универсальный гетерогенный коллагеновый матрикс для имплантации и способ его получения

Формула изобретения

1. Универсальный гетерогенный коллагеновый матрикс для имплантации, представляющий собой упругоэластичную массу, полученную из двух источников коллагена, причем один источник является тканью позвоночного животного одного класса, а второй - животного другого класса.

2. Матрикс по п.1, отличающийся тем, что источниками коллагена являются ткани животных класса млекопитающих и класса птиц.

3. Матрикс по п.1, 2, отличающийся тем, что он состоит из двух фаз: твердой - в виде микросфер из коллагена ткани млекопитающих, и жидкой - из денатурированного коллагена ткани птиц при соотношении фаз (1-10):(1-10).

4. Матрикс по пп.1-3, отличающийся тем, что соотношение твердой и жидкой фаз составляет 1:1.

5. Матрикс по пп.2-4, отличающийся тем, что имеет размер микросфер 100-300 мкм, а конечными продуктами биодеградации являются CO ₂ и Н₂О.

6. Матрикс по пп.1-5, отличающийся тем, что дополнительно содержит компоненты физиологических культуральных сред, а также добавки, способствующие росту и дифференциации клеток и тканей в эффективном количестве.

7. Матрикс по пп.1-6, отличающийся тем, что дополнительно содержит антибактериальные и/или антивирусные компоненты, а также антиагрегационные препараты в эффективном количестве.

8. Матрикс по пп.1-7, отличающийся тем, что дополнительно содержит эмбриональные клетки нервной ткани.

9. Способ получения универсального гетерогенного коллагенового матрикса для имплантации, включающий приготовление раствора коллагена млекопитающего (РКМ) и денатурированного раствора коллагена птицы (РКП), при этом используют 0,3М уксусную кислоту, в конечной концентрации для РКМ ~0,5-1,5%, а для РКП ~3,0-5,0%, а затем РКМ обрабатывают -облучением в дозе 1,0 Мрад и гомогенизируют до получения микросфер, далее отмывают РКМ и РКП дистиллированной водой до рН не менее 6,0, дополнительно промывают фосфатным буферным раствором и смешивают отмытые коллаген млекопитающих и коллаген птиц в соотношении 1:1 с получением матрикса.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что в полученный матрикс дополнительно вносят антибактериальные и/или антивирусные компоненты, а также стимуляторы регенерации тканей и антиагрегационные препараты.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что полученный матрикс стерилизуют -облучением.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что полученный матрикс стерилизуют -облучением в дозе 0,5 Мрад на 1 мл.

13. Способ по п.9-12, отличающийся тем, что в полученный матрикс дополнительно вносят эмбриональные клетки нервной ткани.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биофармакологии и молекулярной биотрансплантологии, точнее к созданию универсального пластического матрикса на основе гетерогенного коллагенового материала для восстановления повреждений мягких тканей и органов путем имплантации, а также способу получения такого матрикса.

Коллаген - самый распространенный белок организма человека. Он составляет от 25 до 33% общего количества белка и, следовательно, около 6% массы тела. Состав коллагена замечателен в том отношении, что треть его аминокислотных остатков представлена глицином; на долю пролина в сумме с 3- и 4-оксипролином приходится 21% остатков, а на долю аланина - 11%. Коллагены - одни из немногих белков, содержащих оксипролины и 5-оксилизин. Изучение соединительной ткани с помощью электронного микроскопа показало присутствие в ней коллагеновых волокон, которые построены из фибрилл. Фибриллы имеют форму цилиндра диаметром от 5 до 200 нм (в зависимости от источника выделения); при большем разрешении обнаруживается, что фибриллы имеют характерную рифленую структуру. Организация фибрилл в волокнах в разных тканях различна. Коллагеновые волокна сухожилий и кожи образованы связками параллельных фибрилл, в то время как фибриллы в заживающей ране агрегированы весьма хаотично. В роговице и стекловидном теле обнаруживаются узкие полосы строго ориентированных фибрилл, что обеспечивает минимальное рассеяние и максимальное пропускание падающего света.

При экстракции кожи очень молодых животных холодными солевыми растворами или же при длительной экстракции нерастворимого коллагена разведенной кислотой получают раствор образующих коллагеновые фибриллы единиц, называемых тропоколлагенами. Хотя тропоколлагены, выделенные из разных источников, несколько отличаются по составу, однако все они обогащены глицином и содержат 5-оксилизин (Нуl) и оксииминокислоту 4-оксипролин (Hyp). Некоторые коллагены содержат также 3-оксипролин, но значительно меньше, чем 4-оксипролина.

Молекулы тропоколлагена (М~300000) имеют толщину около 1,5 нм и длину 300 нм. Они образованы тремя субъединицами, каждая из которых представляет собой полипептидную цепь, содержащую примерно 1000 аминокислот. Молекулы тропоколлагена относятся к числу наиболее асимметричных молекул, когда-либо выделенных из естественных источников. Отдельная цепь представляет собой плотную левозакрученную спираль, содержащую 3 аминокислотных остатка на виток, а три цепи образуют структуру, похожую на кабель, слегка закрученную в правую спираль. Уникальная структура тропоколлагена обусловлена высоким содержанием в нем глицина и иминокислот. Пирролидиновые кольца аминокислот имеют особые стереохимические свойства, которые ограничивают гибкость цепи и способствуют формированию вторичной структуры в виде трехцепочечных спиралей. Эта компактная трехцепочечная структура оказывается возможной также потому, что каждый третий остаток в последовательности цепи тропоколлагена представлен глицином, -углеродный атом которого погружен внутрь молекулы, где R-группа любой другой аминокислоты разместиться не может. Хотя коллагены из различных источников отличаются по составу, во всех случаях при анализе больших полипептидных фрагментов в каждом третьем положении цепи обнаруживается глицин. Три цепи стабилизируются водородными связями между -C=O...NH-группами пептидных связей соседних цепей. В тропоколлагене в отличие от глобулярных белков R-группы всех аминокислот находятся на внешней стороне молекулы и мало участвуют в стабилизации структуры, хотя они, вероятно, участвуют в межмолекулярном взаимодействии при образовании фибрилл и волокон [1].

Биохимические исследования позволили создать достаточно полную концепцию внутриклеточного биосинтеза и внеклеточной модификации коллагена. На рибосомах, фиксированных к мембранам зернистой цитоплазматической сети, происходит сборка из аминокислот одинарных спиральных -цепей, а спомощью пропил- и лизилгидроксилаз образуются специфические для коллагена оксипролин и оксилизин. Затем три -цепи соединяются в трехспиральную молекулу проколлагенов, которая характеризуется наличием на обоих концах неспиральных пептидов, предотвращающих внутриклеточную агрегацию молекул. После выхода проколлагена из клетки концевые N- и С-пропептиды отщепляются проколлагенпептидазами, но на концах молекулы остаются небольшие неспиальные остатки - телопептиды. Молекулы тропоколлагена агрегируют в фибриллы, после чего в присутствии фермента лизилоксидазы и меди происходит образование поперечных ковалентных межмолекулярных связей. Протофибриллы (диаметр 3-5 нм) в свою очередь объединяются в фибриллы с типичной периодичностью 64 нм, что объясняется сдвигом молекул на четверть длины при латеральной агрегации. Фибриллы формируют (на светооптическом уровне) волокна, а те в свою очередь - пучки волокон. При этом на всех уровнях сохраняется спиральное скручивание элементов в структуры следующего порядка, что придает коллагеновым образованиям особую прочность и сопротивляемость растяжению. Представленная схема фибриллогенеза относится к коллагенам I-III типов. Однако в настоящее время известны уже 13 типов коллагена (см. таблицу 1), отличающихся друг от друга комбинацией -цепей, имеющих различия в аминокислотной последовательности, количестве и расположении (на концах или внутри молекулы) неспиральных участков (доменов), длине макромолекулы и локализации в тканях.

Таблица 1
Тип	Локализация в тканях
I	Рыхлая и плотная соединительная ткань, кость, связки, сухожилия, дерма, дентин
II	Хрящ, стекловидное тело, клапаны сердца
III	Рыхлая и плотная соединительная ткань, кожа, селезенка, лимфатические узлы, костный мозг, дерма эмбрионов человека
IV	Базальные мембраны сосудов
V	Рыхлая и плотная соединительная ткань, кожа, хрусталик глаза
VI	То же, стекловидное тело
VII	Кожа, легкие, склера глаза
VIII	Эндотелий
IX	Хрящ
X	Гипертрофический хрящ
XI	Хрящ
XII	Хрящ
XIII	Базальные мембраны

Большинство видов соединительной ткани состоит из коллагенов I и III типов (по мере созревания соотношение измеряется в сторону преобладания I типа) с примесью коллагенов V и VI типов. Основу ретикулярных волокон, а также незрелых аргирофильных коллагеновых волокон составляет коллаген III типа. В хрящах и клапанах сердца преобладает коллаген II типа с примесью IX-XII типов, в базальных мембранах - коллаген IV типа с примесью XIII типа. При этом молекулы коллагена IV типа не образуют фибрилл, так как они соединяются в своеобразную сетевую структуру.

Результаты ультраструктурных иммунохимических исследований показывают, что коллаген I типа образует типичные периодические фибриллы, коллаген III типа представлен более тонкими фибриллами диаметром 10-15 нм, которые сплетают в виде сети фибриллы I типа. Очень тонкие филаменты (диаметр 6-10 нм), тесно связанные с фибриллами коллагенов I и III типов, состоят из коллагенов V и VI типов, которые, кроме того, покрывают поверхность фибрилл I типа, усиливая “рисунок периодичности”, а коллаген V типа - еще и поверхность клеток. Фибронектин также связан с поверхностью фибрилл, хотя выявляется в виде глобул и филаментов в межфибриллярном пространстве [2].

Составляя поддерживающую (стромальную) часть большинства мягких органов и тканей, коллаген используется в биокомпозиционных материалах для реконструктивной хирургии, составляя основную конкуренцию искусственным биополимерным веществам, используемым для подобных целей.

В частности, для терапевтических целей предложен ряд гидрогелей на основе акриламидных или метакриламидных производных со смешивающими агентами (см. патент США №5863557, 1999 г., патент РФ №2205034, май 2003 г.), а также другие вещества, например материал для пластики тканей, РФ №2137441, 1999 г., который представляет собой пористый, прочный и сверхэластичный материал - никелид титана.

Хотя эти вещества и обладают пониженной тканевой реакцией организма на имплантацию таких веществ, но они не могут стимулировать восстановление поврежденной ткани и не предназначены для последующего рассасывания, оставаясь в организме инородным телом. В некоторых случаях полимерные биосовместимые материалы для пластических целей используют совместно с коллагеновым матриксом (см. патент РФ №2033090, 1995 г.).

Аналогами настоящего изобретения можно считать различные коллагенсодержащие вещества и биокомпозиции, которые могут использоваться для биопластических целей: например, ранозаживляющее покрытие (патент РФ №2085217, 1997 г.), способ повышения качества шелковой хирургической нити (патент РФ №2076740, 1997 г.), материал для пластики тканей (патент РФ №2137441, 1999 г.), состав для инъекций при эндопротезировании (патент РФ №2034465, 1995 г.), состав для дентотрансплантации, содержащий коллаген-гель, метилцеллюлозу и спиртовой экстракт прополиса (патент РФ №2106781, 1998 г.), способ сохранения функции межпозвонкового сегмента при остеохондрозе (патент РФ №2171649, 2001 г.), армированный трансплантат для склеропластических операций (патент РФ №2140242, 1999 г.), антиадгезионный агент (патент РФ №2155592, 2000 г.), биосовместимый полимерный материал и способ его получения (патент РФ №2162343, 2001 г.), трансплантат для склеропластики, содержащий небиодеградирущий коллаген (патент РФ №2157159, 2000 г.), коллагенсодержащий материал для кератинопластики (патент США №6197330, 2001 г.), для аорто- и кардиопластики (патент США 2002094573, 2002 г.), способ хирургического устранения рубцовых деформаций кожи (патент РФ №2201146, март 2003 г.).

Однако перечисленные разработки содержат описание использования коллагена, часто в комбинации с другими полимерами, для отдельных органов и тканей.

В известных работах можно встретить описание некоторых веществ, использованных в качестве универсальной коллагеновой основы для трансплантации. Например, коллагенсодержащий матрикс, выделенный из ткани подслизистой оболочки, который может быть использован как ростовой протез (WO 98/22158, 1999 г.). Аллотрансплантат, используемый как прослойка между тканью и пересадочным материалом, представляющий собой этилпроизводное коллагена с антибактериальными свойствами (патент РФ 2143868, 2000 г.). Известен также способ обработки коллагенсодержащей ткани, которую берут у донора и пересаживают реципиенту, метод направлен на подавление иммуногенности ткани или органа у реципиента (патент США 2002119437, 2002 г.).

В качестве наиболее близкого аналога можно рассмотреть патент РФ №2188206, опубликованный в августе 2002 г., где речь идет об использовании нативного коллагена или такового в измельченном и солюбилизированном состоянии, поэтапно прогретого с определенными физико-химическими свойствами. Этот препарат может быть использован в фармацевтической, медико-хирургической, офтальмологической и косметической композиции. Основным недостатком коллагеновых гелей является высокая скорость их биодеградации. В результате из применения происходит лишь частичное восстановление ткани с формированием рубца.

Технической задачей настоящего изобретения является создание универсального матрикса на основе природного коллагена с регулируемым сроком биодеградации, способного стимулировать в поврежденной ткани регенерацию аксонов и неоваскуляризацию, а также способа получения такого матрикса.

Поставленная задача решается тем, что создан универсальный гетерогенный коллагеновый матрикс для имплантации, представляющий собой упругоэластичную массу, полученную из двух источников коллагена, причем один источник является тканью позвоночного животного одного класса, а второй - животного другого класса. Источниками коллагена, например, являются ткани животных класса млекопитающих и класса птиц. В физико-химическом плане матрикс состоит из двух фаз: твердой - в виде микросфер из коллагена ткани млекопитающих, и жидкой из денатурированного коллагена ткани птиц при соотношении фаз (1-10) частей твердой на (1-10) частей жидкой фазы. В наших испытаниях использовался матрикс (коллаген млекопитающего + коллаген птицы) при соотношении фаз 1:1. Матрикс имеет размер микросфер 100-300 мкм а конечными продуктами биодеградации являются СО₂ и Н₂О. Дополнительно матрикс может содержать компоненты физиологических культуральных сред, а также добавки, способствующие росту и дифференциации клеток и тканей, антибактериальные и/или антивирусные компоненты, а также антиагрегационные препараты.

При использовании матрикса для имплантации конкретных тканей он дополнительно может содержать, например, эмбриональные клетки нервной ткани.

Изобретение поясняется следующим примером:

ПРИМЕР 1. Для наших исследований использовали коллаген из соединительной ткани сельскохозяйственных животных (крупного рогатого скота), представляющий собой трехспиральный белок с молекулярной массой 300000 как твердую фазу. для жидкой фазы использовали денатурированный коллаген птиц в соотношении 1:1, иммуногенность полученного коллагена соответствует примерно типам VIII-ХIII.

В общем случае, в качестве твердой фазы предпочтительно использовать коллаген позвоночных животных более высокого класса, чем для жидкой фазы. Например, млекопитающее животное (твердая фаза) - птица (жидкая фаза), птица (твердая фаза) - рептилия (жидкая фаза) и т.п. Полученный матрикс имеет достаточно низкую иммуногенность.

В качестве дополнительных компонентов матрикс может содержать антибиотики, антисептики, стимуляторы регенерации, антисвертывающие препараты и др. антиагреганты.

Например, антибиотики: пенициллины - бензилпенициллин, клоксациллин, ампициллин, цефалоспорины - цефалоридин, цефуроксим, цефотетан, цефтазидин, карбопенемы - мерапенем, монобактамы - азтреонам, аминогликозиды - стрептомицин, гентамицин, амикацин, тетрациклины - тетрациклин, миноциклин, макролиды - эритромицин, азитромицин, линкозамиды - линкомицин, антибиотики пептидной группы - полимиксин В, полимиксин М, ристомицин, бацитрацин.

Антисептики, например, сангвиритрин, эктерицид или томицид. Стимуляторы клеточной регенерации, например, метилурацил лейкоген, АТФ, пентоксил, калия оротат, рибоксин, этаден.

Преимуществами нового гетерогенного коллагенового матрикса для имплантации при повреждении мягких органов и тканей являются:

- многофункциональность (опорная и трофическая функция для клеточных культур, стимулирует регенерацию аксонов и неоваскуляризацию)

- высокая биосовместимость на белковом и клеточном уровне как готового изделия, так и продуктов биодеградации

- способность стимулировать пролиферацию и дифференциацию клеток

- регулируемое время биодеградации от нескольких недель до нескольких месяцев (конечными продуктами биодеградации являются углекислый газ и вода)

- способность к порообразованию непосредственно при контакте с биологическими средами, обеспечивающая процессы неоваскуляризации

- возможность стерилизации без изменения медико-технических свойств.

При комнатной температуре гетерогенный матрикс представляет собой упругоэластичную массу, устойчивую при длительном хранении и не склонную к явлениям синерезиса (выделение жидкой фазы). В таком состоянии матрикс не смешивается с водой и гидрофобными жидкостями. При температуре 37°С вязкость биополимерного матрикса за счет слабо сшитого жидкого компонента, резко уменьшается, при этом физическое состояние глобулярного (твердого) компонента не меняется.

На фиг.1 приведена фотография, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа, нового матрикса, условно обозначенного как “Сферогель-Э”.

На фиг.2 приведена микрофотография матрикса со стволовыми клетками костного мозга крыс.

Изделие, упакованное в шприцах различной емкости, стерилизуют -излучением. Вводится матрикс непосредственно в зону дефекта. Со временем заменяется исходной тканью без образования рубцовой ткани.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ получения гетероколлагенового матрикса, описанного выше.

Известны способы получения коллагеновых матриксов для пластических целей: в частности, в патенте РФ №2174410, 2001 г. описан способ получения коллагеновых пластинок, который позволяет получить коллагеновые материалы в виде порошков, гранул, пластин, патент РФ №2118176, 1998 г., в котором описан способ получения коллагенового материала с насыщением его водяным паром, который затем подсушивают, структурируют в парах формальдегида, в материал можно вводить различные полезные добавки.

Однако способы получения гетерогенного коллагенового матрикса на основе коллагенов позвоночных животных разных классов в доступной литературе не обнаружены.

Технической задачей является создание способа получения такого гетерогенного коллагенового материала.

Способ осуществляют следующим образом.

Способ получения универсального гетерогенного коллагенового матрикса для имплантации включает приготовление раствора коллагена млекопитающего (РКМ) и денатурированного раствора коллагена птицы (РКП), при этом используют 0,3 М уксусную кислоту, в конечной концентрации для РКМ ~0,5-1,5%, а для РКП ~3,0-5,0%, затем РКМ обрабатывают -облучением в дозе 1 Мрад и гомогенизируют для получения микроглобул, далее отмывают РКМ и РКП дистиллированной водой до рН не менее 6,0, дополнительно промывают фосфатным буферным раствором и смешивают отмытые коллаген млекопитающих и коллаген птиц в соотношении 1:1 с получением матрикса.

В матрикс дополнительно можно внести антибактериальные, антивирусные компоненты и или стимуляторы регенерации, а также антиагрегационные препараты, затем его стерилизуют -облучением в дозе на 1 мл 0,5 Мрад.

Полученный, как описано выше, матрикс со свойствами, охарактеризованными в примере 1, подвергался биологическим испытаниям. Далее приведены результаты таких испытаний.

ПРИМЕР 2. Испытания в условиях in vitro.

Цитотоксичность: 1) экстракта на суспензионной культуре подвижных клеток (семя крупного рогатого скота) не выявлена. Индекс токсичности составил 100% при допустимых значениях 70-120%; 2) экстракта на фибробластах мыши линии 3Т3 клона SC-1. Морфология клеток была аналогичной контролю, количество клеток отличалось от контроля в пределах допустимой погрешности. Токсического действия не выявлено.

Гемолитическое действие экстрактов было проверено на изолированных эритроцитах человека. Степень гемолиза составила 0,02% при допустимом значении показателя не более 2%.

ПРИМЕР 3. Испытания в условиях in vivo.

Раздражающего эффекта при однократной инсталляции в конъюктивальный мешок глаза кролика нет. По оценочной шкале реакция соответствовала нулевой степени.

Исследование реакций общей анафилаксии и активной кожной анафилаксии на морских свинках показало отсутствие аллергических реакций анафилактического типа.

Сенсибилизирующего действия на белых крысах не выявлено, реакция дегрануляции тучных клеток отрицательная.

Имплантация выполнена на крысах (внутримышечно). Срок наблюдения 3 месяца. Морфологическими исследованиями патологических изменений окружающих тканей не выявлено.

Стерильность: Испытанные образцы стерильны.

Пирогенность: Экстракты, приготовленные на 0,9% растворе натрия хлорида для инъекций, пирогенных реакций при внутривенном введении кроликам не показали. Суммарное повышение температуры не превысило 1,4°С.

Полученный продукт (матрикс) может быть помещен в одноразовые шприцы, например, объемом 1 мл, 3 мл, 5 мл, 20 мл и т.д., шприц стерильно пакуют, снабжают инструкцией по применению и этикеткой, на которой указывают содержание упаковки, дату изготовления.

Приоритетной областью применения предлагаемого биополимерного гетерогенного гидрогеля является использование его для культивирования стволовых клеток с последующей их дифференциацией в нервные клетки, кардиомиоциты, эндотелиальные и эпителиальные клетки для создания биоискусственных покрытий для искусственного сердца, кровеносных сосудов и кожи, для клеточной терапии заболеваний сердечно-сосудистой системы.

Изобретение поясняется следующим лабораторными испытаниями матрикса.

Испытания нового препарата, условно обозначенного как Сферогель-Э, проводились в условиях острого опыта на лабораторных животных для целей восстановления повреждения спинного мозга.

ПРИМЕР 4. Для экспериментального повреждения спинного мозга были использованы половозрелые беспородные крысы-самки массой тела не менее 300 гр. В соответствии с задачами исследования на крысах была освоена методика хирургического повреждения спинного мозга крыс (острая модель повреждения спинного мозга) путем удаления участка спинного мозга после рассечения на уровне 10 позвонка грудного отдела позвоночника, по S. Woerly et al. [3, 4].

За сутки до операции крысам вводили профилактическую дозу антибиотика энрофлон (5% раствор энрофлоксацина, ООО “ВИК-здоровье животных”, Россия), по 0,1 мл и викасол по 0,02 мл внутримышечно (в/м) однократно. Анестезия осуществлялась в/м введением 1 мл на животное смеси, состоящей из 2% раствора ксилазина - 0,18 мл +10% раствора кетамина (Ketamine, alfasan, Woerden-Holland) - 0,36 мл и 0,5% раствора новокаина - 0,46 мл. В двух опытных группах после полного гемостаза образовавшийся дефект спинного мозга заполняли препаратом Сферогель-Э либо Сферогель-Э + эмбриональные клетки (нейроны и глиальные клетки). Имплантат Сферогеля-Э формировали так, чтобы он соответствовал по объему и по форме области поврежденного спинного мозга и заполняли полость раны, обеспечивая полное соприкосновение полимерной поверхности с поверхностями перерезанного спинного мозга. Сверху область введения препарата и прилегающие к ней участки спинного мозга изолировали от окружающих тканей подкожно-жировой клетчаткой (ПЖК), как и в контроле. В третьей (опытной) группе Сферогель-Э помещался в сформированный канал из полимерной спинномозговой оболочки (СМО).

Из всех прооперированных крыс 20 контрольным животным (I группа) не производили трансплантацию препарата Сферогель-Э в область повреждения спинного мозга. В 25 случаях (II группа) Сферогель-Э изолировали от окружающих тканей подкожно-жировой клетчаткой, 12 крысам после повреждения спинного мозга создавали канал из полимерной спинно-мозговой оболочки, в который помещали Сферогель-Э. 8 крысам вводили Сферогель-Э со стволовыми клетками также в канал, сформированный полимерной спинно-мозговой оболочкой (III группа).

Во время наблюдения регистрировались изменения тонуса мышц и двигательной активности задних конечностей крыс (табл.2).

Таблица 2
Группа	Гипертонус сгибателей (ДНИ)	Реакция отталкивания на тактильные раздражения (ДНИ)	Попытки использовать задние конечности при передвижении (ДНИ)	Другие изменения
Контроль	3 из 12 (18, 24, 55)	1 из 12 (30)	-	-
Сферогель-Э (изолирование ПЖК)	11 из 21 (14-49)	8 из 21 (21-40)	4 из 21 (35-54)	4 из 21 – слабо пытаются опираться на лапы при ходьбе; 2 из 21 – ступни развернуты вперед, шевелит пальцами
Сферогель-Э (изолирование ПСО)	5 из 9 (12-54)	4 из 9 (22)	1 из 9 (25)	1 из 9 – ступни развернуты вперед, с 42 дня крыса использует задние лапы при ходьбе, пытается чесать ими голову
Сферогель-Э + эмбриональные клетки	2 из 3 (21)	3 из 3 (21-41)	-	-

В скобках в таблице 2 указаны дни начала проявления изменений со стороны двигательной активности задних конечностей (Знак “/” в некоторых таблицах заменяет предлог “из” (для удобства чтения таблицы).

По результатам испытаний матрикса на лабораторных животных приводим следующие примеры:

ПРИМЕР 5. В контрольной группе у 9 из 12 крыс (75%) наблюдалась параплегия задних конечностей. У 3 из 12 (25%) животных выявлен гипертонус мышц задних конечностей, а именно:

В клетке 13, у крысы №2 - на 55 сутки после операции выявлен гипертонус правой задней конечности

В клетке 31, у крысы №2 - на 24 сутки после операции отмечен гипертонус левой задней конечности

В клетке 32, у крысы №1 - на 18 день после операции наблюдался гипертонус правой задней конечности, на 40 сутки крыса слабо пытается отталкиваться лапой при ее тактильном раздражении.

ПРИМЕР 6. В опытной группе (I) в 48% (10 из 21) случаев наблюдалась параплегия задних конечностей, атония и дистрофия мышц. У 11 из 21 крысы (52%) выявлены изменения тонуса мышц и двигательной активности задних конечностей, а именно:

В клетке 7, у крысы №1 - на 49 день опыта наблюдался гипертонус сгибателей обеих конечностей, реакция отталкивания на тактильное раздражение. На 54 сутки стопы задних конечностей развернуты вперед, крыса пытается опираться на них.

В клетке 7, у крысы №2 - на 49 день опыта наблюдался гипертонус сгибателей обеих конечностей, реакция отталкивания на тактильное раздражение, которая незначительно усилилась в более поздние сроки наблюдения.

В клетке 9, у крысы №1 - на 34 день после операции наблюдался гипертонус сгибателей задних конечностей, слабая реакция отталкивания на тактильное раздражение, сохраняющаяся при дальнейшем наблюдении.

В клетке 10, у крысы №2 - на 21 день после операции выявлен гипертонус сгибателей задних конечностей, слабая реакция отталкивания на тактильное раздражение. В последующие сроки - без динамики.

В клетке 14, у крысы №1 - на 30 день опыта отмечался гипертонус сгибателей левой лапы. Динамики нет.

В клетке 16, у крысы №1 - на 30 день опыта выявлен гипертонус сгибателей правой лапы. Динамики нет.

В клетке 17, у крысы №1 - на 24 день после операции тонус мышц задних конечностей повысился, крыса хорошо отталкивалась лапами при их тактильном раздражении. В последующие сроки (35 день наблюдения) - редкие слабые попытки опираться на лапы при передвижении.

В клетке 17, у крысы №2 - на 24 день после операции отмечались сильные отталкивающие движения задних лап при тактильном раздражении. На 30 день крыса пытается использовать задние лапы при движениях.

В клетке 18, у крысы №1 - на 14 сутки после операции отмечался гипертонус мышц задних конечностей. На 20 день крыса хорошо отталкивалась лапами при их тактильном раздражении. На 35 день лапы развернуты вперед, крыса слабо пыталась опираться на них при ходьбе. Шевелит пальцами.

В клетке 19, у крысы №1 - на 20 день после операции отмечен гипертонус сгибателей одной лапы. На 28 день крыса активно отталкивалась лапами при их тактильном раздражении.

В клетке 19, у крысы №2 - на 20 день после операции выявлен гипертонус сгибателей одной лапы. При дальнейшем наблюдении - непроизвольные отталкивающие движения лапами при их тактильном раздражении.

ПРИМЕР 7. В группе (II) у 2 из 9 крыс (22%) наблюдалась параплегия задних конечностей, атония и дистрофия мышц. У 7 из 9 крыс (78%) наблюдались изменения тонуса мышц и двигательной активности задних конечностей:

В клетке 20, у крысы №1 - на 48 день опыта повысился тонус мышц задних конечностей.

В клетке 22, у крысы №1 - на 12 день опыта наблюдался гипертонус мышц, с 27 дня - слабо выраженные отталкивающие движения лапами при их тактильном раздражении.

В клетке 22, у крысы №2 - на 12 день опыта наблюдался гипертонус сгибателей задних конечностей, с 25 дня - слабые отталкивающие движения лапами при их тактильном раздражении (справа > слева). С 29 дня реакция на тактильное раздражение усилилась.

В клетке 23, у крысы №2 - на 54 день после операции у крысы незначительно повысился тонус мышц задних конечностей. Динамики нет.

В клетке 24, у крысы №2 - на 40 день опыта крыса слабо отталкивалась левой лапой при тактильном раздражении. Дальнейшей динамики нет.

В клетке 24, у крысы №3 - с 22 день после операции выявлен гипертонус сгибателей задних конечностей. Динамики нет.

В клетке 29, у крысы №1 - с 7 дня после операции наблюдался гипертонус сгибателей задних конечностей. На 22 день крыса отталкивалась лапами при их тактильном раздражении (справа > слева). С 25 дня - задние лапы повернуты вперед, крыса пыталась опираться на них при ходьбе. На 42 день после операции выявлена положительная динамика: крыса активно перемещалась по клетке, опираясь на задние лапы, лапы в разогнутом состоянии, тазовая часть тела значительно приподнята, пыталась использовать задние конечности при почесывании головы.

ПРИМЕР 8. В III опытной группе у всех 3 выживших животных после операции выявили восстановление тактильной чувствительности и появление двигательной активности задних конечностей.

В клетке 25, у крысы №1 - на 21 день после операции крыса хорошо отталкивается задними лапами (левая > правой) при тактильном раздражении.

В клетке 26, у крысы №3 - на 40 день после операции крыса слабо отталкивалась правой лапой при тактильном раздражении.

В клетке 28, у крысы №2 - на 21 день после операции выявлен гипертонус задних конечностей, слабое отталкивание задними конечностями при тактильном раздражении, а на 41 день крыса активно отталкивается обеими лапами при их сжатии.

Таким образом, повышенный тонус мышц задних конечностей (слабо выраженный) выявлен у 25% контрольных крыс с 18 по 55 дни, при этом, гипертонус определялся у 2 крыс только на одной конечности, а у 1 крысы - на обеих конечностях (табл.2). На 40 день у 1 из 3 крыс лапы начали реагировать на тактильные раздражения. Оба признака наблюдались у одной крысы.

При использовании для трансплантации Сферогеля-Э у 52% крыс из I опытной группы выявлялся гипертонус мышц задних конечностей разной степени выраженности (с 14 по 49 день после операции). Реакция отталкивания задних конечностей на тактильное раздражение наблюдалась у 38% животных с 21 по 40 день опыта. Отмечались слабые единичные попытки использовать при передвижении задние конечности у 4 крыс (19%) на 35-54 дни после операции. Гипертонус мышц и реакция отталкивания на раздражение проявлялись одновременно у 7 крыс.

При использовании Сферогеля-Э во II опытной группе гипертонус мышц задних конечностей начал регистрироваться с 12-54 дни у 56% крыс, реакция отталкивания задних конечностей на тактильные раздражения наблюдалась с 22 дня в 44% случаев. На 25 день 1 крыса пыталась опираться на задние конечности при ходьбе. При дальнейшем наблюдении наблюдалась положительная динамика: ступни лап развернуты вперед, при передвижении крыса опиралась на них, лапы больше разогнуты, чем в норме, тазовая область приподнята. На 42 день крыса пыталась почесывать голову. Эти данные позволяют сделать предположение о частичном восстановлении нервной проводимости. Гипертонус и реакция отталкивания на раздражение проявлялись в этой группе животных одновременно у 3 крыс.

При использовании в качестве трансплантата Сферогеля-Э со стволовыми клетками на 21 день после операции наблюдался гипертонус мышц у 21 из 3 крыс. С 21-41 сутки крысы реагировали отталкиванием при раздражении задних конечностей. Гипертонус и реакция отталкивания на раздражение проявлялись одновременно у 2/3 крыс.

ПРИМЕР 9. Трофические изменения у крыс.

Во всех группах (кроме III опытной) на фоне проведения витаминотерапии у крыс развивался гиповитаминоз. Крысы становились гиподинамичны, резко теряли в весе, наблюдалось выпадение волосяного покрова, вплоть до проплешин в области холки и поясницы, волосяной покров тусклый, взъерошенный. У 1 из 12 крыс в контроле развились пролежни в области бедер (табл.3). У крыс с примененным Сферогелем-Э (изолированным подкожно-жировой клетчаткой) пролежни развились у 2 из 21 крыс, а при изолировании Сферогеля-Э полимерной спинномозговой оболочкой - у 2/9 крыс.

ПРИМЕР 11. Функция мочеиспускания

В контрольной и опытных группах после операции ляминэктомия на уровне позвонка Т10 у всех животных отсутствовала функция рефлекторного мочеиспускания весь период наблюдения.

ПРИМЕР 12. Гистологическое исследование.

Позвоночный столб длиной 2-2,5 см, содержащий участок поврежденного спинного мозга, был фиксирован в 10% нейтральном забуференном формалине. Декальцинация образцов была проведена с использованием муравьиной кислоты, затем образцы заключались в парафин. Продольные срезы на уровне спинного мозга толщиной 4-5 мкм были окрашены гематоксилин-эозином.

ПРИМЕР 13. Иммуногистрхимическое исследование было проведено на срезах с парафиновых блоков толщиной 4-5 мкм с использованием стандартной иммуногистохимической реакции. Иммуногистохимическое исследование было проведено с использованием белков, характерных для нервной ткани и участвующих в процессах ее регенерации.

1. GAP-43 (neuromodulin) - нейрон-специфический белок 43, ассоциированный с ростом нейронов. Этот внутриклеточный фосфопротеин специфически локализуется в периферической и центральной нервной системе. GAP-43 - основной белок аксонального роста во время аксоногенеза и регенерации (GAP-43, Sigma, 1:160).

2. GFAP - глиальный фибриллярный кислый белок, который находят в астроцитах и глиальных клетках (GFAP, Sigma 1:80).

3. Нейрофиламент 200 - один из представителей промежуточных нейрофиламентов молекулярной массой 200 кДа, локализуется в клетках и тканях нейронального происхождения (NF200, Sigma, 1:100).

Парафиновые срезы депарафинировали и регидратировали по стандартной методике. Для "демаскировки" антигенов проводили прогревание срезов на водяной бане в предварительно нагретом до 95-99°С 10 мМ цитратном буфере (pН 6,0) в течение 30 минут. Затем стекла охлаждали при комнатной температуре в течение 15-20 минут, и переносили в фосфатный буфер на 5 минут. Для блокирования неспецифического связывания антител срезы инкубировали 15 минут с 1% раствором бычьего сывороточного альбумина. Инкубацию с первичными антителами проводили при 37°С в течение 1 часа. После первичных антител стекла промывали 2 раза по 10 минут в фосфатном буфере. Иммунологическую реакцию проявляли с помощью флуоресцентного окрашивания или непрямой стрептавиади-биотин пероксидазной реакцией.

Иммунофлурресцентнре окрашивание. Инкубацию со вторыми антителами, меченными FITC [Sigma], проводили при 37°С в течение 30 минут, и затем срезы промывали 2 раза по 10 минут. Срезы заключались в 50% глицерин. Оценка результатов проводилась с помощью флуоресцентного микроскопа Opton [Carl Zeiss].

Непрямое пероксидазное окрашивание. Инкубация со вторыми антителами [LSAB®+kit, DAKO] проводили при комнатной температуре в течение 20 минут, и затем срезы промывали 2 раза по 5 минут. Инкубация с антителами, меченными стрептавидином, [LSAB®+kit, DAKO] проводили при комнатной температуре в течение 20 минут, и затем срезы промывали 3 раза по 5 минут. Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали DAB + систему [DAKO]. Реакцию проводили в темноте в течение 5-10 минут. Срезы докрашивали гематоксилином Майера и заключали в канадский бальзам.

Исследовано 39 образцов, взятых через 2 месяца после операции. Из них 25 образцов подверглись гистологической и иммуногистохимической оценке (табл.4).

Таблица 4
Группа	Количество образцов	Примечание
Контроль	5	В одном случае область повреждения спинного мозга находится на границе образца. Случай в анализ не включен.
Сферогель-Э (изолирование ПЖК)	15	В трех случае область повреждения спинного мозга находится на границе образца. Эти случаи в анализ не включены.
Сферогель-Э (изолирование ПСО)	5	В одном случае область повреждения спинного мозга находится на границе образца. Случай в анализ не включен.

ПРИМЕР 14. Контрольные образцы (количество - 4).

В месте дефекта губчатой кости и ткани спинного мозга во всех случаях определяется гранулярная ткань разной степени зрелости с ангиоматозом и скоплением гемосидерофагов, содержащих большое количество гемосидерина. В центре гранулярной ткани определяется многокамерный кистозоподобный дефект ткани, в стенках которого эпителиоидные клетки, макрофаги и гигантские многоядерные клетки типа рассасывающих инородные тела - картина неспецифического хронического гранулематозной реакции. В 2 случаях наблюдается формирование кистозообразной полости аналогичного строения, заполненной инородным веществом.

В трех образцах участки регенерации нервной ткани, располагающиеся под кистозообразным дефектом, выражены незначительно. Иммуногистохимическое исследование показало совсем незначительное окрашивание клеток антителами к нейрон-специфическим белкам (GFAP, GAP и нейрофиламент 200). В образце “клетка 32 ч” под многокамерной полостью без инородного тела определяются участки ткани рыхлого строения с отсутствием крупных нейронов и клеток типа ганглиозных. В этой области обнаруживаются отдельные компоненты микроглии, представленные небольшим количеством мелких нервных клеток и хаотично ветвящимися рыхло расположенными нервными волокнами. Клетки области очень слабо окрашиваются антителами к GFAP и GAP.

ПРИМЕР 15. Сферогель-Э, изолированый ПЖК (количество - 12)

В области повреждения в 1 случае наблюдается формирование однокамерной кистозоподобной полости, в стенках которой эпителиоидные клетки, макрофаги. На месте пересечения спинного мозга и введения Сферогеля-Э определяется плотная область по сравнению с контрольными препаратами в 6 случаях. Наблюдается более высокое количество нервных клеток и их отростков, а также полнокровие кровеносных сосудов без выхода эритроцитов за пределы сосудистого русла. В части препаратов (7 образцов) микрососуды - кавернозно-расширенные, тонкостенные, полнокровные. В большинстве образцов имеются обширные экстравазации и свежие кровоизлияния, возможно травматического характера. В ткани присутствует большое количество гемосидерофагов, окружающих зоны кровоизлияния. Замечено, что при использовании Сферогеля-Э, изолированного ПЖК, диаметр кровеносных микрососудов, их полнокровность и количество экстравазации больше, чем в контроле или использовании изолирования ПСО.

ПРИМЕР 16. Сферогель-Э, изолированый ПСО (количество - 4). В области повреждения по краю спинного мозга наблюдаются инородные тела, похожие по внешнему виду на пленку. Область введения Сферогеля-Э по строению плотная, содержит большое количество мелких нервных клеток и нервных волокон. Количество клеточных элементов, длина и количество их отростков сравнимы результатами при введении Сферогеля-Э, изолированного ПЖК. Кровеносные сосуды тонкостенные, полнокровные, кавернозно-расширенные сосуды отсутствуют.

Иммуногистохимическое исследование показало присутствие белков GFAP, GAP и нейрофиламента 200 в области прорастания.

В одном случае наблюдается многокамерный кистозоподобный дефект ткани с инородным телом, в стенках которого эпителиоидные клетки, макрофаги и гигантские многоядерные клетки типа рассасывающих инородные тела. Ниже полости наблюдается участок повышенной плотности, похожий по строению на ткань неповрежденного спинного мозга.

Таким образом, при введении Сферогеля-Э в район острой травмы спинного мозга в 54% случаев при изолировании ПЖК и в 75% случаев при изолировании Сферогеля-Э ПСО наблюдается появление клеточных элементов: отдельные компоненты микроглии, представленные небольшим количеством мелких нервных клеток и нервными волокнами. Эти клетки позитивно окрашиваются антителами к нейрон-специфическим белкам: GAP, GFAP и нейрофиламент 200.

Кроме нейрохирургии заявленный матрикс может быть использован в ортопедии; при создании биоискусственной печени и поджелудочной железы, а также для восстановления других мягких органов и тканей при их повреждении.

Создание нового гетероколлагенового матрикса для биопластики является значительным продвижением в совершенствовании материалов для трансплантологии и заместительной хирургии различных тканей и органов в живом организме.

ЛИТЕРАТУРА

1. А.Уайт и др. “Основы биохимии”, под ред. Ю.А.Овчинникова, Москва, “Мир”, 1981, 786 с.

2. “Воспаление”, Руководство для врачей, под ред. В.В.Серова, B.C.Паукова, Москва, “Медицина”, 1995, 640 с.

3. Барщенко И.А., и др. Некоторые аспекты патофизиологии травматического повреждения и регенерации спинного мозга, Вопросы нейрохирургии, 2000, №2, с.28-31.

4. 7. S.Woerly, V.D.Doan, F.Evans-Martin, C.G.Paramore, J.D.Peduzzi, “Spinal cord reconstruction using NeuroGel implants and functional recovery after chronic injury”, J. of Neurosciensce Res. 2001. Vol.66, P.1187-1197.