способы, инструменты и материалы для трансплантации зрелых клеток хрящевой ткани

Формула изобретения

1. Способ лечения дефектного участка хряща у животных путем создания имплантируемого сегмента, включающего зрелые клетки хрящевой ткани, прикрепленные к опорному матриксу, изготовленному с возможностью абсорбции в тело указанного животного, трансплантации имплантируемого сегмента в дефектный участок хряща и фиксации имплантируемого сегмента на дефектном участке хряща.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед фиксацией имплантируемого сегмента удаляют дефектную хрящевую ткань с дефектного участка хряща, оставляя при этом хрящевую ткань в количестве, достаточном для предотвращения кровотечения из хряща в его дефектном участке.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед фиксацией имплантируемого сегмента дополнительно устанавливают гемостатический барьер в дефектный участок хряща.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что опорный матрикс выполнен в виде листа, способного поддерживать рост хрящевых клеток и создавать физическую целостность с имплантируемым сегментом.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что опорный матрикс дополнительно включает полипептиды или белки.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что опорный матрикс изготовлен из коллагена.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что коллаген выбирают из группы, включающей в основном лошадиный, свиной, бычий, овечий и куриный коллаген.

8. Способ по п.6, отличающийся тем, что используют лошадиный коллаген.

9. Способ по п.6, отличающийся тем, что используют коллаген типа I.

10. Способ по п.6, отличающийся тем, что используют коллаген типа II.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что опорный матрикс изготавливают из твердого вещества.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что опорный матрикс выполняют гелеподобным.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что имплантируемый сегмент фиксируют на дефектном участке хряща с помощью клея.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что при фиксации выбирают фибриновый клей.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапе фиксации имплантируемый сегмент прикрепляют к дефектному участку механически фиксирующими приспособлениями с возможностью абсорбции.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что в качестве механически фиксирующего приспособления используют штифт.

17. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве животного выбирают человека.

18. Инструмент для введения имплантируемого сегмента, содержащего зрелые клетки хрящевой ткани, расположенные на опорном матриксе, в дефектный участок хряща животного, содержащий внешнюю трубчатую оболочку, имеющую конец, выполненный для удержания его пользователем, и конец, выполненный для введения в дефектный участок хряща, ручку и телескопический элемент, расположенные в конце оболочки, выполненном для удержания его пользователем, инъекционный канал, частично расположенный в ручке и выступающий из конца оболочки, выполненного для удержания его пользователем, в направлении конца оболочки, выполненного для введения в дефектный участок хряща, и захваты, прикрепленные к телескопическому элементу и адаптированные для захвата и освобождения имплантированного сегмента при телескопическом перемещении ручки в оболочке.

19. Инструмент по п.18, отличающийся тем, что он дополнительно содержит колпачок, прикрепленный к концу оболочки, выполненному для удержания его пользователем, с возможностью скольжения и извлечения жидкости из дефектного участка хряща.

20. Имплантируемый сегмент для восстановления хряща животного путем имплантации, состоящий из опорного матрикса и зрелых клеток хрящевой ткани, фиксируемых в нем, причем опорный матрикс изготовлен с возможностью абсорбции в тело животного.

21. Имплантируемый сегмент по п.20, отличающийся тем, что опорный матрикс выполнен в форме листа, способного поддерживать рост хрящевых клеток и создавать физически цельную конструкцию с имплантируемым сегментом.

22. Имплантируемый сегмент по п.20, отличающийся тем, что опорный матрикс содержит полипептиды или белки.

23. Имплантируемый сегмент по п.20, отличающийся тем, что опорный матрикс изготовлен из коллагена.

24. Имплантируемый сегмент по п.23, отличающийся тем, что коллаген выбран из группы, включающей в основном лошадиный, свиной, бычий, овечий и куриный коллаген.

25. Имплантируемый сегмент по п.23, отличающийся тем, что в качестве коллагена выбран свиной коллаген.

26. Имплантируемый сегмент по п.20, отличающийся тем, что опорный матрикс изготовлен из твердого вещества.

27. Имплантируемый сегмент по п.20, отличающийся тем, что опорный матрикс выполнен гелеподобным.

28. Имплантируемый сегмент по п.23, отличающийся тем, что в качестве коллагена использован коллаген типа I.

29. Имплантируемый сегмент по п.23, отличающийся тем, что в качестве коллагена использован коллаген типа II.

30. Имплантируемый сегмент по п.20, отличающийся тем, что он выполнен с возможностью упругой деформации опорного матрикса.

31. Имплантируемый сегмент по п.20, отличающийся тем, что опорный матрикс имеет шероховатую сторону.

32. Имплантируемый сегмент по п.20, отличающийся тем, что шероховатая сторона опорного матрикса выполнена пористой.

33. Имплантируемый сегмент по п.20, отличающийся тем, что опорный матрикс имеет гладкую сторону.

34. Имплантируемый сегмент по п.20, отличающийся тем, что опорный матрикс имеет шероховатую и гладкую стороны.

35. Способ изготовления имплантируемого сегмента, содержащего зрелые клетки хрящевой ткани, фиксируемые в опорном матриксе, включающий извлечение хрящевых клеток из тела пациента, культивирование зрелых клеток хрящевой ткани в питательной среде, образование опорного матрикса, содержащего твердый или гелеподобный элемент с возможностью поддержания роста хрящевых клеток на нем, и добавление культивированных зрелых клеток хрящевой ткани в опорный матрикс с возможностью продолжения роста культивированных хрящевых клеток на опорном матриксе и фиксации их на нем.

36. Способ по п.35, отличающийся тем, что опорный матрикс изготавливают в виде листового сегмента.

37. Способ по п.35, отличающийся тем, что опорный матрикс включает полипептиды или белки.

38. Способ по п.35, отличающийся тем, что опорный матрикс изготавливают из коллагена.

39. Способ по п.38, отличающийся тем, что коллаген выбирают из группы, включающей в основном лошадиный, свиной, бычий, овечий и куриный коллаген.

40. Способ по п.38, отличающийся тем, что используют лошадиный коллаген.

41. Способ по п.38, отличающийся тем, что используют коллаген типа I.

42. Способ по п.38, отличающийся тем, что используют коллаген типа II.

45. Способ по п.35, отличающийся тем, что опорный матрикс изготавливают из твердого вещества.

44. Способ по п.35, отличающийся тем, что опорный матрикс выполняют гелеподобным.

45. Способ по п.35, отличающийся тем, что опорный матрикс изготовляют абсорбируемым.

46. Имплантируемый сегмент, содержащий зрелые клетки хрящевой ткани, расположенные на упругом опорном матриксе и приклеенные к нему с возможностью поддержания роста хрящевой ткани и проникновения в поверхность опорного матрикса, отличающийся тем, что по мере роста зрелые клетки хрящевой ткани приклеивают к опорному матриксу.

47. Имплантируемый сегмент по п.46, отличающийся тем, что опорный матрикс изготовлен с возможностью абсорбции в тело животного.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к области трансплантации зрелых клеток хрящевой ткани, трансплантации и лечения костей и хрящей, восстановления суставов и профилактики артритных патологий. В частности, настоящее изобретение направлено на создание новых способов и инструментов для трансплантации зрелых клеток хрящевой ткани и восстановления хряща.

В США ежегодно проводится более чем 500000 операций по артропластике и замене суставов всех видов. Приблизительно то же количество подобных операций выполняется в Европе, включая приблизительно 90000 операций по замене коленных суставов и около 50000 операций по устранению дефектов в колене. Приблизительно такое же количество подобных операций производится и в США (Praemer A., Fumer S., Rice D.P. Musculoskeletal conditions in the United States, American Academy of Orthopaedic Surgeons, Park Ridge, III, 1992, 125).

Способ восстановительного лечения хрящей был бы наиболее применим и мог бы проводиться на ранней стадии повреждения суставов, уменьшая тем самым количество пациентов, нуждающихся в хирургических операциях по замене суставов. При таких профилактических способах лечения уменьшится также и количество пациентов с развивающимся остеоартритом.

Способы, применяемые для замены структуры хрящей в суставах, в основном направлены на восстановление хрящей с помощью сверления и выскабливания ткани в субхондральной области, в результате которых удаляют больной хрящ и подхрящевую кость, обнажая сетчатую, окруженную сосудами кость (Install, J., Clin. Orthop. 1974, 101, 61; Ficat R.P. et al., Clin. Orthop. 1979, 144, 74; Johnson L.L., in Operative Arthroscopy, McGinty J.B., Ed., Raven Press, New York, 1991, 341).

Известен способ культивирования клеток для синтезирования хрящевой ткани из эмбриосомитов цыпленка (Coon and Cahn, Science 1966, 153, 1116).

Позднее Кан и Лэшер (Cahn and Lasher PNAS USA 1967, 58, 1231) использовали систему анализа нарушения синтеза ДНК, необходимую как предварительное условие для дифференциации хрящей. Зрелые клетки хрящевой ткани соответствовали как EFG, так и FGF по росту (Gospodariwicz and Mesher, J. Cell Physiology) 1977, 93, 117), но полностью утрачивали способность к дифференциации (Benya et al., Cell 1978, 15, 1313).

Способы выращивания зрелых хрящевых клеток были описаны и принципиально используются с небольшими улучшениями по Бриттбергу (Brittberg, M. еt al. New Engl., J. Med. 1994, 331, 889). Выращенные этим способом клетки использовали как аутотрансплантат в коленных суставах пациентов.

Кроме того, Kolletas et al. (J. Cell Science 1995, 108, 1991) изучили экспрессию молекул специфических веществ хряща, таких как коллагены и протеогликаны, при продолжительном процессе культивации клеток. Было обнаружено, что, несмотря на морфологические изменения в однослойных культурах в процессе культивации (Aulthouse, A. еt al. In vitro Cell Dev. Biol., 1989, 25, 659, Archer, С. et al., J. Cell Sci. 1990, 97, 361; Hoenselmann, H. еt al., J. Cell Sci. 1994, 107, 17; Bonaventure, J et al., Exp. Cell Res. 1994, 212, 97), по сравнению с культурами суспензий, выращенных в гелях агорозы, каплях алгината или как культуры кокона (сохраняя морфологию круглой клетки), проверенными различными учеными, остались неизменными маркеры экспрессии зрелых клеток хрящевой ткани, такие как коллагены типа II и IX, и крупные агрегирующие протеогликаны, аггрекан, версикан и связывающий белок (Kolettas, Е. et al., J. Cell Science 1995, 108, 1991).

Известно использование гелей коллагена типа I в опытах с животными для устранения дефектов хрящей (Wakitani et al., Tissue Engineering, 4 (4), 429, 1989).

Во всех случаях основной проблемой был недостаток биомеханических свойств, необходимых для функциональной тканевой репарации.

Зрелые клетки хрящевой ткани представляют собой специализированные клетки, производные мезенхимы, которые находятся исключительно в хрящах. Хрящ является безсосудистой тканью, физические свойства которой зависят от межклеточного вещества, которое производят зрелые клетки хрящевой ткани. В процессе эндохондральной оссификации клетки хрящевой ткани созревают, что приводит к клеточной гипертрофии, отличающейся проявлением экспрессии коллагена типа Х (Upholt, W.B. and Olsen, RR, in: Cartilage Molecular Aspects (Hall, B. & Newman, S., Eds) CRC Boca Raton 1991, 43; Reichenberger, E. et al., Dev. Biol. 1991, 148, 562; Kirsch, Т. et al., Differentiation, 1992, 52, 89; Stephens, M. et al., J. Cell Sci., 1993, 103, 1111).

Кроме того, выраженное разрушение коллагена типа II во внешних слоях хрящевой поверхности суставов вызывается остеоартритом. Сеть коллагена соответственно истончается и после этого развивается фибриллообразование, в результате чего происходят потери и возможно полное вытеснение веществ матрикса, таких как протеогликаны. Такое фибриллообразование остеоартритом хряща может довести до обезвествления хряща и субхондральной кости (Kempson, G.E. et al., Biochem. Biophys. Acta 1976,428, 741; Roth, V., and Mow, V. С, J. Bone Joint Surgery, 1980, 62A, 1102; Woo, S.L.-Y et al., in Handbook of Bioengineering (R. Skalak and S. Chien Eds), McGraw-Hill, New York, 1987, pp.4.1-4.44).

Описания базовых разработок, гистологической и микроскопической анатомии кости, хряща и других соединительных тканей можно найти, например, у Ветера, Буркитта и Даниельса "Функциональная гистология" (Wheater, Burkitt and Daniels, Functional Histology. 2^nd Edition (Churchill Livingstone, London 1987, Chp.4). Кроме того, описания основной гистологической анатомии дефектов кости, хряща и других соединительных тканей можно найти, например, у Ветера, Стивенса и Лове "Общая гистопатология" (Wheater, Burkitt, Stevens and Lowe, Basic Histopathology. (Churchill Livingstone, London 1985, Chp.21).

Несмотря на то, что необходимость трансплантации хрящевых клеток была описана по крайней мере в пределах указанных ссылок, вопрос о необходимости разработки удовлетворительного и эффективного способа восстановления хряща путем трансплантации или иным путем остается открытым.

Настоящее изобретение направлено на создание имплантируемого сегмента, включающего опорный матрикс, который может поддерживать рост и прикрепление к нему клеток, а также способа имплантации такого сегмента для восстановления клеток в месте имплантации. В одном варианте исполнения настоящим изобретением предложен способ эффективного лечения поверхностей хрящей суставных поверхностей у животных путем трансплантации имплантируемого сегмента, включающего зрелые клетки хрящевой ткани, удерживаемые абсорбируемым опорным матриксом. В одном варианте исполнения изобретения опорный матрикс изготавливается из коллагена типа I или II, а зрелые клетки хрящевой ткани являются аутологичными или гомологичными. Предпочтительно имплантируемый сегмент крепят к трансплантируемому участку с помощью клея или механическим крепежным элементом.

Кроме того, настоящее изобретение направлено на создание инструмента для введения имплантируемого сегмента, который предназначен для размещения и приспособления имплантируемого сегмента в месте имплантации, а также элемента для фиксации имплантируемого сегмента в месте имплантации.

Более того, настоящее изобретение направлено на создание имплантируемого сегмента для восстановления хрящей у животных, включающего зрелые клетки хрящевой ткани, удерживаемые в абсорбируемом опорном матриксе, и способ его изготовления.

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими чертежами.

На фиг.1А показан обычный суставной конец кости в коленом суставе, имеющий поверхность сочленения с хрящевым покрытием суставного конца кости.

На фиг.1В показан дефект хряща или травма хрящевого покрытия суставного конца кости.

На фиг.2 показан один из вариантов выполнения имплантируемого сегмента согласно настоящему изобретению.

На фиг.3 показано расположение дуги имплантируемого сегмента согласно фиг.2 в инструменте для введения имплантируемого сегмента перед имплантацией, например, как показано на фиг.4.

На фиг.4 показан инструмент для введения имплантируемого сегмента для имплантации в дефектный участок хрящевой ткани согласно настоящему изобретению.

На фиг.5 изображена схема расположения имплантируемого сегмента, согласно фиг.3, в месте дефекта или травмы в хрящевом покрытии с двумя входными каналами, в которые можно вводить инструмент для введения имплантируемого сегмента.

На фиг.6 показана схема поперечного сечения хряща с дефектом или травмой, которая не распространяется на субхондральный слой, и имплантируемый сегмент, согласно данному изобретению, приклеенный к участку дефекта или травмы.

На фиг.7 показан поперечный разрез хряща с дефектом или травмой, которая не распространяется на субхондральный слой, и имплантируемый сегмент согласно данному изобретению, прикрепленный к участку дефекта или травмы механически фиксирующим климмером.

На фиг.8 показан один из вариантов выполнения механически фиксирующего климмера, используемого для крепления имплантируемого сегмента к участку дефекта или травмы.

На фиг.9 показан поперечный разрез хряща с дефектом или травмой, которая распространяется в субхондральный слой, и имплантируемый сегмент согласно настоящему изобретению, приклеенный к дефектному или травмированному участку.

На фиг.10 показан поперечный разрез хряща с дефектом или травмой, которая распространяется в субхондральный слой, и имплантируемый сегмент согласно настоящему изобретению, прикрепленный к участку дефекта или травмы механически фиксирующим климмером.

На фиг.11А показана черно-белая копия цветной микрофотографии гистологической пробы твердого опорного матрикса в начале роста на нем хрящевых клеток.

На фиг.11АА показана цветная микрофотография фиг.11А.

На фиг.11В показана черно-белая копия цветной микрофотографии с изображением опорного матрикса на фиг.11А, заполненного хрящевыми клетками через три недели их выращивания на нем.

На фиг.11ВВ представлена цветная микрофотография фиг.11В.

На фиг.11С представлена фотография с изображением опорного матрикса, формируемого коллагеном, имеющим зрелые клетки хрящевой ткани, выросшие на нем и показанные иммуногистохимическим окрашиванием.

На фиг.11D представлена фотография опорного матрикса, образованного из коллагена и имеющего зрелые клетки хрящевой ткани, выросшие на нем в биореакторной системе и обозначенные иммуногистохимическим окрашиванием.

Изобретение осуществляют следующим образом.

Как было изложено выше, одним из суставов тела человека, в котором часто происходит травма или дефект хрящей, является коленный сустав. На фиг.1А показан обычный соединительный конец кости в коленном суставе человека. Коленный сустав 10 образуется при соединении бедренной 12 и болышеберцовой 14 костей, при этом здоровый хрящ 16 покрывает суставный конец бедренной кости 12. На фиг.1В показан обозначенный кругом участок дефекта или травмы 18 (далее дефект 18) в хряще 16.

Настоящее изобретение включает восстановительный хрящевой имплантат, способ его имплантирования и инструмент для имплантирования. Имплантат включает опорный матрикс и аутологические и гомологические клетки, удерживаемые в нем.

В общем опорный матрикс является материалом, который должен поддерживать рост хрящевых клеток и который со временем должен абсорбироваться в тело пациента, подвергаемого имплантации. Операция по трансплантации может проводится по артроскопической, минимально инвазивной, или открытой хирургической методике.

Кроме того, способ по настоящему изобретению предполагает использование пригодных аллогенных и ксеногенных хрящевых клеток для восстановления хрящевых дефектов.

На фиг.2 показан имплантат. В частности, имплантируемый сегмент 20 включает опорный матрикс с удерживаемыми на нем хрящевыми клетками 24. Пригодный опорный матрикс 22 может быть твердым или гелеобразным костяком, отличающимся способностью сохранять стабильную форму в течение периода времени роста в нем хрящевых клеток до и после трансплантации и образовывать систему, подобную природной среде местонахождения хрящевых клеток, для оптимизации дифференциации их роста.

Опорный матрикс 22 должен быть устойчивым в течение периода времени, достаточного для полного восстановления хряща, после чего матрикс абсорбируется в тело, например, в течение двух месяцев, не оставляя практически никаких следов и токсических продуктов распада. Термин "абсорбируется" означает процессы, при которых опорный матрикс распадается благодаря природным биологическим процессам, после чего разложенный опорный матрикс и продукты его распада выводятся, например, через лимфатические или кровеносные сосуды. В связи с этим опорный матрикс 22 предпочтительно изготавливается из физиологически абсорбируемого неантигенного материала в форме мембраны. Кроме того, предпочтительно опорный матрикс имеет форму листа с одной относительно гладкой стороной 21 и другой относительно шероховатой стороной 23. Шероховатая сторона 23, например, является волокнистой и обычно покрывает дефект 18 хряща и способствует врастанию хрящевых клеток внутрь, а гладкая сторона 21 обычно отворачивается от дефекта 18 хряща, затрудняя врастание ткани.

В одном из вариантов выполнения опорный матрикс 22 образуется из полипептидов или белков. Предпочтительно полипептиды и белки получать из натуральных источников, например из млекопитающих. Однако искусственные материалы, по физическим и химическим свойствам аналогичные натуральным, также применимы для формирования опорного матрикса 22.

Предпочтительно, чтобы опорный матрикс 22 был упругим, поскольку он регулируется пользователем для возможности выполнения манипуляций с имплантируемым сегментом 20 и затем возвращается в свою исходную форму, согласно одному варианту исполнения данного изобретения, как описано ниже.

Предпочтительным материалом для образования опорного матрикса 22 является коллаген, взятый, например, у лошади, свиньи, коровы, овцы и курицы. Пригодными материалами, из которых можно образовать опорный матрикс, являются Chondro-Cell®, (имеющийся в продаже в виде прокладки матрикса из коллагена типа II, Ed. Geistlich Soehne, Швейцария) и Chondro-Gide® (имеющийся в продаже в виде прокладки матрикса из коллагена типа I, Ed. Geistlich Soehne, Швейцария). Опорный матрикс 22, образованный из коллагена типа I, более жесткий, чем опорный матрикс 22, образованный из коллагена типа II, хотя последний также можно использовать.

Имплантируемый сегмент, как изложено выше, можно изготавливать, например, культивируя зрелые клетки хрящевой ткани на этом опорном матриксе, как будет описано ниже более детально.

Для аугологического имплантата извлекают биоптат хряща по артроскопической методике сначала из области, не несущей весовой нагрузки, в суставе пациента и переносят в лабораторию в питательной среде, содержащей 20% фетальной телячьей сыворотки. Потом биоптат хряща обрабатывают ферментом, например, трипсин - этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТК), протеолитическим ферментом и связующим агентом для выделения и экстрагирования хрящевых клеток. Затем экстрагированные клетки хрящевой ткани культивируют в питательной среде из числа исходных клеток около 50000 клеток до окончательного числа около 20 миллионов зрелых клеток хрящевой ткани и более.

За три дня до повторной имплантации питательную среду меняют на среду переноса, содержащую 10% аутологической сыворотки (а именно, сыворотки, экстрагированной из крови пациента, как описано ниже). Потом культивированные зрелые клетки хрящевой ткани в трансплантируемой среде впитываются и проникают в опорный матрикс 22 и продолжают размножаться, формируя имплантируемый сегмент 20, который затем имплантируют в участок хрящевого дефекта 18 у пациента.

Дефект или травму 18 можно обрабатывать непосредственно, слегка расширяя или скальпируя хирургически перед имплантацией для размещения имплантируемого сегмента 20.

Процесс культивирования клеток, а также питательной среды и среды для их трансплантации подробно описаны примерами, приведенными ниже, начиная с описания лабораторных процедур обработки извлеченного хрящевого биоптата и культивирования зрелых клеток хрящевой ткани согласно настоящему изобретению.

Питательную среду, которая используется для обработки хрящевого биоптата в процессе выращивания и для созревания хрящевых клеток, получают путем смешивания вместе 2,5 мл гентомицин сульфата (концентрация 70 мкмоль/л), 4,0 мл амфотерицина (товарный знак Fungizone®, антигрибковый препарат, поставляемый от Squibb) - концентрация 2,2 мкмоль/л; 15 мл 1-аскорбиновой кислоты (300 мкмоль/л), 100 мл фетальной телячьей сыворотки (конечная концентрация 20%), остальное - среда DMEM/F12; при этом получают около 400 мл питательной среды.

Эту же среду используют для переноса хрящевого биоптата из клиники в лабораторию, в которой зрелые клетки хрящевой ткани экстрагируют и размножают.

Кровь, взятую у пациента, центрифугируют со скоростью приблизительно 3000 оборотов в минуту для отделения сыворотки крови от других ее составляющих. Отделенную сыворотку крови сохраняют и используют в поздней стадии процесса культивирования и в процессе переноса.

Хрящевой биоптат, ранее взятый у пациента для аутологической трансплантации, переносят в вышеописанной питательной среде в лабораторию для дальнейшего культивирования. Среду выращивания фильтруют для отделения хрящевого биоптата и затем выбрасывают по прибытии в лабораторию. Затем хрящевой биоптат промывают в чистом DMEM/F12, по крайней мере, три раза для удаления пленки фетальной телячьей сыворотки с хрящевого биоптата.

После этого хрящевой биоптат промывают составом, включающим вышеописанную среду выращивания, к которому добавляют 28 мл трипсин ЭДТА (концентрация 0,055). В этом составе хрящевой биоптат инкубируют от пяти до десяти минут при 37°С и 5% СO₂. После инкубации хрящевой биоптат промывают дважды или трижды в питательной среде для полной очистки биоптата от какого-либо фермента трипсина. Затем хрящ взвешивают. Как правило, минимальное количество хрящевой ткани, требуемое для выращивания хрящевых клеток, составляет приблизительно 80-100 мг. Предпочтительным является чуть большее количество, например, 200-300 мг.

После взвешивания хрящ помещают в смесь 2 мл коллагеназы (концентрация 5000 ферментных единиц; пищеварительный фермент) в приблизительно 50 мл чистой среды DMEM/F12 и измельчают для частичного переваривания хряща ферментом. После этого измельченный хрящ переносят через воронку в бутылку, добавляя туда приблизительно 50 мл коллагеназы и чистой смеси DMEM/F12. Затем измельченный хрящ инкубируют в течение 17-21 часов при 37°С и 5% СО₃.

В одном варианте выполнения инкубированный измельченный хрящ отцеживают через ячейки размером 40 мкм, центрифугируют (при 1054 об/мин или 200 раз самотеком) в течение 10 минут и промывают дважды питательной средой. Затем зрелые клетки хрящевой ткани считают для определения их жизнеспособности, после чего их инкубируют в питательной среде при 37°С и 5% СO₂ по крайней мере две недели, в течение которых питательная среда меняется три или четыре раза.

За три дня до проведения повторной имплантации пациенту зрелые клетки хрящевой ткани извлекают трипсинизацией и центрифугированием из питательной среды и переносят в трансплантирующую среду, содержащую 1,25 мл сульфата гентомицина (концентрация 70 мкмоль/л), 2,0 мл амфотерицина (товарный знак Fungizone®, антигрибковый препарат, поставляемый от Squibb) - концентрация 2,2 мкмоль/л; 7,5 мл 1-аскорбиновой кислоты (300 мкмоль/л), 25 мл аутологической сыворотки крови (конечная концентрация 10%) и остальное - среда DMEM/F12 для получения 300 мл среды переноса.

Затем опорный матрикс 22 обрезают до необходимого размера, размещая на дне лунки в планшете для культивирования клеток NUNCLON, затем помещают в асептические условия на дно лунки с 1-2 мл среды переноса. Значительное количество культивируемых до созревания хрящевых клеток (3-10 миллионов зрелых клеток хрящевой ткани) приблизительно в 5-10 мл среды переноса просачивается в опорный матрикс 22 и инкубируется приблизительно на протяжении 72 часов при 37°С и 5% СО₂ для возможности продолжения роста хрящевых клеток.

В процессе инкубации зрелые клетки хрящевой ткани располагаются в кластерах и приклеиваются к опорному матриксу 22.

При использовании данного способа было обнаружено, что опорный матрикс 22 поддерживает рост и фиксирует значительное количество зрелых клеток хрящевой ткани на нем для формирования имплантируемого сегмента 20 без существенных потерь биомеханических свойств опорного матрикса 22.

Кроме того, опорный матрикс 22 создает среду для поддержки продолжения роста зрелых клеток хрящевой ткани после имплантации имплантируемого сегмента на дефектном участке хряща.

В другом варианте выполнения изобретения зрелые клетки хрящевой ткани, после периода инкубации 17-21 часов и определения количества клеток и их жизнеспособности, как описано выше, помещают в среду переноса и выращивают непосредственно на опорном матриксе 22 минимум 2 недели.

Было обнаружено, что имплантируемый сегмент 20 может временно деформироваться без механических повреждений или потерь зрелых клеток хрящевой ткани, приклеенных к опорному матриксу 22. Эта деформация полностью восстанавливается при вводе имплантируемого сегмента 20 в сустав или размещении его на поверхности, предназначенной для лечения, как описано ниже.

Соответственно, в другом варианте исполнения данного изобретения опорный матрикс, на котором клетки выращивают или загружают в него в значительном количестве, может временно деформироваться для возможности его введения в рабочее устройство инструмента для введения имплантируемого сегмента без механических повреждений или потерь наращенных хрящевых клеток.

Также было обнаружено, что этот матрикс можно приклеить или прикрепить механически к дефектному участку хряща, не мешая дальнейшей дифференциации зрелых клеток хрящевой ткани в месте их расположения и регенерации натурального вещества матрикса хряща.

В других вариантах исполнения данное изобретение включает инструменты для размещения имплантируемого сегмента 20 в участке имплантации и механически фиксирующее устройство, удерживающее имплантируемый сегмент 20 на участке имплантации.

Согласно настоящему изобретению, операция по имплантации проводится по артроскопической методике. На фиг.3 показано, как имплантируемый сегмент 20 можно скрутить по диаметру в виде спирали и в форме цилиндра трансплантировать таким образом, чтобы доставить имплантируемый сегмент к месту имплантации по рабочему каналу 26 артроскопического проводника 28. Соответствующий инструмент для введения имплантируемого сегмента изображен на фиг.4.

На фиг.4 инструмент для введения имплантируемого сегмента 30 содержит рабочий канал 32 с диаметром и длиной, удобными для ввода в предназначенный для лечения сустав и доставки имплантируемого сегмента 20 необходимого размера.

Например, для большинства операций соответствующий диаметр рабочего канала находится в пределах приблизительно 8-20 мм, а его длина приблизительно 30-60 см. Внутри рабочего канала 32 с возможностью продольного перемещения по нему находится инъекционный канал 34 с расположенной в нем втягивающейся и съемной иголкой 36. Инъекционный канал 34 прикрепляется к ручке 38, которая телескопически входит хотя бы частично вовнутрь рабочего канала 32. Иголка 36 выходит за пределы длины инъекционного канала 34 и позволяет жидкостям протекать по ней к участку имплантации. Инъекционный канал 34 перемещается в пределах рабочего канала 32 с помощью телескопически подвижной ручки 38 по направлению к участку имплантации и от него.

Инструмент для введения имплантируемого сегмента 30 дополнительно включает колпачок 40 из резины или другого пригодного материала, прикрепленный к инструменту для введения имплантируемого сегмента 30 с возможностью скольжения. В рабочем состоянии колпачок 40 охватывает дефектный участок хряща и не пропускает к нему жидкость, например кровь и другие естественные жидкости. Кроме того, инструмент для введения имплантируемого сегмента 30 имеет два или более расположенных снаружи смещаемых захватов 42, удерживающих внутреннюю часть рабочего канала 32 с возможностью перемещения друг к другу, входя в зацепления (по мере перемещения ручки 38 к месту назначения), и расцепляясь друг от друга (по мере удаления ручки 38 от места назначения). Такое телескопическое перемещение можно регулировать элементом смещения (не показан), расположенным в ручке 38, который позволяет инъекционному каналу 34 и захватам 42 скользить вперед и назад внутри рабочего канала 32.

На фиг.5-7 показана обычная артроскопическая операция по имплантации имплантируемого сегмента 22 в участок имплантации, например, коленный сустав 10. Дефектный участок 18 хряща удаляют на глубину преимущественно выше субхондрального слоя 44, оставляя лунку 46 (см. фиг.6, 7). После удаления дефектного участка 18 хряща место дефекта подготавливают к наложению имплантируемого сегмента 22. Если субхондральный слой стал кровоточить в месте имплантации, этот участок покрывают любым впитывающим материалом, который действует как кровоостанавливающий.

В другом варианте исполнения подготовка дефектного участка может включать выполнение инъекции биосовместимого клея через иглу 36 в лунку 46. Такой биосовместимый клей, обозначенный цифрой 48 на фиг.6, может включать фибриновый клей (например, Tisseel®, основанный на фибрине клей, Бакстер, Австрия или фибриновый клей, изготовленный в операционной с использованием аутологических проб крови).

Имплантируемый сегмент 20 предварительно обрезают до нужного размера и скручивают в спираль, образуя цилиндрическую форму, как показано на фиг.5, и затем его зацепляют захватами 42 и удерживают в конце инструмента для введения имплантируемого сегмента 30. Поддерживаемый на конце инструмента для введения имплантируемого сегмента 30 имплантируемый сегмент 20 перемещается вперед по проходному каналу 33 к участку имплантации, расцепляет захваты 42 и раскручивается с их помощью или произвольно, выходя из рабочего канала 32. Проходной канал 33 включает один или больше каналов, которые имеют возможность ввода инструментов в участок трансплантации, таких как инструмент для введения имплантируемого сегмента 30 и инструменты визуализации.

С помощью захватов 42 имплантируемый сегмент 20 располагают таким образом, чтобы шероховатая сторона 23 имплантируемого сегмента была обращена к лунке и мягко удерживалась в месте лунки 46 для возможности застывания клея 48 и приклеивания имплантируемого сегмента к лунке 46.

В другом варианте исполнения изобретения (фиг.7) для прикрепления имплантируемого сегмента 20 в лунке 46 используют механическое крепежное приспособление, например, абсорбируемые механические штифты, фиксаторы, винты или шовные материалы. Пригодными для этих целей штифтами 50 являются Ortho-Pin, (имеющиеся в продаже штифты из лактидного сополимера, Ed. Geistlich Soehne, Швейцария).

На фиг.8 показан один из вариантов исполнения абсорбируемого штифта 50. В этом варианте штифт 50 включает головку 52, интрамедуллярный канал 54 внутри ствола 56 и одно или больше стопорных колец 58. Размеры штифта 50 будут изменяться в зависимости от специфики использования, но обычно штифт 50 имеет длину приблизительно в пределах 10-15 мм, диаметр головки 52 - приблизительно 4 мм, диаметр интрамедуллярного канала 54 приблизительно 1,2 мм, диаметр ствола - приблизительно 2 мм, диаметр стопорных колец - приблизительно 2,5 мм. Стопорные кольца служат для фиксации штифта в здоровом участке хряща, окружая дефектный участок.

Штифт 50 изготавливают из любого материала, который является безвредным для тела и может абсорбироваться или иначе подвергаться распаду в теле по прошествии периода времени. Например, штифт 50 может быть изготовлен из полилактида.

В объем настоящего изобретения входит также использование комбинации клея 48 и механических приспособлений фиксации, таких как штифты 50 для крепления имплантируемого сегмента 20 в лунке 46.

Как показано на фиг.6, второй проходной канал, имеющий один или два канала, которые могут быть использованы для пропуска по ним инструментов к участку имплантации для вспомогательных манипуляций при расположении имплантируемого сегмента, нанесения клея и/или размещении механических фиксирующих приспособлений, или для доступа инструментов визуализации к участку имплантации. Также отдельные проходные каналы могут использоваться для выполнения одной или несколько функций, описанных в отношении инструмент для введения имплантируемого сегмента 30 или другого артроскопического инструмента.

Как указано выше, в случаях, когда дефектный участок 18 хряща распространяется в субхондральный слой 44 или требует удаления хрящевой ткани в и ниже субхондральной области 44, как показано на фиг.9 и 10, вышеописанная процедура изменяется и включает установление кровоостанавливающего барьера 62 в лунке 46 до размещения в ней имплантируемого сегмента 20. Гемостатический барьер ингибирует рост или инвазию сосудистой ткани, остеоцитов, фибропластов и т.д. в разрабатываемом суставе. Считается, что это не будет мешать росту ткани гиалинового хряща в участке трансплантации. Соответствующие гемостатические барьеры будут ингибировать васкуляризацию и инвазию клеток в разрабатываемый хрящ для оптимизации образования хряща и для достижения полного восстановления хряща в дефектном участке.

Преимущественно гемостатические барьеры устойчивы на протяжении длительного периода времени с целью полного восстановления хряща и затем они всасываются или со временем распадаются в теле. Пригодным гемостатическим барьером является Surgicel® W1912 (Ethicon, Ltd., United Kingdom), абсорбируемое кровоостанавливающее средство из окисленной регенерированной стерильной целлюлозы.

Вышеописанные хирургические инструменты изготавливают из любого материала, например металла и/или пластмассы или силикона, пригодного для изготовления хирургических инструментов одноразового или многоразового использования.

Определенные объекты изобретения проиллюстрированы в опыте in vitro для изучения поведения зрелых клеток хрящевой ткани при контакте с различными опорными матриксами. Этот опыт in vitro предполагает исследовать способность определенных материалов механически выдерживать артроскопические процедуры, а также возможность получения информации о процессе роста хрящевых клеток.

Настоящее изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами, которые поясняют, но не ограничивают объем настоящего изобретения.

Пример 1

Зрелые клетки хрящевой ткани выращивали в течение трех недель в питательной среде, описанной выше, в инкубаторе с СО₂ при 37°С и манипулировали в лаборатории класса 100 в Verigen Transplantation Service ApS, Copenhagen, DK или в Университете г. Любека в Германии. Надо отметить, что другие композиции питательной среды можно также использовать для культивирования клеток. Клетки насыщали трипсином с помощью трипсин ЭДТК в течении 5-10 минут и считали с использованием окрашивания для выявления жизнеспособных клеток краской Trypan Blue в камере Бюркера-Тюрка (Burker-Turk). Число клеток доводили до 7,5×10⁵ зрелых клеток хрящевой ткани на миллилитр. Одна чашка NUNCLON была не покрыта в лаборатории класса 100.

Материал опорного матрикса, в частности мембрана коллаген Chondro-Gide®, обрезали до необходимого размера для прикрепления ко дну лунки в планшете NUNCLON для выращивания клеток. В этом случае на дно планшета располагали кольцо диаметром 4 см в асептических условиях.

Через три недели зрелые клетки хрящевой ткани перенесли из питательной среды в среду переноса, описанную выше, и приблизительно 5 х 10⁶ зрелых клеток хрящевой ткани в 5 мл среды переноса помещали непосредственно на опорный матрикс и рассеивали по его поверхности. Чашку инкубировали в инкубаторе с СО₂ при 37°С в течение 3 дней. По окончании этого периода зрелые клетки хрящевой ткани располагали в кластерах и начинали выращивать на опорном матриксе без удаления их с опорного матрикса при промывании их средой или при слабом механическом нажатии на матрикс.

В конце инкубационного периода среду переноса декантировали и опорный матрикс с содержащимися на нем зрелыми клетками хрящевой ткани охлаждали в 2,5%-ном глютаральдегиде, содержащем 0,1 М натриевую соль какодиловой кислоты, добавленной в качестве фиксатора. Опорный матрикс окрашивали Safranin О для гистологического анализа.

На фиг.11А показана черно-белая копия цветной микрофотографии.

На фиг.11АА показана цветная микрофотография для лучшей иллюстрации особенностей микрофотографии.

Пример 2

Зрелые клетки хрящевой ткани выращивали в течение трех недель в питательной среде, описанной выше, в инкубаторе с СО₂ при 37°С и работали с ними в лаборатории класса 100 в Verigen Transplantation Service ApS, Copenhagen, DK или в Университете г.Любека в Германии. Клетки насыщали трипсином с помощью трипсин ЭДТА в течении 5-10 минут и подсчитывали путем окрашивания краской Trypan Blue в камере Бюркера-Тюрка (Burker-Turk) для выявления жизнеспособных клеток. Число клеток регулировали до 5×10 ⁵ зрелых клеток хрящевой ткани на миллилитр. Одна чашка NUNCLON была не покрыта в лаборатории класса 100.

Материал опорного матрикса, указанный в примере 1, обрезали до необходимого размера для фиксации ко дну лунки в планшете NUNCLON для выращивания клеток. В этом случае на дно лунки в планшете располагали кольцо диаметром 4 см в асептических условиях.

Через три недели зрелые клетки хрящевой ткани перенесли из питательной среды в среду переноса, описанную выше, и приблизительно 5×10⁵ зрелых клеток хрящевой ткани в 5 мл среды переноса помещали непосредственно на опорный матрикс и рассеивали по его поверхности. Чашку инкубировали в инкубаторе с СО ₂ при 37°С в течение 3 недель.

По окончании инкубационного периода среду переноса декантировали и опорный матрикс с содержащимися на нем зрелыми клетками хрящевой ткани охлаждали в 2,5% глютаральдегиде, содержащем 0,1 М натриевую соль какодиловой кислоты, добавленной в качестве фиксатора. Опорный матрикс окрашивали Safranin О для гистологического развития. Для иммуногистохимии коллагеновые мембраны фиксировали в метанольном ацетоне и окрашивали краской для аггрекана и коллагена типа II, используя коллаген кролика типа II и аггрекан типа II мыши. Первичные антитела можно было различить с помощью флуоресцирующих вторичных антител.

На фиг.11В показана черно-белая копия цветной микрофотографии с изображением зрелых клеток хрящевой ткани 24.

На фиг.11ВВ показана цветная копия микрофотографии для лучшей иллюстрации свойств микрофотографии.

В течение трех недель инкубационного периода на опорном матриксе Chondro-Gide® наблюдался рост и размножение хрящевых клеток, с образованием кластеров в центре носителя и размещением их в линию по поверхности.

Пример 3

Зрелые клетки хрящевой ткани выращивали в течение трех недель в питательной среде, описанной выше, в инкубаторе с СО₂ при 37°С и работали с ними в лаборатории класса 100 в Verigen Transplantation Service ApS, Copenhagen, DK или в Университете г.Любека в Германии. Клетки насыщали трипсином с помощью трипсин ЭДТК в течение 5-10 минут и подсчитывали с использованием окрашивания для выявления жизнеспособных клеток краской Trypan Blue в камере Бюркера-Тюрка (Burker-Turk). Число клеток регулировали до 5×10⁵ зрелых клеток хрящевой ткани на миллилитр. Одна чашка NUNCLON была не покрыта в лаборатории класса 100.

Материал опорного матрикса, указанный в примере 1, обрезали до необходимого размера для фиксации ко дну лунки в планшете NUNCLON для выращивания клеток. В этом случае на дно планшета располагали кольцо диаметром 4 см в асептических условиях.

Через три недели зрелые клетки хрящевой ткани перенесли из питательной среды в среду переноса, описанную выше, и приблизительно 5×10 ⁶ зрелых клеток хрящевой ткани в 5 мл среды переноса помещали непосредственно на опорный матрикс и рассеивали по его поверхности. Чашку инкубировали в инкубаторе с СO₂ при 37°С в течение 3 недель.

Опорный матрикс с содержащимися на нем зрелыми клетками хрящевой ткани инкубировали с коллагеназой в течение 16 часов, а затем центрифугировали. Клетки высевали на чашку NUNCLON и считали аликвоты с помощью окрашивания жизнеспособности Trypan Blue в камере Бюркера-Тюрка (Burker-Turk).

На фиг.11С показана их микрофотография. Общее количество посчитанных клеток составляло 6×10⁶ и жизнеспособность более 95%.

Пример 4

Опыты с животными выполняли на аппаратуре Университета г.Любека, Германия.

В коленных суставах двух овец выполняли четыре дефекта диаметром 7 мм. Все вмешательства i. v. производили под общим наркозом Кетанестом/Ромпаном (Ketanest/Rompun). Дефекты производили сверлением двух отверстий в хряще в весовых опорных участках медиального бедренного мыщелка и двух отверстий в участке бедренно-надколенного и бедренно-большеберцового суставов.

В двух дефектных участках одно из каждой пары отверстий проходит через метки возвышения и спада хряща и субхондрального слоя над костью, а другое отверстие в каждом участке не проходит через указанные участки.

Одновременно кусочек ткани хряща изымали из участка коленей овец, не несущего весовой нагрузки.

Клетки хрящевой ткани из этого сустава выращивали до зрелости на опорном матриксе согласно примеру 3 в течение шести недель.

Зрелые клетки хрящевой ткани, нанесенные на опорный матрикс, затем имплантировали по методу артроскопической хирургии. У одной овцы производили фиксацию с помощью приклеивания матрикса к дефектному участку фибриновым клеем, а у другой овцы матрикс фиксировали полилактидными штифтами, как описано выше в настоящем изобретении.

Овец изолировали друг от друга и колено фиксировали повязкой в течение одной недели.

После этого овец отпускали для свободного перемещения. Осмотр сустава показал устранение дефекта, прикрепление имплантированного опорного матрикса с клетками к дефектному участку хряща и восстановление хрящевой ткани в дефектном участке.

Кроме вышеописанного способа выращивания зрелых клеток хрящевой ткани на опорном матриксе в стеклянной посуде, такой как чашки NUNCLON, и изменения питательной среды и среды переноса, как требуется для надлежащего выращивания клеток, настоящее изобретение также включает способ выращивания зрелых клеток хрящевой ткани на опорном матриксе в биореакторе, например модели №1302, поставляемой MinuCells GMBH Ltd., D-93077 BadAbbach, Германия.

Используя реактор, постоянный поток питательной среды и среды переноса пропускают через опорный матрикс, при этом хрящевые клетки могут вызревать на опорном матриксе с большей скоростью без замены питательной среды на среду переноса каждые 24-96 часов, как требуется для аналогичного процесса с использованием чашек NUNCLON.

Использование биореактора вызывает развитие хрящевых клеток под углом за счет пропускания потока питательной среды и среды переноса через биореактор.

На фиг.11D показана микрофотография зрелых клеток хрящевой ткани, выращенные на опорном матриксе в биореакторе.

Выращивание зрелых клеток хрящевой ткани либо в стеклянной посуде, либо на опорном матриксе можно проводить в питательной среде или в среде переноса до полного созревания клеток. Это значит, что не требуется никакого переноса хрящевых клеток из питательной среды в среду переноса. Зрелые клетки хрящевой ткани можно переносить из питательной среды в среду переноса и наоборот в любой момент культивирования в зависимости от состояния клеток, стадии роста хрящевых клеток и/или состояния пациента. Зрелыми клетками хрящевой ткани клеток либо в питательной среде, либо в среде переноса необходимо пропитывать опорный матрикс в течение приблизительно 2-3 часа перед трансплантацией для фиксации значительного количества хрящевых клеток на нем.

Если биореактор не используется, то питательную среду и среду переноса, используемые на определенной стадии культивирования, необходимо менять каждые 24-96 часов в зависимости от количества и жизнеспособности клеток.

Данное изобретение включает сегмент (и его использование), состоящий из опорного матрикса, преимущественно эластичного и абсорбируемого в тело живого организма, при этом опорный матрикс служит для поддержки жизнеспособных клеток, фиксированных и выращиваемых на нем в течение определенного минимального периода времени. Такая фиксация при выращивании клеток может быть проникающей в поверхность матрикса.

Опорный матрикс представляет целостную физическую конструкцию вместе с сегментом для упрощения манипуляций с ним, например, для имплантации в тело человека.

Зависимые пункты формулы раскрывают как объекты настоящего изобретения, описанные выше, так и аналогичные и эквивалентные варианты выполнения, известные специалисту в данной области, не выходя за пределы настоящего изобретения.