фосфолипидные комплексы проантоцианидина а2 в качестве антиатеросклеротических агентов

Формула изобретения

1. Комплексы фосфолипидов и проантоцианидина А2.

2. Комплексы по п.1, в которых фосфолипиды выбирают из лецитинов, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина.

3. Комплексы по п.2, в которых фосфолипид представляет собой фосфатидилхолин.

4. Комплексы по любому из пп.1-3, в которых массовое соотношение проантоцианидина А2 и фосфолипида находится в интервале от 2:1 до 1:2.

5. Комплексы по любому из пп.1-4 в качестве активного агента для профилактики или терапевтического лечения атеросклероза и инфаркта миокарда и головного мозга.

6. Фармацевтическая композиция для профилактики и терапевтического лечения атеросклероза и инфаркта миокарда и головного мозга, включающая в качестве активного ингредиента комплекс по любому из пп.1-4 и фармацевтически приемлемый носитель.

7. Фармацевтическая композиция по п.6 в виде стандартной дозы, включающей от 50 до 500 мг активного ингредиента.

8. Фармацевтическая композиция по п.6 или 7 для перорального введения.

9. Фармацевтическая композиция по любому из пп.6-8 в форме мягких или твердых желатиновых капсул или таблеток.

Описание изобретения к патенту

ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение относится к фосфолипидным комплексам проантоцианидина А2 или экстрактам, обогащенным проантоцианидином А2, и к их применению для изготовления лекарственных средств для профилактики и лечения атеросклероза и инфаркта миокарда и головного мозга.

Проантоцианидин А2 или 8,14-метан-2Н,14Н-1-бензопиран-[7,8-d][1,3]бензодиоксоцин-3, 5, 11, 13, 15-пентол-2,8-бис-(3,4-дигидроксифенил) 3, 4-дигидро [2R-2, 3, 8, 14, 15R)] формулы (I)

был выделен из семян Aesculus hippocastanum (Tetrahedron Lett., 429, 1966). Терапевтическое применение проантоцианидина А2 в качестве рубцующего, цитозащитного, противоязвенного, венотонического, вазозащитного и антипероксидативного агента описано а ЕР-А-210785 (4 февраля 1987 г.).

В настоящее время неожиданно было установлено, что фосфолипидные комплексы проантоцианидина А2 обладают выраженной антиатеросклеротической активностью как у животных, так и у человека при системном введении, предпочтительно, пероральным путем.

Комплексы по настоящему изобретению могут состоять из натуральных синтетических фосфолипидов, таких как лецитины, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин. Соотношение проантоцианидина А2 и фосфолипидов изменяется от 2:1 до 1:2, и, предпочтительно, составляет около 1:1,5 масс/масс. Особенно предпочтительным комплексом является комплекс с фосфатидилхолином сои.

Комплексы по настоящему изобретению получают взаимодействием раствора фосфолипида и раствора проантоцианидина А2 в подходящих растворителях, таких как ацетон, этилацетат, этанол, с последующей концентрацией реакционной смеси при пониженном давлении, с получением густого остатка, который можно размалывать.

Комплексы по настоящему изобретению в зависимости от доз предотвращают или уменьшают образование атеросклеротических бляшек. Указанная активность наблюдалась на кроликах, которые получали гиперхолестеринемический рацион для того, чтобы вызвать образование атеросклеротических повреждений, подобных таким повреждениям у человека, на сосудистом уровне, особенно, в дуге аорты, брюшной аорте, сонных артериях и сосудах головного мозга. На указанной модели вышеупомянутые фосфолипидные комплексы изменяют состояние сосудов на макро- и микуровнях, уменьшая, по сравнению с нелеченными животными как количество, так и тяжесть атероматозных бляшек, с удивительно благоприятным действием на сосуды и ткани. На другой модели атеросклероза, с целью защиты головного мозга, когда просвет внутренней сонной артерии кролика уменьшали хирургическим путем, а животные получали гиперхолестеринемический рацион, богатый насыщенными жирами, наблюдалось уменьшение обструкции сонных артерий, уменьшение толщины сосудистых стенок и повышение выживаемости животных. У пациентов, страдающих атеросклерозом, после шести месяцев лечения наблюдалось уменьшение обструкции сонных артерий, вызванной атероматозными бляшками, и улучшение кровотока через сонные артерии, что оценивали с помощью допплеровского ультразвукового исследования.

Фосфолипидные комплексы проантоцианидина А2 можно применять в виде лекарственных форм, подходящих для перорального введения, таких как таблетки, мягкие и твердые желатиновые капсулы, в дозах, в интервале от 50 до 500 мг, два - три раза в день, в зависимости от тяжести заболевания. Изготовление препаративных фармацевтических форм можно осуществлять с использованием обычных технологий и наполнителей.

Следующие ниже примеры иллюстрируют настоящее изобретение более подробно.

Пример 1

Получение комплекса проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином

К раствору 1577 г фосфатидилхолина в 5 литрах этилацетата с температурой 70° добавляли раствор 1 кг проантоцианидината с температурой 70° добавляли раствор 1 кг проантоцианидина А2 в 5 литрах ацетона.

Смесь кипятили с обратным холодильником при перемешивании и выпаривали до сухости в вакууме. Остаток высушивали в вакууме при температуре 50°С в течение 24 ч, затем размалывали до получения частиц желаемого размера.

Пример 2

32 новозеландских кролика разделяли на 4 группы по 8 животных в каждой и обрабатывали следующим образом:

Группа 1): контроль, нормальный рацион

Группа 2): гиперхолестеринемический рацион (0,2 мас.% холестерина)

Группа 3): гиперхолестеринемический рацион + фосфолипидный комплекс проантоцианидина А2, экстракт (0,2 мас.% холестерина +2 мас.% комплекса примера 1).

Группа 4): гиперхолестеринемический рацион + экстракт проантоцианидина А2 (0,2 мас.% холестерина + проантоцианидин А2 в количестве, эквивалентном тому, которое имеется в 2 мас.% комплекса примера 1).

Спустя 8 недель лечения, в ходе которого измеряли уровни холестерина, ЛПНП/ЛПОНП, ЛПВП и триглицеридов, животных умерщвляли.

Оценивали количество, размер и распределение атеросклеротических повреждений в грудной и брюшной аорте.

Полоски аорты фиксировали и окрашивали Суданом IV для визуализации повреждений и оценки сосудистого холестерина и содержания окисленного холестерина с помощью газовой хроматографии.

Результаты, представленные в следующей таблице, доказывают, что лечение фосфолипидными комплексами проантоцианидина А2 заболеваний статистически достоверным образом уменьшает атеросклеротические повреждения, индуцированные гиперхолестеринемическим рационом.

Таблица
Лечение	Процент площади повреждения
Группа 1	0,5%
Группа 2	34%
Группа 3	7,5%*
Группа 4	30%

*р<0,01 по сравнению с группой 2.

Пример 3

Капсулы, содержащие 500 мг фосфолипидного комплекса проантоцианидина А2.

Состав:

Комплекс проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином сои 150 мг

Лактоза 57 мг

Модифицированный крахмал 40 мг

Стеарат магния 3,0 мг

Пример 4

Энтеросолюбильные таблетки

Комплекс проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином сои 200 мг

Микрокристаллическая целлюлоза 118 мг

Осажденный диоксид кремния 3 мг

Стеарат магния 4 мг

Анионный полимер метакриловой кислоты

и его сложные эфиры 12 мг

Тальк 8 мг

Карбонат магния 8 мг

Кукурузный крахмал 5 мг

Аравийская камедь 159 мг

Пример 5

Мягкие желатиновые капсулы

Комплекс проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином сои 216 мг

Арахисовое масло 209 мг

Частично гидрогенизированные растительные масла 100 мг

Лецитин сои 5 мг

Пример 6

Данные физико-химических исследований комплекса проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином при массовом соотношении 1:1,5 (масс/масс)

Обозначения

Проантоцианидин А2 представляет собой димер эпикатецина типа А, а именно эпикатецин-(27, 27)-эпикатецин, в котором две единицы эпикатецина связаны через С-4 - С-8 и С-2 - О-7 связи.

Фосфатидилхолин (торговое наименование (Phospholipon® 90G) представляет собой очищенный фосфатидилхолин, полученный из лецитина сои.

Ниже представленные данные растворимости, термогравиметрического/дифференциального термического анализа (профиль ТГ/ДТА), ИК-спектроскопии, ¹Н-ЯМР и 13С ЯМР спектроскопии для комплекса проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином при массовом соотношении 1:1,5 (масс/масс) индивидуальных соединений проантоцианидина А2 и фосфатидилхолина, а также для физической смеси фосфатидилхолином в том же весовом соотношении.

1. Профиль растворимости

Растворимость комплекса проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином в сравнении со смесью проантоцианидин А2/фосфатидилхолин испытывали в соответствии с методикой, описанной в Eur.Ph., III Ed.

Полученные результаты представлены в таблице.
	толуол	хлороформ	вода
проантоцианидин А2	нерастворим	нерастворим	нерастворим
фосфатидилхолин	легкорастворим	легкорастворим	нерастворим
комплекс проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином	нерастворим	легкорастворим	нерастворим
смесь проантоцианидин А2/ фосфатидилхолин	слаборастворима	нерастворима		нерастворима

2.Термический анализ

Методика и оборудование

Установка для термогравиметрического/дифференциального термического анализа (ТГ/ДТА) Seiko 6200 с программой EXTAR 6000 ver. 5.7, с использованием открытого алюминиевого тигля ( 6 мм). Поток тепла регистрировали от 25°С до 300°С с линейной скоростью нагрева 5°С/мин под током азота 200 мл/мин. ТГ/ДТА нормализовали на основе массы.

Проантоцианидин А₂

ТГ/ДТА профиль (термогравиметрический/дифференциальный термический анализ) показывает высвобождение растворителя кристаллизации при 96°С с соответствующей потерей массы 7,2%, что согласуется с бигидратом. Процесс разложения наблюдают после 240°С с пиком ДТА при 241,7° (Фиг.1).

Комплекс проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином

Профиль не показывает эндотермического пика из-за потери растворителя кристаллизации. Потеря при сушке, составляющая 2,57%, может быть отнесена за счет потери несвязанного растворителя. Процесс разложения начинается при примерно 200°С с переходом при 258,3°С. Твердое состояние проантоцианидина А₂ в фитосоме отличается от чистого вещества (Фиг.2).

Смесь проантоцианидин А₂/фосфатидилхолин

Хотя термический профиль показывает поведение, подобное наблюдаемому для проантоцианидина А₂, наблюдали потерю растворителя кристаллизации (8,15%) с переходом при 108,7°С с последующей дополнительной потерей растворителя (например, воды в липидах). Общая потеря массы составила 9,66%. Твердое состояние отличается, и никакого перехода не происходит при температуре выше 240°С (Фиг.3).

3. Инфракрасный спектр

Методика и оборудование

ИК-спектры записывали на спектрометре Маgnа 550 Series II с Фурье преобразованием. Спектры проантоцианидина А2 и комплекса проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином получали с использованием пластины КВг (степень чистоты для спектроскопии), спектры фосфатидилхолина и смеси проантоцианидин А₂/ фосфатидилхолин - в ячейке NaCl. Оборудование было снабжено оптической скамьей, стандартным детектором DTGS, расщепителем КВr и программой OMNIC ver. 5.1. Спектр получали как результат сбора и преобразования совокупности 32 сканов в области спектра 4000-400 см^-1, при разрешении 4 см^-1.

Фосфатидилхолин

Инфракрасный спектр (Фиг.4, 5) показывает симметричные и асимметричные вытянутые полосы для групп СН₂ при 2852 и 2924 см^-1 , глубокую полосу поглощения группы СН₂ при 1466 см ^-1, и вытянутую полосу для С=О при 1736 см^-1 , симметричные и асимметричные вытянутые полосы поглощения фосфатной группы при 1088 и 1236 см^-1. При 968 см^-1 присутствует также полоса, показывающая внеплоскостной изгиб ("извивы") С-Н на трансдвойной связи. Это согласуется с составом ацильных остатков (олеиновой кислоты 10±3%, линолевой кислоты 66±5%, линоленовой кислоты 5±3%), известным для данного продукта.

Проантоцианидин А₂

Основные полосы поглощения представляют сильное искривление для Н-О-Н при 1630-1610 см^-1 (это согласуется с бигидратом), глубокую полосу поглощения СН₂ при около 1470 см ^-1, вытянутые полосы поглощения фенольной и спиртовой группы С-ОН при 1247 и 1112 см^-1, соответственно (Фиг.6, 7).

Комплекс проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином

Инфракрасный спектр показывает вытянутую полосу поглощения группы С=О при 1735 см^-1, изгиб Н-О-Н при 1618 см ^-1. Две сильные полосы поглощения наблюдали при 1076 и 1203-1179 см^-1. Эти полосы приписывают сдвигу к более низким волновым числам симметрической и антисимметрической вытянутых полос поглощения фосфатной группы. Также присутствует полоса поглощения ненасыщенного ацильного остатка при 969 см^-1 (Фиг.8, 9).

Смесь проантоцианидин А₂/ фосфатидилхолин

Инфракрасный спектр показывает широкие полосы поглощения в области 1300-900 см^-1, без присутствия двух полос при 1076 и 1203-1179 см^-1. Кроме того, полосы поглощения при 1088 и 968 перекрываются полосами поглощения фосфатидилхолина (Фиг.10, 11).

ИК-спектры четырех рассматриваемых продуктов представлены на Фиг.12, 13.

4. Спектры ¹Н-ЯМР

Методика и оборудование

Спектры ЯМР получали в CDCl ₃ или ДМСО-d₆ (чистота для анализа ЯМР) при 300 МГц (¹Н) на установке VARIAN INOVA 300 МГц с программой VNMR^TM ver. 6.1.b, снабженной 5 мм переключаемым широкополосным датчиком. Использовали трубку Wilmad 528-PP (7"×5 мм). Температура 30°С.

Мультиплетность атомов углерода устанавливали с использованием эксперимента DEPT (неискажаемое усиление при переносе поляризации).

Химические сдвиги соотносили с тетраметилсиланом (чистота для анализа ЯМР) при 0 м.д. в качестве внешнего стандарта.

Спектры фосфатидилхолина и комплекса проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином можно получать в CDCl ₃, тогда как спектр проантоцианидина A₂ получают в ДМСO-d₆, в соответствии с профилем растворимости.

Фосфатидилхолин (Спектр ¹H-ЯМР на Фиг.14)

- концевая метильная группа при 0,93 м.д.

- СН₂ на основной длинной цепи при 1,32, 1,64, 2,09, 2,34 и 2,81 м.д.

- NMe⁺₃ синглет при 3,45 м.д.

- протоны на двойных связях и сложноэфирной группе при около 5,3-5,4 м.д.

- мультиплеты при 4,16-4,42 м.д.: СН и СН₂ на глицериновой части.

Проантоцианидин А₂ (Спектр ¹H-ЯМР на Фиг.15)

Протонный спектр, полученный в ДМСО-d₆, показывает следующие сигналы:

Н	М.д.	J (Гц)
3	3,87	т (3,8)
3-ОН	5,22	Д (4,4)
4	4,33	д(3,5)
6	5,89	Д (2,2)
8	5,94	Д(2,2)
2'	4,83	С
3'	4,14	М
3'ОН	4,65	Д(4,4)
6'	6,01	с
4'-На	2,81	Дд (18,0; 4,6)
4'-Hb	2,59	Дд (18,0; 1,8)
12, 12', 15,15',16'	6,75	Д (8,0)
	6,76	Д (8,2)
	6,87	Дд (8,3 2,3)
	7,01	Дд (8,8, 1,9)
	7,03	Д (2,1)
	7,09	Д (1,9)
ОН (фенольная)	8,10 8,69, 8,79,	с (ушир.)
	8,90, 9,07, 9,29

Комплекс проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином (Спектр ¹H-ЯМР на Фиг.16)

Спектр показывает очень широкие сигналы с отсутствием разрешения, что согласуется с сильным изменением времени релаксации протонов. Сигнал, соответсвующий полярной головной группе NMе⁺₃ исчезает, что предполагает сильное взаимодействие с молекулой проантоцианидина А₂ и соответствующую потерю подвижности. Все мультиплеты стали уширенными синглетами, в частности сигналы присутствия глицериновой части СН и СН₂ дают широкий резонанс при около 4,2 м.д. Не наблюдали никаких сигналов, присущих димеру эпикатецина.

Спектр комплекса, полученный после добавления ДМСО-d ₆ (Фиг.17), показывает резонанс и фосфатидилхолина и проантоцианидина A₂. Добавление полярного растворителя влияет на взаимодействие между двумя молекулами с получением спектра с узкими пиками, соответствующими смеси двух веществ без взаимодействия.

Спектрограммы представлены на Фиг.18.

5. Спектры ¹³ С ЯМР

Методика и оборудование

Спектры ЯМР получали в СDСl₃ или ДМСО-d₆ (чистота для анализа ЯМР) при 75 МГц (¹³С) на установке VARIAN INOVA 300 МГц с программой VNMR^TM ver. 6.1.b, снабженной 5 мм переключаемым широкополостным датчиком. Использовали трубку Wilmad 528-PP (7"×5 мм). Температура 30°С.

Мультиплетность атомов углерода устанавливали с использованием эксперимента DEPT (неискажаемое усиление при переносе поляризации).

Химические сдвиги соотносили с тетраметилсиланом (чистота для анализа ЯМР) при 0 м.д. в качестве внешнего стандарта.

Спектры фосфатидилхолина и комплекса проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином можно получать в СDСl₃, тогда как спектр проантоцианидина А₂ получают в ДМСО-d₆, в соответствии с профилем растворимости.

Фосфатидилхолин (Спектр ¹³С-ЯМР на Фиг.19)

- карбоксильные группы при 173,8, 173,7 и 173,4 м.д.

- олефиновые углерода (основной длинной цепи) при 128,1, 128,3, 129,9, 130,2 и 130,4 м.д.

- метиновая группа глицерина, дублет (связывание с фосфором) при 70,8 и 70,7 м.д. (J_c-p=7,4 Гц)

- метиленовая группа глицерина, дублеты (связывание с фосфором) при 66,6 и 66,5 м.д. (J_c-p =7,5 Гц) и при 63,7 и 63,6 м.д. (J_c-p=5,5 Гц)

- метилен на карбоксильной группе (RO-CH₂-CHOR-CH ₂-OP) при 63,2 м.д., без связывания С-Р

- метилен, содержащий группу азота при 59,6 м.д. (как С-Р связанный дублет, J_c-p=4,8 Гц)

- группа тетраметиламмония при 54,6 м.д.

- метиленовые группы на основной длинной цепи в области 34,5-22,8 м.д.

- концевые метильные группы на длинноцепочечной основной цепи при 14,3 м.д.

Проантоцианидин А₂ (Спектр ¹³С-ЯМР на Фиг.20)

Спектр, полученный в ДМСO-d₆, показывает следующие сигналы

С	м.д.	мультиплетность	C	м.д.	Мультиплетность
2	106,3g	С	2'	80,0	Д
3	66,8	Д	3'	65,2	Д
4	28,4	Д	4'	30,0	Т
5	155,6a	С	5'	153,5	с
6	97,2	Д	6'	95,3	Д
7	156,8a	с	7'	151,1 a	с
8	93,5	Д	8'	101,8g	С
9	157,2a	С	9'	151,8a	С
10	103,4g	С	10'	99,2	С
11	131,6 c	С	11'	130,7c	С
12	115,4 e	Д	12'	115,4e	Д
13	146,1b	С	13'	145,2d	С
14	145,4b	С	14'	145,0b	С
15	115,6e	Д	15'	115,9e	Д
16	118,6d	Д	16'	119,5d	Д

Комплекс проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином (Спектр ¹³С-ЯМР на Фиг.21)

Спектр показывает широкие сигналы с отсутствием разрешения, что согласуется с сильным изменением времени релаксации атомов углерода. Резкий сигнал, соответствующий полярной головной группе NHMe⁺₃ при 54,6 м.д. становится уширенным из-за уменьшенного спиннорешеточного времени релаксации в результате ограниченной подвижности молекул. Такой же эффект наблюдали для карбоксильных групп в области 173 м.д. и для групп метилена и метина. Сигналы углеродов, соответствующие основной длинной цепи, становятся более узкими по мере повышения их подвижности. Поэтому сигналы, соответствующие концевым метильной и метиленовой группам, не вовлечены во взаимодействие проантоцианидин А₂/фосфатидилхолин.

Как уже описывалось в §4, добавление ДМСО-d₆ (Фиг.22) обеспечивает распад комплекса, образованного двумя молекулами, с получением спектра, в котором эти два вещества легкораспознаваемы.

ВЫВОДЫ

Представленные данные свидетельствуют о том, что комплекс проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином представляет собой продукт, в котором полярная головная группа липидной фракции вступает в сильное взаимодействие с молекулой проантоцианидина А₂. Ацильные группы длинной цепи фосфатидилхолина не вовлечены в комплексообразование. Характерной особенностью комплекса проантоцианидина А2 с фосфатидилхолином является повышенная липофильность, как продемонстрировано профилем растворимости, что обеспечивает быстрое растворение проантоцианидина А₂ в неполярных растворителях, таких как хлороформ и толуол. Комплекс может быть разрушен добавлением полярного растворителя, который изменяет процесс взаимодействия между двумя веществами. Экспериментальные данные с очевидностью показывают различие между комплексом и смесью проантоцианидина А₂ / фосфатидилхолин.