способ изготовления вирус-вакцины против инфекционного ларинготрахеита птиц

Формула изобретения

1. Способ изготовления вирус-вакцины против инфекционного ларинготрахеита птиц, включающий инфицирование чувствительной биологической системы вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма гомологичного вируса, инкубирование зараженной системы, сбор вируссодержащего материала, добавление защитной среды, высушивание смеси и контроль целевого продукта, отличающийся тем, что для инфицирования чувствительной биологической системы используют вируссодержащий материал из аттенуированного штамма "О" вируса инфекционного ларинготрахеита птиц, коллекция ВГНКИ "О №112-ДЕП", в эффективном количестве.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что из чувствительных биологических систем используют 9-11-суточные эмбрионы SPF-кур.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что для инфицирования 9-11-суточных эмбрионов SPF-кур используют вируссодержащий материал из аттенуированного штамма "О №112-ДЕП" вируса инфекционного ларинготрахеита птиц с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 lg ЭИД ₅₀/см³.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что защитную среду добавляют к вируссодержащему материалу в соотношении 1:19-3:17 соответственно.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и производстве средств специфической профилактики инфекционного ларинготрахеита (ИЛТ) птиц.

ИЛТ - острое контагиозное заболевание птиц - является причиной высокого процента смертности (обычная смертность составляет 10-20%, известны случаи высокой смертности, которая составляет 50-70%), у переболевших особей снижается суточный привес и яйценоскость. ИЛТ вызывается герпес-вирусом. В комплексе мер борьбы с ИЛТ одним из основных средств является вакцинация с помощью живых и инактивированных вакцин.

Преимущества вирус-вакцин состоят в том, что они пригодны для массового применения путем выпаивания, аэрозольного распыления и т.д., для иммунизации птиц требуется относительно малое количество иммунизирующего препарата, так как живой антиген продолжает размножаться в организме иммунизированной птицы, они являются более дешевыми в производстве и для их хранения требуется относительно мало места в холодильных установках.

Известен способ изготовления вирус-вакцины против ИЛТ птиц, включающий инфицирование чувствительной биологической системы вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма “Г” гомологичного вируса, инкубирование зараженной системы, сбор вируссодержащего материала, добавление к нему защитной среды, высушивание смеси и контроль целевого продукта (1).

Известен способ изготовления вирус-вакцины против ИЛТ птиц, включающий инфицирование чувствительной биологической системы вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма “ЦНИИПП” гомологичного вируса, инкубирование зараженной системы, сбор вируссодержащего материала, добавление к нему защитной среды, высушивание смеси и контроль целевого продукта (2).

Известен способ изготовления вирус-вакцины против ИЛТ птиц, включающий инфицирование чувствительной биологической системы вируссодержащим материалом из клона “НТ” аттенуированного штамма “ЦНИИПП” гомологичного вируса, инкубирование зараженной системы, сбор вируссодержащего материала, добавление к нему защитной среды, высушивание смеси и контроль целевого продукта (3).

Недостатки известных способов состоят в том, что полученные данными способами вирус-вакцины обладают низкой иммуногенной активностью. Эти вакцины формируют иммунитет, который не способен защитить 100% птицепоголовья от заражения эпизоотическим вирусом ИЛТ.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ изготовления вирус-вакцины против ИЛТ птиц, включающий инфицирование чувствительной биологической системы вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма “ВНИИБП” гомологичного вируса, инкубирование зараженной системы, сбор вируссодержащего материала, добавление к нему защитной среды, высушивание смеси и контроль целевого продукта (4).

Недостатки способа-прототипа состоят в том, что вирус-вакцина, изготовленная данным способом, обладает низкой иммуногенной активностью и повышенной реактогенностью.

В связи с этим актуальной остается проблема разработки способа изготовления вирус-вакцины против ИЛТ птиц, обладающей одновременно высокой иммуногенной активностью, безвредностью и ареактогенностью при окулярном и оральном способах иммунизации.

В задачу создания настоящего изобретения входила разработка способа изготовления высокоиммуногенной, безвредной и ареактогенной вирус-вакцины против ИЛТ птиц на основе нового производственного штамма гомологичного вируса.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в повышении иммуногенной активности, безвредности и ареактогенности препарата и расширении арсенала средств специфической профилактики ИЛТ птиц, обладающих высокой иммуногенной активностью, безвредностью и аректогенностью при окулярном и оральном способах иммунизации.

Указанный технический результат достигнут созданием вирус-вакцины против ИЛТ птиц, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.

1. Способ изготовления вирус-вакцины против ИЛТ птиц.

2. Инфицирование чувствительной биологической системы вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма “О №112-ДЕП” вируса ИЛТ птиц.

3. Из чувствительных биологических систем используют 9-11-суточные эмбрионы SPF-кур.

4. Аттенуированный штамм “O №112-ДЕП” вируса ИЛТ птиц используют в эффективном количестве.

5. Для инфицирования 9-11-суточных эмбрионов SPF-кур используют вируссодержащий материал из аттенуированного штамма “O №112-ДЕП” вируса ИЛТ птиц с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 lg ЭИД₅₀/см³.

6. Инкубирование зараженной системы.

7. Сбор вируссодержащего материала.

8. Добавление защитной среды.

9. Защитную среду добавляют к вируссодержащему материалу в соотношении 1:19-3:17 соответственно.

10. Высушивание смеси.

11. Контроль целевого продукта.

12. Целевой продукт получают с содержанием вируссодержащего материала из аттенуированного штамма “О №112-ДЕП” вируса ИЛТ птиц с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 lg ЭИД₅₀/см³.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана.

1. Способ изготовления вирус-вакцины против ИЛТ птиц.

2. Инфицирование чувствительной биологической системы вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма “О №112-ДЕП” вируса ИЛТ птиц.

3. Инкубирование зараженной системы.

4. Сбор вируссодержащего материала.

5. Добавление защитной среды.

6. Высушивание смеси.

7. Контроль целевого продукта.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования.

1. Из чувствительных биологических систем используют 9-11-суточные эмбрионы SPF-кур.

2. Для инфицирования 9-11-суточных эмбрионов SPF-кур используют вируссодержащий материал из аттенуированного штамма “O №112-ДЕП” вируса ИЛТ птиц с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 lg ЭИД₅₀/см³.

3. Защитную среду добавляют к вируссодержащему материалу в соотношении 1:19-3:17 соответственно.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый способ и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Способ изготовления вирус-вакцины против ИЛТ птиц.

2. Инфицирование чувствительной биологической системы вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма вируса ИЛТ птиц.

3. Инкубирование зараженной системы.

4. Сбор вируссодержащего материала.

5. Добавление защитной среды.

6. Высушивание смеси.

7. Контроль целевого продукта.

По сравнению со способом-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемого изобретения является использование при изготовлении вирус-вакцины против ИЛТ птиц вируссодержащего материала из нового аттенуированного штамма “О №112-ДЕП” гомологичного вируса в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования.

1. Из чувствительных биологических систем используют 9-11-суточные эмбрионы SPF-кур.

2. Для инфицирования 9-11-суточных эмбрионов SPF-кур используют вируссодержащий материал из аттенуированного штамма “О №112-ДЕП” вируса ИЛТ птиц с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 lg ЭИД₅₀/см³.

3. Защитную среду добавляют к вируссодержащему материалу в соотношении 1:19-3:17 соответственно.

Вирус-вакцина, полученная предлагаемым способом, обладает более высокой иммуногенной активностью, безвредностью и ареактогенностью по сравнению с вирус-вакциной, изготовленной в соответствии со способом-прототипом, и позволяет расширить арсенал средств специфической профилактики ИЛТ птиц, обладающих высокой иммуногенной активностью, безвредностью и ареактогенностью при окулярном и оральном способах иммунизации.

Достижение технического результата от использования предлагаемого способа объясняется тем, что при изготовлении вирус-вакцины против ИЛТ птиц используют вируссодержащий материал из нового аттенуированного штамма “O №112-ДЕП” гомологичного вируса, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации.

Штамм “О №112-ДЕП” вируса ИЛТ птиц является новым, ранее неизвестным, в нативном виде непатогенным.

Исходный вирус для получения штамма "О №112-ДЕП" выделен из гортани и трахеи курицы с признаками латентной формы заболевания в Казахстане в 1992 году.

Производственный штамм "О №112-ДЕП" получен путем многократных последовательных пассажей на 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур.

Штамм "О №112-ДЕП" депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) 05.06.2000 г. под регистрационным наименованием "О №112-ДЕП".

Штамм "О №112-ДЕП" обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации.

Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления вирус-вакцины, обладающей высокой иммуногенной активностью и безвредностью при окулярном и оральном способах иммунизации.

Штамм "О №112-ДЕП" вируса ИЛТ птиц характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства

Штамм "О №112-ДЕП" вируса ИЛТ относится к семейству Herpesviridae. При электронной микроскопии (инструментальное увеличения 4,5×10 ⁵ и 5×10⁵) в поле зрения микроскопа наблюдают хорошо различимые вирусные частицы ИЛТ со свойственной им морфологией. Вирионы имеют сферическую форму, их размеры варьируют от 200 до 250 нм (у некоторых до 330 нм). Вирионы ИЛТ состоят из сферического нуклеотида, окруженного суперкапсидной оболочкой сложной формы. Вирион обладает икосаэдрическим типом симметрии. Икосаэдрический капсид покрыт липопротеидной оболочкой, имеющей на своей поверхности единицы-пепломеры. Димер нуклеокапсида равен 113±2 нм, усредненный диаметр нуклеокапсида оболочки около 350 нм.

Нуклеокапсиды размером 100-110 нм располагаются в вирусной частице, как правило, эксцентрично, реже - в центре частиц. Геном вируса ИЛТ имеет длину 155000 полинуклеотидов и состоит из длинной уникальной последовательности И1 (120000 полинуклеотидов) и короткой уникальной последовательности Иs (17000 полинуклеотидов). Вирус содержит гликопротеины (205, 160, 115, 90, 85, 74, 60 и 50 кД). Гликопротеин В(gВ) является первым структурным белком вируса ИЛТ.

Антигенные свойства

Штамм "О №112-ДЕП" вируса ИЛТ стабильно нейтрализуется гомологичной сывороткой, идентифицируется в сыворотках крови кур, содержащих антитела к данному вирусу, в РДП, РН и ИФА. В РДП идентифицируется гомологичными гипериммунными сыворотками в титре 1:8. В РН индекс нейтрализации гомологичными гипериммунными сыворотками в разведениях 1:10 и 1:20 в среднем составляет 3,8 lg ЭИД₅₀/см³ соответственно. В ИФА идентифицируется полевыми и лабораторными гипериммунными сыворотками в титре до 1:24579. Антигенные различия штамма "О №112-ДЕП" по отношению к другим штаммам вируса ИЛТ не установлены. Гемагглютинирующими свойствами штамм не обладает.

Биотехнологические характеристики

Штамм "О №112-ДЕП" проявляет высокую биологическую, иммуногенную и антигенную активность как в нативном виде, так и после инактивации. Штамм "О №112-ДЕП" используют для изготовления живой и инактивированной вакцины против ИЛТ птиц и диагностических препаратов. Вирус имеет выраженный тропизм к эпителиальным клеткам слизистой оболочки гортани, трахеи и клоаки птиц. Штамм культивируют в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур. Репродукция вируса происходит в ткани хориоаллантоисной оболочки (ХАО). Инфекционный титр вируса в 10-20% суспензии ХАО на 5 сутки культивирования при условии генерализованного распространения по всей оболочке составляет не менее 6,0 lg ЭИД₅₀/см³.

Хемо- и генотаксономическая характеристика

Штамм "О №112-ДЕП" является ДНК-содержащим вирусом.

Устойчивость к внешним факторам

Вирус чувствителен к липолитическим агентам, теплу и различным дезинфектантам. Температура 55°С разрушает вирус в течение 10-15 мин, а 38°С - за 48 часов. В замороженных тушках больных и вынужденно убитых кур, хранившихся при температуре минус 10, 18 и 28°С, вирус оставался активным более 19 месяцев, на поверхности скорлупы в условиях термостата инактивируется через 12 час, в зараженных птичниках сохраняется не более 9 дней. Полностью инактивируется в 1%-ном растворе креолина в течение 30 секунд. Он длительно сохраняет свою активность в лиофилизованном состоянии или при минус 20-60°С. В лиофилизированном гомогенате ХАО вирус сохраняет инфекционность не менее 1,5 лет. В замороженной ткани ХАО инфекционность вируса сохраняется не менее 4 лет.

Иммуногенность штамма

При вакцинации кур старше 15-дневного возраста окулярным способом в дозе 1000 ЭИД₅₀ и оральным способом (выпойкой) в дозе 4000 ЭИД₅₀ индуцирует выработку специфических антител и создает иммунитет против ИЛТ у 100% вакцинированных кур. В лиофилизованном гомогенате ХАО вирус сохраняет иммуногенность не менее 1,5 лет.

Эпизоотичность штамма

При совместном содержании вакцинированных и интактных птиц передача вакцинного вируса штамма "О №112-ДЕП" по контакту не установлена.

Условие поддержания штамма

Лиофилизованный материал из штамма "О №112-ДЕП" хранят при температуре 4°С, вируссодержащие ХАО - при температуре не выше минус 40°С. Для ресуспендирования лиофилизованного вируса используют изотонический фосфатно-буферный раствор рН 7,4-7,6.

Генетическая чистота

После 20 пассажей на ХАО 9-11-суточных эмбрионов SPF-кур каких-либо изменений иммунобиологических свойств штамма "О №112-ДЕП" не установлено.

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность отсутствует.

Патогенность отсутствует.

Вирулентность отсутствует.

Онкогенность отсутствует.

Контагиозность отсутствует.

Стабильность аттенуации отмечена при проведении 4 пассажей на чувствительных цыплятах.

На основании полученных данных можно утверждать, что штамм "О №112-ДЕП" вируса ИЛТ птиц по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ИЛТ птиц.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа как наиболее близкого по совокупности существенных признаков аналога позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемого способа изготовления вирус-вакцины против ИЛТ птиц, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, заявляемое решение соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемое решение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемый способ изготовления вирус-вакцины против ИЛТ птиц соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1.

Для изготовления вирус-вакцины используют авирулентный для цыплят и безвредный для людей производственный штамм "О №112-ДЕП" вируса ИЛТ птиц с биологической активностью не меньше 6,0 lg ЭИД₅₀/см³, который хранят в лиофилизированном состоянии. Для репродукции вируса используют 9-11-суточные эмбрионы SPF-кур. Яйца для куриных эмбрионов получают из хозяйств, благополучных по инфекционным болезням, в том числе по ИЛТ, или от SPF-кур-несушек, невакцинированных против ИЛТ. Для получения матровой расплодки содержимое трех ампул производственного штамма "О №112-ДЕП" разводят в отношении 1:5 стерильным физиологическим раствором рН 7,2-7,4 с добавлением антибиотиков и полученным вирусом заражают хорошо развитые 9-11-суточные эмбрионы в аллантоисную полость в объеме 0,2 см³. Зараженные эмбрионы инкубируют при температуре 37,0±0,5°С и относительной влажности воздуха 60-70% в течение 5 суток.

На 6 сутки определяют характерные для вируса ИЛТ поражения ХАО. Из пораженных ХАО готовят 15-30% суспензию, которую промораживают и освобождают от крупнодисперсных частиц низкоскоростным центрифугированием. Полученный вируссодержащий материал с биологической активностью не меньше 6,0 lg ЭИД₅₀/см³ используют в качестве матровой расплодки для массового заражения 9-11-суточных эмбрионов SPF-кур. Эмбрионы заражают матровым вирусом в объеме 0,2 см³. Зараженные эмбрионы выдерживают в термостате при 37,5±0,5°С и относительной влажности воздуха 60-70% в течение 5 суток. Все погибшие после 72 часов инкубирования эмбрионы и оставшиеся в живых помещают в холодильные камеры при 2-6°С на 16-18 часов. После охлаждения зараженные эмбрионы вскрывают, извлекают ХАО с характерными изменениями (специфические узелки-бляшки). Пораженные ХАО помещают в холодильник при температуре не выше минус 40°С. ХАО используют для приготовления вируссодержащего материала. Для этого пораженные ХАО размораживают и из них готовят однородную гомогенную массу. Полученный вируссодержащий материал смешивают с защитной средой в соотношении 19:1-17:3, которое соответствует содержанию ингредиентов в полученной предлагаемым способом вирус-вакцине, мас.%:

Вируссодержащий материал 85,0-95,0

Защитная среда до 100,0

и является необходимым для получения препарата с заданной иммуногенной активностью.

В качестве ингредиентов защитной среды используют широко применяемые для этих целей вещества (отдельно или в комбинации): сахарозу, желатозу, лактозу, обезжиренное молоко и т.д. Смесь вируссодержащего материала и защитной среды тщательно перемешивают. Полученную смесь контролируют на стерильность, гемагглютинирующую активность (ГА-активность) в капельной РГА и для определения титра вируса до его лиофилизации. Биологическая активность полуфабриката вакцины, идущего на приготовление вакцины, при титровании на РКЭ должна быть не ниже 6,0 lg ЭИД₅₀/см³. После этого смесь подвергают высушиванию. Для этого после получения положительных результатов контроля полуфабрикат вакцины охлаждают до 2-8°С и расфасовывают в стерильные ампулы или пенициллиновые флаконы так, чтобы толщина слоя разлитого жидкого полуфабриката была не более 1/2 высоты ампулы или флакона. Ампулы и флаконы с полуфабрикатом помещают в специальные металлические кассеты, которые затем устанавливают в холодильную камеру с температурой минус (60±5°C) на 8-24 часа в зависимости от объема суспензии в ампулах и флаконах. Замороженный полуфабрикат подвергают лиофилизации. Продолжительность высушивания полуфабриката составляет 56-72 часа в зависимости от конструкции сублимационной установки и уровня материала во флаконе или ампуле. По окончании сушки флаконы с сухой вакциной укупоривают и закатывают алюминиевыми колпачками. Ампулы с сухой вакциной запаивают. Сухая вирус-вакцина против ИЛТ птиц из штамма "О №112-ДЕП" представляет собой однородную пористую в виде таблетки или аморфную массу светло-коричневого цвета. Массовая доля влаги - не более 3%. Биологическая активность вируса в вакцине должна быть не меньше 6,0 lg ЭИД₅₀/см ³.

Полученная вирус-вакцина против ИЛТ птиц имеет оптимальный компонентный состав (рецептуру), приведенный в таблице 1.

Содержание вируссодержащего материала в диапазоне 85,0-95,0 (мас.%) представляет собой эффективное количество антигена в предлагаемой вакцине.

Перед применением вирус-вакцину разводят разбавителем, который представляет собой 5%-ный раствор глицерина в фосфатно-буферном растворе, помеченный нейтральным пищевым красителем типа индигокармина, и предназначен для приготовления рабочего разведения вакцины при окулярном методе иммунизации птиц и доведения значения рН воды, близкого к нейтральному или слабощелочному, при применении вакцины методом выпаивания.

Вирус-вакцину против ИЛТ птиц из штамма “О №112-ДЕП” подвергают контролю на растворимость, определение массовой доли влаги в препарате, стерильность, биологическую активность, безвредность и иммуногенную активность.

Для определения растворимости вирус-вакцины берут 3 флакона (ампулы) и добавляют в них вышеуказанный разбавитель до первоначального объема вакцины. Сухая масса вакцины полностью растворяется в течение 2-3 минут, образуя гомогенную взвесь без хлопьев и осадка.

Массовую долю влаги определяют по ГОСТу 24061-80, которая не превышает 3%.

Определение стерильности препарата проводят по ГОСТу 28085-89.

Биологическую активность определяют титрованием пробы вирус-вакцины на развивающихся эмбрионах SPF-кур 10-дневной инкубации. В качестве пробы берут 2 флакона (ампулы) вирус-вакцины. Содержимое флаконов (ампул) разводят стерильным физиологическим раствором рН 7,2 до первоначального объема вируса, а затем смешивают и готовят десятикратные разведения от 10^-1 до 10^-8. Каждым разведением заражают по 4 эмбриона в аллантоисную полость в объеме 0,2 см³ . 10 эмбрионов оставляют незараженными в качестве контроля. Эмбрионы инкубируют в течение 120 час при 36,5-37,5°С и относительной влажности воздуха 60-70%. Ежедневно проводят овоскопию эмбрионов. Эмбрионы, павшие в течение 72 час после заражения, собирают и уничтожают, так как их гибель в этот период не специфична. Гибель эмбрионов в последующие дни относят за счет действия вакцинного вируса ИЛТ птиц. Через 5 суток эмбрионы вскрывают. При этом учитывают изменения ХАО, характерные для действия вируса ИЛТ птиц (наличие узелков-бляшек). Титр вируса высчитывают по методу Кербера в модификации Ашмарина. Биологическая активность вакцины должна быть не ниже 6,0 lg ЭИД₅₀/см³.

Проверку вакцины на безвредность проводят на 20 цыплятах старше 25-суточного возраста, свободных от антител к вирусу ИЛТ. Для проверки на безвредность используют 6 флаконов с вирус-вакциной против ИЛТ птиц. Содержимое флаконов разводят до исходного объема вышеуказанным разбавителем, объединяют в общую пробу и готовят два разведения вакцины: первое так, чтобы в 0,05 см³ растворенной вакцины содержалось 10000 ЭИД₅₀ (10-кратная окулярная доза), а второе так, чтобы 1 см³ разведенной вакцины содержал 40000 ЭИД₅₀ (10-кратная оральная доза). В первом случае вакцину вводят глазной пипеткой на обнаженную конъюнктиву глаза 10 цыплятам по одной капле, во втором случае выпаивают по 1 см³ с помощью пипетки такому же количеству цыплят. За цыплятами ведут наблюдение в течение 10 суток. Цыплята должны остаться живыми и клинически здоровыми в течение срока наблюдения. Допускается наличие у части цыплят легко выраженного угнетения, конъюнктивита, ринита и снижения аппетита на 3-5 сутки после введения вакцины. Через 3-4 дня эти явления исчезают.

Для определения иммуногенной активности полученного препарата используют 6 флаконов (ампул) с вирус-вакциной, содержимое каждого из которых доводят разбавителем до первоначального объема, равного объему вакцины до лиофилизации, объединяют и из общей пробы готовят разведения вакцины на разбавителе: для окулярного способа иммунизации так, чтобы 0,05 см³ (объем одной капли) содержал 1000 ЭИД₅₀, а для орального способа, чтобы в 1 см³ препарата содержалось 4000 ЭИД₅₀. В опыт берут 50 цыплят и из них 20 иммунизируют окулярно (по 1 капле в глаз), 20 цыплят - орально (выпаивают 1 см³), а 10 цыплят оставляют в качестве контроля. Через 18 суток после вакцинации подопытных и контрольных цыплят заражают вирулентным штаммом “Богатищевский” вируса ИЛТ птиц. Вирус вводят интратрахеально в дозе 500 ИД₅₀ в объеме 0,5 см³.

За цыплятами наблюдают в течение 10 суток. Перед заражением у вакцинированных цыплят берут кровь, получают сыворотки и исследуют их в ИФА. Вакцина считается иммуногенной, если она предохраняет от заболевания ИЛТ до 16 цыплят из 20, вакцинированных каждым методом. В контрольной группе должно заболеть с клиническими признаками ИЛТ не менее 8 цыплят из 10 зараженных.

Предлагаемой вирус-вакциной иммунизируют клинически здоровую птицу старше 15-суточного возраста. Птицу до 60-суточного возраста вакцинируют дважды с интервалом 14 суток. Иммунитет формируется через 21 сутки после прививки. Повторную вакцинацию проводят через каждые 6 месяцев.

Пример 2.

Проведены испытания иммуногенной активности вирус-вакцины против ИЛТ птиц, изготовленной предлагаемым способом так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

Вируссодержащий материал из аттенуированного штамма

"О №112-ДЕП" вируса ИЛТ птиц, репродуцированного

в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур

с биологической активностью

6,0 lg ЭИД₅₀/см³ 85,0

Защитная среда до 100,0.

Определение иммуногенной активности вакцины проводили на цыплятах. Для этого предварительно приготовили разведение вакцины на разбавителе: для окулярного метода иммунизации так, чтобы 0,05 см³ (объем одной капли) содержал 1000 ЭИД ₅₀, для орального - чтобы в 1 см³ содержалось 4000 ЭИД₅₀. В опыт взяли 50 цыплят и из них 20 иммунизировали окулярно (по 1 капле в глаз), 20 - орально (выпаивали по 1 см ³), а 10 цыплят оставили для контроля. Через 18 суток после вакцинации подопытных и контрольных цыплят заражали вирулентным штаммом "Богатищевский" вируса ИЛТ птиц. Вирус вводили интратрахеально в дозе 500 ЭИД₅₀ в объеме 0,5 см ³. За цыплятами наблюдали в течение 10 суток. Вакцина считается иммуногенной, если она предохраняет от заболевания ИЛТ по 16 цыплят из 20 вакцинированных. В контрольной группе должно заболеть с признаками ИЛТ не менее 8 цыплят из 10 зараженных. Результаты испытаний приведены в таблице 2, которые свидетельствуют о том, что все три серии вирус-вакцины против ИЛТ птиц из штамма "О №112-ДЕП", изготовленные согласно вышеприведенной рецептуре, по всем параметрам соответствуют требованиям, заложенным в технические условия на препарат и практически одинаково эффективны при окулярном и оральном применении на птице. В контрольных группах цыплят заболеваемость ИЛТ была 100%, при этом летальность составила 48,6%.

Пример 3.

Проведены испытания иммуногенной активности вирус-вакцины против ИЛТ птиц, изготовленной предлагаемым способом так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

Вируссодержащий материал

из аттенуированного штамма "О№112-ДЕП"

вируса ИЛТ птиц, репродуцированного

в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур

с биологической активностью

6,0 lg ЭИД₅₀/см³ 90,0

Защитная среда до 100,0.

Данную рецептуру предлагаемой вирус-вакцины испытывали так, как описано в примере 2. Опыты проводили трехкратно. Результаты испытаний приведены в таблице 3, которые свидетельствуют о том, что все три серии вирусвакцины, изготовленные согласно вышеприведенной рецептуре против ИЛТ птиц из штамма "О №112-ДЕП", по всем параметрам соответствуют требованиям, заложенным в технические условия на препарат, и практически одинаково эффективны при окулярном и оральном применении на птице. У цыплят контрольных групп заболеваемость ИЛТ при этом была 100%, летальность по 3 опытам составила 45,8%.

Пример 4.

Проведены испытания иммуногенной активности вирус-вакцины против ИЛТ птиц, изготовленной предлагаемым способом так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

Вируссодержащий материал из аттенуированного штамма "О №112-ДЕП"

вируса ИЛТ птиц, репродуцированного

в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур

с биологической активностью

6,0 lg ЭИД₅₀/см³ 95,0

Защитная среда до 100,0.

Данную рецептуру предлагаемой вирус-вакцины испытывали так, как описано в примере 2. Опыты проводили трехкратно. Результаты испытаний приведены в таблице 4, которые свидетельствуют о том, что все три серии вирус-вакцины против ИЛТ птиц из штамма "О №112-ДЕП", изготовленные согласно вышеуказанной рецептуре, по всем параметрам соответствуют требованиям, заложенным в технические условия на препарат и практически одинаково эффективны при окулярном и оральном применении на птице. В контрольных группах цыплят заболеваемость ИЛТ была 100%, при этом летальность по 3 опытам составила 50,2%.

Пример 5.

Проведены сравнительные испытания иммуногенной активности вирус-вакцины против ИЛТ птиц, изготовленной предлагаемым способом так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

Вируссодержащий материал

из аттенуированного штамма "О №112-ДЕП"

вируса ИЛТ птиц, репродуцированного

в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур

с биологической активностью

6,0 lg ЭИД ₅₀/см³ 85,0

Защитная среда до 100,0

и вирусвакцин против ИЛТ птиц, изготовленных на основе известных отечественных и зарубежных штаммов гомологичного вируса: вирус-вакцины "Laryngo-vac" (Голландия), вирус-вакцины из клона "НТ" штамма "ЦНИИПП" и вирус-вакцины из штамма "ВНИИБП". Изучение иммуногенной активности указанных вакцин проводили на SPF-цыплятах 25-суточного возраста. Всем цыплятам вводили орально и окулярно по одной дозе указанных выше вакцин. Оценку эффективности вакцин проводили по результатам контрольного заражения вирулентным штаммом "Богатищевский" вируса ИЛТ. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 5.

Данные таблицы 5 свидетельствуют о том, что при контрольном заражении вакцинированных цыплят вирулентным штаммом "Богатищевский" вируса ИЛТ только вирус-вакцина из штамма "О №112-ДЕП" данной рецептуры индуцировала формирование иммунитета к ИЛТ у 100% вакцинированных цыплят.

Пример 6.

Проведены сравнительные испытания иммуногенной активности вирус-вакцины против ИЛТ птиц, изготовленной предлагаемым способом так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

Вируссодержащий материал

из аттенуированного штамма "О №112-ДЕП"

вируса ИЛТ птиц, репродуцированного

в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур

с биологической активностью

6,0 lg ЭИД₅₀/см³ 90,0

Защитная среда до 100,0

и вирус-вакцин против ИЛТ птиц, изготовленных на основе известных отечественных и зарубежных штаммов гомологичного вируса: вирус-вакцины "Laryngo-vac" (Голландия), вирус-вакцины из клона "НТ" штамма "ЦНИИПП" и вирус-вакцины из штамма "ВНИИБП". Исследования проводили так, как описано в примере 5. Результаты исследований представлены в таблице 6.

Данные таблицы 6 свидетельствуют о том, что при контрольном заражении вакцинированных цыплят вирулентным штаммом "Богатищевский" вируса ИЛТ только вирус-вакцина из штамма "О №112-ДЕП" данной рецептуры индуцировала формирование иммунитета к ИЛТ у 100% вакцинированных цыплят.

Пример 7.

Проведены сравнительные испытания иммуногенной активности вирус-вакцины против ИЛТ птиц, изготовленной предлагаемым способом так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

Вируссодержащий материал

из аттенуированного штамма "О№112-ДЕП"

вируса ИЛТ птиц, репродуцированного

в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур

с биологической активностью

6,2 lg ЭИД₅₀/см³ 95,0

Защитная среда до 100,0

и вирус-вакцин против ИЛТ птиц, изготовленных на основе известных отечественных штаммов гомологичного вируса: вирус-вакцины "Laryngo - vac" (Голландия), вирус-вакцины из клона "НТ" штамма "ЦНИИПП" и вирус-вакцины из штамма "ВНИИБП". Исследования проводили так, как описано в примере 5. Результаты исследований представлены в таблице 7.

Данные таблицы 7 свидетельствуют о том, что при контрольном заражении вакцинированных цыплят вирулентным штаммом "Богатищевский" вируса ИЛТ только вирус-вакцина из штамма "О №112-ДЕП" данной рецептуры индуцировала формирование иммунитета к ИЛТ у 100% вакцинированных цыплят.

Пример 8.

Проведены испытания иммуногенной активности вирус-вакцины против ИЛТ птиц, изготовленной предлагаемым способом так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

Вируссодержащий материал

из аттенуированного штамма "О №112-ДЕП"

вируса ИЛТ птиц, репродуцированного

в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур

с биологической активностью

6,0 lg ЭИД₅₀/см³ 90,0

Защитная среда до 100,0.

Испытания проведены в неблагополучном по ИЛТ птиц ГУП-АПК "Назарьево" Одинцовского района Московской области. Вирус-вакциной против ИЛТ птиц из штамма "О №112-ДЕП" иммунизировано 240 тыс. голов птицы, из них 80 тыс. бройлеров и 160 тыс. кур-несушек и ремонтного молодняка породы Хайдекс белый. Вакцинацию проводили методом выпаивания согласно наставлению о применении препарата. Наблюдением за привитым поголовьем было установлено, что в неблагополучном птичнике выделение больной птицы продолжалось еще в течение 6 суток, после чего клинические признаки заболевания исчезли и физиологическое состояние цыплят нормализовалось. В птичниках, где признаки ИЛТ отсутствовали, отрицательных реакций на вакцинацию не замечено.

Благополучие по ИЛТ в хозяйстве сохраняется до настоящего времени. Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:

- способ изготовления вирус-вакцины против ИЛТ птиц, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;

- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;

- при использовании предлагаемого способа изготовления вирус-вакцины против ИЛТ птиц на основе штамма "О №112-ДЕП" достигается технический результат, предусмотренный задачей создания изобретения.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации

1. Бабкин В.Ф. и др. Ветеринария. Респ.мiж.вiд. тематич.наук. зб. Киев, 1975, вып.42, 14-19.

2. Авт. свид. СССР №129791; 30h, 6; 1960 г.

3. Дутко Ю.С., Шевченко А.А. и др. Иммунологическая эффективность вирусвакцины против инфекционного ларинготрахеита кур. Ветеринария, 1991, 3, 32-34.

4. Малушко В.В., Соколов В.Д. и др. Опыт борьбы с инфекционным ларинготрахеитом. Птицеводство, 1983, 12, 21-23 (прототип).

Таблица 1 Оптимальный компонентный состав (рецептура) вирус-вакцины против ИЛТиз штамма "О №112-ДЕП", изготовленной предлагаемым способом (мас.%)
Ингредиенты	Минимум	Средний	Максимум
Вируссодержащий материал	85	90	95
Защитная среда	15	10	5
Таблица 2 Иммунобиологичвские характеристики вирус-вакцины против ИЛТ птиц из штамма "О №112-ДЕП", изготовленной предлагаемым способом
№№	Стерильность	Биологическая активность lgЭИД50/см3	Метод введения вакцины	Безвредность	Иммуногенность
Кол-во цыплят в опыте	Из них реагировало на вакцину	Кол-во цыплят в опыте	Из них иммунных	% защиты от вируса ИЛТ
1 опыт	Стерильна	6,1±0,17	Оральный	10	0	20	18	90
Окулярный	10	0	20	20	100
2 опыт	Стерильна	6,0+0,20	Оральный	10	0	20	19	95
Окулярный	10	0	20	20	100
3 опыт	Стерильна	6,20+0,14	Оральный	10	0	20	17	85
Окулярный	10	0	20	18	90
Таблица 3 Иммунобиологические характеристики вирус-вакцины против ИЛТ птиц из штамма "О №112-ДЕП", изготовленной предлагаемым способом
№№	Стерильность	Биологическая активность lgЭИД50/см3	Метод введения вакцины	Безвредность	Иммуногенность
Кол-во цыплят в опыте	Из них реагировало на вакцину	Кол-во цыплят в опыте	Из них иммунных	% защиты от вируса ИЛТ
1 опыт	Стерильна	6,15±0,12	Оральный	10	0	20	18	90
Окулярный	10	0	20	20	100
2 опыт	Стерильна	6,20+0,11	Оральный	10	0	20	17	85
Окулярный	10	0	20	18	90
3 опыт	Стерильна	6,10+0,08	Оральный	10	0	20	18	90
Окулярный	10	0	20	20	100

Таблица 4 Иммунобиологические характеристики вирус-вакцины против ИЛТ птиц из штамма "O №112-ДЕП", изготовленной предлагаемым способом
№№	Стерильность	Биологическая активность lgЭИД50/см3	Метод введения вакцины	Безвредность	Иммуногенность
Кол-во ЦЫПЛЯТ в опыте	Из них реагировало на вакцину	Кол-во цыплят в опыте	Из них иммунных	% защиты от вируса ИЛТ
1 опыт	Стерильна	6,15±0,12	Оральный	10	0	20	17	85
Окулярный	10	0	20	20	100
2 опыт	Стерильна	6,10+0,11	Оральный	10	0	20	18	90
Окулярный	10	0	20	19	95
3 опыт	Стерильна	6,25+0,8	Оральный	10	0	20	18	90
Окулярный	10	0	20	20	100

Таблица 5 Сравнительная оценка иммуногенной активности вирус-вакцин против ИЛТ птиц
Наименование штамма, из которого приготовлена вирус-вакцина	Способы введения	Количество птиц в опыте	Результаты контрольного заражения
заражено	из них иммунных	% защиты от вируса ИЛТ
LARYNGO-VAC (Голландия)	Оральный	20	20	15	75
Окулярный	20	20	18	90
КлонНТ шт.ЦНИИПП	Оральный	20	20	13	65
Окулярный	20	20	12	60
Штамм ВНИИБП	Оральный	20	20	15	75
Окулярный	20	20	15	75
Штамм "О №112-ДЕП" (Россия)	Оральный	20	20	18	90
Окулярный	20	20	20	100
КОНТРОЛЬ	Интратрахеально	10	10	0	0

Таблица 6 Сравнительная оценка иммуногенной активности вирус-вакцин против ИЛТ птиц
Наименование штамма, из которого приготовлена вирус-вакцина	Способы введения	Количество птиц в опыте	Результаты контрольного заражения
заражено	из них иммунных	% защиты от вируса ИЛТ
LARYNGO-VAC (Голландия)	Оральный	20	20	14	70
Окулярный	20	20	18	90
КлонНТ шт.ЦНИИПП	Оральный	20	20	13	65
Окулярный	20	20	12	60
Штамм ВНИИБП	Оральный	20	20	15	75
Окулярный	20	20	14	70
Штамм "O №112-ДЕП" (Россия)	Оральный	20	20	19	95
Окулярный	20	20	20	100
КОНТРОЛЬ	Интратрахеально	10	10	0	0
Таблица 7 Сравнительная оценка иммуногенной активности вирус-вакцин против ИЛТ птиц
Наименование штамма, из которого приготовлена вирус-вакцина	Способы введения	Количество птиц в опыте	Результаты контрольного заражения
заражено	из них иммунных	% защиты от вируса ИЛТ
LARYNGO-VAC (Голландия)	Оральный	20	20	15	75
Окулярный	20	20	17	85
КлонНТ шт.ЦНИИПП	Оральный	20	20	12	60
Окулярный	20	20	11	55
Штамм ВНИИБП	Оральный	20	20	15	75
Окулярный	20	20	15	75
Штамм "O №112-ДЕП" (Россия)	Оральный	20	20	19	95
Окулярный	20	20	20	100
КОНТРОЛЬ	Интратрахеально	10	10	0	0