способ определения хлорофилла в растениях гречихи

Формула изобретения

Способ определения хлорофилла в растениях гречихи, включающий измельчение сырья и обработку его спиртом с последующим спектрометрическим измерением при двух длинах волн 665 и 649 нм и расчетом концентрации хлорофилла по формулам С_а=13,7D₆₆₅-5,76D ₆₄₉; С_b=25,80D₆₄₉-7,60D ₆₆₅, где С_а и С_b - концентрации хлорофилла “а” и “b”, D₆₆₅ и D₆₄₉ - измеряемые коэффициенты экстинции в мг/л при соответствующей длине волны, отличающийся тем, что измельченное растительное сырье заливают спиртом в емкостях, которые плотно закрывают, помещают в темное место и по истечении 24-48 ч экспозиции подвергают спектрометрическому измерению для расчета концентраций хлорофилла.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биологии растений и может быть использовано в исследованиях по физиологии растений.

Основным пигментом фотосинтезирующих органов всех зеленых растений является хлорофилл "а" - C₅₅H ₂₂О₅Mg, сопровождаемый обычно хлорофиллом "в" и связанный с ним генетически. Основные максимумы поглощения хлорофилла "а" расположены в области 665 нм, а у хлорофилла "в" 649 нм.

Известен способ определения концентрации хлорофилла "а" и "в" по значениям экстинкции, измеренным при двух длинах волн, с дальнейшим пересчетом на сырое или сухое вещество (1). Способ заключается в следующем: растительную навеску растирают в ступке с кварцевым песком или толченым стеклом, небольшим количеством мела и спиртом. Спиртовой экстракт отсасывают через стеклянный фильтр, остаток повторно 2-3 раза обрабатывают спиртом. Экстракты объединяют. Далее производят спектрометрическое измерение при двух длинах волн с последующим расчетом концентрации хлорофилла "а" и "в".

Недостаток известного способа заключается в том, что он требует затрат большого количества времени, ограничивает объемы исследований.

Задачей предлагаемого способа является сокращение времени на его проведение и упрощение способа.

Для решения поставленной задачи в известном способе определения хлорофилла в растениях, включающем измельчение сырья и обработку его спиртом с последующим спектрометрическим измерением при длинах волн 665 и 649 нм, расчетом концентрации хлорофилла по формулам С_а=13,7D₆₆₅ - 5,76D₆₄₉ ; С_b=25,80D₆₄₉ - 7,60D₆₆₅ , согласно изобретению измельченное растительное сырье заливают в емкостях спиртом, которые плотно закрывают, помещают в темное место и по истечении 24-48 часов подвергают спектрометрическому измерению для расчета концентраций хлорофилла.

Пример: свежесрезанное растение гречихи сорта Богатырь в фазу цветения разделяют на органы и их части. Выделенные компоненты помещают в проэтикированные коробки. Вначале отделяют листья, затем черешки, ветви. Главный побег делят на две части, так как по содержанию хлорофилла и массе верхняя часть почти схожа с ветвями, а нижняя часть отличается большим весом и низким содержанием хлорофилла. Объединение этих частей ведет к снижению достоверности анализа. Разделение главного побега производят по четвертому узлу, так как на фазу цветения одревеснение успевает распространиться только до этого узла. Затем с помощью пинцета приступают к отделению цветков с главного побега и побегов других порядков. Все выделенные органы и их части взвешивают. Наиболее быстрого выполнения этих работ требуют цветы, так как они отличаются наибольшей скоростью в потере воды. После определения сырого веса приступают к отбору навесок. Цветы берут массой 100 мг и, не измельчая, помещают в емкость. Листья очищают от загрязнений при помощи влажной мягкой ткани, удаляют центральные жилки, готовят среднюю пробу, из которой берут навески массой 100 мг. Стебли нарезают как в горизонтальном, так и в вертикальном направлениях, из их средней пробы навески берут массой 300 мг. По 300 мг берут и плоды, которые вследствие ремонтантности изучаемой культуры можно наблюдать и в фазу цветения. Плоды в емкость помещают без измельчения, в противном случае их внутреннее содержимое переходит в спиртовой экстракт, что увеличивает его оптическую плотность. Коробки с растительным материалом помещают в сушильный шкаф с последующим определением сухого веса материала и расчета процента сухого вещества. Навески заливают 96% спиртом. Чтобы избежать испарения спирта, а соответственно возрастания концентрации, емкости плотно закрывают и помещают в темное место. По истечении 24-48 часов емкости встряхивают и, налив в кюветы, делают измерения при двух длинах волн. Используя формулы: С_а=13,7D₆₆₅ - 5,76D₆₄₉ ; С_b=25,80D₆₄₉ - 7,60D₆₆₅, где С_а, С_b - концентрация хлорофилла "а" и "в", a D₆₆₅, D₆₄₉ - измеряемые коэффициенты экстинкции в мг/л при соответствующей длине волн, рассчитывают концентрацию хлорофилла, дальнейшим его пересчетом на сырое или сухое вещество.

Результаты определения количества хлорофилла в органах растений гречихи сорта Богатырь в фазу цветение +20 суток представлены в таблице, где содержание хлорофилла "а" и "б" и их суммы даны в мг на 1 г сухого вещества.

Таблица
Органы и части растения	Способы определения хлорофилла	Хлорофилл "а"	Хлорофилл "в"	Сумма "а"+"в"
1	2	3	4	5
Цветы	По известному способу	5,79	0,52	6,31
	По предлагаемому способу	5,81	0,51	6.32
Лист	По известному способу	9,69	0,71	10,40
	По предлагаемому способу	9,66	0,67	10,33
Главный побег верхняя часть (от 4-го узла)	По известному способу	5,68	0,48	6,16
	По предлагаемому способу	5,70	0,50	6,20
Главный побег нижняя часть (до 4-го узла)	По известному способу	2,12	0,09	2,21
	По предлагаемому способу	2,87	0,14	3,01
Ветви	По известному способу	5,70	0,60	6,30
	По предлагаемому способу	5,71	0.62	6.33
Плоды	По известному способу	1,96	0,62	2,58
	По предлагаемому способу	1,98	0,61	2,59
Черешки	По известному способу	4,48	0,80	5,28
	По предлагаемому способу	4,48	0,81	5,29

Таким образом, сравнивая количество хлорофилла в органах растений, определяемого по известному способу и по предлагаемому, делаем вывод том, что предлагаемый способ обладает достоверностью и высокой точностью. Кроме того, предлагаемый способ отличается простотой и доступностью, а при исследовании наиболее грубых частей растений наиболее достоверен.

При использовании предлагаемого способа сокращается число манипуляций по извлечению хлорофиллов с сохранением точности этого метода, достигается экономия затрат труда за счет сокращения операций по приготовлению толченого стекла и растиранию растительного материала в ступке. Также при использовании предлагаемого способа значительно сокращаются потребности в расходных материалах: меле, толченом стекле, кварцевом песке, наблюдается уменьшение в расходе спирта ввиду сокращения возможных потерь (испарение при обработке фильтрата, распыление при работе вакуумной установки) и отпадает надобность в фильтрах, в вакуумной установке, что ведет к энергосбережению. Кроме того, создаются условия для более продуктивного распределения рабочего времени. При аккуратном наливе кювет экстракт не требует дополнительного фильтрования, что также уменьшает затраты времени на исследования.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. А.М.Гродзинский, Д.М.Гродзинский. Краткий справочник по физиологии растений. Киев, 1973, Из.: Наукова Думка, стр 433-434 - прототип.