способ прогнозирования развития и течения хронического лимфолейкоза
Классы МПК: | G01N33/48 биологических материалов, например крови, мочи; приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры) C12Q1/68 использующие нуклеиновые кислоты |
Автор(ы): | Бакиров Б.А. (RU), Бакиров А.Б. (RU), Викторова Т.В. (RU), Гринчук О.В. (RU) |
Патентообладатель(и): | Государственное учреждение "Уфимский научно-исследовательский институт медицины труда и экологии человека Министерства здравоохранения Российской Федерации" (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2003-07-22 публикация патента:
20.03.2005 |
Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и касается способа прогнозирования развития и течения хронического лимфолейкоза. Сущность изобретения заключается в том, что из лимфоцитов периферической крови выделяют ДНК методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК, проводят генотипирование полиморфизма промоторной области гена TNF- и TNF-. При выявлении генотипа LT22, характеризующегося наличием мутации гена TNF- в гомозиготном состоянии, выявляют лиц, предрасположенных к развитию хронического лимфолейкоза, а при определении комбинаций генотипов TNF22/LT22 или TNF12/LT11 у больных хроническим лимфолейкозом прогнозируют агрессивное течение заболевания. Преимущество изобретения заключается в повышении точности прогнозирования. 3 табл.
Формула изобретения
Способ прогнозирования развития и течения хронического лимфолейкоза путем типирования полиморфизма ДНК лимфоцитов, выделенных из крови больного, генов TNF-alfa и TNF-beta, отличающийся тем, что из лимфоцитов периферической крови выделяют ДНК методом полимеразно-цепной реакции синтеза ДНК, проводят генотипирование полиморфных локусов - 308GА и +252АG промоторных областей генов TNF- и и при выявлении генотипа LT22, характеризующегося наличием мутации гена TNF- в гомозиготном состоянии, выявляют лиц, предрасположенных к развитию хронического лимфолейкоза, а при определении комбинаций генотипов TNF22/LT22 или TNF12/LT11 у больных хроническим лимфолейкозом прогнозируют агрессивное течение заболевания.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано для прогнозирования развития и течения хронического лимфолейкоза.
Согласно современным представлениям хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) является опухолью кроветворной системы, характеризующейся пролиферацией и аккумуляцией морфологически зрелых лимфоцитов, в большинстве случаев имеющих фенотип В-лимфоцитов, реже - Т-лимфоцитов. При классической форме ХЛЛ наблюдается прогрессирующий лимфатический лейкоцитоз, диффузная зрелоклеточная пролиферация в лимфоузле и трепанобиоптате костного мозга, увеличение лимфоузлов, селезенки, нередко печени.
По новой переработанной и дополненной классификации гемобластозов лимфатической природы А.И. Воробьева и М.Д. Бриллиант (1999) хронический В-клеточный лейкоз относится к зрелоклеточным опухолям лимфатической системы. Согласно этой классификации больные были разделены на 2 группы - с агрессивным и доброкачественным течением заболевания [Воробьев А.И., Кременецкая А.М., Д.В. //Гематол. и трансфузиол. - 2000, -Т.45, N 3. -C.4-14].
Все формы с агрессивным течением требуют назначения полихимиотерапии, при данном течении прогноз неблагоприятный, наблюдается лекарственная резистентность. Таким образом, раннее определение прогноза позволило бы:
- оптимизировать терапию данного заболевания;
- повлиять на качество жизни этих пациентов;
- снизить количество затрачиваемых средств государством на лечение данных больных.
Известны традиционные способы прогнозирования развития ХЛЛ, например:
Критерии прогнозирования ХЛЛ.: [Nelson К., Bruce D. Cheson /The Oncologist 1999; 4:352-369]
- Удвоение времени лимфоцитов (<12 месяцев - прогноз хуже);
- Диффузная инфильтрация лимфоцитами костного мозга в биопсийном материале (плохой прогноз);
- Сывороточный -2 микроглобуллин (повышенный уровень - прогноз хуже);
- Растворимый CD23 в сыворотке и ЛДГ (повышенный уровень - прогноз хуже).
Аналогом предлагаемого изобретения является способ прогнозирования течения ХЛЛ путем определения хромосомных нарушений. По мнению большинства исследователей, наличие дополнительной хромосомы 12 прогностически неблагоприятно [Juliusson G., Меrup М. Sem. OncoL-1998. -Vol.25. -P.19-26]. Существует точка зрения, что дополнительная хромосома не влияет на прогноз [Geisler С., Philip P., Christensen В. et al Leuk. Res. -1997. -Vol.21. -P.1011-1023]. Также есть мнение, что хронический лимфолейкоз с трисомией 12 представляет собой отдельный вариант болезни с атипичной морфологией лимфоцитов и относительно неблагоприятным течением [Oscier D.G. In: VIII intemat Worksh. On CLL. Darwin medical Communication Ltd.-Oxford Chise, U.K., 1999 -P.17]. Крайне неблагоприятны в прогностическом отношении и делеции хромосомы 11 [Neilson J., Auer R., White D. et al. Leukemia. -1997. -Vol.11. -P.1929-1932]. Медиана выживаемости у данных больных 64 мес.
Недостатками данных способов является следующее.
1. Дороговизна и значительная трудоемкость выполнения данной методики как в амбулаторных, так и в условиях стационара.
2. Достаточно большой выбор неблагоприятных в прогностическом отношении хромосомных нарушений.
3. Большое количество противоречивых литературных данных относительно возможного прогностического значения того или иного хромосомного нарушения.
Другой аналог предлагаемого изобретения - способ прогнозирования развития ХЛЛ путем определения сывороточного уровня интерлейкина-6 (ИЛ-6), который является индикатором активности течения ХЛЛ [Robak Т., Wierzbowska A., Blasinska-Morawiec M et al: Mediators inflamm. - 1999. -Vol. 8(6). - P.277-86]. Так в работе [Fayad L, Keating M.J., Reuben M.J. at al: Blood. - 2001. - Vol.97(1).-P.256-63] показано, что уровень ИЛ-6 и ИЛ-10 был выше у пациентов с ХЛЛ по сравнению с контролем. Пациенты с повышенным уровнем ИЛ-6 и/или ИЛ-10 имели худшую медиану или 3-х летнюю выживаемость и неблагоприятные характеристики (предшествующая температура, увеличение уровня бета-2 микроглобулина или лактат-дегидрогеназы или стадию заболевания по Раи III или IV. Результаты [Hulkkonen J., Vilpo J., Vilpo L. et al: Br J Haematol. - 1998. - Vol.100 (3). - P.478-83] свидетельствуют, что различная способность продуцировать ИЛ-6 и фактора некроза опухоли-альфа (TNF-) может играть роль при В-ХЛЛ прогрессии и клинической манифестации этого заболевания.
Вместе с тем к недостаткам способа следует отнести следующие:
1) относительно высокую вариабельность сывороточного уровня (СУ) ИЛ-6 даже в течение суток у одного и того же пациента (например, утреннее или послеобеденное время);
2) наличие сопутствующих заболеваний у пациентов может существенно влиять на регистрируемый СУ ИЛ-6. Главным недостатком способа является невозможность выделить группы благоприятного (неблагоприятного) течения заболевания на начальной стадии и тем самым осуществить своевременные профилактические мероприятия (адекватная химиотерапия).
Прототипом данного изобретения является метод, описанный Demeter J. и др. (Demeter J., Porzolt F., Ramiisch S., Schmidt D., Schmidt M., Messer G. Polymorphism of the tumor necrosis factor-alfa and lymphotoxin-alpha genes in chronic lymphocytic leukaemia. // Br. J. Haematol, 1997, Apr; 97(1):107-12), сообщающий о повышении частоты полиморфизма гена TNF-альфа и TNF-бета у больных ХЛЛ по сравнению с контрольной группой. Было выявлено значительное увеличение частоты встречаемости аллели TNF 1 полиморфизма гена TNF-alfa -308G в группе 73 больных ХЛЛ по сравнению с контролем (RR=3.18, границы 95% доверительного интервала 1,57-8,3; р=0.006). А также было выявлено увеличение частоты аллея TNF-beta LT2 у больных ХЛЛ (р=0.004). На основании полученных данных авторы сделали заключение о вовлечении иммуногенетической ассоциации с вовлечением полиморфизма генов цитокинов TNF/LT как паракринных и аутокринных факторов роста в патогенез ХЛЛ.
Недостатками данного метода является следующее.
1. Отсутствие данных о полиморфизме указанных генов при ХЛЛ в зависимости от вариантов течения заболевания.
2. Отсутствие данных об изучении особенности комбинаций генотипов по локусам TNF- и у больных ХЛЛ.
Технический результат - повышение точности прогнозирования развития и течения ХЛЛ. Технический результат достигается тем, что на ранней стадии развития заболевания проводят генотипирование полиморфизма промоторной области гена TNF-alfa и TNF-betta и при выявлении генотипа LT22 выявляют лиц, предрасположенных к развитию ХЛЛ, а при определении комбинации генотипов TNF22/LT22 и TNF12/LT11 прогонозируют у больных ХЛЛ агрессивное течение заболевания.
Способ осуществляется следующим образом.
Выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови.
Материалом для молекулярно-генетического исследования служили образцы ДНК крови. Кровь набирали в пробирки со стандартным консервантом (1 мл глюгицира) в соотношении 4:1. До выделения ДНК кровь хранили при температуре +4°С не более 1 месяца. ДНК выделяли из лимфоцитов периферической венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew С.С., 1984). Для этого к 4 мл крови добавляли 50 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритона Х 100, 5 мМ MgCl 2, 10 мМ трис-HCl рН 7,6. Ядра лимфоцитов осаждали центрифугированием при 4°С и 4000 об/мин в течение 20 минут; к осадку добавляли 8 мл раствора, содержащего 25 мМ EDTA (рН=8,0), суспендировали, добавляли 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/мл, затем инкубировали при 42°С 16 часов. Очистка ДНК от белков производилась с помощью последовательной эктракции раствора ДНК забуференным фенолом (рН=7,8), смесью фенол-хлороформа (1:1) и хлороформом. При этом фенол активно денатурирует белки, смесь фенол-хлороформа полностью ингибирует РНК-зную активность, в результате последней экстракции хлороформом из препарата ДНК удаляют остатки фенола. Экстракцию производили, смешивая раствор ДНК и растворитель до образования эмульсии. Разделение фаз проводили ценрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 мин. Осаждение ДНК производилось добавлением двух объемов охлажденного 96% этанола. Осажденную ДНК дважды промывали 70% этанолом, удаляли этанол из пробирки и подсушенный осадок ДНК растворяли в деионизированной Н2О. Раствор ДНК хранили при -20°С.
Проведение полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.
Анализ полиморфных локусов генов -308GA промоторного участка гена фактора некроза опухолей (-308TNF-) и +252АG интрона 1 гена фактора некроза опухолей (+252TNF-) проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) на термоциклере в автоматическом режиме с использованием локусспецифических олигонуклеотидных праймеров Полиморфизм -308GA промоторной области гена TNF- выявляли с использованием праймеров, один из которых содержит искусственную однонуклеотидную замену для создания сайта рестрикции в нативной последовательности ДНК для рестриктазы NcoI (Wilson A.G. et al., 1993). Условия ПЦР и состав ПЦР-смеси идентичны вышеизложенным. Продукт ПЦР длиной 108 пн подвергали ферментному гидролизу рестриктазой Ncol при температуре 37°С. Аллель TNF-22 размером 108 пн (генотип АА) типировался на электрофорезе в 7% ПААГ по отсутствию сайта рестрикции, аллель TNF-11 (генотип GG), содержал сайт рестрикции и идентифицировался по наличию двух фрагментов длиной 88 и 20 пн (Wilson A.G.et аl., 1993).
Полиморфизм +252AG интрона 1 гена ФНО- выявляли методом ПЦР с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров. Условия ПЦР и состав ПЦР-смеси идентичны вышеизложенным. Продукт ПЦР длиной 300 пн подвергали ферментному гидролизу рестриктазой Ncol при температуре 37°С. Аллель TNF12 размером 300 пн (генотип АА) типировался на электрофорезе в 7% ПААГ по отсутствию сайта рестрикции, тогда как при наличии сайта рестрикции идентифицировался мутантный аллель TNF-22 (генотип GG).
В качестве контроля обследовали группу здоровых индивидов, проживающих на территории республики Башкортостан (101 человек), у которых отсутствовали какие-либо злокачественные заболевания.
В группу с доброкачественным течением ХЛЛ вошли больные с медленным нарастанием лейкоцитоза, очаговым типом роста в костном мозге, незначительным увеличением периферических лимфоузлов и селезенки. В начальной стадии заболевания лечение больным данной группы не назначается.
В группу с агрессивным течением ХЛЛ вошли больные с прогрессирующей формой (быстрое увеличение лимфоузлов и селезенки, диффузный или диффузно-интерстициальный рост опухоли в костном мозге), опухолевой формой ХЛЛ (наличие больших плотных конгломератов лимфоузлов, диффузный рост опухоли в костном мозге) и абдоминальной формой (отличающейся наличием конгломератов лимфоузлов в брюшной полости и диффузной пролиферации в трепанате). Данным категориям больных требовалось назначение полихимиотерапии.
Группа больных ХЛЛ с доброкачественным течением составила 54 человека, группа с агрессивным течением заболевания - 50 человек. В качестве контроля обследована группа практически здоровых доноров, подобранных в соответствии с возрастом и полом исследуемых групп больных.
Молекулярно-генетическое изучение полиморфного локуса -308GА промоторного участка гена TNF-. В табл.1 приведены результаты изучения полиморфного локуса -308GA промоторного участка гена TNF-. В группе больных ХЛЛ частота генотипа TNF2/2 гомозиготного по мутантным аллелям и определяющего повышенный уровень экспрессии гена ФНО-, составила 2,88%, частота аллеля TNF2 - 22,31%, что не имеет достоверных отличий по сравнению с контрольной группой, где на долю генотипа TNF2/2 и аллеля TNF2 приходится 2,13 и 19,29% соответственно. Полученные результаты согласуются с аналогичными литературными данными, представленные в работах Mainou-Fowler Т. и Wihiborg С. [Mainou-Fowler Т., Dickinson A. M., Taylor P.R. et al. // Leuk Lymphoma 2000 Aug; 38(5-6):547-52; Wihiborg C., Sjoberg J., Intaglietta M., et al. //Br. J. Haematol 1999 Feb;104(2):346-9]. Авторами этих исследований был изучен полиморфизм гена TNF- у больных с В-ХЛЛ и болезнью Ходжкина. Результаты этих работ показали отсутствие достоверных различий между группами больных и контролем по распределению частот аллелей.
В результате изучения характера распределения частот генотипов у больных ХЛЛ в зависимости от степени тяжести клинического течения заболевания выявлено увеличение частоты встречаемости мутантного генотипа TNF2 полиморфного локуса - 308GA TNF- у больных с агрессивным течением ХЛЛ до 4,0% по сравнению с доброкачественным течением заболевания, 1,9%. Хотя применение критерия 2 не выявило достоверных различий по частотам аллелей между больными хроническим лимфолейкозом и контрольной группой ( 2=0,01; р=0,95), что может быть обусловлено недостаточностью выборки, повышение частоты мутантного генотипа у больных с опухолевой формой свидетельствует о возможной прогностической значимости данного генетического маркера.
Таблица 1 Распределение частот генотипов и аллелей полиморфного локуса -308GA промоторного участка гена TNF- | ||||||
Обследованные группы | Объем выборки | Частота генотипов (%) | Частота аллелей (%) | |||
TNF11 | TNF12 | TNF22 | TNF1 | TNF2 | ||
Контроль | 101 | 76,59 | 21,28 | 2,13 | 80,71 | 19,29 |
Больные ХЛЛ, в целом | 104 | 72,12 | 25,00 | 2,88 | 77,69 | 22,31 |
Доброкачественное течение | 54 | 72,2 | 25,9 | 1,9 | 77,9 | 22,1 |
Агрессивное течение | 50 | 72,0 | 24,0 | 4,0 | 77,4 | 22,6 |
Молекулярно-генетическое изучение полиморфного локуса +252АG гена TNF-P. В табл.2 приведены результаты изучения полиморфного локуса +252АG гена TNF-. Как видно из полученных данных, только один генотип, а именно генотип LT22, характеризующийся наличием мутации гена ФНО- в гомозиготном состоянии, у больных хроническим лимфолейкозом встречался более чем в 2 раза чаще по сравнению с контролем (9,00% и 3,55% соответственно). Применение критерия 2 показало достоверность различий ( 2=3,82; р=0,05). Для генотипа LT*22 был рассчитан показатель OR, который для больных хроническим лимфолейкозом составил 2,68, что указывает на повышение вероятности развития хронического лимфолейкоза у данной категории индивидов.
Таблица 2 Распределение частот генотипов и аллелей полиморфного локуса +252AG промоторного участка гена TNF- | ||||||
Обследованные группы | Объем выборки | Частота генотипов (%) | Частота аллелей (%) | |||
LT11 | LT12 | LT22 | LT1 | LT2 | ||
Контроль | 101 | 55,03 | 41,42 | 3,55 | 68,21 | 31,79 |
Больные ХЛЛ, в целом | 104 | 55,00 | 36,00 | 9,00 | 66,91 | 33,09 |
Доброкачественное течение | 52 | 53,84 | 36,54 | 9,62 | 66,19 | 33,80 |
Агрессивное течение | 48 | 56,25 | 35,42 | 8,33 | 67,69 | 32,31 |
Анализ комбинаций генотипов по локусам TNF- и TNF- больных хроническим лимфолейкозом. Принимая во внимание, что гены TNF- и TNF- расположены на одной хромосоме в непосредственной близости (локус 6р21.3), целесообразным представлялось изучить особенности комбинаций генотипов по изученным локусам и характер сцепления между ними. Данные по распределению комбинаций генотипов приведены в табл. 3.
В качестве прогностически неблагоприятных комбинаций генотипов по локусам TNF- и TNF- следует отметить варианты TNF22/LT22 и TNF12/LT11, частота которых при агрессивном течении ХЛЛ оказалась почти в 2 раза выше, чем при доброкачественной форме заболевания. Показатели OR в отношении агрессивного течения ХЛЛ составили 2,22 для сочетания TNF22/LT11 и 2,27 для комбинации генотипов TNF12/LT11. Полученные результаты позволяют использовать данные комбинации генотипов по локусам TNF- и в качестве генетических маркеров предрасположенности к агрессивному течению ХЛЛ.
Таблица 3 Распределение генотипов по локусам TNF- и TNF- у больных хроническим лимфолейкозом и в контроле | ||||
Комбинации генотипов -308/+252 | Частота (%) | |||
Контроль (n=101) | Больные ХЛЛ, в целом (n=104) | Доброкачественное течение (n=52) | Агрессивное течение(n=48) | |
TNF11/LT11 | 44,94 | 47,12 | 50,0 | 47,92 |
TNF11/LT12 | 18,35 | 18,27 | 15,38 | 22,92 |
TNF11/LT22 | 1,89 | 3,85 | 5,77 | 2,08 |
TNF22/LT11 | 1,27 | - | - | - |
TNF22/LT12 | 0,63 | - | - | - |
TNF22/LT22 | 0.63 | 2,88 | 1,92 | 4,17 |
TNF12/LT11 | 9,49 | 5,77 | 3,85 | 8,33 |
TNF12/LT12 | 21,52 | 16,35 | 21,15 | 12,5 |
TNF12/LT22 | 1,27 | 1,92 | 1,92 | 2,08 |
Таким образом, определение генотипа LT22, характеризующегося наличием мутации гена TNF- в гомозиготном состоянии, позволит выявлять лица, предрасположенные к возникновению ХЛЛ.
В качестве прогностических маркеров для выявления лиц, предрасположенных к агрессивному течению ХЛЛ должны определяться комбинации генотипов TNF22/LT22 и TNF12/LT11 у больных ХЛЛ.
Для иллюстрации приведем некоторые клинические примеры.
Б-ая М-о., 1937 года рождения, город Белебей, Республика Башкортостан. Диагноз ХЛЛ установлен в апреле 1996 года, подтвержден стернальной пункцией, костный мозг богат клеточными элементами, представлен зрелыми лимфоцитами 89%. Регулярно получает полихимиотерапию с включением циклофосфана, преднизолона. В настоящее время диагноз ХЛЛ, стадия по К.Rai III, продолжает принимать лечение, наблюдается прогрессирование течения заболевания, увеличение количества лимфоузлов, увеличение их до 2 см в диаметре, группирование их в конгломераты, при пальпации отмечается болезненность. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфных участков генов TNF- и в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой Hsp92II провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. Исследование полиморфных локусов генов TNF- и больной выявило генотип LT22, свидетельствующий о предрасположенности к возникновению ХЛЛ, а выявление комбинации генотипов TNF22/LT22 позволило прогнозировать агрессивное течение заболевания.
Пациентка К-ва 1948 года рождения, г.Учалы, Республика Башкортостан. Диагноз ХЛЛ установлен в сентябре 2000 года, подтвержден стернальной пункцией, 95%-зрелых лимфоцитов. Неоднократно проводилось лечение циклофосфаном и преднизолоном. Смерть наступила в декабре 2002 г, на фоне прогрессирования лимфоцитоза до 250×109 /л, анемии -Нв-43 г/л, Тромбоцитопении-Рlt-31×109 /л. Гиперсплено-, гепатомегалия. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфных участков генов TNF- и в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой Hsp92II провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. При исследовании установлена комбинация генотипов TNF12/LT11, что позволило нам прогнозировать агрессивное течение болезни.
Б-ая М-в., 1944 года рождения, город Нефтекамск, Республика Башкортостан. Диагноз ХЛЛ установлен в сентябре 1998 года, подтвержден стернальной пункцией, костный мозг богат клеточными элементами, представлен зрелыми лимфоцитами - 67%. Получает Хлорбутин 5 мг 4 раза в день. В настоящее время диагноз ХЛЛ, стадия по К.Rai II, продолжает принимать лечение, наблюдается стабильное течение заболевания. Увеличены периферические лимфоузлы до 1,0 см в диаметре, при пальпации мягкие, безболезненные. Умеренная гиперспленомегалия, печень по краю реберной дуги. WBC - 106×109/л, RВС - 3,94×1012/л, PLT - 156×109 /л, Нв - 123 г/л. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфных участков генов TNF- и в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой Hsp92II провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. Исследование полиморфных локусов генов TNF- и больной не выявило генотип LT22 свидетельствующий о предрасположенности к возникновению ХЛЛ. При изучении локусов генов TNF- и была выявлена комбинация генотипов TNF11/LT11, в данном случае мы не можем точно прогнозировать течение заболевания, возможен был как доброкачественный, так и злокачественный вариант течения болезни; стратегия химиотерапии выбиралась исходя из традиционных критериев.
Таким образом, нами проведено молекулярно-генетическое изучение полиморфных локусов -308GA и +252AG промоторных областей генов TNF- и у больных с хроническим лимфолейкозом и в контрольной группе. Установлено, что у лиц с выявленным генотипом LT22 характеризующегося наличием мутации гена TNF-P в гомозиготном состоянии, возможность развития ХЛЛ значительно выше по сравнению с контролем. Определение комбинаций генотипов TNF22/LT22 и TNF12/LT11 у больных ХЛЛ, позволяют прогнозировать агрессивные варианты течения ХЛЛ на самых ранних стадиях развития заболевания.
Класс G01N33/48 биологических материалов, например крови, мочи; приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры)
Класс C12Q1/68 использующие нуклеиновые кислоты