олигонуклеотиды для ингибирования экспрессии eg5 человека

Формула изобретения

1. Антисмысловой олигонуклеотид или одно из его производных, отличающиеся тем, что олигонуклеотид соответствует 8-20 нуклеотидам кодирующей eg5 последовательности и имеет одну из последовательностей SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:9, причем

SEQ ID NO:1 является 5’CGACGCCATGACGGAATTC-3’

SEQ ID NO:2 является 5’-AATGGTCTGCATCTCACCA-3’

SEQ ID NO:3 является 5’-GGCTGCGACGCCATGACGG-3’

SEQ ID NO:4 является 5’-ATGACGGAATTC-3’

SEQ ID NO:5 является 5’-CCATGACGGAAT-3’

SEQ ID NO:6 является 5’-ACGCCATGACGG-3’

SEQ ID NO:7 является 5’-GCGACGCCATGA-3’

SEQ ID NO:8 является 5’-GGCTGCGACGCC-3’

SEQ ID NO:9 является 5’-TTGGCTGCGACG-3’.

2. Антисмысловой олигонуклеотид или одно из его производных по п.1, отличающийся тем, что олигонуклеотид соответствует части последовательности, кодирующей eg5 человека и/или eg5 Plasmodium falciparum.

3. Антисмысловой олигонуклеотид или одно из его производных по п.1 или 2, отличающийся тем, что олигонуклеотид имеет одну или несколько модификаций, причем каждая модификация в сравнении с построенным из природной ДНК олигонуклеотидом с той же самой последовательностью, находится в определенном фосфодиэфирном межнуклеозидном мостике.

4. Антисмысловой олигонуклеотид или одно из его производных по одному из пп.1-3, отличающийся тем, что 1-5 концевых нуклеотидных единиц на 5’-конце и/или на 3’-конце олигонуклеотида защищены модифицированными межнуклеозидными мостиками, которые находятся на 5’- и/или 3’-конце соответствующего нуклеозида или соответствующих нуклеозидов.

5. Антисмысловой олигонуклеотид или одно из его производных по одному из пп.1-4, отличающийся тем, что по меньшей мере один внутренний пиримидиновый нуклеозид и/или один находящийся на 5’-конце и/или на 3’-конце этого пиримидинового нуклеозида межнуклеозидный мостик является модифицированным.

6. Антисмысловой олигонуклеотид или одно из его производных по одному из пп.1-5, отличающийся тем, что модификация независимо друг от друга выбрана из а) замены фосфоротиоатного мостика между нуклеозидами, который находится на 3’- и/или 5’-конце нуклеозида, модифицированным фосфоротиоатным межнуклеозидным мостиком, и b) привязывания к молекуле флуоресцеина.

7. Антисмысловой олигонуклеотид или одно из его производных по одному из пп.1-6 для ингибирования экспрессии eg5.

8. Способ получения антисмыслового олигонуклеотида или одного из его производных по одному из пп.1-7, в котором защищенные подходящим образом мономеры конденсируют на твердой фазе.

9. Способ ингибирования экспрессии eg5, отличающийся тем, что антисмысловой олигонуклеотид или одно из его производных по одному из пп.1-7 приводят в контакт с кодирующей eg5 нуклеиновой кислотой и связывают с ней.

10. Способ получения фармацевтической композиции, отличающийся тем, что один или несколько антисмысловых олигонуклеотидов или одно из его производных по одному из пп.1-7 смешивают с физиологически приемлемым носителем и в случае необходимости с дополнительными веществами.

11. Фармацевтическая композиция, ингибирующая экспрессию eg5, отличающаяся тем, что она содержит по меньшей мере один антисмысловой олигонуклеотид или одно из его производных по одному из пп.1-7 и физиологически приемлемый носитель и в случае необходимости с дополнительными веществами.

Описание изобретения к патенту

Данное изобретение относится к олигонуклеотиду или одному из его производных с последовательностью, которая соответствует определенной части последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует eg5 человека или его мутированную форму, а также к способу получения этого олигонуклеотида и его применению.

Во время митоза основанный на микротрубочках механизм веретена помогает распределить удвоенные хромосомы равномерно между дочерними клетками. Родственные кинезину моторные белки составляют одну часть сил, требующихся для образования веретена и распределения хромосом. Образование биполярного митотического веретена требует активности многочисленных различных моторных белков. Одним из родственных кинезину моторных белков человека является человеческий белок eg5, который взаимодействует с митотическими центросомами и для которого показано, что он является важным для образования биполярного веретена (Blangy et al., Cell (1995) 83, 1159). Микроинъекция специфических антител к eg5 человека блокирует перемещение центросом и приводит к остановке митоза в клетках.

Другой возможностью блокирования образования биполярного веретена было бы ингибирование экспрессии eg5. Одним способом специфического ингибирования экспрессии eg5 является применение антисмысловых олигонуклеотидов, которые в случае необходимости могут быть модифицированы для улучшения их свойств (Е. Uhlmann und A. Peyman, Chemical Reviews 90, 543 (1990); S. Agrawal, TIBTECH 1996, 376). Предполагается, что антисмысловые олигонуклеотиды связываются со специфическими последовательностями мРНК, что приводит к разрушению мРНК и/или ингибированию белкового синтеза.

Объектом данного изобретения является олигонуклеотид или одно из его производных, которые соответствуют части кодирующей eg5 последовательности - предпочтительно eg5 человека или eg5 возбудителя заболевания, например Plasmodium falciparum (возбудителя малярии). Предпочтительно, этот олигонуклеотид соответствует 8-100 нуклеотидам, особенно предпочтительно 8-20 нуклеотидам последовательности eg5. Этот олигонуклеотид или его производное связывается с указанной последовательностью и подавляет образование eg5-белков. Человеческая последовательность eg5 опубликована (Blangy et al., Cell (1995) 85, 1159). SEQ ID NO: 20 показывает пример последовательности, кодирующей ед5 человека.

SEQ ID NO: 21 показывает пример последовательности eg5 Plasmodium falciparum.

Этот олигонуклеотид предпочтительно содержит последовательность, которая соответствует части нуклеиновой кислоты, которая кодирует eg5 человека или eg5 Plasmodium falciparum. Понятие “соответствует” означает, что последовательность оснований олигонуклеотида комплементарна части последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей eg5 (например, гена, кДНК, мРНК), что позволяет этому олигонуклеотиду гибридизоваться со “смысловой частью” кодирующей eg5 нуклеиновой кислоты (связываться с ней). На этом основании его называют “антисмысловым олигонуклеотидом”. Таким образом, в одном предпочтительном варианте осуществления данного изобретения этот олигонуклеотид является антисмысловым олигонуклеотидом. В следующем предпочтительном варианте осуществления данного изобретения олигонуклеотид представляет собой рибозим. Рибозим является каталитической нуклеиновой кислотой, которая расщепляет мРНК. Рибозим предпочтительно выбран из группы Hammerhead-рибозимов (Vaish et al., Nucleic Acids Res. (1998) 26, 5237).

Олигонуклеотид данного изобретения связывается с пригодной для гибридизации частью мРНК eg5 и ингибирует образование eg5-белков. Для связывания с мРНК eg5 и для ингибирования экспрессии подходящие олигонуклеотиды направлены на стартовый (инициирующий) район трансляции eg5.

Соответствующая олигонуклеотиду часть кодирующей eg5 последовательности нуклеиновой кислоты имеет длину 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более нуклеотидов, а олигонуклеотид соответствует предпочтительно длине 12 нуклеотидов или 19 нуклеотидов кодирующей eg5 последовательности. Олигонуклеотид по изобретению имеет также длину 10 (10-мер), 11 (11-мер), 12 (12-мер), 13 (13-мер), 14 (14-мер), 15 (15-мер), 16 (16-мер), 17 (17-мер), 18 (18-мер) или 19 (19-мер) нуклеотидов.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения олигонуклеотид имеет длину 12 или 19 нуклеотидов; такие олигонуклеотиды могут, например, обнаруживать последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 или их часть, причем эти последовательности являются приведенными ниже последовательностями:

SEQ ID NO: 1: 3’-CTTAAGGCAGTACCGCAGC-5; 5’-CGACGCCATGACGGAATTC-3’

SEQ ID NO: 2; 3’-ACCACTCTACGTCTGGTAA-5; 5’-AATGGTCTGCATCTCACCA-3’

SEQ ID NO: 3: 3’-GGCAGTACCGCAGCGTCGG-5; 5’-GGCTGCGACGCCATGACGG-3’

SEQ ID NO:4: 3’-CTTAAGGCAGTA-5’; 5’-ATGACGGAATTC-3’

SEQ ID NO: 5: 3’-TAAGGCAGTACC-5’; 5’-CCATGACGGAAT-3’

SEQ ID NO:6: 3’-GGCAGTACCGCA-5’; 5’-ACGCCATGACGG-3’

SEQ ID NO:7: 3’-AGTACCGCAGCG-5’; 5’-GCGACGCCATGA-3’

SEQ ID NO:8: 3’-CCGCAGCGTCGG-5’; 5’-GGCTGCGACGCC-3’

SEQ ID NO:9: 3’-GCAGCGTCGGTT-5’; 5’-TTGGCTGCGACG-3’

Особенно предпочтительно, олигонуклеотид модифицирован для улучшения его свойств; например, для повышения устойчивости против нуклеаз или чтобы сделать его устойчивым против нуклеаз, для улучшения его связывающей аффинности относительно комплементарной кодирующей eg5 нуклеиновой кислоты, например мРНК, или для усиления его проникновения в клетку.

Таким образом, данное изобретение относится преимущественно к олигонуклеотиду, который содержит специфическую приведенную выше последовательность и который, кроме того, содержит одну или несколько химических модификаций в сравнении с “природной” ДНК, которая состоит из природных нуклеозидов дезоксиаденозина (аденин + -D-2’-дезоксирибоза), дезоксигуанозина (гуанин + -D-2’-дезоксирибоза), дезоксицитидина (цитозин + -D-2’-дезоксирибоза) и тимидина (тимин + -D-2’-дезоксирибоза) которые связаны фосфодиэфирными мостиками между нуклеозидами. Олигонуклеотиды могут содержать одну или несколько модификаций одинакового типа и/или модификаций различного типа; каждый тип модификации может быть выбран независимо от других типов из известных для модификации олигонуклеотидов типов модификаций.

Данное изобретение относится также к производным олигонуклеотидов, например их солям, в частности их физиологически переносимым солям. Соли и физиологически переносимые соли описаны, например, в Remington’s Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton, PA (Seite 1418). Эти производные основаны также на модифицированных олигонуклеотидах, которые содержат одну или несколько модификаций (например, в определенных положениях нуклеотидов и/или в определенных межнуклеозидных мостиках), олигонуклеотидным аналогам (например, полиамид-нуклеиновым кислотам (ПНК), фосфомоноэфир-нуклеиновым кислотам (PHONAs = PMENAs), олигонуклеогидам-химерам (например, состоящим из ДНК-части и РНК-части или состоящим из ДНК-части и PHONA(ФMЭHK)-части)). Производные основаны также на олигонуклеотидах, которые соответствуют аллелям и/или мутированным формам (мутантам) нормального или природного eg5, например аллелям и/или мутантам eg5 человека (например, относительно SEQ ID NO: 20) и аллелям и/или мутантам eg5 Plasmodium falciparum (например, относительно SEQ ID NO: 21).

Специалистам известны, например, химические модификации, и они описаны, например, в Е. Uhlman und Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543 и "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties and Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Hrsg., Humana Press, Totowa, USA 1993 и S.T. Crooke, F. Bennet, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36 (1996) 107-129; J. Hunziker und C. Leuman (1995) Mod. Synt. Methods, 7, 331-417.

В сравнении с природной ДНК фосфодиэфирные мостики между нуклеозидами, -D-2’-дезоксирибозная единица и/или природные нуклеозидные основания (аденин, гуанин, цитозин, тимин) могут быть, например, модифицированы или заменены. Олигонуклеотид по изобретению может иметь одну или несколько этих модификаций, причем каждая модификация в сравнении с состоящим из природной ДНК олигонуклеотидом такой же последовательности находится в определенном фосфодиэфирном-межнуклеозидном мостике и/или в определенной -D-2’-дезоксирибозной единице и/или в определенном природном положении нуклеозидного основания.

Данное изобретение относится, например, к олигонуклеотиду, который содержит одну или несколько модификаций, причем каждая модификация выбрана независимо из следующего списка:

a) замена фосфодиэфирного мостика между нуклеозидами, который находится на 3’- и/или на 5’-конце нуклеозида, модифицированным межнуклеозидным мостиком,

b) замена находящегося на 3’- и/или 5’-конце нуклеозида фосфодиэфирного мостика дефосфомостиком,

c) замена сахарофосфатной единицы из сахарофосфатного скелета молекулы другой единицей,

d) замена -D-2’-дезоксирибозной единицы модифицированной сахарной единицей,

e) замена природного нуклеозидного основания модифицированным нуклеозидным основанием,

f) привязывание к молекуле, которая влияет на свойства олигонуклеотида,

g) привязывание к 2’5’-связанному олигоаденилату или его производному, в случае необходимости через подходящий линкер, и

h) введение 3’-3’ и/или 5’-5’-инверсии на 3’- и/или на 5’-конце олигонуклеотида.

Более конкретными примерами химических модификаций олигонуклеотида являются

а) замена фосфодиэфирного мостика между нуклеозидами, который находится на 3’- и/или на 5’-конце нуклеозида, модифицированным межнуклеозидным мостиком, причем модифицированный межнуклеозидный мостик выбран, например, из фосфоротиоатного, фосфородитиоатного, NR¹ R¹'-фосфорамидатного, боранфосфатного, фосфат-(C ₁-C₂₁)-O-алкилэфирного, фосфат-[(C ₆-C₁₂)-арил((C₁-C₂₁)-O-алкил]эфирного, (C₁-C₈)-алкилфосфонатного и/или (C ₆-C₁₂)-арилфосфонатного мостиков и (C₇ -C₁₂)--гидроксиметиларила (известного, например, из WO 95/01363), причем (C₆ -C₁₂)-арил, (C₆-С₂₀)-арил и (C₆-C₁₄)-арил в случае необходимости замещены галогеном, алкилом, алкокси, нитро, циано, и причем R¹ и R¹' независимо друг от друга обозначают водород, (C₁-C₁₈)-алкил, (C₆-C₂₀ )-арил, (C₆-C₁₄)-арил-(C₁ -C₁₈)-алкил, предпочтительно водород, (C₁ -C₈)-алкил, предпочтительно (C₁-C₄ )-алкил и/или метоксиэтил, или R¹ и R¹ ' вместе с несущим их атомом азота образуют 5-6-членное гетероциклическое кольцо, которое дополнительно может содержать дополнительный гетероатом из группы О, S и N,

b) замена находящегося на 3’- и/или 5’-конце нуклеозида фосфодиэфирного мостика дефосфомостиком (дефосфомостики описаны, например, в Uhlmann, E. и Peyman, A. in “Methods in Molecular Biology”, Band 20, “Protocols for Oligonucleotides and Analogs”, S. Agrawal, Hrsg., Humana Press, Totowa 1992, Kapitel 16, 355ff), причем дефосфомостик, например, представляет собой формацеталь, 3’-тиоформацеталь, метилгидроксиламин, оксим, метилендиметилгидразо, диметиленсульфон и/или силильную группу;

c) замена сахарофосфатной единицы (-D-2’-дезоксирибоза и фосфодиэфирный мостик между нуклеозидами образуют вместе сахарофосфатную единицу) из сахарофосфатного скелета молекулы (сахарофосфатный скелет состоит из сахарофосфатных единиц) другой единицей, причем другая единица, например, пригодна для образования

- “морфолинопроизводного”-олигомера (как, например, описано в Е.Р. Stirchak et al., Nucleic Acids Res. 17 (1989) 6129); т.е., например, замена морфолинопроизводной единицей;

- полиамид-нуклеиновой кислоты (“ПНК”) (как, например, описано в Р.Е. Nielsen et al., Bioconj. Chem. 5 (1994) 3 и в ЕР 0672677 А2): т.е., например, замена скелетной ПНК-единицей, например, 2-аминоэтилглицином;

- моноэфира фосфоновой кислоты-нуклеиновой кислоты CPHONA") (как, например, описано в Peyman et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35 (1996) 2632-2638 и в ЕР 0739898 А2); т.е. замена скелетной PHONA- единицей;

d) замена -D-2’-дезоксирибозной единицы модифицированной сахарной единицей, причем модифицированная сахарная единица выбрана, например, из -D-рибозы, -D-2’-дезоксирибозы, L-2’-дезоксирибозы, 2’-F-2’-дезоксирибозы, 2’-О-(C₁ -C₆)-алкилрибозы, причем предпочтительной 2’-О-(C ₁-C₆)-алкилрибозой является 2’-O-метилрибоза, 2’-О-(С₂-С₆)-алкенилрибозы, 2’-[О-(C ₁-C₆) алкил-O-(C₁-C₆)-алкил]рибозы, 2’-NH₂-2’-дезоксирибозы, -D-ксилофуранозы, -арабинофуранозы, 2,4-дидезокси--O-эритрогексопиранозы и карбоциклических (например, описанных в Froehler, J. Am. Chem. Soc. 114 (1992) 8320) и/или нециклических сахарных аналогов (например, описанных в Vandendriessche et al., Tetrahedron 49 (1993) 7223) и/или бициклосахарных аналогов (например, описанных в М. Tarkov et al., Helv. Chim. Acta 76 (1993) 481);

e) замена природного нуклеозидного основания модифицированным нуклеозидным основанием, причем модифицированное основание выбрано, например, из урацила, гипоксантина, 5-(гидроксиметил)урацила, N²-диметилгуанозина, псевдоурацила, 5-(гидроксиметил)урацила, 5-аминоурацила, дигидроурацила, 5-фторурацила, 5-фторцитозина, 5-хлорурацила, 5-хлорцитозина, 5-бромурацила, 5-бромцитозина, 2,4-диаминопурина, 8-азапурина, замещенного 7-деазапурина, предпочтительно 7-деаза-7-замещенного и/или 7-деаза-8-замещенного пурина или других модификаций природных нуклеозидных оснований (модифицированные нуклеозидные основания описаны, например, в ЕР 0710667 А2 и ЕР 0680969 А2);

f) привязывание к молекуле, которая влияет на свойства олигонуклеотида, причем привязывание олигонуклеотида к одной или нескольким молекулам, которые влияют (благоприятно) на свойства олигонуклеотида (например, способность олигонуклеотида проникать через клеточную мембрану или проникать в клетку, стабильность против нуклеаз, аффинность в отношении кодирующей eg5 последовательности-мишени, фармакокинетика олигонуклеотида, способность антисмыслового олигонуклеотида/рибозима или конъюгированной с олигонуклеотидом молекулы воздействовать в каждом случае на кодирующую eg5 молекулу, например, способность связывания и/или образования поперечных связей, если этот олигонуклеотид гибридизуется с кодирующей eg5 последовательностью-мишенью), причем в качестве примеров молекул, которые могут быть привязаны к олигонуклеотиду, могут рассматриваться полилизин, встраивающиеся средства, такие как пирен, акридин, феназин или фенантридин, флуоресцентные средства, такие как флуоресцеин, сшивающие агенты, такие как псорален или азидопрофлавин, липофильные молекулы, такие как (C₁₂-C₂₀)-алкил, липиды, такие как 1,2-дигексодецил-rac-глицерин, стероиды, такие как холестерин или тестостерон, витамины, такие как витамин Е, поли- или олигоэтиленгликоль, предпочтительно привязанные к олигонуклеотиду через фосфатную группу (например, триэтиленгликольфосфат, гексаэтиленгликольфосфат), (C₁₂-C₁₈)-алкилфосфатдиэфир и/или O-CH ₂-CH(ОН)-О-(C₁₂-C₁₈)-алкил, эти молекулы могут присоединяться на 5’-конце и/или на 3’-конце и/или внутри последовательности, например, к нуклеозидному основанию для образования конъюгата олигонуклеотида; способы получения конъюгата олигонуклеотида известны специалисту и описаны, например, в Uhlman, E. and Peyman, A., Chem. Rev.90 (1990) 543, M. Manoharan in “Antisense Research and Applications”, Crooke and Lebleu, Hrsg., CRC Press, Boca Raton, 1993, Kapitel 17, S. 303ff. и ЕР-А 0552766;

g) привязывание к 2’5’-связанному олигоаденилату, предпочтительно через подходящую линкерную молекулу, причем 2’5’-связанный олигоаденилат выбран, например, из молекул 2’5’-связанного триаденилата, 2’5’-связанного тетрааденилата, 2’5’-связанного пентааденилата, 2’5’-связанного гексааденилата или 2’5’-связанного гептааденилата и их производных, причем 2’5’-связанное олигоаденилатное производное представляет собой, например, кордицепин (2’5’-связанный 3’-дезоксиаденилат), и причем пригодным линкером является, например, триэтиленгликоль, и причем 5’-конец 2’5’-связанного олигоаденилата должен нести фосфатный, дифосфатный или трифосфатный остаток, в котором один или несколько атомов кислорода могут быть заменены, например, атомом серы, причем предпочтительной является замена фосфатным или трифосфатным остатком; и

h) введение 3’-3’ и/или 5’-5’-инверсии на 3’- и/или на 5’-конце олигонуклеотида, причем этот вид химической модификации известен специалисту и описан, например, в M. Кода et al., J. Огд. Chem. 56 (1991) 3757, ЕР 0464638 и ЕР 0593901.

Замена сахарофосфатной единицы из сахарофосфатного скелета молекулы другой единицей, которая может быть, например, скелетной ПНК-единицей или скелетной PHONA (ФМЭНК)-единицей, является предпочтительно заменой нуклеотида, например, ПНК-единицей или PHONA-единицей, которая уже содержит природные нуклеозидные основания и/или модифицированные нуклеозидные основания, например, одно из модифицированных нуклеозидных оснований из группы урацил, гипоксантин, 5-(гидроксиметил)урацил, N²-диметилгуанозин, псевдоурацил, 5-(гидроксиметил)урацил, 5-аминоурацил, дигидроурацил, 5-фторурацил, 5-фторцитозин, 5-хлорурацил, 5-хлорцитозин, 5-бромурацил, 5-бромцитозин, 2,4-диаминопурин, 8-азапурин, замещенный 7-деазапурин, предпочтительно 7-деаза-7-замещенный и/или 7-деаза-8-замещенный пурин или другие модификации природных нуклеозидных оснований (модифицированные нуклеозидные основания описаны, например, в ЕР 0710667 А2 и ЕР 0680969 А2).

Тем самым специально делается ссылка на модификации олигонуклеотидов, которые описаны в ЕР 0710667 А2, ЕР 0680969 А2, ЕР 0464638, ЕР 0593901, WO 95/01363, ЕР 0672677 А2, ЕР 0739898 А2 и ЕР 0552766.

В одном особом варианте осуществления данного изобретения модифицированы один или несколько фосфодиэфирных мостиков между нуклеозидами внутри олигонуклеотидной последовательности; предпочтительно модифицированы один или несколько фосфодиэфирных мостиков между нуклеозидами фосфоротиоатными мостиками между нуклеозидами и/или (C₆-C₁₂)-арилфосфонатными мостиками между нуклеозидами, предпочтительно -гидроксибензилфосфонатными мостиками, в которых бензильная группа является предпочтительно замещенной, например, нитро, метилом, галогеном. В одном только фосфоротиоатном олигонуклеотиде все фосфодиэфирные мостики между нуклеозидами модифицированы фосфоротиоатом. Предпочтительно, данное изобретение относится к олигонуклеотиду, в котором не все фосфодиэфирные мостики между нуклеозидами модифицированы единообразно фосфоротиоатом (фосфоротиоатными мостиками между нуклеозидами). Предпочтительно, по меньшей мере один межнуклеозидный мостик имеет другой тип модификации или он является немодифицированным. Данное изобретение относится, в частности, к олигонуклеотиду, который дополнительно содержит по меньшей мере один другой тип модификации. В следующем особом варианте осуществления данного изобретения модифицированы один или несколько нуклеозидов (-D-2’-дезоксирибоза и/или нуклеозидное основание) внутри олигонуклеотидной последовательности; предпочтительно -D-2’-дезоксирибоза заменена 2’-O-(C₁-С₆)-алкилрибозой, предпочтительно 2’-O-метилрибозой и/или нуклеозидное основание заменено 8-азапурином, 7-деаза-7-замещенным пурином и/или 7-деаза-8-замещенным пурином (пурин: аденин, гуанин). Предпочтительно, данное изобретение относится к олигонуклеотиду, в котором не все нуклеозиды модифицированы единообразно. Предпочтительно, данное изобретение относится к олигонуклеотиду, который дополнительно содержит по меньшей мере один другой тип модификации.

В следующем особом варианте осуществления данного изобретения одна или несколько сахарофосфатных единиц из сахарофосфатного скелета заменены скелетными ПНК-единицами, предпочтительно 2-аминоэтилглициновыми единицами. Предпочтительно, замененные сахарофосфатные единицы по меньшей мере в некоторой степени связаны друг с другом. Предпочтительно, данное изобретение относится к олигонуклеотиду, в котором не все сахарофосфатные единицы заменены единообразно. Данное изобретение относится, в частности, к химерным олигонуклеотидам, например, таким, которые состоят из одной или нескольких ПНК-частей и одной или нескольких ДНК-частей. Возможными примерами таких химерных олигонуклеотидов являются следующие образцы модификаций, которые приведены не для ограничения данного изобретения: ДНК-ПНК, ПНК-ДНК, ДНК-ПНК-ДНК, ПНК-ДНК-ПНК, ДНК-ПНК-ДНК-ПНК, ПНК-ДНК-ПНК-ДНК. Подобные образцы были бы возможными для состоящих из ДНК-частей и PHONA (ФМЭНК)-частей химерных молекул, например, ДНК-ФМЭНК, ФМЭНК-ДНК, ДНК-ФМЭНК-ДНК, ФМЭНК-ДНК-ФМЭНК, ДНК-ФМЭНК-ДНК-ФМЭНК, ФМЭНК-ДНК-ФМЭНК-ДНК. Кроме того, конечно, возможными являются также химерные молекулы из трех различных частей, таких как ДНК-часть (части), ФМЭНК-часть (части) и ПНК-часть (части). Предпочтительно, данное изобретение относится к олигонуклеотиду, который дополнительно содержит по меньшей мере один другой тип модификации.

В следующем особом варианте осуществления данного изобретения 3’-конец и/или 5’-конец олигонуклеотида связан с (C₁₂-C₁₈)-алкильным остатком, предпочтительно C₁₆-алкильным остатком, остатком триэтиленгликоля или остатком гексаэтиленгликоля - эти остатки связаны с олигонуклеотидом предпочтительно через фосфатную группу. Данное изобретение относится предпочтительно к олигонуклеотиду, в котором не оба конца (3’-конец и 5’-конец) являются модифицированными. Предпочтительно, данное изобретение относится к олигонуклеотиду, который дополнительно содержит по меньшей мере один другой тип модификации.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения модифицированы только определенные положения внутри олигонуклеотидной последовательности (например, частично модифицированный олигонуклеотид). Частично модифицированные олигонуклеотиды в некоторых научных трудах называют также минимально модифицированными олигонуклеотидами. Внутри последовательности модификация может быть локализована в определенных положениях (при определенных нуклеотидах, при определенных нуклеозидах, при определенных основаниях нуклеозидов, при определенных межнуклеозидных мостиках).

В особом варианте осуществления данного изобретения готовят частично модифицированный олигонуклеотид, в котором некоторые из фосфодиэфирных мостиков заменены модифицированными межнуклеозидными мостиками, например, фосфоротиоатными мостиками и/или -гидроксибензилфосфонатными мостиками. Данное изобретение включает в себя, в частности, такие олигонуклеотиды, которые являются модифицированными только до некоторой степени.

В частности, данное изобретение относится к олигонуклеотиду, в котором концевые нуклеотидные единицы 1-5 на 5’-конце и/или на 3’-конце защищены модификацией межнуклеозидных мостиков, которые находятся на 5’- и/или на 3’-конце соответствующего нуклеозида, предпочтительно заменой фосфодиэфирных мостиков между нуклеозидами фосфоротиоатными мостиками и/или -гидроксибензилфосфонатными мостиками. Особенно предпочтительно, концевые нуклеотидные единицы 1-5 на 3’-конце олигонуклеотида защищены модифицированными межнуклеозидными мостиками, которые находятся на 5’-конце и/или на 3’-конце соответствующих нуклеозидов. В случае необходимости концевые нуклеотидные единицы 1-5 на 5’-конце олигонуклеотида дополнительно защищены модифицированными межнуклеозидными мостиками, которые находятся на 5’-конце и/или на 3’-конце соответствующего нуклеозида. В случае необходимости олигонуклеотид может содержать дополнительные модификации в других положениях.

Кроме этого, данное изобретение относится к олигонуклеотиду, у которого по меньшей мере один внутренний пиримидиновый нуклеозид и/или один находящийся на 5’-конце и/или на 3’-конце этого пиримидинового нуклеозида (нуклеозида с пиримидиновым основанием, таким как цитозин, урацил, тимин) межнуклеозидный мостик модифицирован, предпочтительно заменой фосфодиэфирного мостика (мостиков) между нуклеозидами одним/несколькими фосфоротиоатными мостиками и/или одним/несколькими -гидроксибензилфосфонатными мостиками.

В одном предпочтительном варианте осуществления данного изобретения концевые нуклеотидные единицы 1-5 на 5’-конце и/или на 3’-конце олигонуклеотида защищены модифицирующими межнуклеозидными мостиками, которые находятся на 5’-конце и/или на 3’-конце соответствующего нуклеозида, причем дополнительно модифицирован по меньшей мере один внутренний пиримидиновый нуклеозид и/или один находящийся на 5’-конце этого пиримидинового нуклеозида и/или на 3’-конце этого пиримидинового нуклеозида межнуклеозидный мостик.

Принцип частично модифицированного олигонуклеотида описан в A. Peyman, E. Uhlman, Biol. Chem. Hoppe-Seuler, 377 (1996) 67-70 и в ЕР 0653-439. На эти статьи делается тем самым специальная ссылка. В этом случае защищены концевые нуклеотидные единицы 1-5 на 5’-конце и/или на 3’-конце, например, фосфодиэфирные мостики между нуклеозидами, которые находятся на 3’-конце и/или на 5’-конце соответствующих нуклеозидов, заменены, например, на фосфоротиоатные мостики между нуклеозидами. Предпочтительно, модифицировано дополнительно по меньшей мере одно из внутренних положений пиримидиновых нуклеозидов (или положение нуклеотида); предпочтительно модифицирован(ы)/заменен(ы) 3’- и/или 5’-межнуклеозидный мостик (мостики) одного пиримидинового нуклеозида, например, одним/несколькими фосфоротиоатными мостиками между нуклеозидами. Частично модифицированные олигнуклеотиды обладают особенно выгодными свойствами; например, они в особенно высокой степени устойчивы к нуклеазам и при этом только минимально модифицированы. Они имеют также значительно сниженную склонность к неантисмысловым эффектам, которые часто связаны с применением только фосфоротиоатных олигонуклеотидов (Stein und Krieg (1994) Antisense Res. Dev.4, 67). Частично модифицированные олигонуклеотиды демонстрируют также более высокую аффинность связывания, чем только фосфоротиоатные олигонуклеотиды.

Данное изобретение относится, в частности, к частично/минимально модифицированным олигонуклеотидам.

SEQ ID NO: 10: 3’-С*Т*Т*АAGGС*АGT*AC*CG*CAG*C-5’, (К3)

5’-СGAC*G*C*C*A*TGA*CGGАА*Т*Т*С-3’;

SEQ ID NO: 11: 3’-A*C*C*AC*TC*TAC*GT*C*TGG*TА*А-5’, (К4)

5’-А*АT*GGT*C*TG*CАТ*СТ*СА*С*С*А-3’;

SEQ ID NO: 12: 3’-G*G*C*AG*TAC*CGC*AG*CGT*CG*G-5’, (К6)

5’-G*GC*TGC*GA*CGC*CAT*GA*C*G*G-3’;

SEQ ID NO: 13: 3’-C*T*T*AAGG*CAG*T*A-5’, 5’-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-3’;

SEQ ID NO: 14: 3’-T*A*AGGC*AG*TA*C*C-5’, 5’-C*C*AT*GA*CGGA*A*T-3’;

SEQ ID NO: 15: 3’-G*G*CAG*TAC*C*GC*A-5’, 5’-A*CG*C*CAT*GAC*G*G-3’;

SEQ ID NO: 16: 3’-A*G*TAC*CG*CAG*C*G-5’, 5’-G*C*GAC*GC*CAT*G*A-3’;

SEQ ID NO: 17: 3’-С*C*G*СAG*CGT*CG*G-5’, 5’-G*GC*TGC*GAC*G*C*C-3’;

SEQ ID NO: 18: 3’-G*C*AGC*GT*CGG*T*T-5’,

5’-T*T*GGC*TGC*GA*C*G-3’.

причем “*” обозначает место модификации межнуклеозидного мостика;

“*” является предпочтительно фосфоротиоатным межнуклеозидным мостиком.

Следующий пример особого варианта осуществления данного изобретения относится к частично модифицированному олигонуклеотиду, у которого один нуклеозид является модифицированным, например имеется модификация одного нуклеозидного основания и/или модификация одной -D-2’-дезоксирибозной единицы. Предпочтительно, -D-2’-дезоксирибоза заменена 2’-О-(C₁-C₆)-алкилрибозой, особенно предпочтительной является замена 2’-O-метилрибозой (замена -В-2’-дезоксирибонуклеозида на 2’-O-метилрибонуклеозид).

Кроме одного типа модификации, олигонуклеотид данного изобретения может также иметь другие типы модификации.

Таким образом, в следующем варианте осуществления данного изобретения олигонуклеотид содержит модифицированные межнуклеозидные мостики в определенных положениях и, кроме того, модификации нуклеозида в определенных положениях, предпочтительно замену -D-2’-дезоксирибозы. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения межнуклеозидной модификацией является замена фосфодиэфирного мостика на фосфоротиоатный мостик, а модификацией -D-2’-дезоксирибозы является замена на 2’-O-метилрибозу; в этом случае олигонуклеотид представляет собой химерный олигонуклеотид, который состоит из модифицированных и немодифицированных ДНК- и РНК-частей - которые содержат 2-O-метилрибонуклеозиды и -D-2’-дезоксирибонуклеозиды, а также фосфодиэфирные и фосфоротиоатные мостики между нуклеозидами.

Следующий предпочтительный вариант осуществления данного изобретения относится к олигонуклеотиду, который имеет один или несколько (C₁₂-C₁₈)-алкильных остатков, предпочтительно один С₁₆-алкильный остаток на его 3’- и/или на его 5’-конце. (C₁₂-C₁₈)-алкильный остаток может быть связан, например, в виде фосфодиэфира, как описано в ЕР 0552766 А2 (тем самым делается ссылка на ЕР 0552766 А2) или в виде 3’-фосфодиэфира O-СН₂-СН(ОН)-О-(C ₁₂-C₁₈)-алкила. Предпочтительным является олигонуклеотид, у которого С₁₆-алкильный остаток связан с 3’-концом и/или 5’-концом.

Данное изобретение относится также к олигонуклеотиду, в котором 3’- и/или 5’-конец связан с олигоэтиленгликольным остатком, предпочтительно с триэтиленгликолем или гексаэтиленгликолем, особенно предпочтительно через фосфодиэфирную связь (фосфатный эфир три- или гексаэтиленгликоля). Само собой разумеется, что такой олигонуклеотид может также содержать и дополнительные модификации.

В следующем особом варианте осуществления данного изобретения олигонуклеотид связан через линкер с 2’5’-связанным олигоаденилат-5’-(тио)фосфатом. Линкером может являться, например, олигоэтиленгликольфосфатный, предпочтительно триэтиленгликольфосфатный, тетраэтиленгликольфосфатный или гексаэтиленгликольфосфатный остаток. 2’5’-связанный олигоаденилат предпочтительно связан через его 2’-конец в виде тетра- или в виде пентааденилата, 5’-гидроксигруппа которого замещена фосфатным или тиофосфатным остатком. Известно, что 2’5’-олигоаденилат индуцирует РНКазу L для расщепления мРНК-мишени (Torrence et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 1300). 2’5’-олигоаденилат служит для активации рибонуклеазы L (РНКазы L), которая разрушает мРНК еg5. Вместо 2’5’-связанного аденилата можно также вводить, например, 2’5’-связанный 3’-дезоксиаденилат, происходящий из нуклеозидного аналога кордицепина. В этом случае олигонуклеотидная часть, которая комплементарна нуклеиновой кислоте-мишени, предпочтительно модифицирована в определенных положениях 2’-O-(C₁-C₆)алкилрибонуклеозидом (предпочтительно 2’-O-метилрибонуклеозидом) или ПНК.

Следующий предпочтительный вариант осуществления данного изобретения относится к замене одного или нескольких природных нуклеозидных оснований неприродными или модифицированными нуклеозидными основаниями, предпочтительно 8-азапурином и/или 7-деаза-7-замещенным пурином и/или 7-деаза-8-замещенным пурином, как описано, например, в ЕР 0171066 и ЕР 0680969.

В следующем предпочтительном варианте осуществления данного изобретения нуклеозид может содержать 3’3’- и/или 5’5’-инверсии на 3’- и/или 5’-конце, как описано, например, в ЕР 0464638 и ЕР 0593901.

Следующий предпочтительный вариант осуществления данного изобретения относится к замене одного или нескольких фосфодиэфирных мостиков на -гидроксибензилфосфонатные мостики, как описано в WO 95/01363.

В следующем предпочтительном варианте осуществления данного изобретения олигонуклеотид содержит модификацию сахарофосфатного скелета, предпочтительно при помощи ПНК-единиц.

Возможны также другие образцы модификации, например, ДНК-ПНК-ДНК, ПНК-ДНК. Сравнимые образцы модификаций возможны также для PHONA (ФМЭНК)/ДНК-химер. Эти образцы модификаций могут комбинироваться с любым другим типом модификации, и подобные образцы модификаций, возможны, конечно, также и для других олигонуклеотидов согласно изобретению.

Указанные выше конкретные олигонуклеотиды - определенная последовательность, определенный тип модификации/определенные типы модификаций в определенных положениях (специфический “образец (узор) модификации”) представляют лишь примеры для различных вариантов осуществления данного изобретения. Данное изобретение не ограничивается этими конкретными олигонуклеотидами. Другие комбинации последовательности и виды модификации также являются возможными.

Олигонуклеотид по изобретению ингибирует специфически экспрессию белка-мишени (т.е. eg5) или последовательности-мишени (нуклеиновой кислоты, которая кодирует eg5, предпочтительно мРНК eg5). Олигонуклеотид по изобретению предпочтительно подавляет специфически экспрессию eg5. Результатом этого является снижение концентрации белка eg5 в сравнении с неизмененной экспрессией. Специфичность может быть, например, продемонстрирована определением действия олигонуклеотида по изобретению на экспрессию eg5 в сравнении с действием того же самого олигонуклеотида на экспрессию бета-актина на уровне мРНК и/или на уровне белка. После обработки олигонуклеотидом по изобретению была понижена только концентрация мРНК eg5 и/или концентрация белка eg5, в то время как, например, концентрация мРНК бета-актина (белка домашнего хозяйства) и/или концентрация белка бета-актина оставалась неизмененной.

Олигонуклеотид согласно изобретению предпочтительно способен эффективно ингибировать экспрессию eg5 в клетках человека и/или обладает способностью ингибировать рост опухолей у позвоночных животных. Рассматриваемый олигонуклеотид предпочтительно снижает концентрацию мРНК и/или концентрацию белка eg5 в опухолях подвергаемых лечению индивидуумов в сравнении с индивидуумами, не подвергнутыми лечению. Олигонуклеотид по изобретению предпочтительно уменьшает величину опухоли у позвоночных животных, например у мышей, в сравнении с необработанными мышами или в сравнении с определенной перед обработкой величиной опухоли у того же самого животного.

Данное изобретение относится также к способу получения нуклеотидов по изобретению. Способ получения включает в себя химический синтез олигонуклеотидов. Химический синтез предпочтительно проводят при помощи известного для применения в синтезе олигонуклеотидов стандартного способа, например фосфорамидитного способа согласно Caruthers (1983) Tetrahedron Letters 24, 245, Н-фосфонатного способа (Todd et al., (1957) J. Chem. Soc. 3291) или фосфотриэфирного способа (Sonveaux (1986) Bioorg. Chem. 14, 274; Gait, M.J. “Oligonucleotide Synthesis, A practical Approach", IRL Press, Oxford, 1984) или усовершенствованных или измененных способов, производных от этих стандартных способов. Олигонуклеотид по изобретению может быть, например, получен, как описано в примере 1. Олигонуклеотид по изобретению предпочтительно синтезируют на твердой фазе, где подходящим образом защищенные мономеры (например, нуклеозиды) конденсируются с образованием межнуклеозидных мостиков между этими мономерами. Данное изобретение относится, например, к способу получения олигонуклеотида или его производного, в котором нуклеотидную единицу с 3’- или 2’-концевой фосфор(V)-группой и свободной 5’-гидроксил- или меркаптогруппой преобразуют другой нуклеотидной единицей с фосфор(III)- или фосфор(V)-группой в 3’-положении, или ее активированными производными, причем в случае необходимости применяют защитные группы, которые предварительно могут быть введены в этот олигонуклеотид для защиты других функциональных групп, и которые после синтеза удаляют, и отщепленный от твердой фазы олигонуклеотид в случае необходимости может быть превращен в физиологически приемлемую соль. Для синтеза модифицированного олигонуклеотида стандартные способы в некоторой степени варьируют. Эти вариации известны специалисту и они описаны, например, в Agrowal S. “Protocols for oligonucleotides and analogs” (1993, Humana Press Inc., Totowa, New Jersey). Получение модифицированных олигонуклеотидов описано также в ЕР 0710667, ЕР 0680969, ЕР 0464638, ЕР 0593901, WO 95/01363, ЕР 0672677, ЕР 0739898 и ЕР 0552766. Тем самым делается особая ссылка на описанные в вышеуказанных трудах способы получения модифицированных олигонуклеотидов.

Далее, данное изобретение относится к способу ингибирования экспрессии eg5 и/или модуляции экспрессии кодирующей eg5 нуклеиновой кислоты, в котором олигонуклеотид по изобретению приводят в контакт с кодирующей eg5 нуклеиновой кислотой (например, мРНК, кДНК), и этот олигонуклеотид гибридизуют с указанной кодирующей eg5 нуклеиновой кислотой.

Таким образом, данное изобретение относится также к способу, в котором олигонуклеотид приводят в контакт с кодирующей eg5 нуклеиновой кислотой (например, мРНК, кДНК), например, включением олигонуклеотида с использованием известных способов в клетку, например, инкубированием клеток с указанным выше олигонуклеотидом или его композицией - такая композиция может содержать усилитель поглощения, такой как липофектин, липофектамин, целльфектин или поликатионы (например, полилизин).

Так, например, олигонуклеотид, который предварительно был инкубирован, например, в течение 30 минут с целльфектином при комнатной температуре, затем инкубируют в течение приблизительно 5 или менее часов с клеткой для включения олигонуклеотида в эту клетку.

Данное изобретение относится, далее, к применению олигонуклеотида, предпочтительно в виде антисмыслового олигонуклеотида (связыванию олигонуклеотида на кодирующей eg5 мРНК) или в виде рибозима (связыванию кодирующей eg5 мРНК и расщеплению этой мРНК). В следующем особом варианте осуществления данного изобретения этот олигонуклеотид может быть применен для индукции расщепления кодирующей eg5 мРНК при помощи РНКазы Н, что приводит к пониженной экспрессии eg5.

Данное изобретение относится к применению олигонуклеотида для ингибирования образования биполярного митотического веретена и тем самым ингибирования пролиферации клеток, в частности, роста опухоли.

Данное изобретение относится, далее, к применению олигонуклеотида в качестве лекарственного средства и применению олигонуклеотида для приготовления фармацевтической композиции. В частности, этот олигонуклеотид может применяться в фармацевтической композиции, которая используется для предупреждения и/или лечения заболеваний, которые связаны с экспрессией eg5 или которые могут вылечиваться ингибированием экспрессии eg5.

Данное изобретение относится, далее, к фармацевтической композиции, которая содержит олигонуклеотид и/или его физиологически приемлемые соли вместе с фармацевтически приемлемыми носителями или вспомогательными средствами.

Данное изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит по меньшей мере один нуклеотид согласно изобретению, который может применяться для лечения заболеваний, которые могут лечиться ингибированием экспрессии eg5, таких как рестеноз и рак.

Данное изобретение относится, далее, к способу получения фармацевтической композиции, в котором один или несколько олигонуклеотидов по изобретению смешивают с физиологически приемлемыми носителями и в случае необходимости с дополнительными веществами, например в случае необходимости с подходящими добавками и/или вспомогательными веществами.

Данное изобретение относится, в частности, к применению олигонуклеотида или приготовленной из него фармацевтической композиции для лечения рака, например для ингибирования опухолевого роста и опухолевых метастазов. Этот олигонуклеотид или приготовленная из него фармацевтическая композиция может, например, применяться для лечения твердых опухолей, таких как рак молочной железы, рак легкого, рак головы и шеи, рак мозга, рак брюшной полости, рак толстой кишки, колоректальная карцинома, рак пищевода, раки желудочно-кишечного тракта, глиальная опухоль, рак печени, рак языка, нейробластома, остеосаркома, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, ретинобластома, опухоль Вильмса, множественная миелома, и для лечения рака кожи, такого как меланома, для лечения опухолей лимфатических узлов и рака крови. Данное изобретение относится, далее, к применению олигонуклеотида по изобретению или приготовленной из него фармацевтической композиции для ингибирования экспрессии eg5 и/или для ингибирования накопления асцитной жидкости и плевральных выпотов при различных типах раков, например раке молочной железы, раке легкого, раке головы, раке шеи, раке мозга, раке брюшной полости, раке толстой кишки, колоректальной карциноме, раке пищевода, раке желудочно-кишечного тракта, глиальном раке, раке печени, нейробластоме, остеосаркоме, раке яичника, раке поджелудочной железы, раке предстательной железы, ретинобластоме, опухоли Вильмса, множественной миеломе, раке кожи, меланоме, раке лимфатических узлов и раке крови. На основе ингибирующего действия на экспрессию eg5 олигонуклеотид по изобретению или приготовленная из него фармацевтическая композиция может улучшать качество жизни пациента.

Данное изобретение относится, далее, к применению олигонуклеотида или его фармацевтической композиции, например, для лечения рака или для подавления опухолевого метастаза в сочетании с другими лекарственными средствами и/или другими терапевтическими мероприятиями, например с известными лекарственными средствами и/или известными мероприятиями терапии, например с теми, которые в настоящее время применяют для лечения рака и/или для ингибирования метастазирования опухолей. Предпочтительным является комбинирование с лучевой терапией и химиотерапевтическими средствами, такими как цисплатина, циклофосфамид, 5-фторурацил, адриамицин, даунорубицин или тамоксифен.

Олигонуклеотид и/или его физиологически приемлемая соль может вводиться животному, предпочтительно млекопитающему и, в частности, человеку, отдельно, в смеси с другим олигонуклеотидом (или его физиологически приемлемой солью) или в форме фармацевтической композиции, которая делает возможным местное, чрескожное, парентеральное или кишечное применение и которая содержит в качестве активного компонента эффективное количество по меньшей мере одного олигонуклеотида, дополнительно к обычным фармацевтически приемлемым носителям и вспомогательным веществам. Такая фармацевтическая композиция обычно содержит приблизительно 0,1-90 масс.% терапевтически активного олигонуклеотида (терапевтически активных олигонуклеотидов). Доза может варьироваться в широком диапазоне и в каждом случае должна соответствовать индивидуальным обстоятельствам. Для лечения псориаза предпочтительным является местное применение. В случае рака предпочтительными являются инфузии, пероральное и ректальное введение или назальное введение в виде аэрозоля, предпочтительно в случае рака легкого, в то время как в случае диабетической ретинопатии предпочтительным является местное применение, введение в стекловидное тело и пероральное введение.

Фармацевтическая композиция может быть приготовлена известным per se образом (например, Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA (1985)), с использованием фармацевтически инертных неорганических или органических носителей. Лактоза, кукурузный крахмал и/или их производные, тальк, стеариновая кислота и/или ее соли и т.д. могут применяться, например, для приготовления пилюль, таблеток, таблеток с пленочными покрытиями и твердых желатиновых капсул. Примерами носителей для мягких желатиновых капсул и/или суппозиториев являются жиры, воски, полутвердые и жидкие полиолы, природные и/или отвержденные масла, и т.д. Примерами подходящих носителей для приготовления растворов и/или сиропов являются вода, сахароза, инвертный сахар, глюкоза, полиолы, и т.д. Подходящими носителями для приготовления инъекционных растворов являются вода, спирты, глицерин, полиолы, растительные масла и т.д. Подходящими носителями для микрокапсул, имплантатов и/или зондов являются сополимеры гликолевой кислоты и молочной кислоты. Кроме того, имеются липосомные композиции, которые описаны, например, N. Weiner (Drug Develop Ind Pharm 15 (1989) 1523), “Liposome Dermatics” (Springer Verlag 1992) и Hayashi (Gene Therapy 3 (1996) 878). Фармацевтический состав может также включать в себя готовую форму, которая повышает пероральную доступность олигонуклеотида, например вещества для улучшения поглощения через кишечник, например маннит, мочевину, соли желчной кислоты, такой как CDCA (хенодезоксихолат) (2%).

Возможно также кожное нанесение, например, при применении ионофоретических способов и/или с использованием электропорации. Кроме того, могут применяться липофектины и другие системы-носители, например, используемые в генной терапии. Особенно пригодны системы, которые делают возможным высокоэффективное включение (“шлюзование”) олигонуклеотидов в эукариотические клетки или в ядро эукариотических клеток. Фармацевтическая композиция может также состоять из двух или большего числа различных олигонуклеотидов и/или их физиологически приемлемых солей и, кроме того, дополнительно к по меньшей мере одному олигонуклеотиду, из одного или нескольких различных терапевтических активных веществ.

Дополнительно к активным веществам и носителям, фармацевтическая композиция может также содержать дополнительные вещества, такие как наполнители, разбавители, дезинтеграторы, связывающие вещества, мягчители, смачивающие вещества, стабилизаторы, эмульгаторы, консерванты, подслащивающие вещества, красители, улучшающие вкус вещества или ароматизаторы, загустители, разбавители или буферные вещества и дополнительно растворители и/или гидротропные солюбилизаторы и/или средства для достижения замедляющего действия, а также соли для изменения осмотического давления, материалы для покрытия и/или антиоксиданты.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1: Синтез олигонуклеотидов

Олигонуклеотиды (ON) синтезировали при помощи ДНК синтезатора Applied Biosystems 394 (Perkin Elmer Applied Biosystems, Inc., Foster City, USA) и с использованием стандартной фосфорамидитной химии. После сопряжения вводили фосфоротиоатные связи посредством обработки серой с применением реагентов Beaucage и последующего блокирования ацетангидридом и N-метилимидазолом. После отщепления от твердой фазы и последующего снятия защиты обработкой концентрированным аммиаком олигонуклеотиды (ON) очищали электрофорезом в полиакриламидном геле. 2’-O-метил-модифицированные олигонуклеотиды получали заменой стандартных фосфорамидитов в соответствующем цикле 2’-O-метилрибонуклеозид-фосфорамидитами. Все олигонуклеотиды анализировали электрораспылительной масс-спектроскопией с отрицательными ионами (Fisons-Bio-Q), которая во всех случаях подтвердила рассчитанную массу. C₁₆-модифицированные олигонуклеотиды синтезировали с использованием гексадецилокси(циано-этокси)-N,N-диизопропиламинофосфана вместо стандартного амидита в качестве реагента фосфитилирования в последней стадии синтеза олигонуклеотидов или исходя из соответствующим образом дериватизованной твердой фазы. Триэтиленгликольный линкер можно приобрести у Glen Research Corporation. 2’-фосфорамидиты аденозина и кордицепина получали от Chem Genes Corporation или Chemogen Corporation. Введение 5’-фосфатов или тиофосфатных остатков проводили, как описано ранее (Uhlman und Engels (1986) Tetrahedron Lett. 27, 1023). Химеры ПНК-ДНК получали, как описано в ЕР 0672677.

Олигонуклеотиды анализировали при помощи

а) аналитического гель-электрофореза в 20% акриламиде, 8 М мочевине, 45 мкМ трис-боратном буфере, рН 7,0 и/или

b) ВЖХ-анализа: Waters GenPak FAX-колонка, градиент СН₃СN (400 мл), Н₂О (1,6 л), NaH ₂PO₄ (3,1 г), NaCl (11,7 г), рН 6,8 (0,1 М по NaCl) - CH₂CN (400 мл), H₂O (1,6 л), NaH₂PO₄ (3,1 г), NaCl (17,53 г), рН 6,8 (1,5 М по NaCl) и/или

c) капиллярного электрофореза с использованием Beckmann eCAP^ТМ, U100P гель-капиллярной колонки, длина 65 см, внутренний диаметр 100 мм, причем окно находится на расстоянии 15 см от одного конца, буфер 140 мкМ Трис, 360 мМ борат, 7 М мочевина и/или

d) электрораспылительной масс-спектрометрии с отрицательными ионами, которая во всех случаях подтвердила ожидаемые величины масс.

Способы для анализа олигонуклеотидов согласно а), b), с) и d) известны специалисту. Эти способы были описаны, например, в Schweitzer and Engels “Analysis of oligonucleotides” (в “Antisense - from technology to therapy”, лабораторном справочнике и учебнике, Schlingensiepin et al. Hrsg., Biol. Science Vol.6 (1997) p.78-103).

Следующие олигонуклеотиды были получены (см. описание) и испытаны:

где “*” обозначает фосфоротиоатный межнуклеозидный мостик,

a FITC обозначает флуоресцентный маркер.

ON1-ON12 испытывали в анализе на основе клеток на их эффективность в ингибировании пролиферации лейкозных REH-клеток. ON1, ON2, ON64-ON71 являются антисмысловыми олигонуклеотидами, которые направлены к участку начала трансляции мРНК ед5. ON4 является 5’-флуоресцеин-меченым аналогом ON1. ON3 является сравнительным олигонуклеотидом.

Результаты экспериментов по ингибированию пролиферации показаны на чертеже.

ПРИМЕР 2: Определение антипролиферативной эффективности еg5-антисмысловых олигонуклеотидов

REH-клетки (клетки пре-В-лейкоза человека, DSM АСС 22) или опухолевые А549-клетки культивировали в OptiMEM (Gibco BRL) с 10% телячьей сывороткой (ФТС, Gibco-BRL) при 37°С в 5% CO₂. Плотность клеток для анализа была приблизительно 1×10⁶ на мл. Олигонуклеотиды (0,17 мМ) смешивали для комплексообразования с целльфектином (0,83 мг/мл; Gibco-BRL) для улучшения поглощения клетками. Комплекс олигонуклеотид/целльфектин инкубировали с клетками в отсутствие сыворотки в плашках с 24 лунками в течение 4 часов. Затем комплекс олигонуклеотид/целльфектин удаляли и добавляли сыворотку, так что конечная концентрация составляла 10%. После 96-часовой инкубации при 37°С в 5% CO₂ плотность клеток измеряли с использованием Casy I (Fa. Scharfe). Для этого клетки в каждой лунке хорошо перемешивали и сразу же разбавляли 1:100 казитоном. Средние величины плотности клеток определяли в каждом случае из 3 отдельных лунок с одинаковыми концентрациями олигонуклеотидов. Результаты антипролиферативной эффективности показаны на чертеже.

Чертеж суммирует результаты примеров 1+2: показано действие олигонуклеотидов ON1-ON12 (антисмысловых олигонуклеотидов eg5) на ингибирование пролиферации REH-клеток (в процентах). На чертеже обозначено: - 1-й эксперимент, - 2-й эксперимент, CF: целльфектин-контроль.