного окисленного дийодированного или диаминированного циклодекстринового мономера и сополимеризацию предшественника окисленного дийодированного или диаминированного циклодекстринового мономера с предшественником сомономера А. В предпочтительном воплощении предшественник окисленного дийодированного циклодекстринового мономера формулы VIIa, VIIb, VIIc или их смесь:

может быть получен(а) окислением предшественника дийодированного циклодекстринового мономера формул IVa, IVb, IVc или их смеси, как описано выше. В другом предпочтительном воплощении предшественник окисленного диаминированного циклодекстринового мономера формул VIIIa, VIIIb, VIIIc или их смесь:

может быть получен(а) аминированием предшественника окисленного дийодированного циклодекстринового мономера формул VIIa, VI Ib, VIIc или их смеси, как описано выше. В еще одном предпочтительном воплощении предшественник окисленного диаминированного циклодекстринового мономера формул IXa, IXb, IXc или их смесь:

может быть получен(а) замещением йода или других подходящих уходящих групп предшественника окисленного циклодекстринового мономера, дизамещенного йодом или другой подходящей уходящей группой, фрагментом, содержащим аминогруппу, например -SCH ₂CH₂NH₂.

Альтернативно, предшественник окисленного дийодированного или диаминированного циклодекстринового мономера, как описано выше, может быть получен окислением предшественника циклодекстринового мономера с образованием предшественника окисленного циклодекстринового мономера и последующим дийодированием и/или диаминированием окисленного циклодекстринового мономера, как описано выше. Как описано выше, циклодекстриновый фрагмент может быть модифицирован другими уходящими группами, отличными от группы йода, и другими функциональностями, содержащими аминогруппу. Предшественник окисленного дийодированного или диаминированного циклодекстринового мономера может затем подвергаться сополимеризации с предшественником сомономера А, как описано выше, с образованием линейного сополимера окисленного циклодекстрина данного изобретения.

Линейный сополимер окисленного циклодекстрина может также подвергаться дополнительной модификации посредством присоединения к сополимеру по меньшей мере одного лиганда. Лиганд описан выше.

В предпочтительном воплощении изобретения линейный сополимер циклодекстрина или линейный сополимер окисленного циклодекстрина содержит на конце по меньшей мере один предшественник сомономера А или гидролизованный продукт предшественника сомономера А, которые описаны выше. В результате того, что сополимер циклодекстрина заканчивается по меньшей мере одним предшественником сополимера А, по меньшей мере одна свободная функциональная группа, как описано выше, находится на линейном сополимере циклодекстрина или на линейном сополимере окисленного циклодекстрина. Например, функциональная группа может быть кислотной группой или группой, которая может подвергаться гидролизу с получением кислотной группы. Согласно данному изобретению функциональная группа может подвергаться дополнительной химической модификации, если это необходимо, для улучшения свойств циклодекстринового сополимера, таких как, например, коллоидная стабильность или эффективность трансфекции. Например, функциональная группа может модифицироваться посредством взаимодействия с PEG с образованием сополимера циклодекстрина с концевой PEG группой для повышения коллоидной стабильности или с гистидином для получения сополимера циклодекстрина с концевой группой имидазола для повышения внутриклеточной эффективности и эффективности трансфекции.

Дополнительная химическая модификация сополимера циклодекстрина может осуществляться с использованием модифицированной функциональной группы. Например, модифицированная функциональная группа может использоваться для наращивания полимерной цепи посредством присоединения линейного сополимера циклодекстрина или линейного сополимера окисленного циклодекстрина, как описано в изобретении, к такому же или другому сополимеру циклодекстрина или к нециклодекстриновому полимеру. В предпочтительном воплощении изобретения полимер, к которому должно осуществляться присоединение, является таким же или другим линейным сополимером циклодекстрина или линейным сополимером окисленного циклодекстрина, который также может содержать на конце по меньшей мере один предшественник сомономера А для дальнейшей модификации, как описано выше.

Альтернативно, по меньшей мере два одинаковых или разных линейных сополимера циклодекстрина или линейных окисленных сополимера циклодекстрина, содержащих на конце функциональную группу или модифицированную функциональную группу, как описано выше, могут взаимодействовать и соединяться вместе через функциональную или модифицированную функциональную группу. Предпочтительно в процессе взаимодействия функциональных или модифицированных функциональных групп образуется фрагмент, который способен разлагаться, такой как, например, дисульфидный мостик. Например, модификация концевой функциональной группы с цистеином может применяться для получения линейного сополимера циклодекстрина или линейного сополимера окисленного циклодекстрина, содержащего по меньшей мере одну свободную тиольную группу. Взаимодействие с таким же или другим сополимером циклодекстрина, тоже содержащим по меньшей мере одну свободную тиольную группу, будет приводить к образованию дисульфидного мостика между двумя сополимерами. В предпочтительном воплощении изобретения функциональные или модифицированные функциональные группы могут подбираться для получения мостиков, проявляющих различные скорости разложения (например, ферментативного разложения), и таким образом обеспечивать при необходимости систему с длительным временем высвобождения терапевтического средства. Образующийся полимер может подвергаться сшивке, как описано в данном изобретении. Терапевтическое средство, которое описано в данном изобретении, может добавляться перед сшивкой или после сшивки полимера. Лиганд, который описан выше, также может присоединяться через модифицированную функциональную группу.

Согласно изобретению линейный сополимер циклодекстрина или линейный сополимер окисленного циклодекстрина может быть сшит с подложкой или привит на подложку. Подложкой может служить любая известная в данной области подложка. В другом предпочтительном воплощении изобретения линейный сополимер циклодекстрина или линейный сополимер окисленного циклодекстрина может подвергаться сшивке с полимером для образования соответственно сшитого сополимера циклодекстрина или сшитого сополимера окисленного циклодекстрина. Полимер может представлять собой любой полимер, способный сшиваться с линейным сополимером циклодекстрина или линейным сополимером окисленного циклодекстрина данного изобретения (например, полиэтиленгликоль (PEG), полиэтилен). Полимер может также быть таким же или другим линейный сополимером циклодекстрина или линейным сополимером окисленного декстрина. Таким образом, например, линейный сополимер циклодекстрина может подвергаться сшиванию с любым полимером, включая, но без ограничения, сам этот сополимер, другой линейный сополимер циклодекстрина и линейный сополимер окисленного циклодекстрина. Сшитый линейный сополимер циклодекстрина данного изобретения может быть получен взаимодействием линейного сополимера циклодекстрина с полимером в присутствии сшивающего агента. Сшитый линейный сополимер окисленного циклодекстрина данного изобретения может быть получен взаимодействием линейного сополимера окисленного циклодекстрина с полимером в присутствии подходящего сшивающего агента. Сшивающий агент может представлять собой любой сшивающий агент, известный в данной области техники. Примеры сшивающих агентов включают дигидразиды и дисульфиды. В предпочтительном воплощении сшивающий агент представляет собой подвижную группу, таким образом, чтобы сшитый сополимер мог быть превращен в несшитый, если это необходимо.

Линейный сополимер циклодекстрина или линейный сополимер окисленного циклодекстрина данного изобретения может характеризоваться любыми известными в данной области способами. Такие способы или методы характеристики включают, но без ограничения, гельпроникающую хроматографию (ГПХ), матричную вспомогательную лазерную десорбционную ионизационную - времяпролетную масс-спектрометрию (MALDI-TOF Mass spec), ¹H и ¹³С ЯМР, рассеяние света и титрование.

Изобретение также относится к композиции циклодекстрина, содержащей по меньшей мере один линейный сополимер циклодекстрина и по меньшей мере один линейный сополимер окисленного циклодекстрина данного изобретения, как описано выше. Соответственно, либо один из линейного сополимера циклодекстрина и линейного сополимера окисленного циклодекстрина, либо оба эти сополимера могут быть сшиты с другим полимером и/или соединены с лигандом, как описано выше. Терапевтические композиции согласно данному изобретению содержат терапевтическое средство и линейный сополимер циклодекстрина или линейный сополимер окисленного циклодекстрина, включая сшитые сополимеры, данного изобретения. Линейный сополимер циклодекстрина, линейный сополимер окисленного циклодекстрина и их производные описаны выше. Терапевтическое средство может представлять собой любое синтетическое или природное биологически активное терапевтическое средство, включая известные терапевтические средства. Примеры подходящих терапевтических средств включают, но без ограничения, антибиотики, стероиды, полинуклеотиды (например, геномные ДНК, кДНК, мРНК и антисмысловые олигонуклеотиды), плазмиды, пептиды, пептидные фрагменты, небольшие молекулы (например, доксорубицин) и другие биологически активные макромолекулы, такие как, например, белки и ферменты.

Терапевтическая композиция изобретения может быть получена с помощью известных способов. В предпочтительном воплощении сополимер изобретения смешивается с терапевтическим средством, которое описано выше, для самопроизвольной агрегации. Согласно изобретению терапевтическое средство и линейный сополимер циклодекстрина или линейный сополимер окисленного циклодекстрина ассоциируют друг с другом таким образом, что сополимер действует как носитель доставки терапевтического средства. Терапевтическое средство и сополимер циклодекстрина могут ассоциировать посредством известных квалифицированному специалисту причин, например посредством электростатического взаимодействия и гидрофобного взаимодействия. Степень ассоциации может быть определена известными способами, включая, например, исследование флуоресценции, изучение подвижности ДНК, рассеяние света, электронная микроскопия, и будет изменяться в зависимости от терапевтического средства.

Например, терапевтическая композиция данного изобретения, содержащая сополимер данного изобретения и ДНК, может использоваться в качестве способа доставки для способствования трансфекции, то есть введения ДНК в клетку живого организма (например, человека). (Boussif, О. Proceedings of the National Academy of Sciences, 92:7297-7301 (1995); Zanta et al. Bloconjugate Chemistry, 8:839-844 (1997)).

Терапевтическая композиция изобретения может представлять собой, например, твердое вещество, жидкость, суспензию или эмульсию. Предпочтительно терапевтическая композиция данного изобретения является препаратом, который может вводиться внутривенно. Другие способы введения терапевтической композиции данного изобретения включают в зависимости от физического состояния терапевтической композиции известные способы, такие как, но без ограничения, пероральное введение, местное применение, парентеральную, внутривенную, интраназальную, внутриглазную, интракраниальную или интраперионеальную инъекции.

В зависимости от типа используемого терапевтического средства терапевтическая композиция данного изобретения может использоваться в различных терапевтических методах (например, в ДНК вакцинах, антибиотиках, антивирусных средствах) для лечения наследственных или приобретенных расстройств, таких как, например муковисцидоз, болезнь Гоше, мышечная дистрофия, СПИД, раковые заболевания (например, множественная миелома, лейкоз, меланома и овариальная карцинома), сердечно-сосудистые расстройства (например, прогрессирующая сердечная недостаточность, рестеноз и гемофилия) и неврологические расстройства (например, мозговая травма). Согласно данному изобретению способ лечения включает введение терапевтически эффективного количества терапевтической композиции данного изобретения. Для специалиста ясно, что терапевтически эффективное количество будет определяться для каждого случая. Факторы, которые следует учитывать, включают, но без ограничения, заболевание, которое подлежит лечению, и физические характеристики пациента, страдающего данным заболеванием.

Другое воплощение изобретения представляет собой композицию, содержащую по меньшей мере одно биологически активное соединение сельскохозяйственного применения, и линейный сополимер циклодекстрина или линейный сополимер окисленного циклодекстрина данного изобретения. Например, подходящие сельскохозяйственные биологически активные соединения включают, но без ограничения, фунгициды, гербициды, инсектициды и средства для борьбы с болезнями растений.

Приведенные далее примеры даны для иллюстрации изобретения. Однако следует представлять, что изобретение не ограничивается конкретными условиями или некоторыми деталями, описанными в этих примерах.

ПРИМЕРЫ

Материалы: -циклодекстрин (Cerestar USA, Inc. of Hammond, IN) сушат в вакууме (<0,1 mTorr) при 120°С перед применением. Дифенил-4,4'-дисульфонилхлорид (Aldrich Chemical Comраnу, Inc. of Milwaukee, WI) перекристаллизовывают из смеси хлороформ/гексаны. Йодид калия растирают в порошок с помощью ступки и пестика и сушат в печи при 200°С. Все другие реагенты получают из коммерческих источников и используют без дополнительной очистки. Образцы полимеров анализируют методом ВЭЖХ в системе Hitachi HPLC, снабженной детектором Anspec RI и колонкой Progel-TSK G3000_pwxL, с использованием в качестве элюента воды с объемной скоростью истечения 1,0 мл/мин ^-1.

Пример 1: -Циклодекстрин, блокированный в положениях А и D бифенил-4,4'-дисульфонилом, 1 (Tabushi et al. J. Am. Chem. Soc. 106, 5267-5270 (1984))

В круглодонную колбу объемом 500 мл, снабженную магнитной мешалкой, адаптером Шленка и мембраной, загружают 7,92 г (6,98 ммоль) сухого -циклодекстрина и 250 мл безводного пиридина (Aldrich Chemical Company, Inc). Полученный раствор перемешивают при 50°С под атмосферой азота, в процессе чего добавляют 2,204 г (6,28 ммоль) бифенил-4,4'-дисульфонилхлорида в виде четырех равных порций с интервалами 15 минут. После перемешивания при 50°С в течение дополнительных 3 часов растворитель удаляют в вакууме и остаток подвергают очистке колоночной хроматографией с обращенной фазой, используя градиентное элюирование (0-40% ацетонитрил в воде). Фракции анализируют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) и соответствующие фракции соединяют. После удаления ацетонитрила на роторном испарителе полученную водную суспензию лиофилизируют досуха. В результате получают 3,39 г (38%) 1 в виде бесцветного твердого вещества.

Пример 2: 6^A, 6^D-Дийод-6^A,6^D -деокси--циклодекстрин, 2 (Tabushi et al. J. Am. Chem. Soc. 106, 4580-4584 (1984))

В пробирку для центрифугирования объемом 40 мл, снабженную магнитной мешалкой, адаптером Шленка и мембраной, загружают 1,02 г (7,2 ммоль) 1, 3,54 г (21,3 ммоль) сухого порошкообразного йодида калия (Aldrich) и 15 мл безводного N,N-диметилформамида (DMF) (Aldrich). Полученную суспензию перемешивают при 80°С под атмосферой азота в течение 2 часов. После охлаждения до комнатной температуры твердые вещества выделяют центрифугированием, а супернатант декантируют. Твердый осадок промывают второй порцией DMF и супернатанты соединяют и концентрируют в вакууме. После этого остаток растворяют в 14 мл воды, охлаждают на ледяной бане и затем добавляют с интенсивным перемешиванием 0,75 мл (7,3 ммоль) тетрахлорэтилена (Aldrich). Осадок, содержащий комплекс, фильтруют на стеклянной фрите среды, промывают небольшим количеством ацетона и сушат в вакууме над P₂O₅ в течение 14 часов. В результате получают 0,90 г (92%) 2 в виде твердого белого вещества.

Пример 3: 6^A, 6^D-Диазо-6^A,6^D -деоси--циклодекстрин, 3 (Tabushi et al. Tetrahedron Lett. 18, 1527-1530 (1977))

В круглодонную колбу объемом 100 мл, снабженную магнитной мешалкой, адаптером Шленка и мембраной, загружают 1,704 г (1,25 ммоль) -циклодекстрина дийодида, 0,49 г (7,53 ммоль) азида натрия (ЕМ Science of Gibbstown, NJ) и 10 мл безводного N,N-диметилформамида (DMF). Полученную суспензию перемешивают при 60°С под атмосферой азота в течение 14 часов. После этого растворитель удаляют в вакууме. Полученный остаток растворяют в достаточном количестве воды для получения 0,2 М раствора соли и затем пропускают через 11,3 г смолы Biorad AG501-X8(D) для удаления остаточных солей. После этого элюат лиофилизируют досуха, в результате получают 1,232 г (83%) 3 в виде твердого белого аморфного вещества, которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

Пример 4: 6^A,6^D-Диамино-6^A,6^D -деокси--циклодекстрин, 4 (Mungall et al., J. Org. Chem. 1659-1662 (1975))

В круглодонную колбу объемом 250 мл, снабженную магнитной мешалкой и мембраной, загружают 1,232 г (1,04 ммоль) -циклодекстрина бис-азида и 50 мл безводного пиридина (Aldrich). К этой суспензии при перемешивании добавляют 0,898 г (3,42 ммоль) трифенилфосфина. Полученную суспензию перемешивают в течение часа при комнатной температуре и затем добавляют 10 мл концентрированного водного аммиака. Добавление аммиака сопровождается быстрым выделением газа, и раствор становится гомогенным. Спустя 14 часов растворитель удаляют в вакууме и остаток растирают в порошок с 50 мл воды. Твердые вещества отфильтровывают, фильтрат подкисляют (рН<4) 10% НСl и затем полученный раствор загружают в ионообменную колонку, содержащую смолу Toyopearl SP-650M (NH⁺₄ форма). Продукт 4 элюируют бикарбонатом аммония (элюент с градиентом 0-0,5 М бикарбонат аммония). Подходящие фракции соединяют и лиофилизируют, в результате получают 0,832 г (71%) продукта 4 в виде бис(гидрокарбонатной) соли.

Пример 5: сополимер b-циклодекстрина и DSP, 5

В сцинтилляционную пробирку объемом 20 мл загружают раствор 92,6 мг (7,65×10^-5 моль) бис(гидрокарбонатной) соли 4 в 1 мл воды. Значение рН раствора доводят до 10 с помощью 1М раствора NaOH и затем добавляют раствор 30,9 мг (7,65×10 ^-5 моль) дитиобис(сукцинимидила пропионата) (DSP, Pierce Chemical Со. of Rockford, IL) в 1 мл хлороформа. Полученную двухфазную смесь перемешивают мешалкой Вортекса (Vortex mixer) в течение 0,5 часа. После этого водный слой декантируют и экстрагируют свежеперегнанным хлороформом. Затем водный раствор полимера анализируют с помощью гельпроникающей хроматографии (ГПХ) на смоле Toypearl HW-40F, используя в качестве элюента воду. Фракции анализируют ГПХ и соответствующие фракции лиофилизируют, в результате получают 85 мг (85%) продукта в виде бесцветного аморфного порошка.

Пример 6: сополимер -циклодекстрина и DSS, 6

Сополимер -циклодекстрина и DSS 6 синтезируют способом, аналогичным получению сополимера -циклодекстрина и DSP 5, с тем отличием, что DSP заменяют дисукцинимидилсубератом (DSS, Pierce Chemical Co. of Rockford, IL). Соединение 6 получают с 67% выходом.

Пример 7: сополимер -циклодекстрина и DTBP, 7

В сцинтилляционную колбу объемом 20 мл загружают раствор 91,2 мг (7,26×10^-5 моль) бис(гидрокарбонатной) соли 4 в 1 мл воды. Значение рН раствора доводят до 10 с помощью 1 М раствора NaOH и добавляют 22,4 мг (7,26×10^-5 моль) диметил-3,3'-дитиобис(пропионимидат) 2НС1 (DTBP, Prierce Chemical Co. Of Rockford, IL). Полученный гомогенный раствор перемешивают мешалкой Вортекса в течение 0,5 часов. Водный раствор полимера хроматографируют гельпроникающей хроматографией (ГПХ) на смоле Toypearl HW-40F, используя в качестве элюента воду. Фракции анализируют ГПХ и соответствующие фракции лиофилизируют, в результате получают 67 мг (67%) продукта в виде бесцветного аморфного порошка.

Пример 8: Сополимер b-циклодекстрина и цистамина, 8

К раствору 166,2 мг (7,38×10^-5 моль) цистамина дигидрохлорида (Aldrich) в 15 мл 0,1 н раствора NaOH добавляют 100 мг (7,26×10^-5 моль) 2 и 5 мл ацетонитрила. Полученный гомогенный раствор нагревают до 80°С, выдерживают при этой температуре в течение 2 часов и хроматографируют с использованием гельпроникающей хроматографии (ГПХ) на смоле Toyopearl HW-40F (элюент: вода). Фракции анализируют ГПХ и соответствующие фракции лиофилизируют, в результате получают 17,2 мг (19%) продукта в виде бесцветного аморфного порошка.

Пример 9: Полиэтиленгликоль 6000 дигидразид, 9

В круглодонную колбу объемом 100, снабженную магнитной мешалкой и обратным холодильником, загружают 1,82 г (3,0 ммоль) полиэтиленгликоля 600 (Fluka Chemical Corp. of Milwaukee, WI), 40 мл абсолютного этанола (Quantum Chemicals Pty Ltd of Tuscola, IL) и несколько капель серной кислоты. Полученный раствор кипятят с обратным холодильником в течение 14 часов. Твердый карбонат натрия добавляют для прекращения реакции и под атмосферой азота в капельную воронку переносят раствор сложного диэфира PEG. Этот раствор по каплям добавляют к раствору 0,6 мл (9,0 ммоль) гидразингидрата (Aldrich) в 10 мл абсолютного этанола. Образуется небольшое количество мутного осадка. Полученный раствор кипятят с обратным холодильником в течение 1 часа, фильтруют и концентрируют. ГПХ выявляет в продукте загрязняющие его примеси с более высокой молекулярной массой. Гельпроникающая хроматография на смоле Toyopearl HW-40F позволяет частично очистить продукт с получением целевого соединения с чистотой 85%.

Пример 10: Окисление сополимера -циклодекстрина и DSS, 10 (Husamatsu et al., Starch 44, 188-191 (1992))

Сополимер -циклодекстрина и DSS 6 (92,8 мг, 7,3×10^-5 моль) растворяют в 1,0 мл воды, охлаждают на ледяной бане и добавляют 14,8 мг (7,38×10 ^-5 моль) периодата натрия. Раствор сразу же приобретает ярко-желтое окрашивание, и его перемешивают в темноте при 0°С в течение 14 часов. Затем раствор хроматографируют с использованием гельпроникающей хроматографии (ГПХ) на смоле Toyopearl HW-40F (элюент: вода). Фракции анализируют ГПХ. Соответствующие фракции соединяют и лиофилизируют досуха, в результате получают 84,2 мг (91%) продукта в виде ярко-желтого аморфного порошка.

Пример 11: Полиэтиленгликоль (PEG) 600 хлорид дикислоты, 11

В круглодонную колбу объемом 50 мл, снабженную магнитной мешалкой и обратным холодильником, загружают 5,07 г (са. 8,4 ммоль) полиэтиленгликоля 600 дикислоты (Fluka Chemical Corp. of Milwaukee, WI) и 10 мл безводного хлороформа (Aldrich). К этому раствору при перемешивании добавляют 3,9 мл (53,4 ммоль) тионилхлорида (Aldrich) и полученный раствор кипятят с обратным холодильником в течение 1 часа, в процессе чего наблюдают выделение газа. Полученному раствору дают охладиться до комнатной температуры и растворитель и избыток тионилхлорида удаляют в вакууме. Полученное масло хранят в сухом боксе и используют без очистки.

Пример 12: сополимер -циклодекстрина и PEG 600, 12

В сцинтилляционную пробирку объемом 20 мл загружают раствор 112,5 мг (8,95×10^-5 моль) бис(гидрокарбонатной) соли 6^A,6^D-диамино-6^A,6 ^D-деокси--циклодекстрина, 50 мкл (3,6×10^-4 моль) триэтиламина (Aldrich) и 5 мл безводного N,N-диметилацетамида (DMAc, Aldrich). Полученную суспензию обрабатывают 58 мг (9,1×10^-5 моль) полиэтиленгликоля 600, дихлорангидрида, 11. Полученный раствор перемешивают мешалкой Вортекса в течение 5 минут и затем оставляют при 25°С на 1 час, в процессе чего раствор становится гомогенным. Растворитель удаляют в вакууме и остаток хроматографируют гельпроникающей хроматографией на смоле Toyopearl HW-40F (элюент: вода). Фракции анализируют ГПХ и соответствующие фракции лиофилизируют досуха, в результате получают 115 мг (75%) продукта в виде бесцветного аморфного порошка.

Пример 13: сополимер -циклодекстрина и DSP, 13

В пробирку объемом 8 мл загружают раствор 102,3 мг (8,80×10 ^-5 моль) 2^A,2^A-диaминo-2 ^A,3^A-деокси--циклодекстрина в 1 мл воды. Значение рН раствора доводят до 10 с помощью 1М раствора NaOH и добавляют раствор 36,4 мг (8,80×10^-5 моль) дитиобис(сукцинимидила пропионата) (DSP, Pierce Chemical Co. of Rockford, II) в 1 мл хлороформа. Полученную двухфазную смесь перемешивают мешалкой Вортекса в течение 0,5 часа. Водный слой декантируют и экстрагируют свежеперегнанным хлороформом (3×1 мл). Водный раствор полимера хроматографируют с использованием гель-проникающей хроматографии.

Пример 14: 6^A ,6^D-Бис-(2-аминоэтилтио)-6^A,6^D -деокси--циклодекстрин, 14 (Tabushi, I: Shimokawa, K; Fugita, К. Tetrahedron Lett. 1977, 1527-1530)

В колбу Шленка объемом 25 мл, снабженную магнитной мешалкой и мембраной, загружают 0,91 мл (7,37 ммоль) 0,81 М раствора 2-аминоэтилтиолата натрия в этаноле. (Fieser, L.F.; Fieser M. Reagents for Organic Synthesis, Wiley: New York, 1967; Vol. 3, pp. 265-266). Раствор выпаривают досуха и твердый остаток повторно растворяют в 5 мл безводного DMF (Аldrich). Добавляют 6^A,6^D -дийод-6^A,6^D-деокси--циклодекстрин (100 мг, 7,38×10^-5 моль) и полученную суспензию перемешивают при 60°С под атмосферой азота в течение 2 часов. После охлаждения до комнатной температуры раствор концентрируют в вакууме и остаток повторно растворяют в воде. После подкисления 0,1 н раствором НСl раствор переносят в колонку с ионно-обменной смолой Toyopearl SP-650M (NH⁺₄ форма) и элюируют (раствор бикарбоната натрия, элюент с градиентом 0-0,4 М). Соответствующие фракции соединяют и лиофилизируют досуха. В результате получают 80 мг (79%) 14 в виде белого порошка.

Пример 15: сополимер -циклодекстрин(цистамина) и DTBP, 15

В пробирку объемом 4 мл загружают раствор 19,67 мг (1,42·10 ^-5 моль) бис(гидрокарбонатной) соли 14 в 0,1 М растворе NaHCO₃. Раствор охлаждают на ледяной бане и добавляют 4,4 мг (1,4·10^-5 моль) диметил-3,3'-дитиобиспропионимидата-2НСl (DTBP, Pierce). Полученный раствор перемешивают мешалкой Вортекса и оставляют на 1 час при 0°С. Реакцию гасят 1М раствором Tris-HCl, подкисляют до рН 4 с помощью 0,1 н НСl. Водный раствор полимера подвергают гельпроникающей хроматографии на смоле Toyopearl HW-40F. Фракции анализируют ГПХ и подходящие фракции лиофилизируют досуха. В результате получают 21,3 мг (100%) 15 в виде белого порошка.

Пример 16: сополимер -циклодекстрин (цистамина) и DSM, 16

В колбу Шленка объемом 10 мл, снабженную магнитной мешалкой и мембраной, загружают 200 мг (1,60×10^-4 моль) 14,44 мкл (3,2 мл ×10^-4 моль) триэтиламина (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI), 43,6 мг (1,60×10^-4 ) диметилсуберимидата-2НСl (DMS, Pierse) и 3 мл безводного DMF (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI). Полученную суспензию нагревают до 80°С и выдерживают при этой температуре 18 часов под стационарным потоком азота, в процессе чего большая часть растворителя испаряется. Полученный остаток повторно растворяют в 10 мл воды и полученный раствор подкисляют 10% НСl до рН 4. Затем полученный раствор пропускают через центробежный фильтр Amicon Centricon Plus-20 5000 NMWL. После промывки водой (2×10 мл) раствор полимера лиофилизируют досуха, в результате получают 41,4 мг (18%) продукта в виде твердого аморфного вещества желтоватого цвета.

Пример 17: Присоединение фолиатного лиганда к циклодекстриновому полимеру 1. Присоединение смолы:

50 мг FMOC-PEG₃₄₀₀ -NHS (Shearwater Polymers, Inc. of Huntsville, AL) растворяют в 1 мл безводного N,N-диметилформамида (DMF) и добавляют к 10 эквивалентам гидразид-2-хлортритильной смолы (Novobiochem USA of La Jolla, CA), набухшей в DMF. Смесь перемешивают при 60°С до тех пор, пока весь полимер не присоединится к смоле, что определяют системой ГПХ, снабженной ультрафиолетовым детектором. Соединение состава смола-полимер затем переносят в колонку агломерированного стекла (sintered glass column) для дальнейшего взаимодействия.

2. Блокирование функциональных групп смолы:

Непрореагировавшие гидразидные группы на смолах блокируют уксусным ангидридом и продукты - производные уксусной кислоты нейтрализуют диизопропиленэтиламином.

3. Удаление защитной группы:

Защитную FMOC группу удаляют двумя промывками 20% раствором пиперидина в DMF (общий объем 1 мл). Затем смолу 10 раз промывают DMF (каждый раз 1 мл) и 5 раз H₂O (каждый раз 1 мл).

4. Блокирование функциональных групп фолиевой кислотой:

10 эквивалентов фолиевой кислоты и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид (EDC) добавляют к смоле вместе с 1,5 мл Н₂О. В реакционную смесь добавляют 1 н. раствор NaOH до тех пор, пока фолиевая кислота не растворится (приблизительно рН 10). Затем стеклянную колонку помещают на ротатор и перемешивание продолжают в течение ночи. Смолу промывают 10×1 мл NaOH (1 н.), 10×1 мл 50 мМ бикарбоната натрия и затем по 5 раз водой, THF и дихлорметаном.

5. Выделение из смолы:

1% трифторуксусную кислоту (TFA) в 1 мл DCM добавляют дважды к смоле каждый раз в течение минуты. Супернатант собирают и DCM выпаривают. Полученную маслянистую пленку повторно гидрируют в Н₂О и лиофилизируют, в результате получают светло-желтый порошок. Анализ методом ЯМР подтверждает присутствие PEG полимера.

6. Связывание с полимером:

Соединение состава связующий агент - фолиевая кислота взаимодействует с 6 эквивалентами циклодекстринового сополимера (окисленный как в примере 10) посредством смешения в 50 ммолях бората (рН 8,5). Реакционную смесь анализируют, и наличие сопряженного полимера подтверждается ГПХ системой с ультрафиолетовым детектором при 285 нм. (См. схему 1 в конце описания).

Пример 18: присоединение фолиат-лиганда к циклодекстриновому полимеру

1. Связывание:

36 мг трет-бутилкарбазата растворяют в 240 мкл смеси DCM/этилацетат (1:1), добавляют к 260 мг FMOC-PEG₃₄₀₀-NHS (Shearwater Polymer) и перемешивают при комнатной температуре в течение 2 часов. Продукт высаживают дважды из смеси этилацетат/простой эфир (1:1).

2. Удаление защитной группы:

FMOC защитную группу удаляют с помощью 20% пиперидина в DMF. Растворитель удаляют в вакууме и продукт повторно растворяют в 1,3 мл DMSO.

3. Блокирование функциональных групп фолиевой кислотой:

К 1,2 эквивалента фолиевой кислоты и DCC добавляют одну каплю пиридина и полученный раствор перемешивают в темноте при комнатной температуре в течение 6 часов. DMSO удаляют в вакууме и наличие сопряжения фолиевой кислоты подтверждается ГПХ с УФ мониторингом при 285 нм.

4. Удаление защитной группы гидразида:

Наконец, гидразидную группу удаляют посредством перемешивания в 4М НСl в диоксане в течение часа с последующим удалением растворителя в вакууме. Конечный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии Toyopearl HW-40F.

5. Связывание с полимером:

Соединение состава фолиевая кислота - связывающий агент взаимодействует с 6 эквивалентами сополимера циклодекстрина (окислен, как в примере 10) посредством смешения в 50 ммолях бората (рН 8,5). Реакционную смесь анализируют и наличие сопряженного полимера подтверждают с помощью ГПХ системы с ультрафиолетовым детектором при 285 нм. (См. схему 2 в конце описания).

Пример 19: присоединение трансферринового лиганда к циклодекстриновому полимеру

1. Окисление трансферрина

50 мг трансферрина человека, не содержащего железа (Sigma of St. Louis, МО), растворяют в 30 мМ ацетатно-натриевого буфера и охлаждают до 0°С. К этому раствору добавляют 20 мг периодата натрия, растворенного в 4 мкл 30 мМ раствора ацетата натрия. Смесь перемешивают при 0°С в течение ночи. Затем добавляют 1 г смолы AG501-X8 (Biorad) для удаление солей и раствор лиофилизируют.

2. Связывание со смолой:

20 мг FMOC-PEG₃₄₀₀-NHS (Snearwater Polymers, Inc. of Huntsville, AL) растворяют в 0,5 мл безводного N,N-диметилформамида (DMF) и добавляют к 10 эквивалентам гидразид 2-хлортритильной смолы (Novabiochem USA of La Jolla, CA), набухшей в DMF. Смесь перемешивают при 60°С до тех пор, пока весь полимер не будет связан со смолой, что определяют с помощью ГПХ системы, снабженной ультрафиолетовым детектором. Соединение состава смола-полимер переносят в колонку агломерированного стекла для всех дополнительных реакций.

3. Блокирование функциональных групп смолы:

Непрореагировавшие гидразидные группы на смолах блокируют уксусным ангидридом и продукты - производные уксусной кислоты нейтрализуют диизопропилэтиламином.

4. Удаление защитной группы:

FMOC защитную группу удаляют посредством двухкратной промывки 20% пиперидином в DMF (общий объем 1 мл). Смолу затем промывают 10 раз (каждый раз 1 мл) DMF и пять раз (каждый раз по 1 мл) H₂O.

5. Связывание с трансферрином:

К смоле добавляют 1,2 эквивалента трансферрина, растворенного в 0,05 М растворе карбоната натрия и 0,1 М цитратно-натриевого буфера, рН 9,5. Затем к раствору добавляют 5 М цианоборагидрида в 1 н. растворе NaOH. Стеклянную колонку помещают на ротатор и перемешивают в течение 2 часов. Затем смолу промывают 15 раз водой и 5 раз - каждый раз тетрагидрофураном (THF) и DCM.

6. Выделение из смолы:

1% трифторуксусную кислоту (TFA) в 1 мл DCM два раза добавляют к смоле, каждый раз в течение минуты. Супернатант собирают и DCM выпаривают. Полученную маслянистую пленку повторно гидрируют в Н₂О и лиофилизируют.

7. Связывание с полимером:

Соединение состава связывающий агент - трансферрин взаимодействует с 6 эквивалентами циклодекстринового сополимера посредством восстановительного аминирования с цианоборгидридом натрия: сначала сополимер добавляют к трансферриновому связующему агенту, растворенному в 0,05 М растворе карбоната натрия и 0,1 М натриево-цитратном буфере. Добавляют 5 М цианоборгидрида в 1 н. растворе NaOH и реакционную смесь перемешивают в течение двух часов при комнатной температуре. Непрореагировавшие альдегидные сайты блокируют добавлением этаноламина и взаимодействием в течение 15 минут при комнатной температуре. Полученный конъюгат очищают диализом. (См. схему 3 в конце описания).

Пример 20: Общая методика получения комплексов циклодекстрина с небольшими молекулами

Сополимер на основе циклодекстрина (CD-полимер) растворяют в воде, буфере или органическом растворителе до соответствующей концентрации. Соединение с небольшими молекулами растворяют в растворителе, смешиваемом с растворителем раствора CD-полимера, и добавляют к раствору CD-полимера. Затем смесь перемешивают в течение ¹/₂ часа и оставляют для достижения равновесного состояния на ночь.

Пример 21: Образование комплекса сополимера циклодекстрина с доксорубицином.

Доксорубицин и CD-полимер растворяют с различными концентрациями в PBS (фосфатно-буферный солевой раствор, рН 7,2). Константу ассоциации между CD и доксорубицином определяют измерением степени повышения флуоресценции доксорубицина в результате коплексообразования с CD. (Гидрофобное взаимодействие CD и доксорубицина повышает интенсивность флуоресценции). Константа ассоциации составляет приблизительно 200 М^-1 при рН 7,1. Добавление -CD заметно повышает флуоресценцию доксорубицина, что является показателем комплексообразования между CD-полимером и доксорубицином. В публикации Husain et al., Applied Spectroscopy Vol. 46, No. 4, 652-658 (1992) показано, что константа ассоциации между -CD и доксорубицином равна 210 М^-1 при рН 7,1.

Пример 22: Доставка небольших молекул к культивируемым клеткам

Для культивируемых линий клеток применяют среду, содержащую доксорубицин и комплексы доксорубицин/CD-полимер при различных концентрациях. Спустя 5 часов среду удаляют и заменяют свежей средой. Влияние доксорубицина на выживание клеток определяют с использованием количественного анализа токсичности МТТ ([3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолий). (R. Ian Feshney, “Culture of animal cells”, 3^rd ed., Wiley-Liss: New York (1994)). Результаты представлены в таблице ниже. Сополимер 15 или 16 (138 мкМ эквивалент CD мономера) не токсичны к KB или KB-VI (производная KB, обладающая множественной лекарственной устойчивостью) линиям клеток в отсутствии доксорубицина. При рецептор-проводимой доставке для комплексообразования с доксорубицином используется лиганд, такой как фолиат, ковалентно присоединенный к CD-полимеру.

Пример 23: получение комплекса сополимера с фиксированным постоянным зарядом и плазмиды

Обычно равные объемы CD-полимера с фиксированным зарядом и ДНК плазмиды смешивают при соответствующих соотношениях зарядов полимер/плазмида. Смеси затем дают достичь состояния равновесия и оставляют на ночь для самопроизвольной агрегации при комнатной температуре. Ход комплексообразования контролируют переносом небольшой аликвоты смеси в 0,6% агарозный гель и проверкой подвижности ДНК. Свободная ДНК перемещается под действием применяемого напряжения, в то время как закомплексованная ДНК замедляется в резервуаре.

1 мкг ДНК с концентрацией 0,2 мкг/мкл в дистиллированной воде смешивают с 10 мкл сополимера 15 при соотношении зарядов полимерный амин : ДНК фосфат, равном 2, 4, 6, 12, 24, 36, 60 и 120. Раствор смешивают вручную с помощью микропипетки и осторожно перемешивают в течение ночи на лабораторном ротаторе. На следующее утро в каждый раствор добавляют 1 мкг/мкл загружающего буфера (40% сахарозы, 0,25% бромфенолового синего, 20 мМ Ttis-ацетатного буфера, содержащего 5 мМ EDTA (Gao et al., Biochemistry 35: 1027-1036 (1996)). Каждый образец загружают на 0,6% агарозный гель для электрофореза, содержащий 6 мкг EtBr/100 мл в 1×ТАЕ буфере (40 мМ Тris-ацетат/1 мМ EDTA) и в течение 1 часа на гель подают напряжение 40 V. Степень комплексообразования ДНК/полимер показывает замедление ДНК в миграционной картине в геле. Полимер (15) замедляет ДНК при соотношении зарядом 6 и выше, что говорит о комплексообразовании в этих условиях.

Пример 24: Образование комплекса сшитого полимера с плазмидой Сополимер 15 или сополимер 16 окисляют, как в примере 10. Окисленный сополимер 15 или 16 затем подвергают комплексообразованию с ДНК плазмидой, как в примерах 23 и 26. Затем добавляют сшивающий агент (например, РЕG₆₀₀-дигидразид) для инкапсулирования ДНК. Осуществление инкапсулирования определяют посредством рассеяния света и с помощью электронного микроскопа.

Пример 25: Комплексообразование сополимера с изменяемым (рН-чувствительным) зарядом с плазмидой

Равные объемы растворов CD-полимера и ДНК плазмиды в воде смешивают при соответствующих соотношениях заряд полимера/заряд плазмиды. Смеси оставляют на 30 минут для достижения состояния равновесия и самопроизвольной агрегации. Затем добавляют сшивающий агент (например, РЕG₆₀₀-дигидразид) для инкапсулирования ДНК. Затем добавляют концентрированный буферный раствор для регулирования рН и таким образом получают нейтральный CD-полимер. Осуществление инкапсулирования определяют посредством рассеяния света и визуально с помощью электронного микроскопа.

Пример 26: Изучение трансфекции с плазмидами, кодирующими Luciferase reporter ген

ВНК-21 клетки помещают в 24-ячеечные планшеты с плотностью 60000 клеток/ячейка за 24 часа перед трансфекцией. Плазмиды, кодирующие лусиферазный ген, инкапсулируют с помощью CD-полимера, как описано в примерах 23 или 25, таким образом, чтобы образовывались комплексы при соотношении зарядов ДНК/полимер, равном 6, 12, 24, 36 и 60, как описано в примере 23 изучения связывания ДНК. Среду, содержащую комплексы ДНК/полимер, добавляют к культивированным клеткам и заменяют свежей средой после 5 часов инкубирования при 37°С. Клетки лизируют спустя 48 часов после трансфекции. Подходящие субстраты для световой оценки лусиферазы добавляют к клеточному лизату. Лусиферазную активность, измеренную с полученными единицами света, подсчитывают с помощью люминометра. Комплексы ДНК/полимер успешно трансфектируют ВНК-21 клетки при соотношениях зарядов, равных 6, 12 и 24. Клеточный лизат также используют для определения жизнеспособности клеток с помощью оценки белка по Лаури. (Lowry et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 193, 265-275 (1951)). Максимальную токсичность наблюдают при соотношениях зарядов полимерный амин : ДНК фосфат, равных 36 и 60 при 91% выживании клеток.

Пример 27: Изучение трансфекции с плазмидами, кодирующими Lusiferase reporter ген

ВНК-21 клетки помещают в 24-ячеечные планшеты с плотностью 60000 клеток/ячейка за 24 часа перед трансфекцией. Плазмиды, кодирующие лусиферазный ген, инкапсулируют с помощью CD-полимера, как описано в примере 23, с тем отличием, что полимер 15 заменяют полимером 16 и что комплексы ДНК/полимер успешно трансфектируют ВНК-21 клетки при соотношениях зарядов 10, 20, 30 и 40 с максимальной трансфекцией при соотношении зарядов полимерный амин : ДНК фосфат, равном 20. Среду, содержащую комплексы ДНК/полимер, добавляют к культивированным клеткам и заменяют свежей средой после 24 часов инкубирования при 37°С. Клетки лизируют через 48 часов после трансфекции. Подходящие субстраты для световой оценки лусиферазы добавляют к клеточному лизату. Лусиферазную активность, измеренную с полученными единицами света, подсчитывают с помощью люминометра. Результаты представлены ниже. Комплексы ДНК/полимер успешно трансфектируют ВНК-21 клетки при соотношениях зарядов, равных 6, 12 и 24. Клеточный лизат также используют для определения жизнеспособности клеток с помощью оценки белка по Лаури. (Lowry et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 193, 265-275 (1951)). Результаты представлены ниже. Максимальную токсичность наблюдают при соотношениях зарядов полимерный амин : ДНК фосфат, равных 40 и 50 при 33% выживании клеток.

Пример 28: Изучение трансфекции с плазмидами, кодирующими GFP reporter ген

Плазмиды, кодирующие зеленый флуоресцентный белок, инкапсулируют с помощью CD-полимера, как описано в примерах 23 или 25. Раствор среды, содержащий комплексы ДНК/полимер, добавляют к культивированным клеткам и заменяют свежей средой после инкубирования при 37°С. Клетки отделяют от поверхности трипсина, промывают и повторно суспендируют в сбалансированном солевом растворе Ханкса (Hanks) с пропидиум йодидом. После этого клетки подвергают анализу посредством сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS). Жизнеспособность клеток определяют по размеру клеток и исключением пропидиума йодида, а успешное осуществление трансфекции - посредством GFP белковой флуоресценции.

Пример 29: Образование комплексов полимера с олиогенами

Комплексообразование с десенсибилизирующим олигогенами проводят в соответствии с методиками для плазмидного комплексообразования примеров 23 и 25.

Пример 30: Изучение трансфекции с олигогенами.

Десенсибилизирующие олигогены, направленные против луциферазного гена, инкапсулируют с помощью CD-полимера, как описано в примере 29. Раствор среды, содержащий комплексы олигоген/полимер, добавляют к HeLa X1/5 клеткам (HeLa клетки, которые устойчиво экспрессируют луциферазный ген, предоставленный CLONTECH) и заменяют свежей средой после инкубирования в течение 5 часов при 37°С. Клетки лизируют спустя 48 часов после трасфекции и добавляют подходящие субстраты для количественного анализа луциферазы. Активность луциферазы, измеренная в виде полученных единиц света, вычисляют с помощью люминометра. Успешное осуществление трансферазы определяют улавливанием (by knockout) активности луциферазы.

Пример 31: Токсичности сополимера -циклодекстрин(цистамина) и DTBP, 15

Активную токсичность сополимера 15 исследуют с использованием Swiss-Webster “белой мыши”. Всего используют 48 мышей, как описано в таблице 2 ниже. Каждую мышь подвергают единственному внутривенному (i.v.) или интраперитонеальному (i.p.) заражению стерильным солевым раствором или раствором сополимера 15. Через пять дней животных умерщвляют и производят полное вскрытие. Смертности и токсичности не наблюдают.

Пример 32: Изучение трансфекции с плазмидами, кодирующими Luciferасе reporter ген

Плазмиды, кодирующие луциферазный ген, инкапсулируют с помощью CD-полимера, как описано в примере 23, с тем отличием, что вместо сополимера 15 используют сополимер 16. Комплексы ДНК/полимер используются для успешной трансфекции ВНК-21 или СНО-К1 клеток, каждые помещают на 24 ячеечные планшеты с плотностью клеток 60000 клеток/ячейка за 24 часа до трансфекции при различных соотношениях зарядов в среде, содержащей 10% сыворотки или не содержащей сыворотки, в соответствии с методикой, приведенной в примере 27. Клетки лизируют спустя 48 часов после трансфекции. Соответствующие субстраты для количественного светового определения лусиферазы добавляют к клеточному лизату. Активность лусиферазы, измеряемую из расчета полученных единиц света (то есть относительных световых единиц - relative light units (RLU)), вычисляют с помощью люминометра. Клеточный лизат также используют для определения жизнеспособности клеток посредством количественного определения белка по Лаури. (Lowry et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 193, 265-275 (1951)). Токсичность измеряют определением общего клеточного белка в ячейках спустя 48 часов после трансфекции. Результаты трансфекции и выживания клеток в 10% сыворотке и в среде, не содержащей сыворотки, приведены ниже.

Активность лусиферазного белка в ВНК-21 клетках, трансфектированных в среде, не содержащей сыворотки, достигает стабильного максимума при 30+/- 5×10⁷ RLU. Присутствие 10% сыворотки в трансфекционной среде снижает активность лусиферазы при всех соотношениях зарядов, за исключением 70+/-. Для СНО-К1 клеток повышение соотношения зарядов также приводит к повышению трансфекции для всех условий испытания. Дополнительно, транфекция в сыворотке снижает количество единиц света на порядок.

Сополимер 16 показывает токсичность только в отношении ВНК-21 клеток для трансфекции в отсутствии сыворотки. Токсичность снижается до минимума в присутствии 10% сыворотки в процессе трансфекции. Заметной токсичности не наблюдают при трансфекциях на СНО-К1 клетках.

Влияние соотношения зарядов сополимера 16/ДНК и наличия сыворотки на эффективность трансфекции ( ) и выживание слеток ( ) в ВНК-21 клетках. Результаты трансфекции в 10% сыворотке и среде, не содержащей сыворотки, представлены соответственно пунктирной и сплошной линиями. Данные представлены в виде среднего значения трех образцов +/- ст. отклонение. Данные токсичности представлены в виде линий наилучшего приближения (best fit lines).

Влияние соотношения зарядов сополимера 16/ДНК и наличия сыворотки на эффективность трансфекции ( ) и выживание клеток ( ) в СНО-К1 клетках. Результаты трансфекции в 10% сыворотке и в среде, не содержащей сыворотки, представлены соответственно пунктирной и сплошной линиями. Данные представлены в виде среднего значения трех образцов +/- ст. отклонение. Данные токсичности представлены в виде линий наилучшего приближения (best fit lines).

Сравнительный пример 1: Изучение трансфекции с плазмидами, кодирующими Luciferase reporter ген

В соответствии с методикой примера 32 изучают эффективность трансфекции и токсичность различных невирусных векторов с клетками ВНК-21 и СНО-К1 и результаты сравнивают с результатами, полученными с комплексами ДНК/полимер 16. ВНК-21 и CHO-K1 клетки трансфектируют в интервале соотношений зарядов и исходных плотностей для всех векторов в среде, не содержащей сыворотки. Результаты приведены ниже и они представляют оптимальные условия трансфекции, установленные для каждого вектора.

Следует представлять, что приведенные выше обсуждение и примеры представляют только подробное описание определенных предпочтительных воплощений. Для квалифицированного специалиста ясно, что различные модификации и эквиваленты могут производиться без выделения из объема и области изобретения. Все патенты, журнальные статьи и другие документы, обсуждаемые или цитированные выше, введены в описании в виде ссылок.